专利名称：神经营养因子缓释微球及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种缓释微球及其制备方法。
背景技术：
中枢神经系统疾病是指中枢神经系统的不同部位特殊类型神经元的逐渐丧失或者损伤而导致的以神经系统损害为主要临床表现的一类疾病，譬如老年性痴呆，老年性痴呆是因为基底前脑胆碱能神经元的溃变死亡导致病人出现的以进行性认知障碍和记忆能力的损害，并伴有不同程度的运动、语言和人格等多方面的异常。基底前脑胆碱能神经元为神经营养因子敏感神经元，它们的细胞膜上有P75NTF受体和TrkA受体，神经营养因子与这些受体结合后，能提高胆碱能神经元的胆碱乙酰转移酶的活性，从而提高神经细胞的存活能力，发挥正常的生理功能；将神经营养因子向侧脑室灌注，能够使溃变的胆碱能神经元存活并且促进神经元再生新的突触。此外，与帕金森病、亨廷顿病密切相关的多巴胺能神经元以及中枢神经系统其他多种类型的神经元都是神经营养因子敏感神经元。神经营养因子已在临床上成功地应用于老年性痴呆、帕金森病以及脑损伤等中枢神经系统疾病的实验性治疗。
现代生物技术使大规模生产高纯度的重组生长因子成为可能，现在人们可以用各种神经营养因子用于中枢神经系统疾病的治疗。但是，神经营养因子应用于病人还有一些困难①多数神经营养因子的生物半衰期往往较短，故需要反复大剂量应用，因此增加了治疗的成本；②多数神经营养因子是大分子物质，较难透过血脑屏障，必须长期的侧脑室埋管灌注，长期的侧脑室埋管灌注能够引起病人剧烈的背痛和体重的明显减轻等副作用，并且大大增加了颅内感染的机会；③许多机体组织细胞也存在神经营养因子的受体，因此全身应用神经营养因子将引起广泛的毒性反应。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种生物半衰期长、能够配制成注射液的神经营养因子缓释微球。
本发明的第二个目的是提供一种神经营养因子缓释微球的制备方法。
本发明的技术方案概述如下一种神经营养因子缓释微球，是用下述方法制成(1)将5mg-15mg质量比为1/2000-1/50的神经营养因子/白蛋白混合物溶于50-200μl去离子水中；(2)将50mg-300mg天然高分子囊材或半合成高分子囊材或合成高分子囊材溶于3-10ml一氯甲烷或二氯甲烷或三氯甲烷或体积比为5/1-3/2的一氯甲烷/丙酮或体积比为5/1-3/2的二氯甲烷/丙酮或体积比为5/1-3/2的三氯甲烷/丙酮中；
(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在功率为20-40W的条件下超声0.5-2min或2000-4000rpm匀速搅拌0.5-3min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到20-35ml质量百分比为1％-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，800-1500rpm搅拌3-10min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌2-5h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心收集，用去离子水清洗1-4遍，冷冻干燥20-36h，即制成一种神经营养因子缓释微球。
所述神经营养因子为重组人的神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素-3、神经营养素-4/5、神经营养素-6、睫状神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、白细胞介素、表皮生长因子、血管内皮细胞生长因子或血小板源性生长因子之一。
所述天然高分子囊材为明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠或壳聚糖之一。
所述半合成高分子囊材为羧甲基纤维素钠、醋酸纤维素酞酸酯、邻苯二甲酸醋酸纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素或羟丙甲基纤维素之一。
所述合成高分子囊材为聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚己内酯、聚氨基酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物或聚乳酸-聚乙烯醇共聚物之一，这些聚合物的分子量没什么特殊要求，可用的范围很宽。
一种神经营养因子缓释微球的制备方法，是由下述步骤组成(1)将5mg-15mg质量比为1/2000-1/50的神经营养因子/白蛋白混合物溶于50-200μl去离子水中；(2)将50-300mg天然高分子囊材或半合成高分子囊材或合成高分子囊材溶于3-10ml一氯甲烷或二氯甲烷或三氯甲烷或体积比为5/1-3/2的一氯甲烷/丙酮或体积比为5/1-3/2的二氯甲烷/丙酮或体积比为5/1-3/2的三氯甲烷/丙酮中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在功率为20-40W的条件下超声0.5-2min或2000-4000rpm匀速搅拌0.5-3min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到20-35ml质量百分比为1％-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，800-1500rpm搅拌3-10min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌2-5h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心收集，用去离子水清洗1-4遍，冷冻干燥20-36h，即制成一种神经营养因子缓释微球。
所述神经营养因子为重组人的神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素-3、神经营养素-4/5、神经营养素-6、睫状神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、白细胞介素、表皮生长因子、血管内皮细胞生长因子或血小板源性生长因子之一。
所述天然高分子囊材为明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠或壳聚糖之一。
所述半合成高分子囊材为羧甲基纤维素钠、醋酸纤维素酞酸酯、邻苯二甲酸醋酸纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素或羟丙甲基纤维素之一。
所述合成高分子囊材为聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚己内酯、聚氨基酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物或聚乳酸-聚乙烯醇共聚物之一。
本发明的优点是①微球能够维持包载的蛋白类药物在较长的时期活性不变；②微球能够配制成注射剂，可以准确地进行脑内注射，避免对周围脑组织的损伤，同时起到药物的靶向给药作用，从而大大方便了临床上的应用；③微球能够持续或脉冲式释放有生物活性蛋白几周甚至几个月，避免了生物半衰期较短的蛋白药物要多次应用给病人带来的不便。因此，神经营养因子缓释微球给中枢神经系统疾病的治疗带来新的希望。
图1为FITC标记的rhNGF-PLGA缓释微球在荧光显微镜下的照片(200×)；图2为FITC标记的rhNGF-PLGA缓释微球共聚焦激光显微镜下的照片；图3为实例1制备的rhNGF-PLGA微球进行体外释放实验相差显微镜下的照片，A为.培养基中加入rhNGF(30ng/ml)(200×)；B.为培养基中加入从rhNGF微球中释放的rhNGF(30ng/ml)(200×)；C为.培养基中加入不含NGF的白蛋白微球的释放释放液(400×)。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明实施例1一种神经营养因子缓释微球，是用下述方法制成(1)将10mg质量比为1/2000的重组人的神经生长因子(rhNGF)/白蛋白混合物溶于100μl去离子水中；(2)将100mg聚乳酸-聚乙烯醇共聚物(PLGA)溶于4ml体积比为3∶1的二氯甲烷/丙酮中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在功率为20W的条件下超声1min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到25ml质量百分比为1％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，1000rpm搅拌5min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌3h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心(12000rpm，10min)收集，用去离子水清洗3遍，除掉微球表面的聚乙烯醇和没有包进的药物，冷冻干燥24h，去除微球中的水分，即制成一种神经营养因子缓释微球。
比较不同的蛋白/多聚物比率对微球的粒径、蛋白载药量和包封率的影响，同时观察不同的蛋白/多聚物比率制备的微球体外释放药物特征的差异。
结果显示所得微球呈圆形，形态圆整，粒径分布较均匀；蛋白/多聚物比率越低，蛋白的包封率越高，突释效应越小；粒径和蛋白载药量逐渐增大。
FITC标记的rhNGF-PLGA缓释微球的制备按照实例1的方法制备FITC标记的rhNGF-PLGA缓释微球，将5mg rhNGF/FITC标记的白蛋白(1/2000，w/w)溶于100μl去离子水中，100mg PLGA溶于4ml二氯甲烷/丙酮(3∶1，v/v)的混合溶液中，将蛋白溶液加到PLGA溶液中，在冰浴条件下超声1min(超声功率为20W)，即形成油包水(W1/O)型的乳液，然后，将蛋白和PLGA的混合溶液加入25ml1％PVA的水溶液中，在冰浴的条件下匀速搅拌5min(1000rpm)，即形成水包油包水(W1/O/W2)型的复乳液。在常压下，磁力搅拌3-4h，挥发有机溶剂，固化的微球通过离心(12000rpm，10min)收集，用去离子水清洗三遍除掉微球表面的PVA和没有包进的药物，最后冷冻干燥24h，去除微球中的水分。
分别在荧光显微镜和共聚焦激光显微镜下观察蛋白在微球中的分布。结果显示微球形态圆整，粒径分布较均匀，蛋白均匀地分布在微球中。
实施例2一种神经营养因子缓释微球，是用下述方法制成(1)将5mg质量比为1/50的脑源性神经营养因子/白蛋白混合物溶于50μl去离子水中；(2)将50mg明胶溶于3ml一氯甲烷中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在功率为20W超声2min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到20ml质量百分比为10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，1000rpm搅拌4min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌3h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心收集，用去离子水清洗3遍，冷冻干燥24h，即制成一种神经营养因子缓释微球。
实施例3一种神经营养因子缓释微球，是用下述方法制成(1)将15mg质量比为1/2000的神经营养素-3/白蛋白混合物溶于200μl去离子水中；(2)将300mg阿拉伯胶溶于10ml二氯甲烷中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在功率为40W超声0.5min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到35ml质量百分比为1％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，800rpm搅拌10min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌5h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心收集，用去离子水清洗4遍，冷冻干燥20h，即制成一种神经营养因子缓释微球。
实施例4一种神经营养因子缓释微球，是用下述方法制成(1)将7mg质量比为1/1000的神经营养素-4/5/白蛋白混合物溶于100μl去离子水中；(2)将60mg海藻酸钠溶于5ml三氯甲烷中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在功率为30W超声1min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到20-35ml质量百分比为1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，800-1500rpm搅拌3-10min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌2-5h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心收集，用去离子水清洗1-4遍，冷冻干燥20-36h，即制成一种神经营养因子缓释微球。
实施例5一种神经营养因子缓释微球，是用下述方法制成(1)将10mg质量比为1/2000的神经营养素-6/白蛋白混合物溶于150μl去离子水中；(2)将100mg壳聚糖溶于7ml体积比为5/1的一氯甲烷/丙酮中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在功率为30W超声1min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到20-35ml质量百分比为1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，800-1500rpm搅拌3-10min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌2-5h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心收集，用去离子水清洗1-4遍，冷冻干燥20-36h，即制成一种神经营养因子缓释微球。
实施例6一种神经营养因子缓释微球，是用下述方法制成(1)将10mg质量比为1/1000的睫状神经营养因子/白蛋白混合物溶于100μl去离子水中；(2)将200mg羧甲基纤维素钠溶于3/2的一氯甲烷/丙酮中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在2000rpm匀速搅拌3min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到20-35ml质量百分比为1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，800-1500rpm搅拌3-10min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌2-5h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心收集，用去离子水清洗1-4遍，冷冻干燥20-36h，即制成一种神经营养因子缓释微球。
实施例7一种神经营养因子缓释微球，是用下述方法制成(1)将5mg质量比为1/100的胶质细胞源性神经营养因子/白蛋白混合物溶于100μl去离子水中；(2)将150mg醋酸纤维素酞酸酯溶于8ml 5/2的一氯甲烷/丙酮中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在4000rpm匀速搅拌0.5min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到20-35ml质量百分比为1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，800-1500rpm搅拌3-10min，形成水包油包水型复乳液；
(5)在常压下，磁力搅拌2-5h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心收集，用去离子水清洗1-4遍，冷冻干燥20-36h，即制成一种神经营养因子缓释微球。
实施例8一种神经营养因子缓释微球，是用下述方法制成(1)将10mg质量比为1/2000的碱性成纤维细胞生长因子碱性成纤维细胞生长因子/白蛋白混合物溶于100μl去离子水中；(2)将100mg邻苯二甲酸醋酸纤维素溶于5ml 5/1的二氯甲烷/丙酮中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在3000rpm匀速搅拌2min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到20-35ml质量百分比为1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，800-1500rpm搅拌3-10min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌2-5h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心收集，用去离子水清洗1-4遍，冷冻干燥20-36h，即制成一种神经营养因子缓释微球。
实施例9一种神经营养因子缓释微球，是用下述方法制成(1)将15mg质量比为1/1500的胰岛素样生长因子/白蛋白混合物溶于100μl去离子水中；(2)将100mg乙基纤维素溶于5ml 3/2的二氯甲烷/丙酮中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在3000rpm匀速搅拌1min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到20-35ml质量百分比为1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，800-1500rpm搅拌3-10min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌2-5h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心收集，用去离子水清洗1-4遍，冷冻干燥20-36h，即制成一种神经营养因子缓释微球。
实施例10一种神经营养因子缓释微球，是用下述方法制成(1)将15mg质量比为1/500的白细胞介素/白蛋白混合物溶于100μl去离子水中；(2)将100mg甲基纤维素溶于5ml 5/2的二氯甲烷/丙酮中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在3000rpm匀速搅拌2min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到20-35ml质量百分比为1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，800-1500rpm搅拌3-10min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌2-5h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心收集，用去离子水清洗1-4遍，冷冻干燥20-36h，即制成一种神经营养因子缓释微球。
实施例11一种神经营养因子缓释微球，是用下述方法制成
(1)将15mg质量比为1/200的表皮生长因子/白蛋白混合物溶于100μl去离子水中；(2)将100mg羟丙甲基纤维素溶于4ml 5/1的三氯甲烷/丙酮中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在3000rpm匀速搅拌2min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到20-35ml质量百分比为1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，800-1500rpm搅拌3-10min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌2-5h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心收集，用去离子水清洗1-4遍，冷冻干燥20-36h，即制成一种神经营养因子缓释微球。
实施例12一种神经营养因子缓释微球，是用下述方法制成(1)将10mg质量比为1/1000的血管内皮细胞生长因子/白蛋白混合物溶于100μl去离子水中；(2)将100mg聚乳酸溶于4ml 3/2的三氯甲烷/丙酮中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在3000rpm匀速搅拌2min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到20-35ml质量百分比为1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，800-1500rpm搅拌3-10min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌2-5h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心收集，用去离子水清洗1-4遍，冷冻干燥20-36h，即制成一种神经营养因子缓释微球。
实施例13一种神经营养因子缓释微球，是用下述方法制成(1)将10mg质量比为1/1000的血小板源性生长因子/白蛋白混合物溶于100μl去离子水中；(2)将100mg聚乙醇酸溶于4ml 5/2的三氯甲烷/丙酮中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在3000rpm匀速搅拌2min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到20-35ml质量百分比为1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，800-1500rpm搅拌3-10min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌2-5h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心收集，用去离子水清洗1-4遍，冷冻干燥20-36h，即制成一种神经营养因子缓释微球。
实施例14一种神经营养因子缓释微球，是用下述方法制成(1)将10mg质量比为1/2000的重组人的神经生长因子/白蛋白混合物溶于100μl去离子水中；(2)将100mg聚乙烯醇溶于4ml体积比为3∶1的二氯甲烷/丙酮中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在3000rpm匀速搅拌2min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到25ml质量百分比为1％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，1000rpm搅拌5min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌3h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心(12000rpm，10min)收集，用去离子水清洗3遍，除掉微球表面的聚乙烯醇和没有包进的药物，冷冻干燥24h，去除微球中的水分，即制成一种神经营养因子缓释微球。
实施例15一种神经营养因子缓释微球，是用下述方法制成(1)将10mg质量比为1/2000的重组人的神经生长因子/白蛋白混合物溶于100μl去离子水中；(2)将100mg聚苯乙烯溶于5ml体积比为4∶1的二氯甲烷/丙酮中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在3000rpm匀速搅拌2min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到25ml质量百分比为1％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，1000rpm搅拌5min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌3h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心(12000rpm，10min)收集，用去离子水清洗3遍，除掉微球表面的聚乙烯醇和没有包进的药物，冷冻干燥24h，去除微球中的水分，即制成一种神经营养因子缓释微球。
实施例16一种神经营养因子缓释微球，是用下述方法制成(1)将10mg质量比为1/2000的重组人的神经生长因子/白蛋白混合物溶于100μl去离子水中；(2)将100mg聚己内酯溶于6ml体积比为3∶1的二氯甲烷/丙酮中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在3000rpm匀速搅拌2min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到25ml质量百分比为1％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，1000rpm搅拌5min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌3h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心(12000rpm，10min)收集，用去离子水清洗3遍，除掉微球表面的聚乙烯醇和没有包进的药物，冷冻干燥24h，去除微球中的水分，即制成一种神经营养因子缓释微球。
实施例17一种神经营养因子缓释微球，是用下述方法制成(1)将10mg质量比为1/2000的重组人的神经生长因子/白蛋白混合物溶于100μl去离子水中；(2)将100mg聚氨基酸溶于4ml体积比为3∶1的二氯甲烷/丙酮中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在3000rpm匀速搅拌2min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到25ml质量百分比为1％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，1000rpm搅拌5min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌3h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心(12000rpm，10min)收集，用去离子水清洗3遍，除掉微球表面的聚乙烯醇和没有包进的药物，冷冻干燥24h，去除微球中的水分，即制成一种神经营养因子缓释微球。
实施例18一种神经营养因子缓释微球，是用下述方法制成(1)将10mg质量比为1/2000的重组人的神经生长因子/白蛋白混合物溶于100μl去离子水中；(2)将100mg聚乳酸-聚乙醇酸共聚物溶于4ml体积比为3∶1的二氯甲烷/丙酮中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在3000rpm匀速搅拌2min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到25ml质量百分比为1％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，1000rpm搅拌5min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌3h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心(12000rpm，10min)收集，用去离子水清洗3遍，除掉微球表面的聚乙烯醇和没有包进的药物，冷冻干燥24h，去除微球中的水分，即制成一种神经营养因子缓释微球。
实例19.
不同的水溶性添加剂对蛋白包封率的影响按照实例1的方法制备rhNGF-PLGA缓释微球。将甘油、蔗糖和聚乙烯醇加到蛋白溶液(5mg rhNGF/白蛋白(1/2000，w/w)，100μl去离子水)中，形成不同浓度的甘油、蔗糖和聚乙烯醇-蛋白溶液(5％和10％)；将蛋白溶液加到PLGA溶液(100mg PLGA溶于4ml二氯甲烷/丙酮(3∶1，v/v))中，在冰浴条件下超声形成油包水(W1/O)型的乳液。然后，将蛋白和PLGA的混合溶液加入25ml 1％ PVA的水溶液中，在冰浴的条件下匀速搅拌5min(1000rpm)，即形成水包油包水(W1/O/W2)型的复乳液。在常压下，磁力搅拌3-4h，挥发有机溶剂，固化的微球通过离心(12000rpm，10min)收集，用去离子水清洗三遍除掉微球表面的PVA和没有包进的药物，最后冷冻干燥24h，去除微球中的水分。
重点比较内水相中不同浓度的水溶性添加剂对蛋白包封率的影响。结果显示内水相中加有10％的聚乙烯醇能够将蛋白包封率从89.1％提高到97.5％。
实例20微球中药物活性的鉴定将按照实例1制备的rhNGF-PLGA微球进行体外释放实验，收集第一天释放的溶液进行细胞学实验。具体的过程如下将PC12细胞接种于预先置有涂有赖氨酸盖玻片的24孔培养板中，接种密度为1×104细胞/cm2，每孔加1.5ml DMEM/F12(1∶1)培养基。实验分组①rhNGF组(30ng/ml)；②rhNGF微球释放组(30ng/ml)；③不含NGF的白蛋白微球释放组(微球释放液用0.22μm滤器过滤除菌)。24h后观察细胞长出突起的情况，计数100-200个细胞，计算长出突起细胞占整个细胞的比例。结果发现rhNGF组和rhNGF微球释放组的PC12细胞长出较多的突起，不含NGF的白蛋白微球释放组的PC12细胞几乎看不到长出突起。见图3A.培养基中加入rhNGF(30ng/ml)(200×)；B.培养基中加入从rhNGF微球中释放的rhNGF(30ng/ml)(200×)；C.培养基中加入不含NGF的白蛋白微球的释放释放液(400×)。
将按照实例1制备的微球注射到大鼠的基底前脑，取不同时间点，取脑切片后进行间接免疫荧光染色。结果显示移植的微球呈现抗rhNGF阳性发应。
微球中所包载的药物稳定性的鉴定可以证实微球中药物的生物学活性是否还存在。该方法包括以下几个部分(A)利用细胞学实验，将体外释放的药物加到体外培养的敏感细胞体系中，观察其对敏感细胞的作用；(B)通过切片，利用免疫学技术直接证实微球中药物的生物学活性。
缓释微球的脑内递送本发明中涉及将微球递送至脑内的方法，该方法主要包括以下几部分(A)将微球悬浮于一定的溶液中；(B)将受试动物的脑部固定于立体定位上；(C)根据立体定位图谱选定进针坐标，同时在颅上钻一个合适的进针孔；(D)利用微量注射的形式在预先设定的时间将微球注射到脑内特定的区域。
权利要求
1.一种神经营养因子缓释微球，其特征是用下述方法制成(1)将5mg-15mg质量比为1/2000-1/50的神经营养因子/白蛋白混合物溶于50-200μl去离子水中；(2)将50mg-300mg天然高分子囊材或半合成高分子囊材或合成高分子囊材溶于3-10ml一氯甲烷或二氯甲烷或三氯甲烷或体积比为5/1-3/2的一氯甲烷/丙酮或体积比为5/1-3/2的二氯甲烷/丙酮或体积比为5/1-3/2的三氯甲烷/丙酮中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在功率为20-40W的条件下超声0.5-2min或2000-4000rpm匀速搅拌0.5-3min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到20-35ml质量百分比为1％-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，800-1500rpm搅拌3-10min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌2-5h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心收集，用去离子水清洗1-4遍，冷冻干燥20-36h，即制成一种神经营养因子缓释微球。
2.根据权利要求1所述的神经营养因子缓释微球，其特征是所述神经营养因子为重组人的神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素-3、神经营养素-4/5、神经营养素-6、睫状神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、白细胞介素、表皮生长因子、血管内皮细胞生长因子或血小板源性生长因子之一。
3.根据权利要求1所述的一种神经营养因子缓释微球，其特征是所述天然高分子囊材为明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠或壳聚糖之一。
4.根据权利要求1所述的一种神经营养因子缓释微球，其特征是所述半合成高分子囊材为羧甲基纤维素钠、醋酸纤维素酞酸酯、邻苯二甲酸醋酸纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素或羟丙甲基纤维素之一。
5.根据权利要求1所述的一种神经营养因子缓释微球，其特征是所述合成高分子囊材为聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚己内酯、聚氨基酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物或聚乳酸-聚乙烯醇共聚物之一。
6.一种神经营养因子缓释微球的制备方法，其特征是由下述步骤组成(1)将5mg-15mg质量比为1/2000-1/50的神经营养因子/白蛋白混合物溶于50-200μl去离子水中；(2)将50-300mg天然高分子囊材或半合成高分子囊材或合成高分子囊材溶于3-10ml一氯甲烷或二氯甲烷或三氯甲烷或体积比为5/1-3/2的一氯甲烷/丙酮或体积比为5/1-3/2的二氯甲烷/丙酮或体积比为5/1-3/2的三氯甲烷/丙酮中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，在功率为20-40W的条件下超声0.5-2min或2000-4000rpm匀速搅拌0.5-3min，制成油包水型乳液；(4)将所述油包水型乳液加到20-35ml质量百分比为1％-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，800-1500rpm搅拌3-10min，形成水包油包水型复乳液；(5)在常压下，磁力搅拌2-5h，挥发有机溶剂，将固化的微球通过离心收集，用去离子水清洗1-4遍，冷冻干燥20-36h，即制成一种神经营养因子缓释微球。
7.根据权利要求6所述的神经营养因子缓释微球的制备方法，其特征是所述神经营养因子为重组人的神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素-3、神经营养素-4/5、神经营养素-6、睫状神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、白细胞介素、表皮生长因子、血管内皮细胞生长因子或血小板源性生长因子之一。
8.根据权利要求6所述的一种神经营养因子缓释微球的制备方法，其特征是所述天然高分子囊材为明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠或壳聚糖之一。
9.根据权利要求6所述的一种神经营养因子缓释微球的制备方法，其特征是所述半合成高分子囊材为羧甲基纤维素钠、醋酸纤维素酞酸酯、邻苯二甲酸醋酸纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素或羟丙甲基纤维素之一。
10.根据权利要求6所述的一种神经营养因子缓释微球，其特征是所述合成高分子囊材为聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚己内酯、聚氨基酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物或聚乳酸-聚乙烯醇共聚物之一。
全文摘要
本发明公开了神经营养因子缓释微球及其制备方法，神经营养因子缓释微球是用下述方法制成(1)将神经营养因子/白蛋白混合物溶于去离子水中；(2)将天然高分子囊材或半合成高分子囊材或合成高分子囊材溶于一氯甲烷中；(3)将步骤(1)制成的溶液加到步骤(2)制成的溶液中，冰浴条件，超声，制成油包水型乳液；(4)将油包水型乳液加到聚乙烯醇水溶液中，冰浴条件，搅拌，形成水包油包水型复乳液；(5)常压下，磁力搅拌，挥发有机溶剂，离心收集固化微球，水洗，干燥，制成，神经营养因子缓释微球能够维持包载的蛋白类药物在较长的时期活性不变；能够配制成注射剂，可以准确地进行脑内注射，能够持续或脉冲式释放有生物活性蛋白。
文档编号A61P25/16GK1879876SQ20061001360
公开日2006年12月20日 申请日期2006年4月30日 优先权日2006年4月30日
发明者宋存先, 谷海刚 申请人:中国医学科学院生物医学工程研究所