阻止阿尔茨海默氏症Aβ多肽纤维化的小分子抑制剂及其制备方法、药物组合物和应用的制作方法

专利名称：阻止阿尔茨海默氏症Aβ多肽纤维化的小分子抑制剂及其制备方法、药物组合物和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物化学领域，尤其涉及与阿尔茨海默氏症相关的β-淀粉样蛋白(Aβ)的抑制剂。更具体而言，本发明涉及一类新型的可抑制β-淀粉样蛋白的聚集和纤维化的具有对称结构的化合物(通式I)或其药学上可接受的盐及其制备方法；本发明还涉及包含此类化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，以及该化合物或其药学上可接受的盐及其药物组合物在制备预防和治疗阿尔茨海默氏症的药物中的应用。

背景技术：
在典型顽固性痴呆病例中，50％～70％为阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s Disease，AD)。它是大脑的一种退行性病变，多有脑萎缩，尤其是大脑额叶皮层的萎缩。一般男性在65岁、女性在55岁以后发病。发病早期只是注意力不集中、记忆力衰退，慢慢发展到思想贫乏、行为幼稚、情绪不稳、计算力差、不理解别人的话，最后则卧床不起，完全丧失生活能力。随着社会人口的老龄化，目前AD发病率已呈上升趋势，据统计，当今世界有5000多万老年人患有不同程度的痴呆病。在美国，目前患有AD人数已愈400万人，每年直接或间接用于治疗老年性痴呆疾病的花费已达90亿美元。随着我国已进入老年化社会，现在老年性痴呆症问题在我国也同样是社会所面临的不可回避的突出问题之一。因此寻找治疗AD的良药已受到各国尤其是发达国家的高度重视，成为当务之急。
从20世纪70年代起，人们即开始研制治疗AD的药物，起初，研究方向主要集中在乙酰胆碱与AD的关系；80年代，主要是研究胆碱酯酶抑制剂对AD的影响；但是胆碱能神经功能下降是较后期的变化，因此从理论上说，用胆碱酯酶抑制剂不能从较早阶段发挥对AD的治疗作用。90年代，研究不仅有乙酰胆碱受体激动剂，还包括了雌激素、消炎药、影响自由基代谢的药物及抑制淀粉样蛋白沉积的药物。目前，市售的一些用于治疗AD的药物几乎都只能是缓解AD的一些症状，暂时改善AD病人的记忆力和注意力。因此，到目前为止，AD的临床治疗仍然是一个亟待攻破的世界性难题。
引起AD患者痴呆的原因是由于人脑某些区域中因高水平的“老年斑”和“神经纤维紊乱”而造成的神经元细胞的死亡。阿尔茨海默氏病发生的主要标志是脑血管内形成不可溶解的β-淀粉样蛋白(Aβ肽)，Aβ的异常产生和沉积被认为是导致神经元损伤和丢失的主要原因之一。
Aβ是由β-淀粉样蛋白前体APP(Amyloid precursor protein)被β和γ-分泌酶催化水解而成的39-43个氨基酸多肽，其主要形态为Aβ40和Aβ42。研究结果显示Aβ的产生是AD发病早期的最为关键的因素。在AD发病早期，Aβ42的过量产生会直接引发其病理上的层叠，而过量的Aβ42很难被清除，所以在一些聚集因素的作用下Aβ42会沉积下来。理论上，只要阻断APP的表达即可避免Aβ的生成进而可以达到治疗AD的目的，然而，由于APP本身以及APP的非Aβ片段具有其它一些重要的生理功能，而且，在实际操作过程中，阻断一个特定的靶基因的转录是相当困难的。所以，人们把攻克治疗AD的难题建立在如何阻止APP的水解而不是阻断APP的表达上。APP的催化水解可沿两条主要途径进行α-分泌酶途径和β-分泌酶途径。在正常情况下(α-分泌酶途径)，APP被α-分泌酶在Aβ序列内部催化水解成可溶性的APP片段α-APPs和C83肽，结果阻止了Aβ的生成；在非正常情况下(β-分泌酶途径)，APP被β-分泌酶在Aβ的N-端切割催化水解成可溶性的APP片段β-APPs和C99肽，后者则被γ-分泌酶在Aβ的C-端切割代谢为完整的Aβ。由此可见，β-分泌酶是产生Aβ的限速酶，是APP被催化水解成Aβ的先决条件。
Aβ多肽分子从APP上切割下来之前，其C-末端的12～14个氨基酸残基在细胞膜内，呈α-螺旋形式折叠；其N-末端的28个残基暴露在膜外，结构未知。当Aβ多肽分子被β-分泌酶和γ-分泌酶从APP上切割下来后，C-末端的螺旋折叠形式将被打开。在体内，Aβ多肽分子可能经由①无规则结构(RC)→β-折叠或者②α-螺旋→β-折叠的途径，聚集成纤维。在体外，Aβ多肽分子的构象随所处的溶液环境变化而不同。在水溶液中，它以无规则结构、β-折叠和α-螺旋混合构象的形式存在。在模拟膜环境的SDS水溶液或氟化醇的水溶液中，Aβ多肽以α-螺旋构象形式存在。分子动力学模拟及实验表明，Aβ多肽分子折叠、聚集成纤维，要经过一些含有α-螺旋的稳定中间体构象。设计药物分子与Aβ多肽结合，稳定其中间体构象，就可以阻止Aβ的聚集和进一步的纤维化。
核磁共振结构表明Aβ多肽在TFE、SDS和HFIP中折叠成两段α-螺旋结构，这两段α-螺旋之间有一个柔性的Loop区相连接。Aβ多肽在这些溶液中形成的α-螺旋的长度各不相同，说明Aβ多肽结构灵活，而且依赖于所处的溶液环境。由于核磁共振实验所用的溶液与生理环境差别很大，所以不能直接使用Aβ多肽的这些结构来设计抑制剂分子。
另外，Aβ多肽的聚集需要金属离子Zn2+、Cu2+的参与。某些Aβ多肽抑制剂如Clioquinol与这些金属离子鏊合，可溶解脑内已沉积的Aβ并能阻止Aβ单体分子的聚集。目前，Clioquinol与维生素B12一起使用，已进入二期临床试验。其它已报道的大多数Aβ抑制剂因毒性、在体内易被蛋白酶降解、不能透过血脑屏障等问题而未进入临床试验，还需要进一步的化学结构改造和优化。本发明以Aβ折叠过程中的稳定中间体构象为靶标，利用计算机虚拟筛选、设计并合成出了一类具有全新化学结构骨架的阻止Aβ多肽纤维化的小分子抑制剂。


发明内容
本发明以Aβ40多肽在SDS水溶液中的核磁共振结构(PDB号为1BA4)为起始构象，运用Sybyl6.8中的Biopolymer模块对Aβ40多肽分子加氢和Kollman-all-atom电荷，采用Gromac软件对多肽分子进行分子动力学模拟，研究其构象变化。我们发现Aβ多肽可以α-螺旋/β-折叠的稳定结构形式存在(Xu，Y.Shen，J.，Luo，X.，Zhu，W.，Chen，K.，Ma，J.，and Jiang，H.(2005)Conformational transition of amyloid beta-peptide.Proc Natl Acad Sci USA 102，5403-7.)。以分子动力学模拟所得到的Aβ40多肽含α-螺旋/β-折叠的稳定中间构象为靶点，采用分子对接数据库虚拟筛选技术，从SPECS公司(http://www.specs.net/)化合物数据库中筛选活性化合物。设计出的小分子抑制剂，如图1所示，结合到Aβ多肽上，稳定其非聚集状态下的单体结构，阻止它形成纤维化。
本发明人采用DOCK4.0软件包中的autoMS和sphgen程序对Aβ40多肽分子的α-螺旋/β-折叠的稳定中间体结构的整个分子表面进行表述，将描述分子表面的球集整合在一起，作为筛选的目标活性位点。然后确定GRID程序的计算范围，在Aβ40多肽分子表面网格点上计算分子表面的疏水性、静电作用、范德华作用等性质，保存网格点数据，以便在分子对接过程中加快打分评价的计算速度。SPECS化合物数据库中的化合物用DOCK4.0程序放置到活性位点内，DOCK4.0的主要筛选参数设定为每个循环的构象数(configuration per circle)30；锚点方向(anchor orientation)50；能量优化(energy minimization)100；能量优化循环数(energy minimization circle)1，采用接触打分和化学打分评价函数评价化合物与Aβ40多肽分子的结合。我们取前1000个具有最好打分的化合物，进行生物活性筛选。
因此，本发明的目的在于，提供一类具有下面通式I对称结构的化合物或其药学上可接受的盐，该类化合物通过与阿尔茨海默氏症Aβ多肽(包括Aβ40、Aβ42)结合，阻止Aβ多肽的聚集和纤维化。
本发明的另一个目的是提供上述通式I化合物的制备方法。
本发明的还一个目的是提供包含通式I化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。
本发明的再一个目的是提供通式I化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和治疗阿尔茨海默氏症即抗早老性痴呆症的药物中的应用。
本发明提供具有如下通式I对称结构的化合物或其药学上可接受的盐
其中 W

(其中，n＝1或2)； Y为O、NH或S； R1可为芳香基、

其中，Z为OH、SH或NH2； R4和R5各为氢、C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烃基、饱和或不饱和环烷烃基、芳香基、或5-7元杂环基；所述的芳香基可以是苯基、取代苯基、萘基或联苯基、5-7元芳杂环，其中所述的取代苯基可以包括1～4个取代基，该取代基可选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C1-C4烷氧基、巯基和C1-C4酰基之中；所述的5-7元杂环基含有1-3个选自氧、硫和氮的杂原子，并任选含有一个或多个选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C1-C4烷氧基、巯基、C1-C4酰基和芳香基的取代基，所述的5-7元杂环基可与R4或R5中的苯基并合； R2和R3各为氢、卤素、C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C1-C4烷氧基、巯基、C1-C4酰基、C3-C7环烃基、苄基、芳香基或5-7元杂环基； 所述的卤素为氟、氯、溴或碘； 所述的芳香基可以是苯基、取代苯基、萘基或联苯基、5-7元芳杂环；其中所述的取代苯基可以包括1～4个取代基，该取代基可选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C1-C4烷氧基、巯基和C1-C4酰基之中； 所述的5-7元杂环基含有1-3个选自氧、硫和氮的杂原子，并任选含有一个或多个选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C1-C4烷氧基、巯基、C1-C4酰基和芳香基的取代基，所述的5-7元杂环基可与母核中的苯基并合； 本发明提供的通式I化合物的药学上可接受的盐，具体地可列举与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸等有机酸或天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成酯后再与无机碱形成的盐，如钠、钾、钙、铝盐和铵盐；或与有机碱形成的盐，如甲胺盐、乙胺盐、乙醇胺盐等；或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成酯后的盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸的盐，或与甲酸、乙酸，苦味酸、甲磺酸、乙磺酸等有机酸的盐。
本发明通式I所示化合物的一个优选实施方案是具有如下结构的化合物或其药学上可接受的盐 式(I)中，W为

Y为O；R1为苯基或取代苯基； R2选自于氢、卤素、甲基和乙基； R3选自于氢、卤素、甲基和乙基； 本发明通式I所示化合物的第二优选实施方案是具有如下结构的化合物或其药学上可接受的盐 式(I)中，W为

Y为O；R1为
R2选自于氢、卤素、甲基和乙基； R3选自于氢、卤素、甲基和乙基； 其中，R4选自于甲基、吗啡啉基、甲基哌嗪基、苯基和取代苯基；Z为羟基。
本发明通式I所示化合物的第三优选实施方案是具有如下结构的化合物或其药学上可接受的盐 式(I)中，W为

Y为O；R1为
R2选自于氢、卤素、甲基和乙基； R3选自于氢、卤素、甲基和乙基； R5选自于苯基、取代苯基、噻吩基和呋喃基； 本发明通式I所示化合物的第四优选实施方案是具有如下结构的化合物或其药学上可接受的盐 式(I)中，W为

Y为NH；R1为
R2选自于氢、卤素、甲基和乙基； R3选自于氢、卤素、甲基和乙基； R4选自于甲基、吗啡啉基、甲基哌嗪基、苯基和取代苯基； 本发明通式I所示化合物的第五个优选实施方案是具有如下结构的化合物或其药学上可接受的盐 式(I)中，W为

Y为O；R1为苯基或取代苯基； R2选自于氢、卤素、甲基和乙基； R3选自于氢、卤素、甲基和乙基； 本发明通式I所示化合物的第六个优选实施方案是具有如下结构的化合物或其药学上可接受的盐 式(I)中，W为

Y为O；R1为
R2选自于氢、卤素、甲基和乙基； R3选自于氢、卤素、甲基和乙基； R5选自于苯基、取代苯基、噻吩基、呋喃基； 本发明通式I所示化合物的第七个优选实施方案是具有如下结构的化合物或其药学上可接受的盐 式(I)中，W为

Y为O；R1为
R2选自于氢、卤素、甲基和乙基； R3选自于氢、卤素、甲基和乙基； R5选自于苯基、取代苯基、噻吩基、呋喃基； 本发明通式I所示化合物的第八个优选实施方案是具有如下结构的化合物或其药学上可接受的盐 式(I)中，W为-CH2-；Y为O；R1为
R2选自于氢、卤素、甲基和乙基； R3选自于氢、卤素、甲基和乙基； R5选自于苯基、取代苯基、噻吩基、呋喃基； 本发明提供通式I所示化合物及其中间体的制备方法，其中R1、R2、R3、W、Y的定义如上所述
所述方法包括如下步骤 (1)化合物(II)在浓盐酸催化下与W1反应，得化合物(III)；
其中，W1可为丙酮、1，1，1，3，3，3-六氟丙酮、环烷酮等。
(2)在二氯甲烷溶剂中，化合物(III)与卤素X2和过氧化氢反应，得化合物(IV)，其中中X为卤原子；
(3)化合物(IV)与R1X卤化物反应，得通式I化合物；
或 (1)化合物(II)在浓盐酸催化下与W1反应，得化合物(III)；
其中，W1可为丙酮、1，1，1，3，3，3-六氟丙酮、环烷酮等。
(2)化合物(III)与R1X卤化物反应，得通式I化合物。

在本发明一个优选的化合物中，其中

为Br，R3为氢，R4为吗啡啉基时，其具体合成路线如下
本发明的药物组合物含有治疗有效量的上述通式I的化合物或其药学上可接受的盐，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。该药用组合物还可以进一步包含气味剂、香味剂等 本发明所提供的药物组合物其理想的比例是，通式I化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分占总重量的65％～99.5％，其余部分为占总重量的0.5-35％，或更好为1-20％，或最好为1-10％的药学可接受的载体、稀释液或溶液或盐溶液。
本发明所提供的化合物或其药学上可接受的盐和药物组合物可以多种形式应用，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、溶液状、悬浮液和气雾剂等，并可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中。
本发明的化合物或其药学上可接受的盐和药物组合物的各种剂型可按照药学领域的常规制备方法制备。
本发明的化合物或其药学上可接受的盐和药物组合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以通过口、鼻、皮肤、肺、或者胃肠道等的给药途径。最优选为口服。最佳优选日剂量为0.01-200mg/kg体重，一次性服用，或0.01-100mg/kg体重分次服用。不管用何种服用方法，个人的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。



图1说明有机小分子抑制剂结合到Aβ多肽上，阻止它形成β-折叠和纤维化； 图2说明化合物DC-AB1与Aβ多肽的结合，其中A)用于虚拟筛选的Aβ40多肽分子含α-螺旋/β-折叠的稳定结构；B)设计出的小分子抑制剂DC-AB1结合于Aβ40多肽分子的C-端β-折叠区域；C)DC-AB1与Aβ40多肽氨基酸残基结合的具体作用方式； 图3说明化合物DC-AB1以浓度依赖的方式抑制Aβ42多肽的纤维化； 图4说明20小时37℃的孵育实验证实DC-AB1抑制了Aβ多肽纤维化的形成，数据I、II、III、IV、V是2.5μL 200μM Aβ42分别与0μL、10μL、20μL、30μL、40μL 10mM DC-AB1混合，20小时之后测到的荧光强度。
图5 A)Aβ42在没有化合物DC-AB1存在时，在37℃环境下孵育6天之后，在原子力显微镜下所看到的图像，可以清楚地看出Aβ42聚集形成了纤维；B)Aβ42与化合物DC-AB1一起在37℃环境下孵育6天之后，在原子力显微镜下所看到的图像，可以明显地看出化合物DC-AB1抑制了Aβ42纤维的形成。
图6应用电泳分析DC-AB1对Aβ42纤维化的抑制作用。
图7是采用圆二色谱法观察化合物DC-AB1与Aβ40多肽结合之后引起Aβ40构象发生的变化。

具体实施例方式 在以下的实施例中将进一步举例说明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例中的所有参数以及其余的说明，除另有说明外，都是以质量为说明依据的。
实施例1 2，2-二[3，5-二溴-4-(2-羟基)丙氧基苯基]丙烷的制备
1.1.1 2，2-二(4-羟基苯基)丙烷的制备(方法一) 将1.16克(0.02摩尔)丙酮和5.64g.(0.06摩尔)苯酚置于100mL的烧瓶中，搅拌，加入12mL浓盐酸，并通入干燥的氯化氢气体，反应一周后停止反应。加水，弄碎固体反应物，蒸去过量的酚，抽滤，获得几乎成白色固体，干燥，然后用20mL乙醇重结晶，得白色针状产物4.1克(产率90％)，熔点151-153℃(文献报道151℃)。
1.1.2 2，2-二(4-羟基苯基)丙烷的制备(方法二) 将0.02摩尔的苯酚和0.02摩尔2，2-二乙硫基丙烷置于100mL烧瓶中，搅拌，通入氯化氢气体，在室温下继续反应6.5小时；而后，停止反应，蒸馏，干燥，得粗品，然后用20mL乙醇重结晶，得2，2-二(4-羟基苯基)丙烷(产率约53％)。
1.2 2，2-二(3，5-二溴-4-羟基苯基)丙烷的制备 将0.02摩尔2，2-二(4-羟基苯基)丙烷溶入20mL二氯甲烷中，加入0.02摩尔的30％的H2O2，再用滴液漏斗缓慢滴加10mL0.02摩尔溴水的二氯甲烷溶液，滴毕，常温搅拌20小时；加入50mL水，用二氯甲烷(20mL×3)萃取，合并有机层并用MgSO4干燥，过滤，滤液浓缩后，硅胶柱层析分离(石油醚∶乙酸乙酯∶二氯甲烷＝4∶1∶1(体积比)，得产物2，2-二(3，5-二溴-4-羟基苯基)丙烷，收率约96％，熔点180-182℃。
1.3 2，2-二[3，5-二溴-4-(2-羟基)丙氧基苯基]丙烷的制备 将10mmol的1-氯-2-丙醇和5mmol的2，2-二(3，5-二溴-4-羟基苯基)丙烷置于100mL的烧瓶中，加入50mL无水乙醇，回流4小时；然后停止反应，蒸去溶剂，加入20ml水，用二氯甲烷(20ml×3)提取，合并有机层并用MgSO4干燥，过滤，滤液浓缩后，硅胶柱层析分离(石油醚∶乙酸乙酯∶二氯甲烷＝2∶1∶1(体积比)，得产物2，2-二[3，5-二溴-4-(2-羟基)丙氧基苯基]丙烷。
1HNMR(CDCl3)ppmδ1.24(s，3H，CH3)，δ1.26(s，3H，CH3)，δ3.85(m，2H，CH)，δ4.11(m，2H，CH2)，δ4.24(m，2H，CH2)，δ7.09(s，4H，ArH).EI-MS m/s 660[M+]. 实施例2 2，2-二[3，5-二溴-4-呋喃基-2-甲酰氧基苯基]丙烷的制备
将实施例1步骤1.3中的1-氯-2-丙醇替换成呋喃-2-甲酰氯，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得产物2，2-二[3，5-二溴-4-呋喃基-2-甲酰氧基苯基]丙烷。
1HNMR(CDCl3)ppmδ1.68(s，6H，CH3)，δ6.63(m，2H，ArH)，δ7.42(s，4H，ArH)，δ7.49(m，2H，ArH)，δ7.73(m，2H，ArH).EI-MS m/s 732[M+]. 实施例3 2，2-二[3，5-二溴-4-(5-溴-呋喃基)-2-甲酰氧基苯基]丙烷的制备
将实施例1步骤1.3中的1-氯-2-丙醇替换成5-溴-呋喃-2-甲酰氯，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得产物2，2-二[3，5-二溴-4-(5-溴-呋喃基)-2-甲酰氧基苯基]丙烷。
1HNMR(CDCl3)ppmδ1.71(s，6H，CH3)，δ6.55(m，2H，ArH)，δ7.12(s，3H，ArH)，δ7.31(m，3H，ArH).EI-MS m/s 889[M+]. 实施例4 2，2-二[3，5-二溴-4-(2-羟基-3-吗啡啉基)丙氧基苯基]丙烷的制备
(a)1-氯-3-吗啡啉基-2-丙醇的制备方法 将0.05摩尔吗啡啉和0.065摩尔2-氯甲基环氧乙烷置于100mL的烧瓶中，加入50mL无水乙醇，连上干燥装置，回流24小时；而后减压蒸馏除去溶剂，得产物，可不经处理，直接用于下一步反应。
(b)将实施例1步骤1.3中的1-氯-2-丙醇替换成上述(a)方法制备的1-氯-3-吗啡啉基-2-丙醇，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得产物2，2-二[3，5-二溴-4-(2-羟基-3-吗啡啉基)丙氧基苯基]丙烷。
1HNMR(DMSO)ppmδ1.65(s，6H)，δ2.45(m，8H)，δ3.55(s，4H)，δ3.95(s，8H)，δ4.10(m，2H)，δ4.75(s，4H)，δ7.49(s，4H).EI-MS m/s 830[M+]. 实施例5 2，2-二{4-[4-(邻苯二甲酰亚胺基)苯氧基]苯基}丙烷的制备
(a)2，2-二(4-羟基苯基)丙烷的制备 将1.16克(0.02摩尔)丙酮和5.64g.(0.06摩尔)苯酚置于100mL的烧瓶中，搅拌，加入12mL浓盐酸，并通入干燥的氯化氢气体，反应一周后停止反应。加水，弄碎固体反应物，蒸去过量的酚，抽滤，获得几乎成白色固体，干燥，然后用20mL乙醇重结晶，得白色针状产物4.1克(产率90％)，熔点151-153℃(文献报道151℃)。
(b)4-(邻苯二甲酰亚胺基)溴苯的制备 将0.1摩尔的邻苯二甲酸酐和0.1摩尔对溴苯胺溶入20mLN，N-二甲基甲酰胺中，在微波催化下反应20分钟，加入20mL水，用二氯甲烷萃取(20mL×3)，饱和NaCl液洗涤，MgSO4干燥，柱层析分离(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6(体积比)，得4-(邻苯二甲酰亚胺基)溴苯，收率96％。
(c)2，2-二{4-[4-(邻苯二甲酰亚胺基)苯氧基]苯基}丙烷的制备 将10mmol的4-(邻苯二甲酰亚胺基)溴苯和5mmol的2，2-二(4-羟基苯基)丙烷置于100mL的烧瓶中，加入50mL无水乙醇，回流4小时；然后停止反应，蒸去溶剂，加入20ml水，用二氯甲烷(20ml×3)提取，合并有机层并用MgSO4干燥，过滤，滤液浓缩后，硅胶柱层析分离，得产物2，2-二{4-[4-(邻苯二甲酰亚胺基)苯氧基]苯基}丙烷。
1HNMR(DMSO)ppmδ1.65(s，6H)，δ7.50(m，24H).EI-MS m/s 670[M+]. 实施例6 2，2-二{4-[4-(邻苯二甲酰亚胺基)苯氧基]苯基}-1，1，1，3，3，3-六氟丙烷的制备
将丙酮替换成1，1，1，3，3，3-六氟丙酮，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得产物2，2-二{4-[4-(邻苯二甲酰亚胺基)苯氧基]苯基}-1，1，1，3，3，3-六氟丙烷。
实施例7 1，1-二[4-(3-甲氧基苯酰氧基)]苯基环己烷的制备
将4-(邻苯二甲酰亚胺基)溴苯替换成3-甲氧基苯甲酰氯，丙酮替换成环己酮，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5的步骤(a)和(c)，得产物1，1-二[4-(3-甲氧基苯酰氧基)]苯基环己烷。
1HNMR(DMSO)ppmδ1.60(m，6H)，δ2.35(s，4H)，δ3.89(s，6H)，δ7.1(m，6H)，δ7.39(m，6H)，δ7.59(s，2H)，δ7.70(d，2H).EI-MS m/s 536[M+]. 试验性实施例 化合物DC-AB1(即2，2-二[3，5-二溴-4-(2-羟基-3-吗啡啉基)丙氧基苯基]丙烷)与Aβ40多肽的结合作用模式 化合物DC-AB1与Aβ40多肽的结合作用如图2所示，该化合物主要是以疏水作用与Aβ多肽分子结合。DC-AB1的两个芳香环基团分别结合到Aβ多肽分子的Val-24、Gly-29、Val-40氨基酸残基以及Tyr-10、Phe-19、Phe-20围成的疏水位点处(如图2C))，DC-AB1的吗啡啉基团结合到多肽分子的Val-40和Leu-34围成的疏水位点处。
荧光法测定化合物与Aβ多肽的结合 实验原理 硫代硫磺素(Thioflavin T，ThT)在与纤维化Aβ多肽结合之后，其最大荧光发射波长由435nm偏移到482nm，荧光强度与它结合的纤维化Aβ多肽的量有相关性。化合物与Aβ多肽结合能力越强，溶液中以游离形式存在的、可纤维化的Aβ多肽也就越少，硫代硫磺素因结合纤维化多肽而在482nm附近处的荧光发射强度也就越弱，根据这一原理，我们可利用荧光强度来测量化合物与Aβ多肽的结合。
实验方法 将Aβ42多肽(购自美国Sigma-Aldrich公司，产品号A-9810)溶解于DMSO中，配成200μM浓度的溶液。Aβ42溶液以12,000rpm的速度高速离心10分钟，取上清液做实验。采用本发明的小分子抑制剂DC-AB1溶解于DMSO中，配成0.1～10mM一系列不同浓度。
在96孔板中加入76μL的PBS缓冲液(pH＝7.4)和2μL不同浓度的化合物，再加入2μL200μM Aβ42。室温下静置1小时后，向每个孔中加入80μL的5μM硫代硫磺素溶液(含50mM glycine-NaOH，pH＝8.5)。避光、室温下静置30分钟，使用TECAN，Genios ProTM酶标仪，在430nm激发波长和488nm发射波长处测量荧光强度。如图3所示，化合物DC-AB1以浓度依赖形式阻止Aβ42纤维形成。反应液中Aβ42的浓度为2.5μM，阻止半数浓度Aβ42纤维化所需DC-AB1的浓度为35.6μM，即需要14.24倍量的化合物可阻止半数浓度Aβ42的纤维化。
化合物DC-AB1抑制Aβ42多肽纤维化的形成 DC-AB1对Aβ42多肽纤维化的抑制作用还可以通过20个小时长时间的孵育实验证实。我们将2.5μL 200μM Aβ42多肽溶液分别与0μL、10μL、20μL、30μL、40μL 10mM DC-AB1混合，加入PBS溶液至最终体积为50μL。将反应体系在37℃的水浴中孵育20小时。再加入100μL 7.5μM ThT(in PBS)，测量在430nm激发波长、483nm处荧光发射的强度。实验在Hitachi F-2500荧光仪上进行，PMT设置为700，反应时间为0.08秒。如图4所示，在没有抑制剂存在的情况下，经过20个小时的孵育，从Aβ42反应体系中测到的荧光强度大约是2,700 RFU(数据I)。随着反应体系中抑制剂DC-AB1浓度的增高，荧光强度也随之降低，至大约1,100RFU(数据II→V)。从而说明形成的Aβ42纤维减少了，DCAB1的存在明显抑制了Aβ多肽纤维化的形成。
利用原子力电镜观察化合物DC-AB1抑制Aβ42多肽纤维化 将2.5μL 10mM DC-AB1与2.5μL 200μM Aβ42混合，加入含有20％TFE pH＝7.4的PBS缓冲液至最终体积为50μL。作为对照，2.5μL 200μM Aβ42加入含有20％TFE pH＝7.4的PBS缓冲液至最终体积为50μL。将这两个样品在37℃环境下孵育6天。分别从这两个样品中，取3μL放到云母片上，放置5分钟，吹干，用tapping模式在Multimode Nano IIIa原子力显微镜(Veeco，Woodbury，NY)下观察Aβ42多肽的形态。所使用的7TESP探针的共振频率为280-290kHz，扫描速度为1-3Hz。图5A)是Aβ42在没有化合物DC-AB1存在时，在原子力显微镜下所看到的图像，可以清楚地看出Aβ42聚集形成了纤维。图5B)是Aβ42与化合物DC-AB1一起孵育后，所看到的图像。与图5A)相对照，可以明显地看出化合物DC-AB1抑制了Aβ42纤维的形成。
化合物AB1对Aβ42多肽聚集状态的影响 将3μl 200μM Aβ42与3μl 10mM DC-AB1混合，加入PBS(20％TFE，pH＝7.4)至最终体积为20μl。作为对照，3μl 200μM Aβ42加入PBS(20％TFE，pH＝7.4)至最终体积为20μl。将这两个样品在37。℃环境下孵育6天，用10％聚丙烯酰胺凝胶(非变性胶)电泳分析这两个样品，结果如图6所示。第一个样品槽中加入的是新鲜配制的Aβ42(没有经过孵育)，可以看到一条是Aβ42单体的黑带；第三个样品槽中加入的是没有DC-AB1时Aβ42单独孵育的样品，没有看到单体的黑带，说明Aβ42已经聚集为大分子量的纤维或多聚体；而第二个样品槽中加入的是有DC-AB1存在时Aβ42孵育的样品，可以看到Aβ42仍然以从单体到低聚体的形式存在。从这张电泳图上，可以清楚地看到DC-AB1对Aβ42纤维化的抑制作用。
圆二色谱法观察DC-AB1与Aβ40结合对其构象的影响 我们还用圆二色谱研究了化合物DC-AB1与Aβ40结合之后，是否会引起Aβ40构象发生变化。圆二色谱实验是在0.1cm的石英样品池中在190-260nm波长区间范围内测得，水的本底信号已从中扣出。实验是在室温下在Jasco J-810圆二色谱仪上测得(JASCO Corporation，Japan)。如图七所示，Aβ40在水溶液中与化合物DC-AB1以1∶1的摩尔比混合，可以看出Aβ40的CD谱发生变化。这一结果在含有20％TFE(三氟乙醇)的水溶液中更加明显。Aβ40在加入20％TFE之后，其α-螺旋构象明显增多，这是由于TFE该低极性溶剂可拆开β-折叠的氢键作用，而稳定蛋白质的α-螺旋结构。而在加入等摩尔量的化合物DC-AB1之后，Aβ40于20％TFE中所形成的α-螺旋含量明显降低，而β-折叠的构象增多，表现在表征α-螺旋构象的两谷底峰208nm、220nm减弱，而在216nm处出现了表征β-折叠构象的特征峰。这进一步说明了DC-AB1与Aβ40结合，而解聚了Aβ40的α-螺旋，促使它形成β-折叠。
产业上利用的可能性 本发明的通式I化合物的制备方法具有反应条件温和、原料丰富易得、操作及后处理简单等优点。
本发明的通式I化合物在计算机虚拟筛选以及β-分泌酶结合实验中，显示激活/抑制酶活性的作用，可以有效地治疗和预防阿尔茨海默病、儿童智力低下症、健忘症及其他心血脑管疾病。
本发明的化合物毒性很低。
因此，本发明的化合物或其药学上可接受的盐可用于制备治疗或预防由分泌酶调节所致疾病的药物。
权利要求
1、一种具有如下通式I对称结构的化合物或其药学上可接受的盐
其中
W为
或
其中，n＝1或2；
Y为O、NH或S；
R1为芳香基、
或
其中，Z为OH、SH或NH2；
R4和R5各为氢、C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烃基、饱和或不饱和环烷烃基、芳香基、或5-7元杂环基；所述的芳香基为苯基、取代苯基、萘基或联苯基、5-7元芳杂环，其中所述的取代苯基包括1～4个取代基，该取代基选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C1-C4烷氧基、巯基和C1-C4酰基；所述的5-7元杂环基含有1-3个选自氧、硫和氮的杂原子，并任选含有一个或多个选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C1-C4烷氧基、巯基、C1-C4酰基和芳香基的取代基，所述的5-7元杂环基可与R4或R5中的苯基并合；
R2和R3各为氢、卤素、C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C1-C4烷氧基、巯基、C1-C4酰基、C3-C7环烃基、苄基、芳香基或5-7元杂环基；所述的卤素为氟、氯、溴或碘；所述的芳香基为苯基、取代苯基、萘基或联苯基、5-7元芳杂环；其中所述的取代苯基包括1～4个取代基，该取代基选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C1-C4烷氧基、巯基和C1-C4酰基；所述的5-7元杂环基含有1-3个选自氧、硫和氮的杂原子，并任选含有一个或多个选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C1-C4烷氧基、巯基、C1-C4酰基和芳香基的取代基，所述的5-7元杂环基可与母核的苯基并合。
2、根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征是，W为
Y为O；R1为苯基或取代苯基；R2选自于氢、卤素、甲基和乙基；R3选自于氢、卤素、甲基和乙基。
3、根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征是，W为
Y为O；R1为
R2选自于氢、卤素、甲基和乙基；R3选自于氢、卤素、甲基和乙基；其中，R4选自于甲基、吗啡啉基、甲基哌嗪基、苯基和取代苯基；Z为羟基。
4、根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征是，W为
Y为O；R1为
R2选自于氢、卤素、甲基和乙基；R3选自于氢、卤素、甲基和乙基；其中R5选自于苯基、取代苯基、噻吩基和呋喃基。
5、根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征是，W为
Y为NH；R1为
R2选自于氢、卤素、甲基和乙基；R3选自于氢、卤素、甲基和乙基；R4选自于甲基、吗啡啉基、甲基哌嗪基、苯基和取代苯基。
6、根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征是，W为
Y为O；R1为苯基或取代苯基；R2选自于氢、卤素、甲基和乙基；R3选自于氢、卤素、甲基和乙基。
7、根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征是，W为
Y为O；R1为
R2选自于氢、卤素、甲基和乙基；R3选自于氢、卤素、甲基和乙基；其中R5选自于苯基、取代苯基、噻吩基和呋喃基。
8、根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征是，W为
Y为O；R1为
R2选自于氢、卤素、甲基和乙基；R3选自于氢、卤素、甲基和乙基；其中R5选自于苯基、取代苯基、噻吩基和呋喃基。
9、根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征是，W为-CH2-；Y为O；R1为
R2选自于氢、卤素、甲基和乙基；R3选自于氢、卤素、甲基和乙基；其中R5选自于苯基、取代苯基、噻吩基和呋喃基。
10、根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征是，所述的化合物为2，2-二[3，5-二溴-4-(2-羟基)丙氧基苯基]丙烷、2，2-二[3，5-二溴-4-呋喃基-2-甲酰氧基苯基]丙烷、2，2-二[3，5-二溴-4-(5-溴-呋喃基)-2-甲酰氧基苯基]丙烷、2，2-二[3，5-二溴-4-(2-羟基-3-吗啡啉基)丙氧基苯基]丙烷、2，2-二{4-[4-(邻苯二甲酰亚胺基)苯氧基]苯基}丙烷、2，2-二{4-[4-(邻苯二甲酰亚胺基)苯氧基]苯基}-1，1，1，3，3，3-六氟丙烷或1，1-二[4-(3-甲氧基苯酰氧基)]苯基环己烷。
11、根据权利要求1～10任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征是，所述的药学上可接受的盐为所述化合物与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸有机酸或天冬氨酸、谷氨酸酸性氨基酸形成酯后再与无机碱形成的钠盐、钾盐、钙盐、铝盐或铵盐；或与有机碱形成的甲胺盐、乙胺盐、或乙醇胺盐；或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸碱性氨基酸形成酯后的盐酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、苦味酸盐、甲磺酸盐、或乙磺酸盐。
12、一种制备权利要求1～10任一项所述通式I化合物的方法，其中R1、R2、R3、W、Y的定义如权利要求1所述
所述方法包括如下步骤
(1)化合物(II)在浓盐酸催化下与W1反应，得化合物(III)；
其中，W1可为丙酮、1，1，1，3，3，3-六氟丙酮或环烷酮；
(2)在二氯甲烷溶剂中，化合物(III)与卤素X2和过氧化氢反应，得化合物(IV)，其中X为卤原子；
(3)化合物(IV)与R1X卤化物反应，得通式I化合物；
或
(1)化合物(II)在浓盐酸催化下与W1反应，得化合物(III)；
其中，W1可为丙酮、1，1，1，3，3，3-六氟丙酮或环烷酮；
(2)化合物(III)与R1X卤化物反应，得通式I化合物。
13、一种药物组合物，其特征是，该组合物含有治疗有效量的权利要求1～11任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
14、根据权利要求13所述的药物组合物，其特征是，所述的化合物或其药学上可接受的盐占该药物组合物总重量的65％～99.5％。
15、根据权利要求13或14所述的药物组合物，其特征是，该组合物进一步包括一种或多种药学上可接受的载体、气味剂、香味剂、赋形剂或稀释液。
16、一种权利要求1～11任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗阿尔茨海默氏症的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一类新型的可抑制β-淀粉样蛋白的聚集和纤维化的、具有通式I的对称结构的化合物或其药学上可接受的盐，及其制备方法；本发明还涉及包含此类化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，以及该化合物或其药学上可接受的盐及其药物组合物在制备预防和治疗阿尔茨海默氏症的药物中的应用。本发明提供的化合物或其药学上可接受的盐可通过与Aβ多肽结合，抑制了Aβ多肽的聚集和纤维化，因此可用于预防和治疗阿尔茨海默氏症。
文档编号A61K31/21GK101100416SQ20061002855
公开日2008年1月9日 申请日期2006年7月3日 优先权日2006年7月3日
发明者刘东祥, 许叶春, 红 柳, 宇 周, 旭 沈, 陈凯先, 蒋华良 申请人:中国科学院上海药物研究所