专利名称：狗胆粉及其在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及狗胆粉及其在制药中的新用途，特别涉及狗胆粉在制备防治肝纤维化的药物中的应用。
背景技术：
狗胆是犬科动物狗的胆汁，对狗胆的应用《本草纲目》中早有记载，“凡气血痛及伤损者，热酒服半个，淤血尽下。治刀箭疮，去肠中脓水，耵耳出脓，拔白换汤不换黑，血气摄痛，反胃吐食，痞块疳积，赤白下痢”。作为药材民间应用已久，具有清肝明目，止血消肿之功效。近代，狗胆作为一种传统中药材被收编于《中药大词典》中，但对狗胆的研究、利用甚少。查阅文献，迄今为止国内外尚未见狗胆在抗肝纤维化方面的研究报道，更没有发现利用狗胆在制备防治肝纤维化的药物中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种狗胆粉及其新用途，尤其是在制备防治肝纤维化的药物中的应用。
实际上，本发明涉及的一种狗胆粉，通过以下方法步骤制得提供新鲜狗胆囊并取胆汁，经100目筛过滤，在60℃下干燥，经研磨后再过100目筛，最后消毒。
本发明的狗胆粉涉及在制备防治肝纤维化的药物中的应用。
为了更好地理解本发明的实质，下面将狗胆粉的药理实验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
一、狗胆粉对二甲基亚硝胺(Dimethylnitrosamine，DMN)诱发大鼠肝纤维化的防治作用(一)狗胆粉对二甲基亚硝胺诱发大鼠肝纤维化的抑制作用本实验用DMN制备大鼠肝纤维化模型，以类似品—熊胆为药物对照，进一步证明狗胆抑制肝纤维化的作用。
1材料和方法1.实验动物S-D雄性大白鼠，体重160-180g。
2.试剂及药物二甲基亚硝胺(DMN)；直接红(Direct Red 80)；免疫组化单克隆抗体ED1(Serotec.co.uk)和αSMA(Dako，Denmak)。
本发明的狗胆粉；熊胆粉(吉林省延边熊厂提供的明月山牌)。
3.动物模型制作将60只动物随机分为6组，中毒组(10只)1％DMN(生理盐水稀释)1ml/kg连续3天/周，腹腔内注射共4周，同时用生理盐水2cc/d灌胃共4周。狗胆1、2、3组(每组10只)1％DMN腹腔内注射，剂量、时间同上，同时用狗胆小剂量(400mg/kg)、中剂量(600mg/kg)、大剂量(800mg/kg)，每日灌胃共4周。熊胆组(10只)1％DMN腹腔内注射，剂量、时间同上，同时用熊胆400mg/kg/d灌胃共4周。对照组(10只)注射用生理盐水1ml/kg连续3天/周，腹腔内注射共4周，同时用生理盐水2cc/d灌胃共4周。实验第4周末麻醉大鼠，心脏采血离心处理，处死动物后立即取肝脏。
4.血清AST、ALT、总蛋白、总胆固醇的测定血清AST、ALT的测定采用Reiman氏方法，血清总蛋白的测定采用Biuret法，血清总胆固醇的测定采用酶法，全部Kit购自Eiken Chemical(Tyoko，Japan)公司，严格按Kit说明书进行操作，利用分光光度计(Ultraspec 4050，LKB，Switzerland)测定吸光度，对照标准曲线计算AST、ALT值，总蛋白、总胆固醇含量。
5.病理检查大鼠肝/体重的检测处死前测量动物的体重，采血后立即取肝脏称重量，计算肝/体重百分比。称重后于肝左叶相同部位取组织二块，经10％的中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片行H-E、直接红染色(0.1％直接红picric acid饱和液)，光镜下观察肝组织的病理变化及纤维组织增生程度，。直接红染色的切片利用CMIAS真彩色病理图象分析系统(北京航空航天大学)进行胶原纤维的定量分析。观察条件物镜10倍，每张切片随机选4个视野，图象采集、分割处理，参数统计分析，得出目标总面积/统计场总面积之比值。免疫组织化学染色切片厚4～5μm，常规脱蜡至水，用ABC法进行免疫组织化学染色，ED1工作浓度为1∶500，α-SMA工作浓度为1∶50。
6.统计学处理数据取均值行t检验。
2结果1.血清AST、ALT、总蛋白、总胆固醇检测结果见下表1。
表1 各组实验动物4周后血清生化指标的检测结果(
)
***与中毒组比较p＜0.001，*与中毒组比较p＜0.052.肝/体重比检测结果见下表2。
表2 各组实验动物4周后肝/体重百分比(
)
***与中毒组比较p＜0.0013.肝组织纤维组织增生图象分析结果见下表3。
表3各组实验动物4周后肝组织胶原纤维面积密度％(
)
▲▲与中霉组比较P＜0.01，**与熊胆组比较P＜0.01。
4.病理学观察结果如下对照组肝小叶结构正常，无明显变性、坏死，个别标本中见门管区内少量炎细胞浸润。
中毒组肝小叶结构紊乱，肝细胞肿胀、变性，部分肝细胞胞浆浓缩，核深染，可见较多再生的肝细胞，肝细胞灶状或片状坏死，门管区内大量纤维组织增生，形成较粗的纤维间隔深入肝组织内，形成弥漫性假小叶的7/9只。
熊胆组肝小叶结构紊乱，肝细胞变性，并可见较多的点状、灶状坏死，门管区内较多纤维组织增生，形成较细的纤维间隔深入肝组织内，形成弥漫性假小叶的4/9只。
狗胆各组肝小叶结构基本正常，肝细胞轻度变性、个别标本中偶见点状坏死，门管区内纤维组织增生，形成纤细的纤维间隔深入肝组织内，仅有个别动物形成假小叶。狗胆3种不同剂量组之间病理变化及纤维组织增生程度无明显差异。
免疫组化染色结果对照组ED1+细胞在门管区、肝小叶中央静脉周围和肝实质内少量散在分布。α-SMA+细胞在门管区的各种血管壁上分布，肝小叶中央静脉壁有少量阳性表达，肝细胞间无阳性细胞分布。中毒组ED1+、α-SMA+细胞在增生的纤维间隔间大量弥漫分布，肝实质间散在分布。熊胆组ED1+、α-SMA+细胞分布同上，但数量比中毒组减少。狗胆各组ED1+、α-SMA+细胞分布与熊胆组相似，但数量比熊胆组少，狗胆三个不同剂量组两种阳性细胞的数量相似。
结论DMN是一种具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性的化学物质，DMN在微粒体代谢后形成乙醛，从而损伤肝细胞，并使核酸和蛋白质甲基化，导致肝细胞坏死。DMN可使肝细胞变性、坏死，4周后形成与人类酒精性肝硬化相似的病理所见，并有停药后仍维持肝硬化几个月的特点。
本实验的血清AST、ALT值和总蛋白的含量检测结果看，狗胆和熊胆均有较好的降酶及增加血清总蛋白作用，而狗胆的作用优于熊胆，但熊胆组有较好的降低血清胆固醇的作用。本实验肝/体重比、肝纤维组织的图象检测结果，狗胆组与熊胆组比较有显著差异，狗胆3个组之间纤维组织增生程度无明显差异；肝组织病理观察表明，中毒组肝细胞排列紊乱，失去正常结构，肝细胞弥漫性变性，可见较多灶状、片状坏死。熊胆组病变比中毒组轻，但仍可见较多肝细胞变性，可见较多的点状、灶状坏死。狗胆组肝细胞轻度变性，偶见点状坏死。上述结果从病理学角度上进一步证实了狗胆对肝细胞的保护作用。根据本实验中血清AST、ALT的检测、肝/体重比、肝纤维组织图象分析结果及肝组织的病理检查结果，狗胆粉具有较好的抑制DMN诱发的肝纤维化的作用，其作用优于熊胆。
(二)狗胆粉在对二甲基亚硝胺诱发大鼠肝纤维化的治疗作用用1％二甲基亚硝胺腹腔注射4周诱发肝纤维化的模型后进行治疗。将60只大鼠随机分为狗胆组(3种不同剂量)、熊胆组、中毒组及对照组。观察各组大鼠肝/体重比、血清AST、ALT值，总蛋白、总胆固醇含量。肝组织标本行直接红染色，经病理图象分析系统测定肝组织内胶原纤维的面积。免疫组化采用ABC方法，观察肝组织内ED1、α-SMA阳性细胞的数量及分布。
1材料和方法1.实验动物S-D雄性大白鼠，体重160-180g。
2.试剂及药物(1)二甲基亚硝胺(DMN)；直接红(Direct Red80)；免疫组化单克隆抗体ED1(Serotec.co.uk)和αSMA(Dako，Denmak)。
(2)本发明的狗胆粉；熊胆粉(吉林省延边熊厂提供的明月山牌)。
3.动物模型制作将60只动物随机分为6组，中毒组(10只)1％DMN(生理盐水稀释)1ml/kg连续3天/周，腹腔内注射共4周，第5周开始用生理盐水2cc/d灌胃共3周。狗胆1、2、3组(每组10只)1％DMN腹腔内注射，剂量、时间同上，第5周开始用狗胆小剂量(400mg/kg)、中剂量(600mg/kg)、大剂量(800mg/kg)，每日灌胃共3周。熊胆组(10只)1％DMN腹腔内注射，剂量、时间同上，第5周开始用熊胆400mg/kg/d灌胃共3周。对照组(10只)注射用生理盐水1ml/kg连续3天/周，腹腔内注射共4周，第5周开始用生理盐水2cc/d灌胃共3周。实验第7周末麻醉大鼠，心脏采血离心处理，处死动物后立即取肝脏。
4.血清AST、ALT、总蛋白、总胆固醇的测定血清AST、ALT的测定采用Reiman氏方法，血清总蛋白的测定采用Biuret法，血清总胆固醇的测定采用酶法，全部Kit购自Eiken Chemical(Tyoko，Japan)公司，严格按Kit说明书进行操作，利用分光光度计(Ultraspec 4050，LKB，Switzerland)测定吸光度，对照标准曲线计算AST、ALT值，总蛋白、总胆固醇的含量。
5.病理检查大鼠肝/体重的检测处死前测量动物的体重，采血后立即取肝脏称重量，计算肝/体重百分比。称重后于肝左叶相同部位取组织二块，经10％的中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片行H-E、直接红染色(0.1％直接红picric acid饱和液)，光镜下观察肝组织的病理变化及纤维组织增生程度，肝纤维化分级分为4级未见明显纤维间隔形成者为“-”，有纤细的纤维间隔形成，但尚未形成假小叶“+ ”，肝组织部分区域形成假小叶(50％以下)“++”，肝组织内形成弥漫性假小叶“+++”。
直接红染色的切片利用CMIAS真彩色病理图象分析系统(北京航空航天大学)进行胶原纤维的定量分析。观察条件物镜10倍，每张切片随机选4个视野，图象采集、分割处理，参数统计分析，得出目标总面积/统计场总面积之比值。免疫组织化学染色切片厚4～5μm，常规脱蜡至水，用ABC法进行免疫组织化学染色，ED1工作浓度为1∶500，α-SMA工作浓度为1∶50。
6.统计学处理数据取均值行t检验。
2结果
1.血清AST、ALT、总蛋白、总胆固醇检测结果见下表4。
表4 各组实验动物7周后血清生化指标的检测结果
2.肝纤维化的分级见表5表5各组实验动物7周后肝纤维化的分级
3.肝/体重比检测结果见下表6。
表6 各组实验动物7周后肝/体重百分比
4.肝组织纤维组织增生图象分析结果见下表7。
表7 DMN7周狗胆抗肝纤维化的作用
5.病理学观察结果如下对照组肝小叶结构正常，无明显变性、坏死，个别标本中见门管区内少量炎细胞浸润。
中毒组肝小叶结构紊乱，肝细胞肿胀、变性，部分肝细胞胞浆浓缩，核深染，可见较多再生的肝细胞，肝细胞灶状或片状坏死，门管区内大量纤维组织增生，形成较粗的纤维间隔深入肝组织内，形成弥漫性假小叶的6只。
熊胆组肝小叶结构紊乱，肝细胞变性，并可见较多的点状、灶状坏死，门管区内较多纤维组织增生，形成较细的纤维间隔深入肝组织内，形成弥漫性假小叶的4/8只。
狗胆各组肝小叶结构基本正常，肝细胞轻度变性、个别标本中偶见点状坏死，门管区内纤维组织增生，形成纤细的纤维间隔深入肝组织内，仅有个别动物形成假小叶。随着狗胆剂量的增加病理变化及纤维组织增生程度减轻。
免疫组化染色结果对照组ED1+细胞在门管区、肝小叶中央静脉周围和肝实质内少量散在分布。α-SMA+细胞在门管区的各种血管壁上分布，肝小叶中央静脉壁有少量阳性表达，肝细胞间无阳性细胞分布。中毒组ED1+、α-SMA+细胞在增生的纤维间隔间大量弥漫分布，肝实质间散在分布。
熊胆组ED1+、α-SMA+细胞分布同上，但数量比中毒组减少。狗胆各组ED1+、α-SMA+细胞分布与熊胆组相似，但数量比熊胆组少，随着狗胆剂量的增加两种阳性细胞的数量减少。
结论本实验的血清AST、ALT值和总蛋白的含量检测结果看，狗胆和熊胆均有降酶及增加血清总蛋白作用，但统计学无显著性差异，而熊胆组有较好的降低血清胆固醇的作用。本实验肝/体重比、肝纤维组织的图象检测结果，狗胆组与熊胆组比较有显著差异，随着狗胆剂量的增加差异更显著；肝组织病理观察表明，中毒组肝细胞排列紊乱，失去正常结构，肝细胞弥漫性变性，可见较多灶状、片状坏死。熊胆组病变比中毒组轻，但仍可见较多肝细胞变性，可见较多的点状、灶状坏死。狗胆组肝细胞轻度变性，偶见点状坏死。上述结果从病理学角度上进一步证实了狗胆对肝细胞的保护作用。根据本实验中血清AST、ALT的检测、肝/体重比、肝纤维组织图象分析结果及肝组织的病理检查结果，狗胆具有较好的治疗DMN诱发的肝纤维化的作用，作用优于熊胆，随着剂量的增加其治疗效果更好。
二、狗胆对四氯化碳诱发大鼠肝纤维化防治作用本实验用四氯化碳(CCl4)制备大鼠肝纤维化模型，以类似品熊胆为药物对照，进一步证实狗胆抗肝纤维化的作用1材料和方法1.实验动物S-D雄性大白鼠(清洁级)，体重160-180g。
2.试剂及药物CCl4；直接红(Direct Red 80)；免疫组化单克隆抗体ED1，单克隆抗体α-SMA；血清ALT、AST、ALP、TP(总蛋白)、TB(总胆红素)检测试剂；免疫组化单克隆抗体ED1，单克隆抗体α-SMA。
药物本发明狗胆粉；熊胆粉(吉林省延边熊厂提供的明月山牌)。
3.动物模型制作实验1将46只动物随机分为5组，对照组(6只)注射用生理盐水1ml/kg/2次/周，腹腔内注射共12周，同时用生理盐水2cc/d灌胃共12周。中毒组(10只)50％CCl4(橄榄油稀释)1ml/kg 2次/周，腹腔内注射共12周，同时用生理盐水2cc/d灌胃共12周。狗胆组小剂量(400mg/kg)、中剂量(600mg/kg)、大剂量(800mg/kg)，每组10只；50％CCl41ml/kg2次/周腹腔内注射，剂量、时间同上，同时用狗胆小剂量、大剂量每日灌胃共12周。熊胆组(10只)50％CCl41ml/kg 2次/周腹腔内注射，剂量、时间同上，同时用熊胆400mg/kg/d灌胃共12周。实验第12周末用乙醚麻醉大鼠，心脏采血离心处理，处死动物后立即取肝脏。
实验2将46只动物随机分为5组，对照组(6只)注射用生理盐水1ml/kg/2次/周，腹腔内注射共8周，第9周开始用生理盐水2cc/d灌胃共4周。中毒组(10只)50％CCl4(橄榄油稀释)1ml/kg 2次/周，腹腔内注射共8周，第9周开始用生理盐水2cc/d灌胃共4周。狗胆组小剂量(400mg/kg)、中剂量(600mg/kg)、大剂量(800mg/kg)，每组10只；50％CCl41ml/kg 2次/周腹腔内注射，剂量、时间同上，第9周开始用狗胆小剂量、大剂量每日灌胃共4周。熊胆组(10只)50％CCl41ml/kg2次/周腹腔内注射，剂量、时间同上，第9周开始用熊胆400mg/kg/d灌胃共4周。实验第12周末用乙醚麻醉大鼠，心脏采血离心处理，处死动物后立即取肝脏。
4.血清生化指标的检测血清AST、ALT的测定采用Reiman-Rankel氏方法，ALP采用kind-King法(改良的K-K法)，血清总蛋白采用Biuret法，血清总胆红素采用Evelyn-Malloy法，严格按Kit说明书进行操作，利用分光光度计(Ultraspec 4050，LKB，Switzerland)在490nm测定吸光度，对照标准曲线计算AST、ALT、ALP值，总蛋白、总胆红素的含量。
5 .病理学检查(1)大鼠肝/体重比的检测处死前测量动物的体重，采血后立即取肝脏称重量，计算肝/体重百分比。
(2)肝组织病理学观察称重后于肝左叶相同部位取二块组织，经10％的中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，切片作H-E染色观察肝组织病理形态学变化，直接红染色(0.1％直接红picric acid饱和液)，观察肝组织内纤维组织增生程度。
(3)肝纤维化的分级0级无纤维化；I级汇管区纤维组织增生，有纤细的纤维间隔进入肝组织内，形成汇管区-汇管区的纤维间桥。II级在I级的基础上肝组织可见个别假小叶。III级汇管区纤维组织明显增生，纤维间隔较粗，肝组织部分区域(50％)形成大的假小叶。IV级汇管区纤维组织大量增生，纤维间隔粗大，肝组织内形成弥漫性、大小不等的假小叶。
(4)胶原纤维的定量分析直接红染色的切片利用CMIAS真彩色病理图象分析系统(北京航空航天大学)进行胶原纤维的定量分析。观察条件物镜4倍，每张切片随机选2个视野，图象采集、分割处理，参数统计分析，得出目标总面积/统计场总面积之比值。
(5)免疫组织化学染色切片厚4～5μm，常规脱蜡至水，用ABC法进行免疫组织化学染色，ED1工作浓度为1∶100，α-SMA工作浓度为1∶50。
6.统计学处理数据取均值行t检验。
结果1.血清生化指标的检测结果见下表。
实验1 大鼠血清生化指标检测结果
ALT熊胆组、狗胆1组与中毒组比较P＜0.01，狗胆2组与中毒组比较P＜0.05。AST熊胆组、狗胆各组与中毒组比较P＜0.01。ALP熊胆组、狗胆各组与中毒组比较ALP值下降，但无统计学意义。TP熊胆组、狗胆2组与中毒组比较P＜0.01，TB熊胆组、狗胆各组与中毒组比较TB值下降，但无统计学意义。
实验2 大鼠血清生化指标检测结果
ALT熊胆组与中霉组比较P＜0.05。AST狗胆2组与中毒组比较P＜0.05。ALP熊胆组、狗胆各组与中毒组比较ALP值无统计学意义。TP狗胆各组与中毒组比较P＜0.01，TB熊胆组与中毒组比较P＜0.05。
2.病理学检查结果(1)大鼠肝/体重比实验1由于CCl4导致肝细胞弥漫性脂肪变性，注射CCl4的大鼠肝脏体积增大，重量比对照组明显增高，中毒组大部分形成弥漫性肝硬化，大量纤维组织增生，肝脏体积相对缩小，重量减轻，熊胆组与中毒组相似，狗胆组肝/体重比与中毒组和熊胆组比较有显著性差异，见下表。
实验1 大鼠肝/体重比(X±SD)
*P＜0.001狗胆组间无显著性差异实验2由于CCl4腹腔注射到第8周末，第9周开始停止注射CCl4，第12周末中毒组肝组织内脂肪变性消失，肝纤维化减轻，肝脏重量接近恢复正常，狗胆组肝/体重比略高于中毒组与熊胆组，但统计学上无显著性差异。
实验2 大鼠肝/体重比X±SD
(2).肝组织的病理学变化实验1对照组肝小叶结构正常，以中央静脉为中心，肝细胞索呈放射状排列，肝细胞无变性、坏死，个别标本中门管区内有少量炎细胞浸润。
中毒组肝小叶结构破坏，肝细胞明显肿胀，胞浆内可见弥漫性、大小不等的脂肪空泡，可见点状、灶状坏死，门管区内大量纤维组织增生，粗大的纤维间隔深入肝组织内，大部分形成弥漫性、大小不等的假小叶(5/6)。
熊胆组肝小叶结构紊乱，肝细胞脂肪变性较中毒组轻，门管区内较多纤维组织增生，形成较粗的纤维间隔深入肝组织内，形成大的假小叶(4/6)。
狗胆各组肝小叶结构轻度紊乱，肝细胞轻度脂肪变性，门管区内纤维组织增生，形成纤细的纤维间隔深入肝组织内，个别形成假小叶。
实验2对照组肝小叶结构正常，以中央静脉为中心，肝细胞索呈放射状排列，肝细胞无变性、坏死，个别标本中门管区内有少量炎细胞浸润。
中毒组肝小叶结构紊乱，肝细胞脂肪变性消仅见失轻度变性，偶见点状坏死，门管区内纤维组织增生，纤维间隔纤细，染色淡，细胞成分少，与实验1组的中毒组比较，肝纤维化开始恢复。
熊胆组肝小叶结构紊乱，肝细胞轻度变性，门管区内纤维组织较中毒组少，纤维间隔纤细，染色淡，细胞成分少。
狗胆各组肝小叶轻度结构紊乱，肝细胞轻度变性，门管区内纤维组织较熊胆组少，纤维间隔纤细，染色淡，细胞成分少。
(3).肝纤维化的分级实验1中毒组纤维间隔粗大，深入肝组织内，大部分形成弥漫性、大小不等的假小叶。熊胆组形成较粗的纤维间隔深入肝组织内，大部分形成大的假小叶。狗胆各组纤细的纤维间隔深入肝组织内，个别形成弥漫性假小叶，见下表。
实验1 肝纤维化的分级
实验2中毒组与实验1中毒组比较肝纤维化减轻，汇管区纤维组织减少，淡染，肝内纤维间隔变细，深入肝组织内，一半形成大的假小叶。熊胆组和狗胆各组形成纤细的纤维间隔深入肝组织内，个别形成大的假小叶，见下表。
实验2 肝纤维化的分级
(4).胶原纤维面密度实验1中毒组肝组织内大量纤维组织增生，胶原纤维面密度明显增高，熊胆组纤维组织增生减少，胶原纤维面密度与中毒组比较有显著性差异，狗胆组纤维增生明显减少，与熊胆组比较有显著性差异，狗胆组间无显著性差异，见下表。
实验1 大鼠胶原纤维面密度X±SD
**P＜0.001狗胆组间无显著性差异实验2中毒组肝组织内仍有较多纤维组织增生，但比实验1的中毒组肝纤维化减轻，熊胆组与中毒组比较纤维组织减少，胶原纤维面密度有显著性差异，狗胆组与熊胆组比较也有显著性差异，狗胆组间无显著性差异，见下表。
实验2.大鼠肝胶原纤维面密度X±SD
**P＜0.001狗胆组间无显著性差异(5).免疫组化染色结果实验1ED1对照组ED1+细胞在门管区、肝小叶中央静脉周围和肝实质内散在分布。
中毒组ED1+细胞在汇管区增生的纤维组织及纤维间隔内大量分布，肝实质内明显增多。
熊胆组ED1+细胞在汇管区增生的纤维组织、纤维间隔及肝实质内分布。但其数量较中毒组少。
狗胆各组ED1+细胞分布同上，但数量比熊胆组少，随着狗胆剂量的增加ED1+细胞的数量减少。
α-SMA对照组α-SMA+细胞在门管区的各种血管壁上分布，肝小叶中央静脉壁有少量阳性表达，肝细胞间无阳性细胞分布。中毒组α-SMA+细胞在汇管区增生的纤维组织、纤维间隔内大量分布，且靠近肝细胞分布。熊胆组α-SMA+细胞分布同上，但数量比中毒组减少。
狗胆各组α-SMA+细胞分布与熊胆组相似，但数量减少。除了对照组，中毒组、熊胆组及狗胆组大鼠间汇管区增生的纤维组织及纤维间隔内α-SMA阳性表达是不均匀的。
实验2ED1对照组ED1+细胞在门管区、肝小叶中央静脉周围和肝实质内散在分布。中毒组ED1+细胞在汇管区增生的纤维组织及纤维间隔内大量分布，肝实质内明显增多。熊胆组ED1+细胞在汇管区增生的纤维组织、纤维间隔及肝实质内分布。但其数量较中毒组少。狗胆各组ED1+细胞分布同上，但数量比熊胆组少。
α-SMA对照组α-SMA+细胞在门管区的各种血管壁上分布，肝小叶中央静脉壁有少量阳性表达，肝细胞间无阳性细胞分布。
中毒组α-SMA+细胞分布同上，汇管区增生的纤维组织及纤维间隔内无阳性细胞表达。
熊胆组及狗胆各组α-SMA+细胞分布同上，汇管区增生的纤维组织及纤维间隔内无阳性细胞表达。
结论CCl4是经典肝毒性物质，在体内形成Free radical，产生脂质过氧化，并影响细胞内钙离子浓度，从而损伤肝细胞，CCl4可直接损伤肝脏，引起肝细胞脂肪变性、中央静脉周围肝细胞坏死，长期慢性中毒可导致肝纤维组织增生，形成肝纤维化及肝硬化。在动物实验中单投CCl46周可形成肝纤维化，12-15周可发生肝硬化，目前CCl4诱发的肝纤维化、肝硬化动物模型仍被广泛应用，但此模型一旦停止攻击可以恢复。
本实验的血清AST、ALT值和总蛋白的含量检测结果看，狗胆和熊胆均有较好的降酶及增加血清总蛋白作用，而狗胆的作用优于熊胆，但熊胆有较好的降低血清胆固醇的作用。肝/体重比、肝纤维组织的图象检测结果，实验1的狗胆组与熊胆组比较有显著差异，狗胆组间无明显差异；肝组织病理观察表明，中毒组肝组织的正常结构破坏，肝细胞弥漫性脂肪变性，脂肪空泡大小不一，可见散在的灶状、片状坏死。熊胆组病变比中毒组轻，但仍可见较多肝细胞脂肪变性，可见点状、灶状坏死。狗胆组肝细胞轻度脂肪变性，偶见点状坏死。肝纤维化的分级结果看中毒组汇管区大量纤维组织增生，并形成粗大的纤维间隔，绝大多数形成弥漫性肝硬化(5/6)，熊胆组肝纤维化与中毒组比较减轻，而狗胆组仅有个别形成弥漫性肝硬化。实验2停止攻击4周后肝组织内无脂肪变性，肝重量恢复接近正常，狗胆组肝/体重比略高于中毒组，但统计学上无显著性差异。除了对照组，中毒组肝纤维化减轻，但仍可见纤维间隔尚未完全恢复，纤维组织的图象检测结果中毒组仍有较多的纤维组织，熊胆组与中毒组比较纤维组织有显著性差异，狗胆组与熊胆组比较也有显著性差异。肝组织病理观察表明，中毒组肝组织结构紊乱，肝细胞轻度变性，胶原纤维淡染，自然吸收一部分，纤维间隔变细，纤维化程度减轻，但仍有一半形成大的假小叶，而熊胆组和狗胆组肝纤维化比中毒组轻，仅有个别形成大的假小叶。上述结果从病理学角度进一步证实了狗胆抗肝纤维化的作用。根据本实验中血清AST、ALT检测、肝/体重比、肝组织的病理变化、肝纤维化的分级、肝纤维组织定量分析结果，狗胆具有良好的预防和治疗CCl4诱发大鼠肝纤维化的作用，其作用优于熊胆。
具体实施例方式
实施例1狗胆粉通过以下方法步骤制得提供新鲜狗胆囊并取胆汁，经100目筛过滤，在60℃下干燥，经研磨后再过100目筛，最后用紫外线消毒30分钟。在无菌条件下，把狗胆粉装入胶囊，每粒胶囊0.25g，包装10粒/板，一盒4板。用法及用量一次1-2粒、一日2次，口服。
实施例2狗胆粉的制备方法同实施例1，制备的狗胆粉与虫草菌丝、丹参等重量配制胶囊，每粒胶囊0.25g，包装10粒/板，一盒4板。用法及用量一次1-2粒、一日2次，口服。另外，狗胆粉也可与其它具有抗肝纤维化作用的中药材等量配制复方制剂胶囊，提高防治肝纤维化的效果。
权利要求
1.一种狗胆粉，通过以下方法步骤制得提供新鲜狗胆囊并取胆汁，经100目筛过滤，在60℃下干燥，经研磨后再过100目筛，最后消毒。
2.狗胆粉在制备防治肝纤维化的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种狗胆粉，通过以下方法步骤制得提供新鲜狗胆囊并取胆汁，经100目筛过滤，在60℃下干燥，经研磨后再过100目筛，最后消毒。本发明还公开了狗胆粉的新用途，即狗胆粉在制备防治肝纤维化的药物中的应用，尤其是狗胆粉在制备对狗胆粉在对二甲基亚硝胺诱发大鼠肝纤维化药物的防治作用；狗胆粉在制备对四氯化碳诱发大鼠肝纤维化药物的防治作用。
文档编号A61K9/14GK1994325SQ20061001650
公开日2007年7月11日 申请日期2006年1月6日 优先权日2006年1月6日
发明者朴东明 申请人:朴东明