专利名称：灵芝孢子精油复方软胶囊制剂及其制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明公开一种灵芝孢子精油复方软胶囊制剂及其制备工艺。它对各种原因引起的免疫功能低下均有作用，可用于预防疾病、病后康复、增强体质、亚健康状态人群中的免疫力低下者。
背景技术：
近半个世纪以来，严重威胁人类的疾病已不是霍乱等急性传染病，而是找不到病原体的非感染性疾病，如心脑血管病、癌症等，而这些患者的前期均是处于亚健康状态。据世界卫生组织调查表明仅占世界总人口的15％左右的人完全处于健康状态，患有多种疾病的患者也仅有15％左右，而处于“亚健康”状态人群却高达60～70％。“免疫力低下”是一切疾病的根源，是许多疾病的“可口诱饵”，尤其是各种慢性病、常见病。全世界约有80％以上的疾病是由免疫力低下引起的，日益恶化的环境、不合理的饮食结构、人口密度的增加、生活节奏加快、工作竞争力增强、巨大的精神压力，都会使人免疫力下降。人类虽然已跨入了21世纪，但许多疾病一时难以被治愈。因此科学家们卓有远见地提出21世纪的保健是提高人体免疫力的时代，因为人类80％的疾病都是与身体免疫机能的退化与失调有关。提高人体抗病能力要从生命培基—修复活化细胞开始，并综合调节人体生态平衡，主要是提高人体免疫力，这才是人类健康长寿的根本，人类保健的实质。因此开发提高免疫力保健食品是社会的需要。再加上随着生活水平提高和医学科学的进步，世界人均寿命不断延长，我国老年人口已达1.3亿，老年人体质差、免疫力下降，导致医疗保险费用支出迅速上升，再加上服用药物的毒副作用的危害，使人们认识到预防疾病、保持身体健康用增强免疫力的保健食品更合算、更安全。市场增强免疫功能的保健食品品种较多，目前虽然经国家食品药品监督局网站统计，新批准的提高免疫力的产品有260余种，但主要原料为人参、西洋参、蜂胶类、大蒜、灵芝，灵芝孢子粉等，且大多数是单方，灵芝孢子油也有两种均是单方，且大部分采用经典法提取制备，产品没有克服黑、大、粗，或服用不方便、有副作用，或功效成分不明确，效果不显著，存在诸多问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种破常规生产、常规配方的提高人体免疫力的保健食品，公开一种能显著增强免疫力且无毒性的灵芝孢子精油复方软胶囊制剂及其制备工艺，是应用中医理论遗药组方按君、臣、佐、使组成复方，发挥多成分、多通道、多靶点协同作战，采用高新技术超临界流体萃取和半仿生提取技术，使功效成分更富集、生物利用度高、易被人体吸收的新剂型软胶囊。
本发明是这样实现的一种灵芝孢子精油复方软胶囊制剂，包括灵芝孢子粉，其特征在于组份中还包括红景天、刺五加、黄精和绞股蓝，各组份的重量配比为灵芝孢子粉800～1200g、红景天800～1200g、刺五加800～1200g、黄精200～500g、绞股蓝400～700g。
其制备工艺分为药材提取工艺和软胶囊制备工艺。
1、药材提取工艺1)提取药材A破壁率98％以上的灵芝孢子粉用萃取压力30Mpa、萃取温度55℃、萃取时间3h采用超临界流体萃取工艺萃取，提取物分离精制成为灵芝孢子精油A；2)提取药材B刺五加、绞股蓝分别切片制成饮片，然后用4～5倍量70％乙醇溶液回流二次，每次1.5h，提取液过滤后弃去药渣，滤液减压浓缩干燥，制得提取物粉末B；3)提取药材C红景天切片制成饮片，然后用4～5倍量95％乙醇溶液回流二次，每次1.5h，提取液过滤后弃去药渣，滤液减压浓缩干燥，制得提取物粉末C；4)提取药材D黄精切片制成饮片，采用半仿生提取法，在40℃、pH6.0的水溶液中提取二次，每次1.5h，提取液过滤后弃去药渣，滤液减压浓缩干燥，制得提取物粉末D；5)将提取物粉末B、提取物粉末C和提取物粉末D混合，制得固体提取物混合物粉末。
2、软胶囊制备工艺将药材提取工艺中灵芝孢子精油A，在40℃加入大豆色拉油搅匀，将药材提取工艺制得的固体提取物混合物粉末在搅拌下加入灵芝孢子精油和大豆色拉油的混合油中，搅匀后过胶体磨，在100目网筛中过滤，重复操作二次，制得的混悬液在40℃下保温，存放在贮药桶内。另外，将明胶加水浸泡成为明胶液，与甘油、水按10∶4∶12的比例混合成明胶液混合物，刮去泡沫后在40℃下保温，存放在贮液桶内。然后，将贮药桶内的灵芝孢子精油混合物与贮液桶内的明胶混合物混合制成软胶囊，制成后的软胶囊在20℃下保温获得成型软胶囊，经整粒后，软胶囊用90％的酒精洗涤、吹干，制成成品软胶囊，最后通过化验检验后，将合格产品包装，本发明产品制备完成。
本发明药材提取工艺中灵芝孢子精油工艺过程采用超临界流体萃取工艺；黄精提取成提取粉末D工艺过程采用半仿生提取法，软胶囊制备工艺中的灵芝孢子精油与固体提取物粉末制成混悬液的工艺采用胶体磨工艺，获得的灵芝孢子精油软胶囊中内容物的细度达微米级。本发明功效性成分总多糖达到1745mg/100g，红景天苷≥363.6mg/100g。
中药中的活性成分提取分离是保证保健食品功效和质量的关键，起着至关重要的作用。从现有大多数产品来说常采用水煮、醇提等经典提取工艺，其方法缺点提取粗糙，产品黑、大、粗、重金属超标、有机溶剂残留等一系列缺点。因此本产品的研制过程中采用了一些高新技术、新方法，例如超临界流体萃取和半仿生提取技术，使活性成分充分富集。
超临界流体萃取是近十几年来世界上发展迅速的一种高新提取、分离技术，它常以超临界CO2为提取溶剂，方法萃取效率高、选择性强、快速、特别对挥发性、脂溶性成分及受热易破坏、氧化的活性成分提取具有独特的优势，产品无溶剂残留、无污染，与传统工艺比较有明显的优势，可使活性成分充分富集，例如灵芝孢子粉中每克含三萜类活性成分仅十几毫克，灵芝孢子粉经超临界萃取，每克灵芝孢子精油中含三萜类活性成分达200毫克以上，高的可达370毫克以上，提高数十倍。
半仿生提取法也是一种先进生产工艺，该法模拟口服给药途径，经胃肠道转运的环境，以一定PH和温度条件下提取，可使活性成分充分富集，较传统水煮法有明显优势，例如提取黄精等中的多糖类活性成分药材中仅含多糖1％～3％经半仿生提取可达到18～29％以上。
中药的剂型因受许多条件限制，无论制备技术、剂型选择上均存在不少问题，特别对固体药物来说其分散状态尤其重要，它直接影响到药物的溶出和吸收。例如灵芝孢子是一种功效很好的中药，在保健食品中不管是灵芝孢子粉或灵芝孢子胶囊，往往是原药直接制成，药物粒度大，因此人体吸收速度慢、吸收不完全，影响功效的发挥。本发明由于采取了新的提取技术，将灵芝孢子粉中挥发性脂溶性成分用超临界流体萃取法提取，将灵芝孢子粉及其他药材中的多糖类以半仿生提取法提取，将其提取的固体活性成分粉末和灵芝孢子油采用新的粉碎技术胶体磨，使提取物粉末达到微粉化，研磨成小于1um以下的微粉并均匀混悬于油中制成软胶囊，这样使其能成倍地提高溶出速率，极容易吸收、生物利用度高，克服了服用灵芝孢子粉后的恶心、吸收不完全的缺点，功效作用大大提高。
本发明应用经国家卫生部批准的药食同用或可用于保健食品的中药，科学配伍组方，经高新技术超临界流体萃取、半仿生技术等先进工艺，将具有显著增强免疫功能的灵芝孢子粉、黄精、红景天、刺五加、绞股蓝中活性成分充分富集，制成生物利用度高的复方软胶囊制剂，经功能性试验，安全性毒理试验等，证明本品是一种功效显著、无毒性、服用方便、功效成分明确、含量可以测定的增强免疫力的新颖保健食品。
本发明经江苏省疾病预防控制中心试验证明，既具有增强小鼠体液免疫功能，又具有增强小鼠细胞免疫功能，还具有增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的作用，即具有增强免疫力的保健功能，而且经安全性毒理试验证明本发明产品为无毒级新颖产品，达到了有益效果，具有较高的科学性。本发明产品由于功效明显，安全性高，既适用于中、老年人的预防疾病、病后康复、增强体质，也适用于亚健康状态人群、免疫力低下者，具有很好的实用性。
具体实施例方式实施例1根据上述灵芝孢子粉1200g、红景天1200g、刺五加1200g、黄精360g、胶股蓝600g。
实施例2灵芝孢子粉1000g、红景天1000g、刺五加1000g、黄精300g、胶股蓝500g。
实施例3灵芝孢子粉900g、红景天900g、刺五加900g、黄精270g、胶股蓝450g。
灵芝孢子精油软胶囊的增强免疫功能试验及安全性毒理试验(一)灵芝孢子精油软胶囊的增强免疫功能动物实验选用18～22g健康雌性或雄性二级ICR小鼠(动物证号scxk(苏)2002-0030号)，分批按体重随即各分为4组，每组10只共分五批(3批雌性和2批雄性)分别以1100mg/kg、366.7mg/kg、183.3mg/kg作为高、中、低剂量组(分别相当于人体推荐量的30、10、5倍)，经口每天给予灵芝孢子精油软胶囊共30天，分别进行(1)小鼠脾淋巴细胞转化试验和NK细胞活性测定；(2)二硝基氟苯诱导小鼠迟发性变态反应(DTH)试验；(3)小鼠碳廓清试验；(4)抗体生成细胞检查和血清溶血素测定；(5)小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。
1.细胞免疫功能试验，硝基氟诱导小鼠迟发性变态反应(DTH)由下表可见，各剂量组小鼠的耳廓肿胀度均高于溶剂对照组值，且随剂量增加而增加，经方差分析及两两比较统计学处理，各剂量组均有统计学显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)。提示灵芝孢子精油软胶囊可增强DNFB引起的小鼠迟发性变态反应。
表灵芝孢子精油软胶囊对小鼠耳廓迟发性变态反应的影响
2.细胞免疫功能试验，ConAi诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法)由下表可见，各剂量组光密度差值均高于溶剂对照品组值，且随剂量增加而增加，经方差分析及两两比较统计学处理，中、高剂量组有统计学显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)。提示中、高剂量灵芝孢子精油软胶囊具有增强小鼠淋巴细胞增殖能力。
表灵芝孢子精油软胶囊对小鼠脾淋巴细胞转化的影响
3.体液免疫功能试验，抗体生成细胞检测(Jeme改变玻片法)由下表可见，各剂量组空斑数均高于溶剂对照品组值，且随剂量增加而增加，经方差分析及两两比较统计学处理，中、高剂量组空斑数与对照品组值相比，有统计学差异(P＜0.05，P＜0.01)。提示中、高剂量灵芝孢子精油软胶囊具有增强小鼠产生抗体细胞能力。
表灵芝孢子精油软胶囊对小鼠脾抗体生成细胞的影响
4.体液免疫功能试验，血清溶血试验由下表可见，各剂量组小鼠血清半数溶血值(HC50)与均高于对照品组值，经方差分析及两两比较统计学处理，高剂量组有统计学显著性差异(P＜0.05)。提示高剂量灵芝孢子精油软胶囊可增强小鼠血清溶血素能力。
表灵芝孢子精油软胶囊对血清溶血素试验影响
5.单核-巨噬细胞功能试验，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞由下表可见，各剂量组小鼠的吞噬率和吞噬指数均高于溶剂对照品组，经方差分析及两两比较统计学处理，与对照组相比，中、高剂量组吞噬率及各剂量组吞噬指数均有统计学差异(P＜0.05，P＜0.01)。提示灵芝孢子精油软胶囊具有增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的作用。
表灵芝孢子精油软胶囊对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响(x±s)
结论经口给予小鼠不同剂量的灵芝孢子精油软胶囊30天，对小鼠体重增长无影响；低、中、高剂量灵芝孢子精油软胶囊均可增强DNFB引起的小鼠迟发性变态反应和增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力；中、高剂量灵芝孢子精油软胶囊具有增强小鼠淋巴细胞增殖能力和增强小鼠产生抗体生成细胞的能力；高剂量灵芝孢子精油软胶囊具有增强小鼠产生血清溶血素能力。根据保健食品增强免疫力功能评价标准，灵芝孢子精油软胶囊具有增强免疫力的功能。
(二)灵芝孢子精油软胶囊安全性毒理试验1.灵芝孢子精油软胶囊小鼠急性经口毒性试验选择健康ICR小鼠20只，雌雄各半，体重18～22g，设计剂量为1500mg/kgb.wt.，称取样品1500mg，加色拉油至20ml，配制成受试物。小鼠禁食过滤后，24小时内一次灌胃给予，观察14天。
结果各剂量组小鼠灌胃后，灵芝孢子精油软胶囊对动物体重增长无明显不良反应，经口给予后未见明显中毒表现，观察期内无动物死亡。本实验雌雄小鼠经口MTD均大于15000mg/kgb.wt.，根据小鼠急性经口毒性分级标准，该样品属无毒级。详细结果见下表。
表灵芝孢子精油软胶囊对小鼠体重的影响(x±s)
表灵芝孢子精油软胶囊急性毒性观察情况
2.Amesi试验称取受试物500mg，用二甲基亚砜(DMSO)定容至10ml，37℃提取24小时，离心取上清夜，并以次连续用DMSO作5倍稀释，共设5个剂量组，2个溶剂对照组，另设3个阳性对照组，阳性对照物敌克松(Dexon)和2-氨基芴(2-AF)1.8-二基蒽醌分别用双蒸水和DMSO溶解，用平板掺入法对经鉴定符合要求的各菌株TA97a、TA98、TA100和TA102进行Amesi试验，共测试两次，每次每个剂量对平行样3个。
实验结果两次试验，样品各计量组的回变菌落数，不论加s9与否，均未超过相应溶剂对照值的两倍，也无剂量—反应类系，因此灵芝孢子精油软胶囊对标准测试菌TA97a、TA98、TA100和TA102均未检出明显的诱变活性。
3.小鼠微核试验取健康ICR小鼠50只，体重25～30g，雌雄各半，按体重随机分入2500、5000、10000mg/kgb.wt.各3个剂量组，1个溶剂对照组(色拉油)，一个阳性对照组(环磷酰胺40mg/kgb.wt.)，每组10只，雌雄各半，各组均用30小时两次灌胃法(间隔24小时)，每次灌胃容量均为20ml/kg，第二次灌胃后6小时杀鼠，取股骨骨髓悬于小牛血清中直接涂片，固定、染色、镜检嗜多染红细胞1000个/鼠，计算具有微核的细胞，观察嗜多染红细胞和正染红细胞比率(PCE/NCE)。
结果各样品受试组的微核率与溶剂对照品组相比，均无显著差异，也无剂量—反应关系，阳性对照组微核率与溶剂对照组相比则有极显著差异。各组动物的PCE/NCE比率均大于0.1，提示骨髓红细胞系统的增值并无明显受抑，对嗜多染红细胞微核的观察无明显影响，故在受试剂量条件下，灵芝孢子精油软胶囊对小鼠骨髓嗜多染红细胞无诱发微核作用，详见表。
表灵芝孢子精油软胶囊对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果(x±s)
4.小鼠睾丸初级精母细胞染色体畸变分析取雄性ICR小鼠25只，体重25～30g，按体重随机分入3个样品剂量组，一个溶剂组(色拉油)和一个阳性对照品组(取丝裂霉毒C(MMC)2mg/g加生理盐水10ml使成0.2mg/ml)，每组5只。样品各剂量组和溶剂对照品组动物连续灌胃5天，每次灌胃容量均为20ml/kg，每天一次。阳性对照物丝裂霉素C(MMC)以10mg/kg的量一次腹腔注射。各组动物均处于死前6h腹腔注射积水仙素4mg/kg，实验第12天，杀鼠取睾丸，按开精曲细管，低渗、固体、软化、制片、染色、镜检。
结果各样品剂量小鼠具染色体畸变的初级精母细胞率与溶剂对照值之间均无统计学差异，也无剂量—反应关系。阳性对照值与溶剂对照值之间有极显著的差异，故在受试剂量条件下，未检出灵芝孢子精油软胶囊对雄性小鼠睾丸初级精母细胞染色体的诱变活性，见下表。
表灵芝孢子精油软胶囊对小鼠睾丸初级精母细胞染色体畸变试验结果(x±s)
5.30天喂养试验选择4周龄SD大鼠，雌雄各40只，将推荐人日服剂量2200mg/日，即37mg/kgb.w/d设0(基础饲料对照)、1833、3667和5500mg/kg b.w/d(相当于推荐剂量50、100、150倍)各4个剂量组，分别称取样品0、1833、3667、5500mg拌入基础饲料100g，以每日100g/kg b.w的摄食量给予大鼠自由食用，喂养大鼠30天，进行观察和测定各项指标，结果显示动物活动、生长正常；各剂量组体重、30天食物利用率、脏体比一对照组比较无显著性差异(p＞0.05)；雌雄各剂量组的血液检测值、生化指标检测值均在正常波动范围内；高剂量雌雄大鼠实际摄入量分别相当于推荐剂量的148和156倍，未显示对病理组织学有不良影响。试验结果表明灵芝孢子精油软胶囊对各项受试指标均未见有明显的毒性，30天喂养的NOAEL值为5500mg/kg/d。
结论经安全性毒理试验，结果表明灵芝孢子精油软胶囊经口MTD值大于15000mg/kgb.wt，30天喂养的NOAEL值为5500mg/kg/d，未检出明显的诱变活性，致微核作用，睾丸初级精母细胞染色体的诱变活性属无毒级。
权利要求
1.一种灵芝孢子精油复方软胶囊制剂，包括灵芝孢子粉，其特征在于组份中还包括红景天、刺五加、黄精和绞股蓝，各组份的重量配比为灵芝孢子粉800～1200g、红景天800～1200g、刺五加800～1200g、黄精200～500g、绞股蓝400～700g。
2.根据权利要求1所述的灵芝孢子精油复方软胶囊制剂，其特征在于各组份的重量配比为灵芝孢子粉1200g、红景天1200g、刺五加1200g、黄精360g、绞股蓝500g。
3.根据权利要求1所述的灵芝孢子精油复方软胶囊制剂，其特征在于各组份的重量配比为灵芝孢子粉1000g、红景天1000g、刺五加1000g、黄精300g、绞股蓝500g。
4.根据权利要求1所述的灵芝孢子精油复方软胶囊制剂，其特征在于各组份的重量配比为灵芝孢子粉900g、红景天900g、刺五加900g、黄精270g、绞股蓝450g。
5.根据权利要求1所述的灵芝孢子精油复方软胶囊制剂，其特征在于功效性成分总多糖达到1745mg/100g，红景天苷≥363.6mg/100g。
6.由权利要求1～4中任意一项灵芝孢子精油复方软胶囊制剂的制备工艺，工艺分为1)药材提取工艺A破壁率98％以上的灵芝孢子粉用萃取压力30Mpa、萃取温度55℃、萃取时间3h萃取，提取物分离精制成为灵芝孢子精油A；B刺五加、绞股蓝分别切片制成饮片，然后用4～5倍量70％乙醇溶液回流二次，每次1.5h，提取液过滤后弃去药渣，滤液减压浓缩干燥，制得提取物粉末B；C红景天切片制成饮片，然后用4～5倍量95％乙醇溶液回流二次，每次1.5h，提取液过滤后弃去药渣，滤液减压浓缩干燥，制得提取物粉末C；D黄精切片制成饮片，在40℃pH6.0的水溶液中提取二次，每次1.5h，提取液过滤后弃去药渣，滤液减压浓缩干燥，制得提取物粉末D；2)软胶囊制备工艺，将药材提取工艺中灵芝孢子精油A，在40℃加入大豆色拉油搅匀，将药材提取工艺中提取物B、C、D在搅拌下加入灵芝孢子精油及大豆色拉油中，搅匀后过胶体磨，在100目网筛中过滤，重复操作二次，在40℃下保温，存放在贮药桶内，另外将明胶加水浸泡成为明胶液，与甘油、水按10∶4∶12的比例混合成明胶液混合物，刮去泡沫40℃下保温，存放在贮液桶内，然后将贮药桶内的灵芝孢子精油混合物与贮液桶内的明胶混合物混合制成软胶囊，其特征在于药材提取工艺中灵芝孢子精油工艺过程采用超临界流体萃取工艺；黄精提取成提取粉末D工艺过程采用半仿生提取法，软胶囊制备工艺中的灵芝孢子精油与其他提取物制成均匀混悬液工艺采用胶体磨工艺，获得固体颗粒细度达微米级。
全文摘要
本发明为灵芝孢子精油复方软胶囊制剂及其制备工艺，对各种原因引起的免疫功能低下均有作用，可用于预防疾病、病后康复、增强体质、亚健康状态人群中的免疫力低下者，其制剂组份灵芝孢子粉800～1200g、红景天800～1200g、刺五加800～1200g、黄精200～500g、绞股蓝400～700g。制备工艺包括药材提取工艺和软胶囊制备工艺，其特征在于药材提取工艺中灵芝孢子精油工艺过程采用超临界流体萃取工艺；黄精提取工艺过程采用半仿生提取法，软胶囊制备工艺采用胶体磨工艺，获得的灵芝孢子精油软胶囊中内容物的细度达微米级。本发明的软胶囊是功效成分富集、生物利用度高、易被人体吸收的新剂型软胶囊。
文档编号A61P1/14GK1895545SQ200610027609
公开日2007年1月17日 申请日期2006年6月13日 优先权日2006年6月13日
发明者柳正良, 宓鹤鸣 申请人:上海永昊生物医药研究所