专利名称:一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法与应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及一种从动物体中得到提取物的制备方法与应用,特别是以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法与应用。
背景技术:
水蛭,俗称蚂蟥,是蛭纲动物的总称。它是我国传统名贵中药材,具有破血通经、消积散瘀、消肿解毒等功能,临床上用于治疗跌打损伤、目赤肿痛和防治脑中风、高血压、高脂血症、冠心病等心脑血管疾病。
世界上的水蛭有500多种,我国也有97种。
水蛭依其食性不同,可分为非吸血水蛭和吸血水蛭两大类非吸血水蛭以螺类,如田螺、福寿螺等、河蚌等软体动物的汁液为食,主要分布于长江中下游沿岸的省区如湖北、江苏、浙江、上海等。常见的品种是宽体金线蛭Whitman pigra,隶属于无吻蛭目、黄蛭科、金线蛭属,由于其成年个体较大,易采集,因此它一直是中药材市场上的主流品种,目前在国内生产的中成药中,凡是含有水蛭成分的绝大多数都是以宽体金线蛭做为原料。
吸血水蛭以吸吮人和脊椎动物,如牛、青蛙等的血液为生。常见的品种有①菲牛蛭Hirudinaria manillensis,俗称金边蚂蟥,隶属于无吻蛭目、医蛭科、牛蛭属,主要分布于华南的广西、广东和海南等省区;②日本医蛭Hirudonipponia,隶属于无吻蛭目、医蛭科、医蛭属,它在我国分布较广,常见于四川、湖南和江苏等省区。吸血水蛭的个体较小,其成年个体重一般仅是宽体金线蛭的1/5~1/20。由于个体小、采集难、产量低的缘故,故到目前为止,中药材市场上很少见有吸血类水蛭饮片销售。国内仅有1~2家药厂以吸血水蛭为原料生产胶囊。
现代科学研究,如天然产物研究与开发,8(2)54~56;中药材,21(12)599~600;中医药学刊,23(4)705~706;等等表明,水蛭的药理活性强弱取决于其体内活性成分的抗凝酶活性强度,也就是说水蛭的抗凝酶活性强,其药理活性就强,反之就弱。吸血水蛭的抗凝酶活性明显强于非吸血水蛭,而吸血水蛭的抗凝血酶活性成分主要是天然水蛭素Hirudin,非吸血水蛭的抗凝酶活性成分不含天然水蛭素,到目前为止,其活性成分尚未清楚。
众多研究,如水生生物学报,21(2)169~173;中国新药杂志,6(3)186~188;等等报道,天然水蛭素是迄今为止世界上所发现的最强的天然抗凝血酶物质,对人类心脑血管疾病尤其是脑血栓等血栓性疾病有特效,其防治效果是任何物质所不能比拟的。同时相关研究还表明,如生物化学杂志,11(3)321~326;生物学通报,2003,38(3)3~5;等等,水蛭素是由65~66氨基酸组成的低分子酸性多肽,分子量仅为7000,极易溶于水和生理盐水,异常稳定,单纯温度升高到100℃,不影响其活性。
对于吸血水蛭提取物,即水蛭素的制备方法,国内已有申请专利,如申请号为02116727.3的申请,它所采用的干燥方法是冷冻干燥,其设备昂贵,干燥成本高。
发明内容
本发明的目的是提供一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法,它能解决上述水蛭素提取存在的实际问题,具有很强的针对性。
本发明的技术方案是这样实现的一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法,其特征在于该方法通过下述步骤制得1、取吸血水蛭活体或冷冻结冰保存的吸血水蛭尸体,按其重量计算,加入生理盐水或饮用水1~10倍,在胶体磨里反复匀浆2~6次,制得到吸血水蛭浆液。
2、用60~150目筛网将吸血水蛭浆液进行过滤,除去滤渣后得到吸血水蛭滤液。
3、在吸血水蛭滤液中加入辅料,其用量按重量份比为吸血水蛭滤液50~90份,淀粉,如木薯淀粉、玉米淀粉等10~50份,水溶性填充剂,如乳糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糊精等0~5份。
4、按上述配比,将淀粉和/或水溶性填充剂放入吸血水蛭滤液中,搅拌均匀后即得到悬浊液。
5、将上述吸血水蛭悬浊液置于喷雾干燥机内进行喷雾干燥,其条件是进口温度165~195℃,出口温度68~85℃,制得干燥粉末。
6、上述制得的粉末,其主要活性成分是水蛭素,可采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测其天然水蛭素的含量,一般是每克干粉含天然水蛭素60~4000ATU。
本发明的另一个目的是提供具有抗凝血酶活性的水蛭素的应用。
所述的水蛭素,可通过常规的方法,单独做成胶囊、软胶囊、颗粒剂、片剂使用,或与其它动、植物药(或它们的提取物)配成复方制剂,均可用于防治脑中风、高血压、高脂血症、冠心病等心脑血管疾病。
本发明水蛭素的制备方法,其优点在于能最大限度地提取水蛭体内的主要有效活性成分,工艺简单、生产成本较低、产品保存期长、并可采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测其活性成分含量,从而使质量稳定,且携带和服用方便,可为制药提供安全、优质的原料,在临床应用中,根据不同的需要,可以将本发明制成具有针对性的药物。
水蛭素质量控制技术吸血水蛭中主要活性成分是水蛭素,用Markwardt凝血酶直接滴定法可检测其含量。其原理是水蛭素能与凝血酶特异性结合,使凝血酶失活,其结合比例为1∶1,水蛭素的计量单位为国际单位,以ATU表示,凝血酶活性的国际单位为NIH,即1个ATU等于中和1个NIH凝血酶的水蛭素量。
水蛭素含量检测方法取本品粉末约1g,精密称定,精密加入0.9%氯化钠溶液5ml,充分搅拌,浸提30分钟,并时时振摇,离心,精密量取上清夜100μl,置试管(10mm×100ml)中,加入0.5%(牛)纤维蛋白原(以凝固物计)的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(取0.2m0l/L三羟甲基氨基甲烷溶液25ml与0.1m0l/L盐酸溶液约40ml,加水至100ml,调节pH值至7.4)200μl,摇匀,置水浴(37℃±0.5℃)中缓缓滴加每1ml(中)含40U(单位)的凝血酶溶液(每分钟5μl,边滴加边轻轻摇匀)至凝固,记录消耗凝血酶溶液的体积,按下式计算U=C1V1/C2V2W式中U---每1g含凝血酶活性单位,即水蛭素含量,U/g;C1---凝血酶溶液的浓度,μ/ml;C2---供试品溶液的浓度,g/ml;V1---消耗凝血酶溶液的体积,μl;V2---供试品溶液的加入量,μl;W---取样量。
上述水蛭素含量检测方法亦适用于以吸血水蛭为主要原料所制成的各种制剂的质量监测。
具体实施例实施例一取菲牛蛭活体10千克,用干净水冲洗干净后,加入生理盐水100千克,在胶体磨里反复匀浆3次后得到菲牛蛭浆液;用80目筛网将菲牛蛭浆液进行过滤,除去滤渣后得到菲牛蛭滤液104.3千克,因菲牛蛭活体内尚有一些未消化的血液及其本身的蛋白质;在上述滤液中分别加入普通木薯淀粉95千克、乳糖5千克,搅拌均匀后即得到悬浊液204.3千克;将上述悬浊液置于喷雾干燥机内进行喷雾干燥,其条件为进口温度175℃,出口温度78℃,共得到干燥粉末101.5千克,因菲牛蛭活体内尚有一些未消化的血液及其本身的蛋白质;经采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测上述粉末中天然水蛭素的含量为61ATU/克。
实施例二取冷冻结冰保存的日本医蛭尸体30千克,待其溶解后加入饮用水210千克,在胶体磨里反复匀浆4次后得到日本医蛭浆液;用60目筛网将日本医蛭浆液进行过滤,除去滤渣后得到日本医蛭滤液221.7千克,因日本医蛭尸体内尚有一些未消化的血液;在上述滤液中加入玉米淀粉50千克,搅拌均匀后即得到悬浊液271.7千克;将上述悬浊液置于喷雾干燥机内进行喷雾干燥,其条件为进口温度185℃,出口温度81℃,共得到干燥粉末52.9千克,因日本医蛭尸体内尚有一些未消化的血液及其本身的蛋白质;经采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测上述粉末中天然水蛭素的含量为436ATU/克。
实施例三取冷冻结冰保存的菲牛蛭尸体20千克,待其溶解后加入生理盐水20千克,在胶体磨里反复匀浆5次后得到菲牛蛭浆液;用100目筛网将菲牛蛭浆液进行过滤,除去滤渣后得到菲牛蛭滤液26.6千克,因菲牛蛭尸体内尚有一些未消化的血液;在上述滤液中分别加入普通木薯淀粉3千克、甘露醇0.4千克,搅拌均匀后即得到悬浊液30千克;将上述悬浊液置于喷雾干燥机内进行喷雾干燥,其条件为进口温度168℃,出口温度68℃,共得到干燥粉末4.2千克,因菲牛蛭尸体内尚有一些未消化的血液及其本身的蛋白质;经采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测干燥粉中天然水蛭素的含量为3809.5ATU/克。
实施例四取冷冻结冰保存的菲牛蛭尸体50千克,待其溶解后加入饮用水150千克,在胶体磨里反复匀浆3次后得到菲牛蛭浆液;用70目筛网将菲牛蛭浆液进行过滤,除去滤渣后得到菲牛蛭滤液164.3千克,因菲牛蛭尸体内尚有一些未消化的血液;在上述滤液中分别加入普通木薯淀粉40千克、麦芽糊精10千克,搅拌均匀后即得到悬浊液214.3千克;将上述悬浊液置于喷雾干燥机内进行喷雾干燥,其条件为进口温度178℃,出口温度75℃,共得到干燥粉末54.2千克,因菲牛蛭尸体内尚有一些未消化的血液及其本身的蛋白质;经采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测干燥粉中天然水蛭素的含量为599.6ATU/克。
实施例五取实施例一所得的粉末100克(其天然水蛭素含量为61ATU/克),按常规方法制成胶囊,0.3克/粒(水蛭素含量为18.3ATU/粒)。日服2~3次,每次2~4粒,可防治高脂血症、高血粘等疾病。
临床试验结果治疗高脂血症108例,有效77例,显效25例,无效6例,总有效率94.4%。
实施例六
取实施例三所得的粉末30克(其水蛭素含量为3809.5ATU/克),药用淀粉870克,两者混合、拌匀,按常规直接压片法制片,0.3克/片(水蛭素含量为38.1ATU/片)。日服2~3次,每次2~4片,对治疗经闭、脑中风的后遗症如半身不遂、肢体麻木等有显著的效果。
临床试验结果吕××,女,44岁,广西经济管理干部学院教师,2004年5月以来,经期异常,时间长短不一,有时提前,有时推迟,月经量减少,每月的月经量仅是原来正常时的1/5~1/10,经多次服用调经胶囊和中药单方,效果不佳。2005年12月15日开始服用实施例五的片剂,每天2次,每次4片,服用30天,其间的月经量明显增多,整个经期的月经量达到200毫升,比未服用前的50毫升增加了四倍,继续服用60天后,整个经期的月经量达到了400毫升,已恢复到原来的正常水平。在这以后停止服用,到2006年5月31日经期和月经量都很正常。
权利要求
1.一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法,其特征在于该方法包括下述步骤①制浆步骤常在常温下,将吸血水蛭活体或尸体加入生理盐水或饮用水,粉碎制成吸血水蛭浆,经过滤取吸血水蛭滤液;②配制悬浊液步骤在吸血水蛭滤液中加入辅料制成吸血水蛭悬浊液;③干燥步骤采用喷雾干燥法将吸血水蛭悬浊液进行喷雾干燥,得到粉末成品。
2.根据权利要求1所述的一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法,其特征在于所用的生理盐水或饮用水为吸血水蛭重量的1~10倍,并用胶体磨制成浆液。
3.根据权利要求1所述的一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法,其特征在于用60~150目筛网对吸血水蛭浆液进行过滤得到吸血水蛭滤液。
4.根据权利要求1或3所述的一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法,其特征在于在吸血水蛭滤液中加入的辅料为淀粉和水溶性填充剂,其用量按重量份比为吸血水蛭滤液50~90份,淀粉10~50份,水溶性填充剂0~5份。
5.根据权利要求1所述的一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法,其特征在于采用喷雾干燥法将吸血水蛭悬浊液进行喷雾干燥,其条件是进口温度165~195℃,出口温度68~85℃。
6.根据权利要求1所制得的水蛭素的应用,其特征在于该水蛭素通过常规的方法可单独做成胶囊、软胶囊、颗粒剂、片剂,或与其它动、植物药或它们的提取物配成复方制剂。
7.根据权利要求6所述水蛭素的应用,其特征在于所述单独或配成复方的制剂,均可用于防治脑中风、高血压、高脂血症、冠心病及相关的心脑血管疾病。
全文摘要
本发明公开了一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法与应用,该制备方法的特征在于包括吸血水蛭制浆、配制悬浊液和干燥三个步骤,所得到的粉末,它保存了吸血水蛭最主要的有效活性成分——天然水蛭素。本发明具有工艺简单、生产成本较低、产品保存期长、并可采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测天然水蛭素含量,从而使质量稳定,产品疗效有保证等特点。水蛭素应用范围广泛,可通过常规的方法单独做成胶囊、软胶囊、颗粒剂、片剂使用,或与其它动、植物药制成复方制剂,用于防治脑中风、高血压、高脂血症、冠心病等心脑血管疾病。
文档编号A61P9/10GK1883510SQ20061001953
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月29日 优先权日2006年6月29日
发明者周维海, 周维官 申请人:周维海