专利名称：没食子酸酯在制备抗癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及EGCG(即表没食子儿茶素没食子酸酯，英文全称(-)-Epigallocatechin gallate，俗称没食子酸酯)的新用途，即EGCG在制备抗癌药物中的应用。
背景技术：
羰基还原酶(carbonyl reductase，CBRs)大多是单体、低分子量的一类氧化还原酶，依赖于辅酶NADPH催化各种醌，醛和酮等底物，广泛分布于哺乳动物和非哺乳类动物的各种组织多种细胞的胞质中。人的羰基还原酶(CBR)是胞质中的辅酶NADPH依赖的氧化还原酶，可以催化前列腺素、类固醇、奎宁和一些蒽环类的抗肿瘤药物。通过氧化还原作用，体内高表达的CBR能使许多药物灭活，因此CBR的抑制剂的研制对增强药效克服细胞耐药性有非常重要的意义。
蒽环类药是目前应用最广泛的抗癌药物，CBR能将蒽环霉素测链上的C13位的羰基还原为羟基化合物。蒽环类药物的羟基代谢物可能较还原反应之前的羰基对细胞的毒性要弱一些，比如柔红霉素。但是，有实验证明，在K562细胞中表达CBR能使细胞特异性的抵制柔红霉素的毒性；而且，并非所有蒽环类药物的羟基代谢物都相应的羰基代谢物对细胞的毒性弱，例如，阿霉素被羰基还原酶代谢为相应的C13羟基化合物就能引发心脏毒性。为了在体内检测CBR对药物诱导的心脏毒性的影响，将CBR的cDNA克隆到一个含有心脏特异性的启动子表达载体中，培育心脏中过量表达的CBR的转基因小鼠。对转基因小鼠和野生型的对照组，平行注射DOX(阿霉素)分别能引起急性中毒和慢性中毒。急性毒性和慢性毒性实验都证实，CBR能引起DOX诱导的心脏毒性。CBR的高表达能引起肿瘤患者对DOX的敏感性，而在转基因小鼠体内敲除CBR的一个等位基因，能使小鼠对DOX诱导的心脏毒性的耐受性升高。
鉴于CBR对蒽环类药物的代谢能降低药物的毒性，引起肿瘤细胞的耐受性，因此，CBR抑制剂的开发具有两方面的益处，即可增加对肿瘤细胞的毒性，又可降低代谢产物引起的心脏毒性。
EGCG分子式C22H18O11，FW 458.4。它是一种高效广谱无毒副作用的生物抗氧化剂，俗称没食子酸酯。没食子酸酯能有效清除引发多种疾病和衰老的体内自由基和过氧化物，提高人体免疫力，延缓衰老，具有优异的抗病毒、降血脂、保鲜、美容等效能，在医药、保健、食品、日化等行业有广泛的用途。但是，到目前为止，尚未有关于其作为羰基还原酶抑制剂的报道。
发明内容
本发明的目的是提供表没食子儿茶素没食子酸酯的新用途。
本发明提供了EGCG(即表没食子儿茶素没食子酸酯，英文全称(-)-Epigallocatechin gallate，俗称没食子酸酯)作为羰基还原酶抑制剂在制备抗肿瘤抗癌药物中的应用。
本发明中所述的羰基还原酶为CBR1，位于21q22.12-(NM_001757)，是人的CBR基因。CBR1的cDNA序列是Wermuth从胎盘CDNA文库中得到编码277个氨基酸，蛋白的分子量为30375Da。
实验证明，EGCG可与羰基还原酶相互作用，对其酶活的抑制率随着EGCG浓度的增加而加强。进一步分析表明，EGCG和辅酶NADPH非竞争性抑制羰基还原酶。鉴于羰基还原酶抑制剂既可增加对肿瘤细胞的毒性，又可降低代谢产物引起的心脏毒性，因此，本发明的EGCG用于制备抗肿瘤抗癌药物，或者与其它抗肿瘤抗癌药物联用，可以大大增加药物对肿瘤细胞的杀伤效果同时减轻患者的负担。
所述的抗肿瘤抗癌药物是由含有效治疗量的表没食子儿茶素没食子酸酯和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。
本发明的EGCG当在治疗上进行施用(给药)时，可配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，例如肌内、腹膜内、皮下、皮内或局部给药。
以本发明的EGCG为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的EGCG可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的EGCG还可与其他治疗剂一起使用。
本发明所述的有效治疗量为每天1微克/千克至5微克/千克体重。
当本发明的EGCG被用作药物时，可将治疗有效剂量的EGCG施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的，并且可以参考目前EGCG的用药情况。
进一步而言，上述的抗肿瘤抗癌药物可以是化疗药物。
本发明的EGCG作为药物时，可以是针剂或者片剂。
EGCG是绿茶茶多酚的主要的活性成分。茶叶是深受人们喜欢的饮品之一，大量研究证明绿茶提取物有多重生物活性和药理效应。本发明中，EGCG有羰基还原酶抑制剂的功能，将其作为抗肿瘤抗癌药物，或者与其它抗肿瘤抗癌药物联用，将大大增加药物对肿瘤细胞的杀伤效果，减少患者，尤其是受化疗者的痛苦，降低治病成本。EGCG作为药物日前已广泛使用，高效、广谱、无毒副作用。来源广泛，提取工艺已经比较纯熟，它作为CBR1的抑制剂，与抗癌药物联合使用，将在逆转耐药性、增强化疗效果方面有着比较好的发展前景。
图1为EGCG对CBR1活性的抑制IC50的测定结果图。可见，反应速度随着抑制剂浓度增加。Y＝102.86e-1.266X，R2＝0.9873.
图2为EGCG对CBR1抑制效果受pH的影响图。抑制效率受pH影响也很大，酸性条件下抑制效果较弱，中性和弱酸性条件下较强。
图3和图4为EGCG对CBR1的抑制作用类型分析图。可见，EGCG和辅酶NADPH非竞争性抑制CBR1。
具体实施例方式
实施例1 CBR1和EGCG的结合大分子互作仪检测CBR1和EGCG的互作情况。CBR1蛋白配在pH 5.0的缓冲液，固定在传感器芯片表面。将EGCG(Sigma E4143)分别配2.5μM，1.25μM.，0.625μM，0.3125μM，0.1563μM，0.0782μM和0.0391μM的溶液流过芯片表面。检测器能跟踪检测溶液中的EGCG分子与芯片表面的CBR1结合、解离整个过程的变化。
大分子互作仪检测CBR蛋白和EGCG的结合情况，把EGCG逐级稀释后跟芯片表面的CBR1反应。结果显示，EGCG与CBR1的结合强度呈现浓度依赖的趋势，而且每一条曲线随着时间先上后下也表现EGCG和CBR1的结合和解离，同时说明EGCG和CBR1的结合是可逆的。根据数据算出亲和系数为2.73e-6，表示CBR1和EGCG有比较强的结合。
实施例2 酶活测定以吲哚满二酮为底物，NADPH为辅酶进行酶活性分析。辅酶NADPH在340nm处有最大吸光值，用紫外分光光度计进行时间扫描，检测波长340nm处的吸光度的改变量来反应酶促反应速度。反应体系为600μl，缓冲体系是0.1M磷酸盐缓冲液，酶适量，不同反应变化辅酶NADPH，底物是吲哚满二酮，抑制剂EGCG的量。每个样品做3个平行管。
(1)EGCG对CBR1活性的抑制----IC50的测定600μl反应体系，底物吲哚满二酮的浓度为200μM，辅酶NADPH浓度为100μM，酶浓度为1ug/ml。改变加入的抑制剂EGCG的浓度，检测反应速度，每个每一浓度测三次反应。(表1)以相对比活力对抑制剂浓度作图，反应速度随着抑制剂浓度增加，表现指数下降趋势.半数抑制浓度IC50为0.5908μM(图1)。其中，d OD/min是指OD值的变化率。
表1 EGCG对CBR1活性的抑制IC50的测定
(2)研究EGCG对CBR1的抑制作用类型，酶的动力学测定根据IC50结果，选择3种不同浓度EGCG(0，0.5，0.75μM，)进行实验分组，酶浓度为1μg/ml.
a.在固定辅酶NADPH浓度100μM，变化底物吲哚满二酮(即isatin)的浓度(200-33μM)，测定酶的反应速度。(表2)以底物浓度对反应速度Lineweaver-Burk双倒数作图，不同抑制剂浓度作出的直线相交于X轴(图3)，说明，随着抑制剂浓度增加，抑制剂并不改变表观Km值，而使Vmax变小，EGCG和底物吲哚满二酮非竞争性抑制CBR1.图3中，y1＝2813.9x+12.884，R2＝0.9961；y2＝1938.5x+9.4449，R2＝0.9998；y3＝1588x+7.5731，R2＝0.9993.
b.固定底物吲哚满二酮的浓度200μM，变化辅酶NADPH浓度(75-16.7μM)，测定酶的反应速度(表3).以底物浓度对反应速度Lineweaver-Burk双倒数作图，不同抑制剂浓度作出的直线相交于X轴(图5)，说明，随着抑制剂浓度增加，抑制剂并不改变表观Km值，而使Vmax变小，EGCG和辅酶NADPH非竞争性抑制CBR1。其中，V(d OD/min)和D(OD)是以OD值的变化率来衡量的，1/c是浓度的倒数，单位为μM-1，1/V为速度的倒数。y4＝582x+13.74，R2＝0.9943；y5＝451.21x+11.791，R2＝0.9978；y6＝342.26x+8.6079，R2＝0.9937。
表2
表3
实施例3 EGCG对CBR1抑制效果受pH的影响按上述测定酶活的方法操作。固定底物吲哚满二酮浓度为200uM，辅酶NADPH浓度为100uM，在pH为5.8-7.8的范围下检测加或不加抑制剂EGCG的酶活.(表4，图2)其中，V(d OD/min)是以OD值的变化率来衡量的。可见，不加抑制剂时，酶的活性随着PH变化而变化，在PH6.2时活性最强，抑制剂的抑制效率受pH影响也很大，酸性条件下抑制效果较弱，中性和弱碱性条件，例如，pH6.9-7.5较强。
表4 EGCG对CBR1抑制效果受pH的影响
权利要求
1.表没食子儿茶素没食子酸酯作为羰基还原酶抑制剂在制备抗癌药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征是所述的抗肿瘤抗癌药物是由含有效治疗量的表没食子儿茶素没食子酸酯和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。
3.如权利要求1或者2所述的应用，其特征是所述的有效治疗量为每天1微克/千克至5微克/千克体重。
4.如权利要求1或者2所述的应用，其特征是所述的药物为化疗药物。
5.如权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，所述药物是针剂或者片剂。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及EGCG的新用途，即EGCG作为羰基还原酶抑制剂在制备抗癌药物中的应用。EGCG是绿茶茶多酚的主要的活性成分。本发明中，EGCG有羰基还原酶抑制剂的功能，将其抗肿瘤抗癌药物，或者与其它抗肿瘤抗癌药物联用，将大大增加药物对肿瘤细胞的杀伤效果，减少患者痛苦，降低治病成本。EGCG作为药物日前已广泛使用，高效、广谱、无毒副作用。来源广泛，提取工艺已经比较纯熟，它作为CBR1的抑制剂，与抗癌药物联合使用，将在逆转耐药性、增强化疗效果方面有着比较好的发展前景。
文档编号A61P35/00GK1887281SQ200610029179
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月20日 优先权日2006年7月20日
发明者余龙, 黄维雪, 丁丽娅, 胡海荣, 唐丽莎 申请人:复旦大学