专利名称：细胞核进入性组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于递送生理活性剂的组合物和方法的领域。
背景技术：
本领域需要改进的用于递送生理活性剂的组合物和方法。 发明概述
根据本发明，进入细胞核的药学可接受组合物包括细胞核进入性 多肽(nucleus-entering polypeptide),该多肽包括氨基酸序列LKKTET、 氨基酸序列LKKTNT或氨基酸序列KSKLKK，或者其保守变异体中 的至少一种，所述多肽连接到在所述细胞核内具有治疗性或诊断性应 用中的至少一种应用的生理活性剂上。
发明详述
本发明提供了利用了肌动蛋白-隔离肽(actin-sequestering peptide)的组合物和方法，所述隔离肽例如为胸腺素(34 (Tp4、 TB4 或TBeta4)和包括氨基酸序列LKKTET、 LKKTNT或KSKLKK，或
者其保守变异体的其他肌动蛋白-隔离肽或肽片段。所述多肽还包括 N-或C-末端的变异体，例如KLKKTET和LKKTETQ。这些肽和肽 片段对进入细胞核以治疗和/或阻止多种状况，以及影响许多生理功 能是有用的。在一些优选的具体实施方式
中，细胞进入性肽是TP4。
生理活性剂可在任何合适的位置连接到细胞进入性肽上。例如， 试剂可以连接到TP4的N-末端，或在另外一个位置连接到细胞进入 性肽的一个氨基酸上，最优选的是谷氨酰胺残基。所述活性剂可以是
药物、化学治疗剂、DNA序列、RNA序列、DNA-或RNA-活化或失
活剂、诊断剂或类似物。
在优选实施方式中，细胞进入性肽穿透核膜从而将所连接的试剂 运送入细胞核。核膜优选的是哺乳动物核膜，更优选的是人核膜。
本发明也适用于对哺乳动物受试者施用携带试剂的细胞进入性 肽的方法。该方法包括将受试者的核膜或组织与本文所述的组合物， 优选药学可接受的组合物接触。在优选具体实施方式
中，受试者是哺 乳动物，更优选的是人。
胸腺素P4起初被认为是在内皮细胞迁移和体外分化期间被上调 的蛋白。胸腺素(34是一个具有43个氨基酸、4.9KDa的普遍存在的 多肽，可在多种组织中鉴定到。已经记述的该蛋白的几种功能包括在 内皮细胞分化和迁移、T细胞分化、肌动蛋白隔离和血管形成中的功 能。
胸腺素(34是在多种组织和细胞类型中发现的、具有高度保守的 极性5-KDa多肽的(3-胸腺素家族的成员。胸腺素(34最初从胸腺纯化 并认为是一种胸腺激素，后来又发现其参与了许多生物过程。作为主 要的G-肌动蛋白隔离肽，在细胞增值、迁移和分化期间，它在肌动 蛋白装配的调节中起到重要作用。大量研究提示胸腺素P4参与了癌 变、发炎、血管生成和创伤愈合的调节。已发现胸腺素(34的表达通 过基于肌动蛋白细胞骨架的组织调节了恶性细胞的致瘤性和转移活 性。己发现正在形成微管的内皮细胞中胸腺素(34的升高；这提高了 它们的附着、扩散和迁移从而促进了血管生成。已在渍疡提取物和伤 口液体中发现了高浓度的胸腺素卩4，从而说明其作为抗细菌因子发 挥作用。几个使用动物模型的研究已经证明了胸腺素P4对创伤愈合 的剌激作用。当外用给药或腹腔内施用时，胸腺素P4在大鼠全层模 型中增强了皮创伤愈合。在db/db糖尿病小鼠、类固醇-免疫抑制小鼠 和年老小鼠中也观察到了其加速皮创伤愈合的能力。胸腺素P4也表
现出加速烧伤后的角膜上皮愈合以及下调了大量角膜细胞因子和趋 化因子，减少了炎症反应。
血管损伤产生的凝集级联活化导致了凝血酶的产生，而凝血酶将 纤维蛋白原转化为纤维蛋白。纤维蛋白自发聚合而形成血凝块，血凝 块密封受损的部位从而阻止了血液流失。在后续的创伤愈合过程中， 纤维蛋白也可作为临时基质，使得多种细胞类型在其上粘附、迁移和 增殖，从而使正常组织替代纤维蛋白。
胸腺素(34作为组织转谷氨酰胺酶的特异底物，能够选择性地与 胶原、肌动蛋白、纤维蛋白原和纤维蛋白，以及在上述过程中涉及的 蛋白交联。血小板被凝血酶活化后，胸腺素(34以时间依赖性和韩依 赖性方式被释放并交联到纤维蛋白上。
在优选的具体实施方式
中，细胞进入性多肽包括氨基酸序列
LKKTET、 LKKTNT、 KSKLKK、 KLKKTET、 LKKTETQ、胸腺素Tp4 (Tf34)、 Tp4的N-末端变异体、邓4的核进入性C-末端变异体、Tp4 的N-末端片段、T(34的异构体、T卩4的剪接变异体、氧化的TP4、 T|34 亚砜(T|34 sulfoxide)、淋巴的T卩4 (lymphoid T (34)、聚乙二醇化T&4、 或者任何其他具有肌动蛋白结合域的肌动蛋白隔离或捆扎蛋白、或者 包含或基本上由氨基酸序列LKKTET、 LKKTNT或KSKLKK或其保 守变异体组成的肽片段。国际申请PCT/US99/17282公开了可用于本 发明的TP4的异构体，以及可用于本发明的氨基酸序列LKKTET和 其保守变异体。国际申请PCT/GB99/00833 (W099/49883)公开了可 用于本发明的氧化胸腺素P4，该申请通过引用的方式纳入本文。尽 管本发明在下文中主要针对TP4和TP4异构体进行描述，但应当理 解为以下描述同样适用于氨基酸序列LKKTET、LKKTNT、KSKLKK、 KLKKTET、 LKKTETQ、包含或基本上由LKKTET、 LKKTNT、 KSKLKK、 KLKKTET或LKKTETQ组成的月太禾口片段、它们的保守变 异体，以及氧化T(34、 T(34亚砜、淋巴的T(34、聚乙二醇化T卩4。
带有连接试剂的细胞进入性肽可以任何合适的有效量施用。例 如，带有连接试剂的细胞进入性肽可以0.1-50毫克范围内的剂量施 用，更优选的以l-30毫克范围内的剂量施用。
本发明的组合物可以仅一次、每天、每两天、每两周、每两个月 等的频率施用，其中每施用当日可进行单次或多次用药，例如每施用
当日用药2、 3、 4或更多次。
己经鉴定了 TP4异构体，其与已知的TP4氨基酸序列具有约70%、 或约75%、或约80%或更高的同源性。这些异构体包括，例如Tp4ala、 T卩9、 TpiO、 Tpil、 Tpl2、 Tpl3、 T(314禾B Tpl5。与T卩4、 TJ310禾Q Tpi5
相似，TP4的剪接变异体也表现出能隔离肌动蛋白的活性。TP4、 TpiO 和T(315，还有其他异构体共有氨基酸序列LKKTET，其似乎参与调 节肌动蛋白的隔离或结合。尽管不希望被任何特定的理论所限制，但 T卩4异构体的活性部分地源于调节肌动蛋白聚合的能力。(3-胸腺素似 乎通过隔离游离的G-肌动蛋白而解聚F-肌动蛋白。TP4调节肌动蛋 白聚合的能力因而全部或部分地归因于其通过LKKTET序列结合或 隔离肌动蛋白的能力。这样，像TP4 —样，其他结合或隔离肌动蛋白， 或者调节肌动蛋白聚合的蛋白(其包括具有氨基酸序列LKKTET的 TP4异构体)很可能如本文说明的那样单独或与T卩4组合作为含有细 胞进入性序列的细胞进入性肽而发挥作用。
因而，明确预期已知T(34异构体，例如邗4ala、 Tp9、 T(310、 T(311、 T(312、 Tpi3、 T(314和T(315，以及还未鉴定的T(34异构体和Tp4的 剪接变异体，可用于本发明的方法。这样，TP4异构体可用于本发明 的方法，其中包括在受试者中施用的方法。本发明从而进一步提供了 包括携带试剂的T卩4，以及T卩4异构体Tp4ala、T(39、T|310、Tpil、T卩12、 Tpi3、 TP14和T(315，以及药学可接受载体的药物组合物。
另外，如在适当的隔离、结合、动员或聚合分析中所显示的那样或 如通过调节肌动蛋白结合的氨基酸序列(例如LKKTETR、 LKKTNT或 KSKLKK)的存在所证实的那样，其他具有肌动蛋白隔离或结合能力的 蛋白质，或能够动员肌动蛋白或调节肌动蛋白聚合的蛋白质，可相似地 用于本发明的方法。这样的蛋白包括例如凝溶胶蛋白、维生素D结合蛋 白(DBP)、抑制蛋白(profilin)、 cofilin、 adsevertin、原肌球蛋白 (propomyosin)、 fmcilin、蚕食蛋白(depactin)、 DNA酶I、绒毛蛋白 (villin)、截断蛋白(fragmin)、肌割蛋白(severin)、加帽蛋白(capping
protein)、 |3-辅肌动蛋白和肌动调解蛋白(acumentin)。因为这些方法包 括在受试者中施用的方法，所以本发明进一步提供了一种药物组合物， 其包括凝溶胶蛋白、维生素D结合蛋白(DBP)、抑制蛋白、cofilin、 adsevertin、原肌球蛋白、fmcilin、蚕食蛋白、DNA酶I、绒毛蛋白、截 断蛋白、肌割蛋白、加帽蛋白、P-辅肌动蛋白和肌动调解蛋白。这样， 本发明包括利用含有氨基酸序列LKKTETR、 LKKTNT或KSKLKK (其 可在多肽的初级氨基酸序列中)和其保守变异体的多肽的组合物和方 法。
本文所使用的术语"保守变异体"或其语法上的变体是指氨基酸残 基被另一种生物学上相似的残基替换。保守变异体的实例包括疏水残基 例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸替换另一个疏水性残基，极 性残基替换另一个极性残基，例如用精氨酸替换赖氨酸、谷氨酸替换天 门冬氨酸、或谷氨酰胺替换天门冬酰胺以及类似的替换。
实际应用的剂量、制剂或组合物依赖许多因素，包括受试者的大小 和健康状况。然而，本领域技术人员能够使用在PCT/US99/17282
中所描述的方法和技术来确定临床剂量，该文献以引用的方式纳入 本文。
合适的制剂可包括在载体中的携带试剂的LKKTET、 LKKTNT或 KSKLKK肽，其浓度在0.0001-10wty。的范围内，更优选的在大约 0.0]-0.1wt。/。范围内，最优选的是大约为0.05wt%。可应用任何合适的药 物学可接受载体，例如注射用水。
本发明也涉及递送药学活性试剂进入细胞核的方法，其包括对细胞 核施用在本文描述的药学可接受组合物。该方法包括对含细胞核的细 胞、对细胞内的细胞核、或对哺乳动物受试者施用该组合物，或通过将 受试者的组织与本发明的组合物接触来施用该组合物。
实施例1
在细胞核内具有治疗性和/或诊断性应用的生理活性剂按以下方法 连接到T(34上。该活性剂选自药物、化学治疗剂、DNA序列、RNA序 列、DNA-或RNA-活化或失活试剂以及诊断剂。通过将240|ig胸腺素(34 (200pM)与120吗试剂(lmM)禾13 0.2U
豚鼠转谷氨酰胺酶在室温下、240pl缓冲液中温育来制备连接试剂的胸 腺素p4，所述缓冲液由10mM Tris-HCl、 pH7.4、 15mM CaCl2、3mM DTT 组成。在1个和2个小时后，用HPLC分析5^1反应混合液。4小时后， 添加5pl三氟乙酸来停止反应。然后对反应混合物进行HPLC分析。所 分离的肽进行真空浓縮，再用氨基酸分析和质谱定性。
连接试剂的胸腺素(34的蛋白酶水解片段通过下述步骤制备50|ig 肽与20pU AsnC-内源蛋白酶在100^1反应缓冲液(50mM醋酸钠pH5.0、 0.2mMDTT、0.2mMEDTA)中在室温下温育16小时。然后，添加5jil 10% TFA停止反应，产物用制备性HPLC分离。在分析前，样品真空浓縮。
显微注射实验
使用由显微操作仪5170和与AxioverlOO倒置显微镜(Zeiss， G6ttingen， Germany)适配的显微注射仪5342组成的ECET细胞注射系 统(Eppendorf， Hamburg, Germany)实施显微注射。显微注射通过CCD 照相机在TV监视器(SSM121CE， Sony, Tokyo, Japan)上可视化控制。 连接试剂的胸腺素(34和交联的ADP糖基化的肌动蛋白胸腺素(34复 合物在含135mM KC1、 5mM Na2HP04, pH7.2的溶液中，分别以32|iM 和8.27pM的浓度注射到胞浆内。注射压力在65到80hPa(lhPa=0.1kPa) 之间，注射时间在0.5到0.7秒之间。
将连接试剂的胸腺素P4显微注射到细胞胞浆内。显微注射后，连 接的肽立即在胞桨内分布均匀。温育1小时后，检测到明显的细胞核定 位。
胸腺素卩4的N-末端部分包括富含赖氨酸残基("KSKLKK19)的序 列段，其是一个功能性细胞核定位信号。包括mksklkk"序列的n-末端片段(胸腺素(327—434)表现出显著的细胞核定位。
权利要求
1.用于进入细胞核的药学可接受的组合物，其包括细胞核进入性多肽，该多肽包括氨基酸序列LKKTET、氨基酸序列LKKTNT或氨基酸序列KSKLKK，或者其保守变异体中的至少一种，所述多肽连接到在所述细胞核内具有治疗性或诊断性应用中至少一种应用的生理活性剂上。
2. 根据权利要求1的组合物，其中所述的生理活性剂包括药物、 化学治疗剂或核酸序列。
3. 根据权利要求1的组合物，其中所述的细胞核进入性多肽包括 氨基酸序列LKKTET或氨基酸序列KSKLKK。
4. 根据权利要求1的组合物，其中所述的细胞核进入性多肽包括 胸腺素(34。
5. 根据权利要求1的组合物，其中所述的多肽包括胸腺素(34的 N-末端片段。
6. 根据权利要求1的组合物，其中连接到所述活性剂上的所述细 胞核进入性多肽存在于药学可接受载体中。
7. 根据权利要求6的组合物，其中连接到所述活性剂上的所述细 胞核进入性多肽在所述载体中的浓度为所述载体重量的大约 0.0001~10wt%。
8. 递送生理活性剂进入细胞核的方法，其包括将权利要求1的组 合物施用至所述细胞核。
9. 根据权利要求8的方法，其包括对哺乳动物受试者施用所述组 合物。
10. 根据权利要求9的方法，其包括将所述受试者的组织与所述组 合物接触。
11. 根据权利要求8的方法，其中所述的生理活性剂包括药物、化 学治疗剂或核酸序列。
12. 根据权利要求8的方法，其中所述的细胞核进入性多肽包括氨 基酸序列LKKTET或氨基酸序列KSKLKK。
13. 根据权利要求8的方法，其中所述的细胞核进入性多肽包括胸 腺素(34。
14. 根据权利要求8的方法，其中所述的多肽包括胸腺素P4的N-末端片段。
15. 根据权利要求8的方法，其中连接到所述活性剂上的所述细胞 核进入性多肽存在于药学可接受载体中。
16. 根据权利要求15的方法，其中连接到所述活性剂上的所述细胞 核进入性多肽在所述载体中的浓度为所述载体重量的大约 0.0001-10wt%。
17. 根据权利要求4的组合物，其中所述的生理活性剂连接到所述 胸腺素(34的N-末端部分上。
18. 根据权利要求5的组合物，其中所述的生理活性剂连接到所述 N-末端片段的N-末端部分上。
19. 根据权利要求13的方法，其中所述的生理活性剂连接到所述胸 腺素(34的N-末端部分上。
20. 根据权利要求14的方法，其中所述的生理活性剂连接到所述 N-末端片段的N-末端部分上。
全文摘要
根据本发明，进入细胞核的药物学可接受组合物包括细胞核进入性多肽(nucleus-entering polypeptide)，该多肽包括氨基酸序列LKKTET、氨基酸序列LKKTNT或氨基酸序列KSKLKK，或者其保守变异体中的至少一种，所述多肽连接到在所述细胞核内具有治疗性或诊断性应用中至少一种应用的生理活性剂。
文档编号A61K38/00GK101184498SQ200580049898
公开日2008年5月21日 申请日期2005年10月3日 优先权日2005年5月27日
发明者埃瓦尔德·汉纳佩尔, 大卫·克罗克福德, 托马斯·赫夫, 阿兰·L.·戈尔茨坦 申请人:雷金纳克斯生物制药公司;埃朗根-纽伦堡弗里德里希·亚历山大大学