专利名称：β2－微球蛋白的抗原表位及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药工程技术领域，涉及β2-微球蛋白的抗原表位及应用。
背景技术：
β2-微球蛋白是由99个氨基酸组成的单链多肽低分子蛋白。其氨基酸序列为Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr-Ser-Arg-His-Pro-Ala-Glu-Asn-Gly-Lys-Ser-Asn-Phe-Leu-Asn-Cys-Tyr-Val-Ser-Gly-Phe-His-Pro-Ser-Asp-Ile-Glu-Val-Asp-Leu-Leu-Lys-Asn-Gly-Glu-Arg-Ile-Glu-Lys-Val-Glu-His-Ser-Asp-Leu-Ser-Phe-Ser-Lys-Asp-Trp-Ser-Phe-Tyr-Leu-Leu-Tyr-Tyr-Thr-Glu-Phe-Thr-Pro-Thr-Glu-Lys-Asp-Glu-Tyr-Ala-Cys-Arg-Val-Asn-His-Val-Thr-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val-Lys-Trp-Asp-Arg-Asp-Met在Cys 25和Cys 80有一个二硫键，平均分子量为11729.1694，单同位素分子量11721.7718。
β2-微球蛋白是Berggard于1968年首先从肾小管病变患者尿中分离出来的。β2-微球蛋白是有核细胞分泌的一种低分子球蛋白，可自由透过肾小球滤过99.0％在近曲小管重吸收，由99个氨基酸残基组成的单链多肽，分子量为11800，它广泛存在于人的血浆、尿和脑脊液等各种体液中及有核细胞膜的表面在正常情况，细胞表面上的β2-微球蛋白跟体液中游离的β2-微球蛋白反复结合解离，维持动态平衡。
β2-微球蛋白近年来受到相当重视，因为多种肿瘤病人的血清β2-微球蛋白水平上升。很多学者对其生物性能、病理生理及临床意义进行了深入的研究。在临床上有多种肿瘤如肺癌、肾癌、乳腺癌、消化系统恶性肿瘤血、尿的β2-微球蛋白均有异常变化，一般是高于正常水平。因此，β2-微球蛋白已用于多种恶性肿瘤早期血清学诊断。
发明内容
本发明的目的之一是提供β2-微球蛋白的一个抗原表位及其应用。
本发明的目的之二是提供β2-微球蛋白的一个抗原表位的应用。
本发明提供β2-微球蛋白的一个抗原表位，位于(61-67)位点，是氨基酸序列为SFYLLYY的多肽。
为了实现本发明提供β2-微球蛋白的抗原表位。我们利用亲和质谱技术(MALDI-TOF/MS)，将免疫亲和提取方法与现代软电离质谱技术相结合，系统的研究β2-微球蛋白与其抗体的特异性反应，进而确定其抗原决定簇的位点和氨基酸序列，并对对抗原-抗体反应的影响条件进行详细的研究，探索活性蛋白质固定载体上的最佳实验条件建立微量快速灵敏的免疫学的新方法。实验结果表明质谱作为一种快速而有效的分析方法，是分析抗原决定簇的强有力的手段。
首先将其用蛋白酶水解产生一系列肽段，然后与固定在琼脂糖珠上的单克隆抗体发生免疫亲和反应。反应后收集珠子并用适当的缓冲液冲洗多次。未与抗体结合的肽段则被冲洗掉，而含有抗原决定簇的肽段与抗体结合形成复合物同珠子一起保留下来，最后直接进行质谱分析，得到和抗体结合的肽段质谱数据。实验中我们分别运用了Endoproteinase Lys-C、Glu-C和Trypsin三种不同切割位点的蛋白酶，并采取合成肽段的方式确定抗原与抗体结合部位即表位的位点为肽段(61-67)SFYLLYY。
抗原表位作为免疫细胞识别的靶结构和激发特异性免疫应答的物质基础，对于免疫反应的相关研究具有重要意义。
本发明的β2-微球蛋白的一个抗原表位肽SFYLLYY，可以刺激人体产生针对β2-微球蛋白的抗体。β2-微球蛋白能够与其相对应的抗体特异性结合，因此本发明的β2-微球蛋白的一个抗原表位肽SFYLLYY产生的抗体可以用作探针，识别β2-微球蛋白并与之发生免疫沉降反应。因此本发明的β2-微球蛋白的一个抗原表位肽SFYLLYY以及相对应的抗体可用于疾病的早期血清学诊断、治疗与预后的判断。
本发明的小分子多肽可以通过化学合成或基因工程重组表达的方法制得。
实验表明本发明的β2-微球蛋白的一个抗原表位肽SFYLLYY能够与β2-微球蛋白竞争，参与多抗特异性的结合；能够有效的抑制抗体的功能，与合适的载体耦联后具有与β2-微球蛋白相似的免疫原性。这就为用于制备新型疫苗和药物提供了科学的依据。
结合一些生物技术，PCR、ELISA技术，蛋白质芯片，利用本发明的β2-微球蛋白的一个抗原表位肽SFYLLYY可以用于开发新的诊断试剂盒和做为诊断芯片的靶蛋白，都有临床应用前景。
本发明的β2-微球蛋白的一个抗原表位为多种肿瘤，如肺癌、肾癌、乳腺癌、消化系统恶性肿瘤早期血清学诊断和治疗奠定了基础；并开辟了新的技术途径和新的应用，为用于制备新型疫苗和药物提供了科学的依据。
具体实施例方式
实施例1本实施例为β2-微球蛋白的抗原表位测定(1)试剂的配制称取10mgCHCA溶于50％ACN+0.1％TFA中配制成10mg/ml的基质溶液。5μg Endoproteinase Lys-C溶解在20μLMillpore超纯水中，配制成浓度为0.25μg/μL的溶液。50μgEndoproteinase Glu-C溶解在200μL Millpore超纯水中配制成浓度为0.25μg/μL的溶液。100μg的Trypsin溶解在200μL Millpore超纯水中配制成浓度为0.5μg/μL的溶液。
(2)β2-微球蛋白的酶解反应在1.5mL离心管中加入60μLEndoproteinase Glu-C(酶解缓冲溶液50mM的乙酸铵溶液，pH＝4.5)实验按酶/底物为1∶20的比例加入到酶解缓冲溶液中，于37℃反应2h，再置于-20℃终止酶解反应。酶解液按ZiptipC18使用说明进行脱盐处理。吸取1μL脱盐后的酶解液与1μL CHCA基质溶液点靶，于空气中室温自然干燥后做MALDI-TOF-MS分析。Trypsin(50mMTris-HCl 1mM CaCl2pH8.0)和Endoproteinase Lys-C(酶解缓冲溶液50mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，pH＝8.0)按照Endoproteinase Glu-C酶解β2-微球蛋白的操作步骤进行。
(3)免疫亲和在酶解混合肽段溶液中再加100μL TSO(75mMTris-HCl，200mM NaCl，0.5％N-octyl glucoside，pH＝8.0)缓冲溶液和10μg单克隆抗体(CloneGJ14，mouse IgG1)于4℃反应4小时。取4μL Protein G/Protein AAgarose于溶液中混合均匀于4℃反应2小时。反应结束后于14000r/min离心，去上清液并收集琼脂糖珠。每次用200μL TSO缓冲溶液洗3次琼脂糖珠，再接着用200μL TSMK缓冲溶液(10mM Tris-HCl，200mM NaCl，5mM β-巯基乙醇，pH＝8.0)。取4μL基质溶液与洗后的琼脂糖珠混合均匀，最终取1.5μL混合液点靶，于空气中室温自然干燥，待干燥后做MALDI-TOF-MS分析。
采用Endoproteinase Glu-C所得到的β2-微球蛋白的连续表位范围是肽段(51-69)，氨基酸序列为HSDLSFSKDWSFYLLYYTE；Endoproteinase Lys-C得到β2-微球蛋白的连续表位范围为肽段(59-75)，氨基酸序列为DWSFYLLYYTEFTPTEK；Trypsin得到β2-微球蛋白的连续表位范围为肽段(59-75)，氨基酸序列为DWSFYLLYYTEFTPTEK。得知β2-微球蛋白的表位范围在肽段(59-69)之内，即DWSFYLLYYTE。
(4)合成肽段的亲和质谱分析01--SFYLLYYTE，02---DWSFYLLYY，03---SFYLLY，04---FYLLYY；这四个肽段分别与单克隆抗体免疫共沉淀，并进行质谱分析结果表明，01和02样品能与抗体相结合，而03和04则不与抗体发生免疫共沉淀反应。01和02样品能与抗体相结合，那么两者的相同序列的肽段—SFYLLYY可以与抗体结合，所以对01和02样品的亲和质谱分析得到的结论是SFYLLYY含有β2-微球蛋白抗原决定簇。03合成的肽段序列则是SFYLLYY在C末端少了一个氨基酸残基Y，即SFYLLY。04合成的肽段序列则是SFYLLYY在它N末端少了一个氨基酸残基S，对03和04所做的亲和质谱分析可知03和04则不与抗体发生免疫共沉淀反应，不和抗体相结合。
因此通过01、02、03和04样品的亲和谱分析得到的结果的是β2-微球蛋白抗原决定簇的氨基酸序列为SFYLLYY实施例2利用本发明的抗原表位肽从患者血清中筛选出了阳性血清，制备相对应的抗体，并采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测了抗原表位SFYLLYY的相应抗体在患者血清中与健康者的血清之间的滴度水平，50例样本证实患者的血清滴度水平明显高于健康者，统计学差异p＜0.01。
将β2-微球蛋白表位肽植入小鼠体内免疫小鼠，免疫2次后，运用ELISA和Westen Blot检测特异性的抗体的产生。实验证明产生的抗体血清能够与β2-微球蛋白特意性结合。此实验结果表明β2-微球蛋白的一个抗原表位肽SFYLLYY与合适的载体耦联后具有与β2-微球蛋白相似的免疫原性，进一步就可以将其用于制备新型疫苗和药物。
序列表<110>中国科学院长春应用化学研究所<120>β2-微球蛋白的抗原表位及应用<160>1<210>1<211>7<212>PRT<400>1Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr1 权利要求
1.β2-微球蛋白的抗原表位，其特征在于具有下式所示的氨基酸序列位于(61-67)位点，氨基酸序列为SFYLLYY。
2.如权利要求1所述的β2-微球蛋白的抗原表位的多肽的应用，其特征在于以任何形式用于制备新型的抗多种肿瘤，如肺癌、肾癌、乳腺癌、消化系统恶性肿瘤疫苗或药物。
3.如权利要求1所述的的β2-微球蛋白的抗原表位的多肽的应用，其特征在于做为靶蛋白用于开发新的药物和诊断试剂盒。
全文摘要
本发明涉及采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱与亲和分离方法研究β2－微球蛋白的抗原表位。该抗原表位的氨基酸序列位于第61－67位点，序列为SFYLLYY。本发明的抗原表位可用于研发新的肽段疫苗，也可用作治疗靶点，可以用于肿瘤相关疾病的诊断与预后的判断提供科学依据。
文档编号A61P35/00GK1831011SQ20061001676
公开日2006年9月13日 申请日期2006年4月14日 优先权日2006年4月14日
发明者刘淑莹, 黎根, 刘志强, 刘宁, 宋凤瑞, 万翠红 申请人:中国科学院长春应用化学研究所