专利名称：：类紫杉醇纳米制剂的新用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及类紫杉醇纳米制剂的一种新用途，可用于制备通过腹腔注射防治卵巢癌、胃癌等腹腔内淋巴道扩散的淋巴靶向治疗药物。
背景技术：
：卵巢癌是国内外妇科临床常见的肿瘤，死亡率居首位。一旦临床确诊时已有三分之二属于晚期，手术难以切除。复发和转移是影响其预后的主要原因。卵巢癌具有高度的淋巴结转移率,静脉化疗时，腹腔淋巴转移灶往往达不到有效的治疗浓度，且无法避免全身毒性。与卵巢癌具有相同腹腔内淋巴道扩散特征的肿瘤还有胃癌、直肠癌等腹膜腔转移肿瘤。腹腔注射是治疗上述肿瘤，防治其复发、转移，巩固术后效果的一个重要给药途径。其优点在于(l)腹腔内药物浓度明显高于外周血液药物浓度；(2)增加了病灶与药物的接触面与时间，有利于增强药效；(3)淋巴耙向制剂血浆药物浓度较腹腔用的传统制剂用药后浓度低，因而引起的毒副反应轻；(4)有效地控制腹水。但是，传统的腹腔注射制剂也有其局限性(1)腹膜粘连使药物分布不均也影响疗效；(2)普通制剂药物进入病灶的深度也仅限于l2mm;(3)药物在局部停留的时间较短；(4)腹膜吸收后，仅少量药物能从腹腔内渗透进入腹膜后淋巴结。后者据报道是卵巢癌等肿瘤细胞转移的主要病灶[杨孝军、王文福，卵巢癌淋巴结转移的解剖基础与临床意义.解剖与临床，2002,7(l-2):52-54;刘爱民、徐耀红、王占东等，卵巢癌后腹膜淋巴结转移的临床观察，白求恩医科大学学报，1997,23(3):295-296]。研究表明利用毛细淋巴管具有吞噬大分子物质和颗粒物质的特征，将小分子量的抗癌药物通过物理吸附、包裹或化学链与大分子或颗粒物质相结合后注射，使其通过毛细淋巴管对颗粒物质和大分子物质的吞噬、包饮进入毛细淋巴管，然后通过淋巴引流，在淋巴结处机械滤过截留，达恶性肿瘤区域淋巴结转移灶内，这种对转移癌细胞行靶向化疗的治疗方式称为"淋巴化疗"。类紫杉醇是指紫杉垸类化合物的总称，是一类具有二萜环母核结构的抗癌活性药物。包括紫杉醇、多西紫杉醇(多烯紫杉醇)及相应的衍生物，也包括各种化学修饰的活性前体药物。这些类紫杉醇药物对卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多类肿瘤都有确切疗效。目前临床用的类紫杉醇注射剂，以聚氧乙烯蓖麻油和乙醇50:50(v/v)增溶，给药后常存在严重的过敏反应、中性粒细胞减少等毒副作用，不得不加用糖皮质激素以减少不良反应的发生率。为此，对类紫杉醇类药物的剂型进行了诸多改良，公开号分别为CN1561987、CN1660073的专利申请公开了将类紫杉醇类药物包载于生物降解性高分子聚合物载体中制成纳米制剂，并发现其对于原位肿瘤的靶向性较好。然而，对于经淋巴道转移的肿瘤，特别是淋巴结、如腹膜后淋巴结转移灶的防治，仍是目前抗肿瘤治疗中一个棘手的问题，直接影响了诸如卵巢癌、胃癌、直肠癌等通常经淋巴道扩散的肿瘤的预后。
发明内容本发明的目的即是解决上述课题，提供一种类紫杉醇纳米制剂的新用途，用于制备腹腔淋巴靶向化疗药物。本发明人经研究后发现，类紫杉醇纳米制剂表面亲水性修饰和纳米粒子粒径是两个关键的部分。由于腹膜腔内巨噬细胞丰富，普通的纳米粒子进入后容易被吞噬并富集于肝、脾等处。而亲水修饰的粒子表面可有效地规避巨噬细胞的捕噬，从而有利于增加进入淋巴系统的机会。另一方面，纳米粒尺径也对淋巴摄取有重要影响。试验表明平均粒径过小，〈100nm时，载药量大为减小，同时淋巴结滤过截留差，靶向效果也不理想。平均粒径过大，〉300nm甚至微米时，被巨噬细胞捕获的机会增加，肝脾聚集增加，进入毛细淋巴管的机会大为减少，从而淋巴靶向的效果也差；与此同时，粒径较大时造成腹膜粘连的风险也加大。故本发明类紫杉醇纳米制剂的粒子平均粒径选择在100300nm之间。本发明所说的"类紫杉醇纳米制剂"是指将类紫杉醇包载于药学上可接受的高分子聚合物载体粒子中的制剂。所说"类紫杉醇"是一类具有细胞毒性的紫杉垸类化合物，较佳地是现已在临床广泛使用的抗肿瘤药物紫杉醇或多西紫杉醇。所说"药学上可接受的高分子聚合物"通常为现有技术中生物降解性和生物相容性的高分子聚合物载体，例如脂肪族聚酯(聚乳酸，聚羟基乙酸，乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯，聚交酯等)，聚烷基氰基丙烯酸酯，聚氨基酸等，以及它们的衍生物，如与亲水性链段的偶联物或共聚物(KumareshSS，TejrajMA,AnandraoRK.Biodegradablepolymericnanoparticlesasdmgdeliverydevices.JournalofControlledRelease，2001,70(1-2):1-20)。而本发明所说的"亲水表面修饰"或"表面亲水性修饰"包括化学性或物理性的。"化学性的亲水表面修饰"通常是指上述类紫杉醇纳米制剂中所使用的高分子聚合物载体为亲水修饰的，如上述脂肪族聚酯，聚烷基氰基丙烯酸酯，聚氨基酸等高分子聚合物与亲水性链段的偶联物或共聚物。其中，所述亲水性链段选自聚乙二醇，糖类化合物及其衍生物，如壳聚糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖和6-氨基-甘露糖等(高萍、张向荣、徐晖等,纳米颗粒的修饰及其在医药领域的应用，中国药剂学杂志，2004，2(6):144-152)。为使纳米粒子的平均粒径处于100~300nm，并且保证生物相容性，亲水性链段的分子量优选在100012000之间，占载体分子量比重约为1/201/3之间。关于上述具有"化学性亲水表面修饰"、且平均粒径处于100300nm的类紫杉醇纳米制剂的制备，更详细的请参见上述专利文献CN15619S7、CN1660073。所述"物理性的亲水表面修饰"是指在类紫杉醇纳米制剂中，采用上述脂肪族聚酯，聚烷基氰基丙烯酸酯，聚氨基酸等高分子聚合物时，还额外包括亲水性修饰活性剂。所述亲水性修饰活性剂可选用任何现有技术中的亲水性表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)，聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯(Tween)，泊罗沙姆(Poloxamer)及其乙二胺衍生物(poloxamine)，卖泽(Myrij)，苄泽(Brij)等。其使用时通常配制成0.5~2%(w/v)的表面活性剂水溶液。可见，本发明类紫杉醇纳米制剂优选为腹腔注射制剂，其腹腔注射用稀释液包括0.9%生理盐水，5%葡萄糖水溶液或其它可腹腔注射的生理试液或混悬分散液，从而避免使用毒性较大的增溶剂。换言之，由于本发明所选用的纳米制剂成分中不含聚氧乙烯蓖麻油，仅使用安全性高的聚合物载体和少量的表面活性剂，避免了过敏性副作用，提高了用药的安全性。本发明具有一定的亲水修饰及合适大小粒径的类紫杉醇纳米制剂可以有效地规避腹腔巨噬细胞的吞噬，并提高靶向于淋巴病灶，特别是髂淋巴结等腹膜后淋巴结中的药物浓度。Spmgue-Dawley大鼠试验表明，其腹腔注射有效剂量在312mg/kg之间，与巿售普通类紫杉醇制剂相比，剂量可减小30%~50%。腹腔注射6~12小时，在腹膜后的髂淋巴结处，市售制剂组的组织平均含药量为6.34Ug/g组织，而本发明纳米制剂组可达20.12ug/g组织，提高了2倍。与此同时，肝脏含药量降低，比巿售制剂组降低30%。血中浓度较低，大大减少了系统毒性。因此，本发明载药纳米粒经腹腔注射用药，利用卵巢癌等患者腹部淋巴系统的引流和机械过滤，达到对淋巴病灶的靶向治疗和对复发预防的目的。图1为具有一定的亲水修饰及合适大小粒径的类紫杉醇纳米制剂腹腔注射后612h各脏器平均浓度。图2为市售普通紫杉醇制剂腹腔注射后6~12h各脏器平均浓度。具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中的平均粒径均是采用NICOMP-380ZLS型动态激光散射粒度仪(美国PSS公司)检测(波长635nm，温度23°C，粘度0.933cp，发射频率300MHz)，粒径的大小以Gaussian分布的Int-Wt(光强度统计权重)表示的宏观平均值。实施例1制备过程请参见上述专利申请CN1561987的实施例3。本发明对其稍作改良，具体步骤为7.5mg紫杉醇和50mg聚丙交酯-聚乙二醇二嵌段共聚物，两嵌段分子量分别为10000和5000溶于3ml二氯甲烷中，把二氯甲垸溶液加入到40ml浓度为2%的聚乙烯醇溶液中，超声乳化60秒，乳化功率为40W。然后把所得乳液用蒸馏水稀释到400ml，减压挥发2个小时，在20000rpm离心下收集纳米球，再用蒸馏水洗涤四次，重新分散到水中，冷冻干燥得到以紫杉醇为主药的纳米制剂，平均粒径为300纳米。临用时用0.9%生理盐水稀释到所需浓度腹腔注入。实施例2根据上述专利申请CN1660073说明书第4页中公开的方法制备多烯紫杉醇纳米制剂，具体步骤为准确称取多烯紫杉醇药物200mg和聚乙二醇化聚乳酸乙醇酸共聚物800mg溶于10ml二氯甲烷中，将此溶液注入在15000rpm速度搅拌下的0.3X的聚乙烯醇水溶液500ml中，继续高速搅拌(15000rpm)，形成0/W乳液，随后慢速(500rpm)搅拌4h，挥去二氯甲烷，固化纳米粒，将获得的纳米粒悬浮液通过高速(15000rpm)离心收集，并用蒸馏水200ml洗涤3次后干燥，得平均粒径140nm的纳米粒。临用时用5%葡萄糖溶液稀释到所需浓度腹腔注入。实施例3紫杉醇100mg聚乳酸(分子量6.6万)1000mg二氯甲烷30ml1.6%的聚乙烯醇60ml1%泊罗沙姆409水溶液100ml将紫杉醇和聚乳酸载体溶于二氯甲烷，加入1.6%的聚乙烯醇，高速剪切(8000rpm，2min)制成初乳，探头超声震荡后(40W，30秒)，加入1%泊罗沙姆409水溶液稀释，液中干燥二氯甲烷，纳米粒纯化、分装、冻干。得到的纳米粒的平均粒径为100nm。实施例4以壳聚糖对聚乳酸-羟基乙酸纳米粒进行表面偶联修饰。20mg紫杉醇与120mgPLGA(乳酸-羟基乙酸共聚物，聚合摩尔比例为50/50，分子量2万)溶解于5ml丙酮-二氯甲烷(体积比为2:8)的混合溶剂中，加入到20ml浓度为1%的泊罗沙姆188溶液中，20000rpm的高速剪切2min乳化。然后把所得乳液用壳聚糖(脱乙酰度88.9%，特性粘度45cps)0.5。/。的稀醋酸溶液稀释到100ml，常压搅拌挥发8个小时，在20000rpm离心下收集纳米球，再用蒸馏水洗涤四次，重新分散到水中，冷冻干燥得到以紫杉醇为主药的纳米制剂，平均粒径为150纳米。临用时用0.9%生理盐水稀释到所需浓度腹腔注入。上述实施例中各原料和试剂均为常规市售产品。效果实施例1本发明以实施例3的紫杉醇纳米制剂为例，并以市售的含聚氧乙烯蓖麻油的紫杉醇注射剂(商品名紫杉醇注射液，上海华联制药有限公司生产)为对照，对Sprague-Dawley大鼠腹腔注射剂量7.5mg/kg的药物后，6-12h处死，取淋巴结(髂淋巴结和颈淋巴结)和心、肝、脾、肺、肾等组织，洗净、吸干、称重。组织匀浆后进行HPLC检测。计算对应的组织含药总量后，按下式计算组织含药浓度组织含药浓度=组织含药总量/组织重量(单位pg/g组织)每组制剂共试验6只样本。每一组织的浓度数据取平均值并计算偏差，以柱状图显示、比较。结果如图l、图2所示。可见，同等剂量下，本发明紫杉醇纳米粒组在淋巴结和脾脏中的药物浓度水平比紫杉醇市售制剂组明显高得多。考虑到脾脏是重要的淋巴器官，说明纳米粒组可使药物主要靶向于淋巴系统。而与此同时，肝、肺中药物浓度比市售组低，表明亲水性表面修饰后的纳米粒规避巨噬细胞捕噬的效果明显。另外，心、肾药物水平与市售组相比也有不同程度的降低。效果实施例2以SKOV-3细胞株腹腔种植于F344型大鼠，2个星期后得卵巢癌的大鼠晚期肿瘤模型。取48只模型大鼠随机分6组，本发明以不同平均粒径的亲水性表面修饰的纳米制剂A,-A3(实施例1、3、4)为试验组，并分别以紫杉醇的上述市售氢化蓖麻油制剂，非亲水纳米制剂B与微球制剂作为对照组，以同等的7.5mg/kg剂量进行腹腔给药。每周一次，连续给药4周。其中，作为对比的纳米制剂B的制备方法参见上述实施例3，其中不加入亲水性修饰活性剂1%泊罗沙姆409水溶液。而微球制剂是按照上述专利申请CN1561987的实施例1制备，具体为15mg紫杉醇和85mg聚丙交酯-聚乙二醇两嵌段共聚物，两嵌段分子量分别为60000和5000溶于5ml二氯甲烷中，把二氯甲垸溶液加入到40ml2%的聚乙烯醇溶液中，超声乳化90秒，乳化功率为70W。然后把所得乳液用蒸馏水稀释到500ml，减压挥发2个小时，在18000rpm下收集纳米微球，再用蒸馏水洗涤四次，重新分散到水中，冷冻干燥得到以紫杉醇为主药的纳米制剂，平均粒径约0.8微米。临用时用0.9%生理盐水稀释到所需浓度腹腔注入。第4周末结束试验，处死动物并剖腹、取样、观测。同时统计髂淋巴结药物浓度、抑瘤率、腹水量减少度、成活率、腹膜粘连程度。其中，腹膜粘连考察标准为脏层腹膜与腹壁层腹膜的相互连结程度。以正常大鼠作参照，粘连轻重状况可分为以下三个状态良好各脏器可自由拨动，脏层腹膜与壁层腹膜无明显连结；一般各脏器仍可自由拨动，但脏层腹膜与壁层腹膜有轻微连结；严重脏层与脏层，脏层与壁层都有明显连结，脏器不能随意拨动。结果见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>此表中微球制剂效果反而不如市售制剂，可能的原因在于载药微粒较大时，容易在腹膜间形成异物介入性粘连，同时粒径较大时要实现淋巴结摄取的淋巴引流通路障碍也加大。导致药效不理想。各方面的指标表明具有亲水修饰的合适粒径的类紫杉醇纳米制剂在腹腔注射时的淋巴靶向性强、疗效明显、副作用小。类紫杉醇纳米制剂的这一新用途有望取得对卵巢癌、胃癌等腹膜腔内淋巴道扩散典型肿瘤的针对性治疗。权利要求1、类紫杉醇纳米制剂在制备腹腔淋巴靶向化疗药物中的应用，该类紫杉醇纳米制剂的粒子具有亲水表面修饰，平均粒径控制在100～300纳米之间。2、如权利要求1所述的应用，其特征在于该类紫杉醇纳米制剂包括将类紫杉醇包载于药学上可接受的高分子聚合物载体粒子中。3、如权利要求2所述的应用，其特征在于该高分子聚合物具有偶联的或嵌段共聚的亲水性链段。4、如权利要求3所述的应用，其特征在于所述亲水性链段选自聚乙二醇，糖类化合物及其衍生物。5、如权利要求4所述的应用，其特征在于糖类化合物及其衍生物选自壳聚糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖和6-氨基-甘露糖等。6、如权利要求2所述的应用，其特征在于该类紫杉醇纳米制剂中还包括亲水修饰性的表面活性剂。7、如权利要求6所述的应用，其特征在于该亲水性修饰活性剂选自聚乙二醇、聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯、泊罗沙姆及其乙二胺衍生物、卖泽和苄泽。8、如权利要求1所述的应用，其特征在于该类紫杉醇纳米制剂为腹腔注射制剂。9、如权利要求18任一项所述的应用，其特征在于该腹腔淋巴靶向化疗药物为防治腹膜后淋巴结转移灶的药物。10、如权利要求9所述的应用，其特征在于该腹膜后淋巴结转移灶为卵巢癌髂淋巴结转移灶。全文摘要本发明公开了类紫杉醇纳米制剂在制备腹腔淋巴靶向化疗药物中的新用途，该类紫杉醇纳米制剂的粒子具有亲水表面修饰，平均粒径控制在100～300纳米之间。通过腹腔注射后，该纳米制剂可有效减少腹腔巨噬细胞的吞噬并明显提高类紫杉醇对腹膜后淋巴的靶向性，该给药系统可用于卵巢癌、胃癌、直肠癌等具有腹膜腔内淋巴道扩散的典型肿瘤的淋巴靶向治疗，在防治淋巴转移方面取得较好效果。文档编号A61K9/08GK101099723SQ20061002874公开日2008年1月9日申请日期2006年7月7日优先权日2006年7月7日发明者徐丛剑,李立民,陆红霞,陈庆华申请人:上海医药工业研究院