专利名称：Ed的制作方法
本申请是2003年3月7日提交的题为“EDb-纤粘连蛋白结构域(II)的受体”的中国专利申请01815346.1的分案申请。
本发明涉及特异性结合EDb-纤粘连蛋白结构域的蛋白质。
纤粘连蛋白是一类重要的基质-糖蛋白质，其主要作用在于可附着在细胞的各种不同的胞外基质上。纤粘连蛋白在培养基中非转化细胞表面的存在以及其在转化细胞表面的缺失导致识别纤粘连蛋白的重要粘附蛋白质。它们与众多不同种类的其它分子相互作用，例如胶原蛋白、硫酸肝素(肝素)-蛋白聚糖和血纤蛋白，并因此调节细胞的形状和形成细胞骨架。此外它们负责胚胎发生过程中的细胞迁移和细胞分化。另外，它们对伤口愈合很重要，这其中它们使巨噬细胞和其它免疫细胞迁移到伤口区域成为可能并通过使血小板粘附在血管的受伤区域以形成血块。
纤粘连蛋白是两个类似多肽的二聚体，其中每条链约60-70nm长。到目前至少已识别了20种不同的纤粘连蛋白链，所有这些都是通过单个纤粘连蛋白基因RNA-转录的交替接合产生的。纤粘连蛋白的蛋白水解分析表明所述多肽由六条强烈折叠的结构域构成，其中每个结构域又包含所谓的重复序列，根据其氨基酸序列的相似性将其分成三类(第I、II、III类)。二聚体两条链的中心区域由所谓的第III类重复的片断组成，其平均为90个氨基酸长(Kornblihtt，A.R.，Viobe-Pedersen，K.和Baralle，F.E.，1983.对人和牛纤粘连蛋白的cDNA。Proc Natl Acad Sci USA，80，3218-22)。结构研究显示每一第III类的重复由七条β链构成，其折叠成两个反平行的折叠层，其中短的环区域暴露成为潜在的蛋白质-蛋白质相互作用点(Leahy，D.J.；Hendrickson，W.A.；Aukhil，I.和Erickson，H.P.，1992。通过硒蛋氨酸蛋白质MAD分析定相结合腕蛋白纤粘连蛋白第III类结构域的结构。Science，258，987-91)。第III类的这种重复使纤粘连蛋白可能作为与细胞表面分子，所谓的“整联蛋白”相互作用的粘附分子起作用。术语“整联蛋白”于1987年第一次用于综述文章(Hynes，R.O.，1987，细胞48，549-550)以描述杂二聚的细胞表面分子的相关基团，其作为胞外基质和胞内细胞骨架之间的信使起作用并因此引起细胞粘附和迁移。这些杂二聚受体以特异性地细胞功能“结合”或调节来自胞外环境的信号。至今已知17个β-亚单元可与超过20个α-亚单元特异性和非共价地相互作用，以形成超过20个不同的族(Plow，E.F.等2000，J Biol Chem，275，21785-21788)。发现于纤粘连蛋白第III类的第10个重复的序列(III-10)RGDS特别调节纤粘连蛋白与至少8种不同的整联蛋白的相互作用。而且，已表明至少四种整联蛋白可与纤粘连蛋白以RGDS-非依赖性的方式特异性地相互作用(Plow，E.F.等，2000，J Biol Chem，275，21785-21788)。除了III7-、III8-、III9-和III10序列外，第III类的重复序列还包含重复的EIIIB和EIIIA(EDb和EDa)。目前，还不理解或只在很小程度上理解这两种重复序列的功能。Jarnagin，W.等(Jarnagin，W.；Rockey，D.；Koteliansky，V.；Wang，S.和Bissell，D.1994，在伤口愈合中变体纤粘连蛋白的表达在小鼠肝纤维发生中EIIIA片断的细胞源和生物活性。J Cell Biol，127，2037-48)的研究建议EDa结构域参与了对肝脏损伤的早期反应，此外所述EDa结构域似乎参与了细胞粘附过程的介导。不能在正常成年组织中发现含有EDb序列(EDb-FN或ED-B或EDB)的纤粘连蛋白异构体，但这表明在胎儿组织以及肿瘤组织中的强表达，就象伤口愈合过程一样。
在肿瘤的发展中，其中长肿瘤的组织的胞外基质通过已存在的基质成分的蛋白降解而介导，由此产生了肿瘤引起的胞外基质，其与正常组织的胞外基质不同，给肿瘤生长提供了更适宜的环境并促进了血管生成。血管生成是肿瘤生长的一个最重要的过程并涉及由已有的内皮包被的血管形成新血管的过程。血管生成是一个侵入过程，其需要在新毛细血管中内皮细胞的胞外基质的蛋白水解、增殖、定向迁移和分化，这使肿瘤的生长超过一定的大小。
EDb纤粘连蛋白一直与肿瘤生长相关。另外，在血管生成过程中EDb-FN在新血管周围浓集并因此提供了一个血管生成标记物(Castellani，P.；Viale，G.；Dorcaratto，A.；Nicolo，G.；Kaczmarek，J.；Querze，G.；Zardi，L.(1994)Int.J.Cancer 59612-618)。
EDb结构域是第III类的重复序列，其含有91个氨基酸并且大鼠和鸡纤粘连蛋白之间具有特别高的序列同源性，该同源性为96％-100％。在该结构域中不存在RGDS序列或其它氨基酸序列，由此可知它们介导与整联蛋白的相互作用。ED-B结构域的这一具体功能至今还是未知的。已出版了三篇对与各种细胞的粘附/细胞繁殖有关的一般促进功能的推测的文章。
Chen和Culp(1996)，Exp.Cell Res.223，9-19表明细胞纤粘连蛋白包含EDb结构域和邻近的第III类重复序列作为可能的促进粘附序列，其可由细胞通过纤粘连蛋白初始转录的交替接合进行调节。
近期的研究(Chen和Culp，1998，Clin.Exp.Metast.，16，1，30-42)表明EDb诱导细胞信号活动，导致病灶粘连蛋白质的酪氨酸磷酸化，并且具有与发现整联蛋白的重复序列III8-9-10介导的机制不同的机制。越来越证实，细胞粘附到胞外基质或其它细胞上是重要的细胞信号来源，其负责调节许多现象，例如细胞生长、细胞分化和细胞转变。粘附引起的信号包括蛋白质-酪氨酸-激酶的活化和不同信号分子的酪氨酸-磷酸化级联。上述文章的作者指出，对于该信号过程，125kDa的病灶粘连激酶(FAK)起重要作用，它和细胞与基质蛋白质相互作用以活化分子内信号分子有关，信号分子如Src(Xing，Z.；Chen，H.C.；Nowlen，J.K.；Taylor，S.J.；Shalloway，D.，and Guan，J.L.，1994，v-Src与通过Src SH2结构域介导的病灶粘连激酶的直接相互作用，Mol BiolCell.5，413-21)，Grb2(Schlaepfer，D.D.；Hanks，S.K.，Hunter，T.and van derGeer，P.，1994，与通过GRB2结合病灶粘连激酶的Ras通路相关的整联蛋白介导的信号传导，Nature，372，768-91)和PI-3-激酶(Chen，H.C.and Guan，J.L.，1994，病灶粘连激酶与其潜在底物磷脂酰肌醇3-激酶的结合，Proc Natl AcadSci USA，91，10148-52)。虽然至今没有说明其具体功能，但从另一病灶粘连蛋白质p130cas也推定它与粘附介导的信号活动和特异性的肿瘤活动有关。(Sakai，R.；Iwamatsu，A.；Hirano，N.，et al.1994，一种新的信号分子，p130，在体内与v-Crk和c-Src以酪氨酸磷酸化-依赖方式形成稳定的配合物。EMBO J.13，3748-56；Petch，L.A.；Bockholt，S.M.，Bouton，A.，Parsons，J.T.and Burridge，K.，1995，粘附诱导的p130 SRC底物酪氨酸磷酸化，J Cell Sci，108，1371-9；Polte，T.R.和Hanks，S.K.，1995，病灶粘连激酶和Crk-相关的酪氨酸激酶底物p130Cas之间的相互作用，Proc Natl Acad Sci USA，92，10678-82)。
Chen和Culp的研究(1998，aaO)表明单重复的蛋白质EDb比邻近的重复III8等大大地促进了BALB/c 3T3细胞的繁殖以及促进了FAK-酪氨酸磷酸化的诱导。这形成了这样的假定，在细胞纤粘连蛋白的生理浓度下来自III10的四肽RGDS与整联蛋白的结合可能产生了对细胞粘附强度不足的信号，因此没有来自III10和整联蛋白之间相互作用介导的机制产生的酪氨酸-磷酸化应答。进一步假定，与各种介导的细胞粘附的应答不同是由于各种小GTP结合蛋白质的活化不同产生的。这些蛋白质中的三种，cdc42、rac和rho，它们都是ras超家族的成员，在细胞形态变化中起重要作用。从序列上cdc42在rac的上游并直接诱导丝状假足的出现(Nobes，C.D.和Hall，A.，1995，Rho，rac和cdc42 GTPa-ses调节与肌动蛋白应激纤维、层形足板和丝状假足有关多分子病灶复合物的结合，Cell.81，53-62)。然后，rac的活化负责层形足板和丝状假足之间的肌动蛋白丝极的网络的形成。再往下游，rho可被rac活化并诱导病灶粘连和肌动蛋白应激纤维。所有这些活动取决于酪氨酸激酶活化并且由FAK推定它参加到该过程中。Chen和Culp提出假定，即经7-EDb-8粘附的细胞以及经8-9-10粘附的细胞间的形态差异是由于小GTP-结合蛋白质的活化不同，由此推断通过8-9-10粘附经整联蛋白介导的信号途径最终导致rho活化，以引起病灶粘连和肌动蛋白应激纤维，BALB/c-3T3细胞经7-EDb-8的粘附只导致cdc42蛋白质和rac蛋白质的活化，但不活化rho。但以上推测的两项研究都没有给出数据。
另一项研究(Hashimoto-Uoshima等，1997，J.Cell Sci.110，2271-2280)表明，包含EDb-纤粘连蛋白结构域的纤粘连蛋白片断的存在促进培养的成纤维细胞的细胞粘附，由此推断接合的EDb的情况下，包含Eda的片断抑制了在细胞中良好病灶粘附的形成。基于此，该研究的作者推测，在纤粘连蛋白分子中包含两个结构域可产生抑制机制，通过这种机制，细胞粘附达到使移动的过程更容易的程度，其中粘附和失去粘附需要细胞的运动。
对鸡胚胎和成年小鼠的研究表明，EDb-介导的血管生成可以通过抑制内皮细胞整联蛋白α3β1阻断(Renato等，AACR 2001，LB-60)。
然而，上述研究任何一个都没有得出对EDb结构域功能的清楚的回答。识别EDb结构域的可能受体的陈述仍在不断进行。
因此，本发明目的是进一步澄清EDb结构域的功能。本发明的另一个目的是识别EDb结构域的可能的特异性受体。本发明的再一个目的是澄清EDb-特异性粘附机制和与受体分子的相互作用，在该过程中可能涉及血管生成。另外，本发明的目的是识别EDb的特异性结合部位。
本发明目的通过一种蛋白质实现，a)其能够特异性地结合EDb-纤粘连蛋白结构域；b)其在内皮细胞中特异性地表达或活化；c)其在肿瘤基质细胞中特异性地表达或活化；d)其在肿瘤细胞中特异性地表达或活化；e)其与EDb-纤粘连蛋白结构域的结合被多肽抑制；以及f)其表观平均分子量，对于轻链为120-130kDa，对于重链为150-160kDa，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定。
尤其优选一种蛋白质，a)其能够特异性地结合EDb-纤粘连蛋白结构域，其中的结合部位通过至少一种选自SEQ ID NO1-3的序列表征；b)其在内皮细胞中特异性地表达或活化；c)其在肿瘤基质细胞中特异性地表达或活化；d)其在肿瘤细胞中特异性地表达或活化；e)其与EDb-纤粘连蛋白结构域的结合被多肽抑制，所述多肽包含选自SEQID NO1-3的序列；以及f)其表观平均分子量，对于轻链为120-130kDa，对于重链为150-160kDa，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定。
最优选为一种蛋白质，a)其能够特异性地结合EDb-纤粘连蛋白结构域，并且它包含整联蛋白的α2β1链；b)其在内皮细胞中特异性地表达或活化；
c)其在肿瘤基质细胞中特异性地表达或活化；d)其在肿瘤细胞中特异性地表达或活化；e)其与EDb-纤粘连蛋白结构域的结合被多肽抑制，并且它包含整联蛋白的α链；以及f)其表观平均分子量，对于轻链为120-130kDa，对于重链为150-160kDa，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定。
在一个优选的实施方案中，所述内皮细胞是增殖内皮细胞。
在一个优选的实施方案中，所述基质细胞是肿瘤基质细胞。
此外，这一目的通过一种蛋白质达到，其与EDb-纤粘连蛋白结构域的特异性结合调节内皮细胞、瘤基质细胞和肿瘤细胞的粘附。这里的结合部位可通过至少一种选自SEQ ID NO1-3的序列并且尤其是包含整联蛋白的α2β1链的序列表征。
该目的也可以通过一种蛋白质达到，其与EDb-纤粘连蛋白结构域的特异性结合诱导内皮细胞的增殖。这里的结合部位可通过至少一种选自SEQ IDNO1-3的序列并且尤其是包含整联蛋白的α2β1链的序列表征。
此外，该目的通过一种蛋白质达到，其与EDb-纤粘连蛋白结构域的特异性结合诱导胶原蛋白基质中内皮细胞的增殖、迁移和分化，其中的结合部位通过至少一种序列表征。这里的结合部位可通过至少一种选自SEQ IDNO1-3的序列并且尤其是包含整联蛋白的α2β1链的序列表征。
另外，该目的通过一种蛋白质达到，该蛋白质与EDb-纤粘连蛋白结构域结合并引起特异性信号传导通道，其中至少诱导一种基因，它编码选自下列的蛋白质病灶粘连激酶、CD6配体(ALCAM)、玻璃体结合蛋白受体的α链、结合的α8亚单元和follistatin相关蛋白质的前体。
这里的结合部位可通过至少一种选自SEQ ID NO1-3的序列并且尤其是包含整联蛋白的α2β1链的序列表征。
优选在特异性信号传导通道的诱导中，至少单倍诱导上述一种基因。对此，优选双倍诱导上述一种基因。
该目的也可通过一种能够结合本发明蛋白质的抗体达到。
此外，该目的也可通过一种能够结合本发明蛋白质的抗体达到，所述蛋白质包含选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，所述抗体能抑制EDb结构域的特异性作用。
优选所述结合和抑制在体外和/或体内进行。
在一个优选的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体或重组体。
在一个优选的实施方案中，所述抗体是scFv片断。
该目的还可通过表达本发明蛋白质的细胞达到。
另外，该目的还可通过表达本发明抗体的细胞达到。
此外，该目的通过表达本发明抗体的噬菌体达到。
该目的还可通过抑制筛选化合物的方法达到，所述化合物结合EDb-纤粘连蛋白结构域的受体，其中该方法包括比较在一种或多种这些化合物存在下的细胞应答与所述细胞在无这些化合物存在下细胞的对照应答，其中所述细胞表达本发明的蛋白质或含有编码该蛋白的核酸，和其中的应答或对照应答是通过EDb-纤粘连蛋白结构域的受体介导的。
在一个优选的实施方案中，所述应答或对照应答包括细胞粘附到被EDb-纤粘连蛋白结构域或其部分覆盖的表面。
在该方法的一个优选的实施方案中，EDb-纤粘连蛋白结构域达到结合部位包含序列SEQ ID NOS1-4或其部分。
优选所述应答或对照应答包括被EDb-纤粘连蛋白结构域或其部分覆盖的表面上的细胞的增殖。
在一个优选的实施方案中，所述应答或对照应答包括在胶原蛋白基质中内皮细胞的增殖、迁移和分化，其被EDb-纤粘连蛋白结构域或其部分覆盖。
优选所述化合物选自抗体、抗体片断、人工抗体、肽类、低分子化合物、aptamers和Spiegelmers。
在一个优选的实施方案中，所述抗体是重组抗体。
优选所述抗体选自scFv和其片断。
所述目的也可以通过一种筛选与EDb-纤粘连蛋白结构域结合的化合物的方法达到，对此，该方法包括a)在不同浓度的一种或多种化合物存在下使细胞与固定浓度的蛋白质接触，所述蛋白包含EDb-纤粘连蛋白结构域或具有用SEQ ID NO1-4表示的序列之一的蛋白质；和b)检测在化合物存在下，细胞对包含EDb-纤粘连蛋白结构域或具有用SEQID NO1-4表示的序列之一的蛋白质的应答，与在无化合物存在下细胞对包含EDb-纤粘连蛋白结构域或具有用SEQ ID NO1-4表示的序列之一的蛋白质的对照应答的不同，其中所述细胞表达本发明的蛋白质或含有编码该蛋白的核酸，和其中的应答或对照应答是通过EDb-纤粘连蛋白结构域的受体介导的。
对此，优选所述应答和对照应答包括细胞粘附到被EDb-纤粘连蛋白结构域或其部分覆盖的表面上。
单克隆抗体用杂交技术的标准方法制备并通过免疫组织学在人类肿瘤-低温断面上表征(见附
图13)。
顺便举例为AK AM-EDBr-2(鼠IgG 1/κ)在一个优选的实施方案中，所述应答和对照应答包括细胞在被EDb-纤粘连蛋白结构域或其部分覆盖的表面上的增殖。
在另一个优选的实施方案中，所述应答和对照应答包括在胶原蛋白基质中内皮细胞的增殖、迁移和分化，其与EDb-纤粘连蛋白结构域或其部分混合。
优选所述化合物选自抗体、人工抗体、抗体片断、肽类、低分子化合物、aptamers和Spiegelmers。
另外，所述目的通过应用编码蛋白质的核酸筛选与EDb-纤粘连蛋白结构域的受体或EDb-纤粘连蛋白结构域结合达到，所述蛋白质包含选自SEQ IDNO1-4的序列。
所述目的也可通过应用本发明的蛋白质或本发明的抗体筛选与EDb-纤粘连蛋白结构域的受体或EDb-纤粘连蛋白结构域结合达到。
所述目的也可通过应用本发明的细胞筛选与EDb-纤粘连蛋白结构域的受体或EDb-纤粘连蛋白结构域结合达到。
所述目的也可通过应用编码包含选自SEQ ID NO1-4序列的蛋白质的核酸以开发用于诊断和治疗目的抗体或scFv-融合蛋白质而达到。
所述目的也可通过应用本发明的蛋白质以开发用于诊断和治疗目的抗体或scFv-融合蛋白质而达到。治疗目的特别是指用特异性抑制EDb和所述受体相互作用的化合物的抗血管生成治疗。其中，所述抗体既针对所述受体又针对EDb，对此应用序列SEQ ID NO1-3的肽类和其稳定化的衍生物以及低分子化合物。
所述目的也可通过应用本发明的细胞以开发用于诊断和治疗目的抗体或scFv-融合蛋白质而达到。
所述目的也可通过应用本发明的噬菌体以开发用于诊断和治疗目的抗体或scFv-融合蛋白质而达到。
所述目的也可通过包含选自SEQ ID NO1-4序列的蛋白质用于pro-angiogenic治疗的用途而达到。
所述目的也可通过包含选自SEQ ID NO1-4序列的蛋白质用于诊断目的的应用而达到。
所述目的也可通过包含选自SEQ ID NO1-4序列的蛋白质用于基因治疗目的的用途而达到。
所述目的也可通过包含选自SEQ ID NO14序列的蛋白质用于覆盖结合内皮细胞的表面的应用而达到。
其中，优选所述覆盖在体外或体内进行。
所述目的也可通过在细胞培养基中应用包含选自SEQ ID NO1-4序列的蛋白质而达到。
所述目的也可通过应用包含选自SEQ ID NO1-4序列的蛋白质与至少一种移植体而达到。
对此，优选所述移植体选自血管、皮肤、角膜、肾脏、肝脏、骨髓、心脏、肺、骨、胸腺、小肠、胰脏、其它内部器官及其部分或细胞。
所述目的也可通过应用包含选自SEQ ID NO1-4序列的蛋白质与至少一种植入物而达到。
对此，优选所述植入物选自肺植入物、人工起博器、人工心脏瓣膜、血管植入物、内涵管、螺丝、薄片、板、丝、针、柱、人造关节、乳房植入物、人工颅板、假牙、牙齿填充物和牙桥。
“对EDb-纤粘连蛋白结构域特异性的作用”定义为由EDb-纤粘连蛋白结构域，而不是由EIII7、EIII8等产生的所有这种作用。一种这类作用例如描述在Chen等，1998(aaO)中，即多种胞内蛋白质的快速酪氨酸-磷酸化作用，不同于由结构域EIII8-9-10介导的粘附后更慢的磷酸化。“低分子化合物”定义为相对分子量低于约1000-1200所有化合物。“Aptameren”定义为构建形成核酸的分子，所述分子可作为大量生物分子的高特异性的配体。“前血管生成治疗”是指血管生成需要的各种治疗形式。“抗血管生成处理/治疗”是指以抑制血管生成为目的的任何处理/治疗方式。“基因治疗”是指在生病情况下，以消除基因引起的功能失调或重新形成正常基因功能为目的的任何治疗方式，消除或提供蛋白质影响所述疾病。这可包括将外源DNA引入体细胞中，但不应限于此。“细胞培养物”是指细胞培养介质和细胞培养器。所述细胞培养优选选自细胞培养瓶、细胞培养盘、细胞培养盆、细胞培养板、微滴定板、96-孔板、细胞培养瓶和生物反应器。
“诊断目的”判断有机体/器官/细胞的状态或将有机体/器官/细胞当前的状态分为特定状态类型(例如，一种特定疾病)的所有目的，例如，这可应用试剂盒/化学试剂/测量设备，以确定物理数值，例如温度等，或化学数值，例如浓度等，但不应理解为对此的限制。
“治疗目的”是改善或治愈有机体/器官/细胞疾病状态的所有目的。术语“一起应用蛋白质和植入体”是指时间或空间上相同的应用。例如，在“植入”体内的情况下，可将蛋白质分子固定到植入体上，或者可将它空间上与植入体分离，但与植入体同时“植入”(注射等)。
现在通过下列实施例和附图对本发明进行详细描述。其中图1表示在该研究中所用的第III类重复序列；图2表示在EDb-纤粘连蛋白结构域(ED-B)对内皮细胞或人类基质细胞影响的情况下不同基质的增殖试验结果；图3表示在ED-B影响下内皮细胞的分裂试验(试管形成试验)结果；图4表示粘附试验，其中内皮细胞粘附在用ED-B覆盖的表面上；图5表示类似于图4的试验结果，不同的是所述细胞与各种合成肽一起预培养，所述肽的序列是EDb-纤粘连蛋白结构域的部分序列；图6表示在图5中所用的来自EDb-纤粘连蛋白结构域合成肽的部分序列；图7表示内皮细胞在各种合成的ED-B肽上的粘附结果；图8表示在ED-B的肽主链的模型结构中在图6-7中确定的合成肽的状态；图9表示在分裂试验(试管形成试验)中，EDb-纤粘连蛋白结构域和衍生于环5的肽(SEQ ID NO2)对毛细样结构的作用；图10表示在应用Fn-7-8-9或Fn-7-B-8-9的情况下，表面标记的人类皮肤内皮细胞裂解液的两次亲和性色谱运行的结果；图11表示在应用Fn-7-8-9或Fn-7-B-8-9的情况下，表面标记的人类皮肤基质细胞裂解液的两次亲和性色谱运行的结果；图12表示EDbB受体的亲和性色谱纯化；图13表示免疫组织学表征的人类肿瘤冷切片。
图1表示在该研究中应用的各种重组体纤粘连蛋白片断，其具有带不同的第III类重复序列的不同结构域结构。对此，Fn-7-B-8-9包含纤粘连蛋白结构域7，EDb包含8和9，Fn-7-8-9包含结构域7、8和9，ED-B包含结构域EDb，FN-10包含结构域10，以及Fn-6包含结构域6。这些蛋白质被在大肠杆菌中表达为具有His标记的不同蛋白质并在镍-螯合物-琼脂糖柱上纯化。在该研究中用的数字标记相应于在文献中所应用的。对此，缩写FN-B、ED-B、EDB和EDb都涉及EDb-纤粘连蛋白结构域并被看作同类物质。
图2表示增殖试验的结果，其中测定了EDb-纤粘连蛋白结构域(ED-B)对内皮细胞(EC)的增殖或基质细胞(SC)的作用。在96孔板中按每孔1000个细胞培养，在增殖试验过程中将溶解的ED-B(10μg/l)加到介质中，三天后用MTS试验确定细胞数，细胞的增殖通过碱性纤粘连蛋白生长因子(bFGF)诱导。这表明，在无bFGF的情况下ED-B无作用，同样在细胞中在bFGF存在下，没有检测到对第III类纤粘连蛋白结构域10的作用(数据没有给出)。ED-B对人类内皮细胞增殖的作用可以在平铺到明胶(EC/明胶)上的细胞中确定，在平铺到胶原蛋白(EC/胶原蛋白)上的细胞中也是同样，但其中后者的作用不如平铺到明胶上明显。在人类基质细胞平铺在明胶(SC/明胶)上的情况下，即使在无bFGF存在下也发生增殖，其明显超过了用人类内皮细胞的情况。加入bFGF或bFGF+ED-B不能使其增加，在490nm下测定消光作为细胞数的量度。
对于增殖试验，按照下列试验方法进行材料96-孔板(平底)，Nunc介质MCDB131，Pen/Strep，两性霉素(0.25μg/ml)，肝素(20μg/ml)，热灭活的FCS(5％)方法将细胞，每孔500-1000个(96-孔板)于100μl中，在介质中与bFGF(1-3ng/ml)或VEGF(30-50ng/ml)培养3天，对于每一批次，通过滴定测定其准确量最佳的是达到最多增殖刺激的最小浓度。在试验前不必对细胞进行同步化，但可以做。3天后，用按照制造商的说明用MTS试剂盒(Promega)测定细胞数。建议在多个时间点测定吸收，以得到线性区域的最大吸收(0.5；1；2；4小时)。
对照阴性对照，无分裂素(无增殖)(-bFGF/VEGF)阳性对照，含分裂素(最大刺激)(+bFGF/VEGF)图3表示ED-B对来自球状体的内皮细胞分裂的作用。对此将HUVEC(人类脐静脉内皮细胞)-球状体埋入胶原蛋白中并通过加入10μg/ml bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)在无或有6μg/ml ED-B存在下诱导分裂。试验表明单独加入bFGF诱导分裂，然后通过加入ED-B可进一步刺激(+bFGF+ED-B)。
对于分裂试验(试管形成试验)应用下述试验方法材料甲基纤维素，高粘度(Sigma)用于细胞培养的胰蛋白酶/EDTA(Gibco)圆底96-孔板(Greiner#650185)重组体bFGF(Gibco#13256-029)重组体VEGF(R&D System)抗-大鼠-CD31(RDI#RDI-CD31TLD)肝素(Gibco#15077-027)溶液PBS/抗生素细胞培养-PBS，10×Pen/Strep，2.5μg/ml两性霉素1％明胶(Difco，压热并冷却后与Pen/Strep和两性霉素(0.25μg/ml)混合介质MCDB131，谷氨酰胺，Pen/Strep，两性霉素(0.25μg/ml)，肝素(20μg/ml)，热灭活的FCS(10％)生长介质含有2ng/ml bFGF和10ng/ml VEGF的介质细胞HUVECDermal MVEC(传代＞4)方法将内皮细胞溶于胰蛋白酶/EDTA中并在含有0.24％甲基纤维素的介质中稀释至5000细胞/ml。向Greiner板中每孔加入200μl(1000个细胞)并培养过夜。用除去尖端的1ml移液管收获圆的细胞簇(球状体)并离心。将球状体重悬于1.2％甲基纤维素/FCS中并与中和的胶原蛋白混合。将EDb和bFGF共聚。
如从图中可明显看出，加入ED-B分裂的提高明显超出bFGF-诱导的值。
图4表示内皮细胞在被ED-B覆盖的微孔滴定板上的粘附试验的结果。对此，将得自其原始培养瓶的内皮细胞通过胰蛋白酶(胰蛋白酶/EDTA)作用溶于其基质中，然后在覆盖不同浓度(0、1、2、3、5、10、20、40μg/ml)ED-B的微孔滴定板上培养并使其粘附1小时。覆盖1mg/ml BSA(牛血清蛋白)的孔作为阴性对照；减去在BSA上的粘附(＜10％)。
用结晶紫染色定量粘附，然后用SDS溶解。该量化通过测量595nm的消光进行定量。图形中水平表示的线在A595nm≈1.06时表示与血浆-纤粘连蛋白100％的粘附。
这一试验的结果表明，细胞粘附到覆盖ED-B的表面上，这容易理解为细胞表面上有ED-B受体。
下列实验当地用于附着/粘附试验溶液1％BSA(Sigma，乙醇沉淀)2％血清在PBS中(或胰蛋白酶中和溶液)介质MCDB131，Pen/Strep，两性霉素(0.25μg/ml)，肝素(20μg/ml)，0.1％BSA(Sigma，乙醇沉淀)0.1％结晶紫，2％戊二醛在PBS中，过滤灭菌2％SDS方法37℃下，用蛋白质覆盖96-孔板(Nunc)的孔1小时。在小蛋白质(＜20kDa)或肽类的情况下，建议使其在板上干燥(在无菌条件下无盖过夜)。然后用在37℃.下用1％BSA饱和所述孔1小时，用1×胰蛋白酶溶解细胞，用2％的血清洗涤使胰蛋白酶失活，并重新悬浮于介质中。如果要测试抗体或肽类，在37℃.下将其与细胞一起在悬浮液中预培养30分钟。在37℃.下，每孔(96-孔板)在50-100μl体积中培养104细胞1小时，小心倾倒出上清液，将所述板倒扣到一张纸巾上1分钟以使液滴滴下并用结晶紫细胞/戊二醛染色粘附的细胞15分钟并固定。用PBS洗涤所述孔三次，然后加入2％SDS(振摇15分钟)将细胞溶解。在595nm下测定吸收，用水洗涤三次后，如果需要，可将细胞重新染色。
对照阴性对照空孔(BSA对照)
阳性对照血浆-纤粘连蛋白(2.5μg/ml)％粘附＝A595(样品)100×A595(纤粘连蛋白)图5表示类似于图4的试验结果，但粘附于用ED-B覆盖的微滴定孔前，将内皮细胞与250μM的各种合成肽类预培养，所述肽的序列是EDb-纤粘连蛋白结构域的部分序列。通过在595nm(A595)测定消光测定粘附。在该图示中表示的肽的名称详细列于图6中。对此，肽序列No.043相对于SEQ ID NO1表示的序列，肽序列No.553相对于SEQ ID NO2表示的序列，肽序列No.038相对于SEQ ID NO3表示的序列。高A595值相当于不抑制的粘附，而低A595值相当于相应的肽抑制粘附。
按照对于图4描述的方法。
图6表示具有所选序列名称的合成的ED-B肽类的部分序列，该序列除去了EDb-纤粘连蛋白结构域的总序列。其中使用了单字母编码表示氨基酸。
图7表示类似于图5的试验的试验结果，但在这里，所述微滴定孔板不用EDb-纤粘连蛋白结构域覆盖，而是与在图5试验中证明抑制的肽类预培养，或者与在图5试验中证明不抑制的肽类预培养。对此，通过测得的A595值表明在该试验中，在用一种抑制肽覆盖的情况下，细胞粘附，而由图5证明不抑制的肽不引起粘附。
按照对于图4描述的方法。
图8表示EDb-纤粘连蛋白结构域(ED-B)的模型结构，其中表示了抑制肽No.1(＝SEQ ID NO1)、No.2(＝SEQ ID NO2)和No.3(＝SEQ ID NO3)的位置。它表明这些抑制肽类处于ED-B结构的环1或环5，并由此识别了所述结构域的结合细胞的区域或者与细胞上的受体结合的区域。表示于图8中的该ED-B结构域的模型结构基于已确定的第III类纤粘连蛋白结构域7的结构。N-T和C-T表示N端或C-端。
图9显示下述试验的结果，其中加入ED-B和先前确定为抑制的肽No.2，以及加入第III类纤粘连蛋白结构域6对在Sprieβ试验诱导毛细样结构(管形成)的作用。该结果表明，通过基本的bFGF-诱导的渗入到胶原蛋白凝胶中，通过粘附抑制肽SEQ ID NO2产生最大作用。该肽也对内皮细胞向胶原蛋白凝胶中渗入有刺激作用。因此，该肽相当于EDb的结合部位并类似于EDb本身刺激内皮细胞向胶原蛋白凝胶中渗入。
按照对于图3描述的方法。
图10表示表面标记的人类皮肤细胞裂解物的亲和性色谱的结果。对此，用去污剂将表面生物素化的增殖内皮细胞溶解并进行亲和性色谱，其中具有或不具有插入的EDb-纤粘连蛋白结构域(具有EDb-纤粘连蛋白结构域＝Fn-7-B-8-9，不具有EDb-纤粘连蛋白结构域＝Fn-7-8-9)的纤粘连蛋白的短片断与琼脂糖偶合。可以看出，具有表观分子量为120-130kDa的生物素化的蛋白质特异性地结合到含有ED-B的片断上(见箭头)。用EDTA洗脱，收集下述的几个级分，对这些级分进行SDS-PAGE并用蛋白质印迹、抗生蛋白链菌素过氧化物酶和化学发光(ECL)进行研究。痕迹1和5表示预洗脱级分，而痕迹2、3、4或6、7、8表示洗脱的级分1、2和3。痕迹1-4表示用Fn-7-8-9的色谱，而痕迹5-8表示用Fn-7-B-8-9的色谱。这类表示的结果明显地表明具有分子量为120-130kDa的主要带是一种特异性结合到含EDb纤粘连蛋白片断上的蛋白质，因此是EDb-纤粘连蛋白结构域的受体。
对于内皮细胞的生物素化和溶解，按照下列实验方法进行材料生物素酰氨基己酸-3-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯；Sigma PBS w/o Mg/Ca(Dulbecco)HEPES-缓冲液20mM HEPES，pH7.6，1mM CaCl2，1μM MgCl2，0.1％ NaN3，1％ CHAPS(V/V)和Boehringer完全Mini蛋白酶抑制剂，不含EDTA，Cocktail片方法在生物素化前和后各用PBS w/Ca+Mg洗涤细胞培养瓶三次。在最后一次洗涤前准备生物素缓冲液(1mg/15ml PBS)，在每一瓶底的中间通过移液管慢慢加入5ml该缓冲液(对于225cm2)或12.5ml(对于500cm2盘)，使其体积在摇动下能够分布到整个瓶底。然后将第一个培养瓶用裂解缓冲液体积的一半进行处理，该缓冲液也通过移液管加到瓶底的中心并分布到整个表面，然后用细胞刮刀将细胞刮下，然后将第一培养瓶的全部体积通过移液管加到第二瓶中，在第二瓶中重复该过程。在最后一瓶后将该体积转移至50ml锥形离心管中，用另一半裂解缓冲液在所有培养瓶中重复该过程(不用细胞刮刀)并同样将最终的体积转移至离心管中。在50ml锥形细胞培养管中于3000转/分钟在室温下离心5分钟(Heraeus台式离心机)。移出裂解液并且理想的是尽快用于亲和色谱(但在紧急情况下也可在-80℃.冷冻)。
对于蛋白质和琼脂糖的共价偶合，选择下列过程材料活化的CH琼脂糖4B Pharmacia Biotech，Code No.17-0490-011mmol HCl，2.2％ NaHCO3方法将HCl用冰浴冷却，使琼脂糖温热至室温。
然后用1mmol HCl洗涤琼脂糖，每ml琼脂糖需要10ml HCl，然后将该琼脂糖慢慢滴到预冷却的小管中，然后膨胀约15分钟(1g琼脂糖相当于3ml膨胀的琼脂糖)，然后将该管于800转/分钟下离心1分钟。移出上清液并弃掉。
重复该过程三次。
洗涤三次后，再加入盐酸，摇动该小管并在800转/分钟下离心3-5分钟。吸出上清液，将团丸溶于20微孔过滤水中并转移至两个新离心管中(7-EDB-8-9琼脂糖和7-8-9琼脂糖各一管，即琼脂糖与具有重复III7、EDb、III8和III9或III7、III8和III9的多肽偶合)。尽快将这些管离心，吸出上清液，每ml琼脂糖可偶合1-5mg蛋白质。
(即，2mg蛋白质/ml琼脂糖7-8-92mg蛋白质/ml 7-EDB-8-9)通过振摇使小管混合，然后快速加入2.2％ NaHC3(50μl/ml凝胶)，由此中和残余的盐酸。将这些小管振摇并在台式摇摆振荡器的最大档上充分混合1-5小时。
然后重新离心。
为了测定用于与琼脂糖共价偶合的蛋白质的浓度，进行Bradford试验材料BSA储备液，2mg/mlBradford试剂方法如下述将BSA溶液加到Nunc-免疫板上(Maxi Sorp)5μg-4μg-3μg-2μg-1μg(80μl Vol.+20μl Assay)预稀释BSA5μg/50μl＝0.1mg/ml储备液2mg/ml，1∶20稀释到0.1mg/ml。
为了进行亲和性色谱或洗脱，选择下列步骤a)亲和性色谱材料活化的CH琼脂糖4B Pharmacia Biotech，Code No.17-0490-01缓冲液A(20mM HEPES，pH7.6，1mM CaCl2，1mM MgCl2，0.1％NaN3)缓冲液B(缓冲液A+150mmol NaCl+0.1％Chaps)缓冲液C(缓冲液A+0.1％Chaps)PH4-缓冲液(微孔过滤水+0.1％冰醋酸+0.1％Chaps)EDTA-缓冲液(缓冲液A+200mmol EDTA pH8.5+0.1％Chaps)方法首先将裂解液分三次加到柱上。
在柱下面放置收集液体的小管，用Eppendorf移液管将开始的2ml裂解液小心地加到柱上，其它的裂解液用测量移液管。注意柱是垂直放置的。如果该柱是第一次用，要在实际运行前用所有不含蛋白质的的缓冲液“干运行”。一根柱至多使用5次。
如果裂解液是冷冻的(-80℃.)，先在水浴上加热，然后离心(3000转/分钟离心5分钟)。
但是，新制裂解液优选总是先冷冻。
将500μl裂解液移液至Eppendorf瓶中。
这用于在色谱前或后研究裂解液。
如果使用两根柱(一根用于7-8-9琼脂糖，另一根用于7-B-8-9琼脂糖)，分别将各一半裂解液加到各自的柱上。两根柱的洗脱速率相同。如果不是这样，流速“慢”的柱子相应地晚结束。理想的洗脱速率为0.2-0.5ml/min。
如果裂解液分三次过柱，在混合之后同样将500μl加到Eppendorf瓶中，因此在此也进行研究。
然后，将各10倍柱体积的缓冲液B和缓冲液C加到柱上，然后完成洗涤程序。
b)洗脱预洗脱将缓冲液C加到柱上，由此可确定尽管进行了洗涤步骤是否有蛋白质仍保留在柱上。在Eppendorf瓶中收集500μl(用两根柱相应为2×500μl)。
EDTA-洗脱EDTA配合Ca和Mg离子，结果需要Ca和Mg结合的内皮细胞蛋白质被洗脱。将2×4ml EDTA-缓冲液加到柱上(或两根柱上)并在Falcon小管中收集两级分(E1和E2/BE1和BE2)，然后混合管中的洗脱液，并将5000μl移液到一个(或两个)Eppendorf瓶中。
pH4-洗脱缓冲液的实际pH为3.7。在中性pH范围(pH6-8)之外，会抑制所述受体与其蛋白质的结合。如在EDTA-洗脱中一样，在这里将2×4ml pH4-缓冲液加到柱上，收集两个级分并在每神情况下移取500μl(4.1和4.1/B4.1和B4.2)。
然后向柱上加三倍柱体积的缓冲液A，以洗出酸。最后一倍柱体积的缓冲液留在柱中，将柱关闭并保存在冰箱中。
将Eppendorf瓶中的500μl级分在-80℃.下冷冻至少15分钟并在“SpeedVac”中冷冻干燥。
用SDS-PAGE分离如此得到的级分或预洗脱级分并在还原条件下进行蛋白质印迹。
图11表示与图10相同的实验，例外的是在这里不是用裂解的内皮细胞，而是用裂解的基质细胞。在图11所示的蛋白质印迹中，痕迹1-3表示具有Fn-7-8-9的亲和性柱的洗脱级分，而痕迹4-6表示具有Fn-7-B-8-9的亲和性柱的洗脱级分。痕迹1和4是预洗脱因子(Faktor)，而痕迹2、3或5、6表示各洗脱的级分1和2。从图10可以看出，具有表观分子量120-130kDa的主要带在得自人类基质细胞的所述细胞裂解液中不能看到。
公开于上述描述、权利要求以及附图中的本发明的特征既可以独立，也可以任意结合以在其各种实施方案中实现本发明。
图12表示ED-B结合蛋白质，其通过所述亲和性色谱纯化并通过SDS-梯度凝胶电泳(4-12％)分离，剪下特异性浓集的双带(箭头)并通过质谱分析。
序列分析清楚地确定分离到的蛋白质为α2-β1-整联蛋白，其中占优势的深带相应于β1亚单元，浅带相应于α2亚单元。
这一发现说明，与EDB的结合主要是通过整联蛋白β1亚单元介导的。相应于研究的细胞类型，其它α亚单元(例如α2)也可与β1联合介导与EDB-FN的结合。
图13表示免疫组织学表征的人类肿瘤细胞切片，其中A肾癌细胞，箭头表示通过AK AM-EDBr-2特异性染色B同一制品的Close-upC肝细胞癌D黑素瘤(这里没有发现特异性染色)EDB-受体的分析从1D-凝胶上将所述带切下，用NH4HCO3溶液和乙腈洗涤、干燥并用胰蛋白酶将凝胶中的蛋白质水解。从凝胶洗脱到消化液中的肽类通过μC18柱浓缩并脱盐并用MALDI-质谱测定(＝消化的蛋白质的肽的质量的列表)。
用从每一凝胶带所得的肽质量进行数据库检索。在无明显检索结果的情况下，再对单独的肽进行MALDI-PSD-谱(片断谱)。该谱图直接用于确定预测的肽序列(识谱)，或者用这些谱图进行数据库检索。
所研究的带A带＝制品6的第1带制品5的第4带酸洗脱的第6带结果整联蛋白α2—参见数据库检索结果第4带—第1和第6带的谱图表示相同最增强的肽—第1带的肽的PSD-谱确认为整联蛋白α2的部分序列B带＝制品6的第2带制品5的第5带酸洗脱的第7带结果整联蛋白β1—参见数据库检索结果第5、7带—第2的谱图表示相同最增强的肽—数据检索与第2带的肽的PSD-谱确认为整联蛋白β1BSA—在所有三条带中都包含—通过数据库检索与PSD-谱和无数肽质量证明function expandlt(whichE1){whichE1.style.display=(whichE1.style.displa=="none") "":"none";}ProFound-检索结果简述 版本4.10.61997-2000ProteoMetricsA:hover{COLOR:red}togglelt(E1){whichlm=event.srcElement;if(E1.style.display=="none"){E1.style.display="";whichlm.src="/prowl/minus.gif';} else{whichlm.src="/prowl/minus.gif"; E1.style.display=="none";}}A:hover{COLOR:red}搜索20010208092948-0121-149234049162的候选蛋白[搜索到121056个序列]
注1.用不相配的质量再次搜索，点击符号。
2.将高度相似的蛋白序列置于同一行(IE用户点击“+”以扩展/收缩)。
输入简述日期和时间2001年2月8日星期四08:29:55UTC(搜索时间6.30秒)搜索代码EDB Fibronektin，Bande4数据库NCBInr[..\databases\nr]分类哺乳动物(mammals)蛋白分子量范围80-135kDa蛋白p1范围0.0-14.0搜索仅单个蛋白化学消化胰蛋白酶Max Missed Cut2修饰+C3H5ON@C(Partial);+O@M(Partial)电荷状态MH+肽分子量(Da，平均)公差(AVG)1.00ppm935.536 1007.504 1179.635 1222.729 1277.731 1307.689 1473.816 149.833肽分子量1510.835 1553.895 1567.768 1586.801 1638.888 1707.772 1819.830(Da，Monoisotopic) 1815.993 1915.959 1931.980 1947.990 1973.966 1993.998 2044.9682051.077 2068.095 2095.065 2150.093 2224.097 2283.137 2344.1152501.214 2705.123 2775.304 2872.336 2902.333 2932.502 3052.4243280.542公差(MON)50.00ppm肽的数量37ProteoMetrics’ProFound是基于洛克非勒大学的ProFound[搜索+传输时间＞＝6.33秒]function expandlt(whichE1){whichE1.style.display=(whichE1.style.display=="none") "":"none";}ProFound-检索结果简述 版本4.10.61997-2000ProteoMetricsA:hover{COLOR:red}togglelt(E1){whichlm=event.srcElement;if(E1.style.display=="none"){E1.style.display="";whichlm.src="/prowl/minus.gif';}else{whichlm.src="/prowl/minus.gif';E1.style.display=="none";}}A:hover{COLOR:red}搜索20010207110038-0035-149234049162的候选蛋白[搜索到121056个序列]
注1.用不相配的质量再次搜索，点击符号。
2.将高度相似的蛋白序列置于同一行(IE用户点击“+”以扩展/收缩)。
输入简述日期和时间2001年2月7日星期三10:00:44UTC(搜索时间5.91秒)搜索代码EDB Fibronektin，#0824，Bande5数据库NCBInr[..\databases\nr]分类哺乳动物(mammals)蛋白分子量范围80-100kDa蛋白pI范围0.0-14.0搜索仅单个蛋白化学消化胰蛋白酶Max Missed Cut2修饰+C3H5ON@C(Partial);+O@M(Partial)电荷状态MH+
肽分子量(Da，平均)公差(AVG) 1.00ppm881.288 927.495 983.498 1007.525 1222.666 1376.820 1422.642 1439.854肽分子量(Da， 1475.797 1479.791 1553.852 1567.742 1638.888 1781.886 1915.892Monoisotopic) 1961.078 2019.135 2044.949 2225.083 2283.131 2470.203 3143.4113299.415 3323.912 3337.675公差(MON) 50.00ppm肽的数量25ProteoMetrics'ProFound是基于洛克非勒大学的ProFound[搜索+传输时间＞＝5.94秒]function expandlt(whichE1){whichE1.style.display=(whichE1.style.display=="none") "":"none";}ProFound-检索结果简述 版本4.10.61997-2000ProteoMetricsA:hover{COLOR:red}togglelt(E1){whichlm=event.srcElement;if(E1.style.display=="none"){E1.style.display="";whichlm.src="/prowl/minus.gif';}else{whichlm.src="/prowl/minus.gif';E1.style.display=="none";}}A:hover{COLOR:red}搜索20010207110746-00D6-149234049162的候选蛋白[搜索到121045个序列]
注1.用不相配的质量再次搜索，点击符号。
2.将高度相似的蛋白序列置于同一行(IE用户点击“+”以扩展/收缩)。
输入简述日期和时间2001年2月7日星期三10:07:52UTC(搜索时间5.88秒)搜索代码EDB Fibronektin，#0824，Bande7数据库NCBInr[..\databases\nr]分类哺乳动物(mammals)蛋白分子量范围80-100kDa蛋白pI范围0.0-14.0搜索仅单个蛋白化学消化胰蛋白酶Max Missed Cut2修饰+C3H5ON@C(Partial);+O@M(Partial)电荷状态MH+肽分子量(Da，平均)公差(AVG)1.00ppm881.213 983.479 1222.615 1266.561 1376.698 1422.672 1473.821 1479.786肽分子量(Da， 1553.850 1567.725 1639.856 1781.886 1819.830 1915.945 1931.961 1961.051 5019.150Monoisotopic) 5068.101 2224.061 2283.101 2344.093 2470.201 2501.215 2705.64 2776.358 2840.5452872.558 3052.493 3143.494 3159.559 3280.571 3297.582Tolerance(MON)50.00ppm肽的数量32ProteoMetrics’ProFound是基于洛克非勒大学的ProFound[搜索+传输时间＞＝5.91秒]
序列表<110>舍林股份公司<120>EDB-纤粘连蛋白结构域的受体<130>s5495<140>
<141>
<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>15<212>PRT<213>推定在EDB分子上EDB-受体的第I结合序列<400>1Val Asp Ile Thr Asp Ser Ser Ile Gly Leu Arg Trp Thr Pro Leu1 5 10 15<210>2<211>15<212>PRT<213>推定在EDB分子上EDB-受体的第II结合序列<400>2Gly Tyr Tyr Thr Val Thr Gly Leu Glu Pro Gly Ile Asp Tyr Asp1 5 10 15<210>3<211>15<212>PRT<213>推定在EDB分子上EDB-受体的第III结合序列<400>3Thr Gly Leu Glu Pro Gly Ile Asp Tyr Asp Ile Ser Val Ile Thr1 5 10 15<210>4<211>91<212>PRT<213>智人<400>4Glu Val Pro Gln Leu Thr Asp Leu Ser Phe Val Asp Ile Thr Asp Ser1 5 10 15Ser Ile Gly Leu Arg Trp Thr Pro Leu Asn Ser Ser Thr Ile Ile Gly20 25 30
Tyr Arg Ile Thr Val Val Ala Ala Gly Glu Gly Ile Pro Ile Phe Glu35 40 45Asp Phe Val Asp Ser Ser Val Gly Tyr Tyr Thr Val Thr Gly Leu Glu50 55 60Pro Gly Ile Asp Tyr Asp Ile Ser Val Ile Thr Leu Ile Asn GLy Gly65 70 75 80Glu Ser Ala Pro Thr Thr Leu Thr Gln Gln Thr85 90
权利要求
1.筛选结合EDb-纤粘连蛋白结构域的化合物的方法，其中该方法包含a)在不同浓度的一种或多种化合物存在下使细胞与一种固定浓度的蛋白质接触，所述蛋白质包含EDb-纤粘连蛋白结构域或为具有用SEQ ID NO1-4表示的序列之一的蛋白质；和b)检测在所述化合物存在下细胞对一种蛋白质的应答与在无这些化合物存在下细胞对这种蛋白质的对照应答的不同，所述蛋白质包含EDb-纤粘连蛋白结构域或具有用SEQ ID NO1-4表示的序列之一，其中所述细胞表达一种蛋白质，该蛋白质具有一种序列，所述序列选自包含SEQ ID NO1-3和含整联蛋白的α2β1序列的序列的组中，或所述细胞包含编码该蛋白质的核酸，其中所述应答或对照应答是通过EDb-纤粘连蛋白结构域的受体介导的。
2.按照权利要求1的方法，其中所述应答或对照应答包含细胞在被EDb-纤粘连蛋白结构域或其部分包被的表面上的粘附。
3.权利要求1的方法，其中所述应答或对照应答包含细胞在被EDb-纤粘连蛋白结构域或其部分包被的表面上的增殖。
4.权利要求1的方法，其中所述应答或对照应答包括胶原蛋白基质中内皮细胞的增殖、迁移和分化，所述胶原蛋白基质与EDb-纤粘连蛋白结构域或其部分混合。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述化合物选自抗体、人工抗体、抗体片段、肽类、低分子化合物、Aptamere和Spiegelmere。
全文摘要
本发明涉及特异性结合ED
文档编号A61K48/00GK1865284SQ20061000477
公开日2006年11月22日 申请日期2001年8月30日 优先权日2000年9月7日
发明者亚历山大·雷德利茨, 马库斯·科皮茨, 乌尔苏拉·埃格纳, 因克·巴尔, 安德烈亚斯·门拉德 申请人:舍林股份公司