专利名称：C的制作方法
技术领域：
本发明涉及C60-苯甲酸氮芥的应用，尤其涉及C60-苯甲酸氮芥在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
目前，抗肿瘤药(或称化疗药)的给入多是血行途径如动脉灌注、静脉注射等，药代动力学的研究也是基于血循环进行的，这些给药方法对经血行途径的转移灶是有效的。然而血行途径化疗时，化疗药在淋巴系统中的药物浓度极低，既不能有效防止癌细胞向淋巴转移和腹膜转移，同时对淋巴系统转移灶几乎也不起作用。另一方面，淋巴转移与恶性肿瘤的预后及术后复发有很大关系，如胃癌，其是最常见的恶性肿瘤之一，在消化系统恶性肿瘤中占第一位，在全身恶性肿瘤中占第三位。胃癌的治疗，手术为首选，术后再辅以化疗、免疫治疗等。由于胃癌转移途径主要还是淋巴途径，虽然在行胃癌根治性手术时连同区域淋巴结一并切除，但手术时不可避免地会遗漏细小阳性的淋巴结或清扫不到跳跃性转移的淋巴结，还可能在切断淋巴管或挤压肿瘤时造成癌细胞的外逸等等。因此，尽管多年来化疗药物的品种在不断更新，然而，胃癌总生成率至今并无突破性进展。
进一步寻找新的药物和剂型，并探索出更有效的用药途径，达到有效的治疗恶性肿瘤如胃癌和防止癌细胞通过淋巴道转移是非常紧迫的。目前有很多尝试，利用大分子载体如葡聚糖、乳剂、脂质体、活性炭和微球等载带肿瘤药物，起到靶向治疗的效果，其中研究得最多的是活性炭，日本学者将氨甲蝶呤吸附于活性炭，皮下注射于模型小鼠，荷瘤鼠生存期显著延长。在临床实验中胰腺癌患者口服和胃癌术前和术后化疗，结果复发率显著降低。作为碳的同分异构体C60代替活性炭载带药物具有很大的优越性，主要表现在(1)与活性碳不同，水溶性C60衍生物在体内能代谢，排泄，体内无积累，实验证明无急性毒性，因此能避免使用活性炭导致较多的并发症，长期预后较差的弊病；(2)C60有30个双键，可以通过多种方式和各种抗癌化疗药物联结，因而药物品种和研制方法有较大选择和优化的空间；(3)富勒烯衍生物分子组成和结构明确，粒径较小，大小均匀，能载带足够的荷药量，且比活性炭更容易进入病变组织甚至癌细胞。
氮芥类药物属烷化剂类抗肿瘤药物，属于细胞周期非特异性药物，虽然氮芥是一个用于恶性淋巴肿瘤、肺癌、头颈部癌、慢性白血病、乳腺癌、卵巢癌及绒癌等恶性肿瘤治疗的药物，但是由于氮芥类药物毒副作用比较大，在临床应用上有一定的限制性。
文献(V.P.Gubskaya，N.P.Konovalova et al.Synthesis of new functionallysubstituted fullereopyrrolidines.Russian Chemical Bulletin，International Edition，Vol.51，No.9，pp.1723-1726)已报到了C60-苯甲酸氮芥及其制备方法，其结构如式I所示，但是还没有报道该化合物在抗肿瘤方面的应用。
式I
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于氮芥以C60为载体药物的应用，进一步开创C60在医药领域的应用，并开发氮芥类药物在消化道肿瘤治疗中的新用途。
因此，本发明是提供式I所示的C60-苯甲酸氮芥在制备抗肿瘤药物中的应用。
式I。
所述的肿瘤包括胃癌、肺癌、头颈部癌、慢性粒细胞白血病、肝癌、乳腺癌或前列腺癌等，优选胃癌。
该肿瘤还可为淋巴原发或转移性肿瘤，淋巴系统原发性肿瘤如恶性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白细胞，而转移性肿瘤则通常由上述胃癌、肺癌等肿瘤经淋巴转移至淋巴管道或淋巴结中的肿瘤。
本发明成功地用放射性核素125I对C60-苯甲酸氮芥进行了标记，利用放射性核素的示踪作用，得到了C60-苯甲酸氮芥在SD大鼠体内的摄取、分布和代谢数据，结果表明，大鼠胃中的放射性摄取率高达60％ID/g以上。而且，在肿瘤细胞及原位胃癌模型的疗效实验中，发现与其他几个对照组(苯甲醛氮芥、活性炭-苯甲醛氮芥相比)，本发明涉及的C60-苯甲酸氮芥对胃癌的抑制率最高，其高的胃癌抑制率与C60-苯甲酸氮芥的高的胃摄取有一定的关系。总之，本发明的C60-苯甲酸氮芥可以提高对机体肿瘤组织的杀伤作用，抑瘤率高于氮芥。
图1为125I-C60-苯甲酸氮芥在大鼠体内的分布示意图。
具体实施例方式
C60-苯甲酸氮芥的制备(具体见文献V.P.Gubskaya，N.P.Konovalova etal.Synthesis of new functionally substituted fullereopyrrolidines.RussianChemical Bulletin，International Edition，Vol.51，No.9，pp.1723-1726)将216mg(0.6mmol)C60(富勒烯)溶于200mL甲苯，加入53mg(0.6mmol)肌氨酸和74mg(0.3mmol)苯甲醛氮芥，在110℃油浴中加热回流10h，溶液由紫红色变为红色。将所得溶液旋转蒸发至干，得一棕黑色固体，柱层析(硅胶H300～400目，正己烷装柱)分离，先用正己烷洗去未反应的富勒烯，然后用体积比为1∶1的正己烷和甲苯的洗脱液淋洗，洗下C60单加成物，挥干溶剂，得到96mg棕褐色固体，产率42％。
实施例1125I-C60-苯甲酸氮芥在大鼠体内的分布C60-苯甲酸氮芥的放射性标记a.C60-苯甲酸氮芥的碘化 称取11mg C60-苯甲酸氮芥溶于含30mLCH2Cl2及5mL CHCl3的混合溶剂中，加入ICl溶液约2mL，避光下室温反应5天；用50mL 10％Na2S2O3分两次洗去过量的ICl，浓缩有机相，过硅胶柱收集深褐色产品带。
b.125I的同位素交换法标记 将5mg碘化后的C60-苯甲酸氮芥溶于10mL0.5mM的甲苯中，取0.5mL装在安瓿管中，再加20μL Na125I溶液(10微居里)，将安瓿管封好后置130℃油浴中反应1小时进行同位素交换；油浴完毕，以体积比为8∶2的乙酸乙酯和甲苯为展开剂在新华一号滤纸上展开，碘标的C60-苯甲酸氮芥的Rf＝0.9，125I-在原点位置，标记率达94.5％。
125I-C60-苯甲酸氮芥在大鼠体内的分布 取30只SD大鼠，随机分成5组，每组6只，取已标记好的125I-C60-苯甲酸氮芥按200μL/只的剂量通过大鼠足下皮垫注入体内，各组在给药后不同时间段(0.5h、1h、2h、6h、24h)处死并解剖，取重要的脏器和组织(血液、心脏、肺、肝、脾、肾、胃、肌肉、淋巴、脑)，分别称重，并用γ射线探测器测量放射性计数，计算每克脏器的放射性计数占注射量的百分比(％ID/g)。
结果标记化合物在大鼠内的分布见图1，从图1中可以看出标记化合物能直接很快进入血液或通过淋巴道进入血液，其中胃的摄取最高，在1小时时高达70％以上，各时相的淋巴药物浓度大体与同时相的血药浓度相当，说明C60-苯甲酸氮芥有一定的淋巴靶向性。
实施例2 C60-苯甲酸氮芥在体外对肿瘤细胞的抑制作用C60水溶液的制备 将2.88mg C60(富勒烯)溶于100mL甲苯，90mg聚乙烯基吡咯烷酮溶于100mL氯仿，再将两者混匀后旋转蒸发除去溶剂，将除去溶剂后的残余物用10mL纯水溶解得浅黄色C60PVP溶液。
苯甲醛氮芥水溶液的制备 将0.98mg苯甲醛氮芥溶于100mL无水乙醇，90mg聚乙烯基吡咯烷酮溶于100mL氯仿，再将两者混匀后旋转蒸发除去溶剂，将除去溶剂后的残余物用10ml纯水溶解得无色苯甲醛氮芥PVP溶液。
C60-苯甲酸氮芥水溶液的制备 将3.976mg C60-苯甲酸氮芥溶于100mL体积比为1∶1甲苯和二硫化碳的混合溶剂中，将90mg聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)溶于100mL氯仿，再将两者混匀后旋转蒸发除去溶剂，将除去溶剂后的残余物用10mL纯水溶解得棕黄色C60-苯甲酸氮芥PVP溶液。
C60-苯甲酸氮芥在体外对肿瘤细胞的抑制作用 取指数生长期的S180肿瘤细胞、Lewis肿瘤细胞，制成0.5×106个/mL细胞悬液，然后按2mL/孔加入6孔培养板中，每组6孔，每孔各加入2mL相应下列制剂并分组A生理盐水组、B C60组、C苯甲醛氮芥组、D C60-苯甲酸氮芥。置37℃5％的CO2孵箱中孵育24小时，然后收集细胞，进行PI染色，分析细胞凋亡情况。
结果发现在体外，在A、B、C、D四种不同物质作用下，S180细胞的凋亡率分别为20.0％、28.6％、38.5％、41.5％，Lewis细胞细胞凋亡率则分别为22.5％、29.4％、39.1％、42.0％。该数据表明C60-氮芥组、氮芥组S180细胞、Lewis细胞凋亡率高于C60组、生理盐水组，但C60-氮芥组、氮芥组组间细胞凋亡率无明显差异。
实施例3 C60-苯甲酸氮芥对原位胃癌肿瘤的抑制作用活性炭-苯甲酸氮芥水溶液的制备 将0.98mg苯甲醛氮芥溶于100mL无水乙醇，加入3mg活性炭，将两者混匀后旋转蒸发除去溶剂，将除去溶剂后的残余物用10ml纯水超声分散得黑色活性炭-苯甲酸氮芥水溶液。
苯甲醛氮芥水溶液、苯甲醛氮芥水溶液、C60-苯甲酸氮芥水溶液的制备同实施例2。
C60-苯甲酸氮芥对原位胃癌肿瘤的抑制作用 取雄性体重为20g左右的BABL/c nu/nu裸小鼠，原位种植胃癌，荷瘤鼠随机分成五组，其中生理盐水组15只，其他组每组10只，分别给予相应下列制剂0.025mmol/kg1)生理盐水组、2)C60组、3)苯甲醛氮芥组、4)活性炭-苯甲酸氮芥组、5)C60-苯甲酸氮芥组。腹腔给药，隔天给药第9周处死动物，测量原位肿瘤最大径a和最小径b，用公式V＝ab2/2计算肿瘤体积，计算各组的抑瘤率，抑瘤率＝(V对照组-V实验组)/V对照组×100％。
表1
注1为生理盐水组，2为C60组，3为苯甲醛氮芥组，4为活性炭-苯甲酸氮芥，5为C60-苯甲酸氮芥。
结果对原位胃癌模型的药效分析中(见表1)，发现与其他几组相比，C60-苯甲酸氮芥的抑瘤效果最好，抑瘤率可到69.7％，C60的抑瘤率为21.1％，苯甲醛氮芥的抑瘤率为33.6％，并且C60-苯甲酸氮芥能有效抑制肿瘤细胞的腹膜转移和淋巴结转移。
结论在体外与苯甲醛氮芥相比，C60的引入并没有提高氮芥对细胞的抑制率。但是从体内结果来看，C60的引入能提高氮芥对机体肿瘤组织的杀伤作用，是因为其不仅对原位肿瘤及经血行播散肿瘤进行杀伤，并且还明显抑制腹膜、淋巴结等经淋巴道的转移。这与其在胃及淋巴中的高的摄取率及较长的滞留时间有关，因此本发明的C60-苯甲酸氮芥除对现有氮芥有效的各种肿瘤及其淋巴转移肿瘤有更佳的防治作用外，还对胃癌的防治具有较佳的效果。
权利要求
1.式I所示的C60-苯甲酸氮芥在制备抗肿瘤药物中的应用， 式I。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于该肿瘤为胃癌。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于该肿瘤为淋巴原发或转移性肿瘤。
全文摘要
本发明公开了一种基于氮芥以C
文档编号A61P35/00GK101057842SQ20061002595
公开日2007年10月24日 申请日期2006年4月21日 优先权日2006年4月21日
发明者冉铁成, 李晴暖, 徐晶莹, 李文新 申请人:中国科学院上海应用物理研究所