专利名称：一株严格厌氧海洋细菌的活性提取物及其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株严格厌氧活性海洋细菌，特别是该种海洋菌株培养物的活性提取物及其制法和该提取物在抗细菌药物方面的用途。
背景技术：
海洋微生物来源的新药开发是二十一世纪世界范围的研究热点问题，以其新菌种来源、产生新结构活性物质、克服传统抗生素耐药性以及实现资源可持续等特点而为人们所普遍关注。目前已经从各类海洋微生物中分离到许多结构新颖的抗细菌抗生素、抗真菌抗生素、抗病毒抗生素、抗肿瘤抗生素以及一些抗炎症和镇痛的活性物质、酶抑制剂等。海洋中存在一类严格厌氧的微生物——硫酸盐还原细菌，这类微生物在自身代谢过程中能够分解低分子有机物并还原硫酸盐为硫化氢，在地球化学循环中起着极为重要的作用。至今尚未见有报道从硫酸盐还原细菌类群中分离提取到具有药理活性的次生代谢产物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脱硫脱硫弧菌海洋菌株培养液的活性提取物。
本发明的另一个目的是提供了该活性提取物分离方法。
本发明进一步的目的是提供了该活性提取物在制备抗细菌药物中的应用。
本发明中涉及的一株严格厌氧活性海洋细菌DM18是从中国黄海海域缺氧环境中分离获得，该菌株合适的生长盐浓度范围为0.5％～5.0％；对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌有抗性，依据《Bergy’s manual of systematicalbacteriology》(vol.3.The Williams & wilkins Co.Baltimore.1984，663-669)，鉴定为Desulfovibrio desulfuricans，即脱硫脱硫弧菌，已于2006年3月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(其简称为CGMCC)，保藏单位地址北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.1657。
海洋菌株DM18具有下述性质菌株细胞呈弧状，菌体大小为(0.6～1.0)μm×(3.5-5.0)μm，具有单根极生鞭毛，能运动，革兰氏染色为阴性，胞内含脱硫绿啶类的亚硫酸盐还原酶，严格厌氧，能利用硫酸盐或者其他氧化态硫化物作为电子受体来异化有机物，并产生H2S。最佳生长温度范围26～30℃，最佳生长pH为7.0～7.5。对有机碳(能)源的利用情况如下在(1)乳酸+硫酸盐，(2)丙酮酸+硫酸盐，(3)丙酮酸(未加硫酸盐)，(4)苹果酸+硫酸盐，(5)胆碱+硫酸盐，(6)胆碱营养组合中生长良好；在(1)苹果酸(未加硫酸盐)，(2)乙酸+硫酸盐，(3)丁酸+硫酸盐营养组合中不能生长。另外能利用硝酸盐、亚硝酸盐和2，4，6-三硝基苯(TNT)作为氮源和电子受体。
海洋菌株DM18的16S rDNA全基因(1391bp)已向美国国家生物技术信息中心(NCBI)的Genbank基因序列数据库提交，登陆号为DQ417602。其全序列如下CTGCCCTTATGATCGGGATAACAGTTGGAAACGGCTGCTAATACCGGATACGCTCAAAATGAACTTTTTGAGGAAAGATGGCCTCTGCTTGCATGCTATCACGTAAGGATGAGTCCGCGTCCCATTAGCTTGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAGGCATCGATGGGTAGCCGATTTGAGAGGATGATCGGCCACACTGGAACTGAAACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAACCTCTGTCAGAAGGGAAGAAACTACGTTGTGCTAATCAGCAGCGTACTGACGGTACCTTCAAAGGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCTGTAGTGTAAGTCAGGGGTGAAATCCCACGGCTCAACCGTGGAACTGCCTTTGATACTGCACAAC
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这种海洋菌株DM18可以利用常规的液体培养方式，可使培养基中含有用于微生物培养的碳源、氮源及其他营养源。其中碳源可为乳酸、丙酮酸、苹果酸、胆碱等。氮源可为氯化铵、硝酸盐、亚硝酸盐和2，4，6-三硝基苯(TNT)。至于其他营养源则可适当添加一些无机盐类，例如氯化钠、磷酸盐类及钾、钙、锌、锰、铁之类的金属盐。对温度、时间等培养条件并无严格的限制，以适宜于DM18海洋菌株的生长为准，并以选择使培养物的活性提取物的收率最高的条件为好。当然这些培养基的组分、氢离子浓度、培养温度、搅拌条件等均应根据所使用的菌株种类及外部条件等进行适当的调节，以获得最好的效果。由以上所得的培养物出发，通过一些适当的方法就能提取其中的活性组分，这些方法是常使用于提取代谢物的方法，例如可利用活性提取物与其它杂质在溶解度、离子结合力、吸附亲和力及分子量等方面的差别进行提取，这些方法可以单独使用，也可以适当配合或者反复使用。其中，以如下培养基、培养方法和提取方法来培养海洋菌株DM18产生抗生素为最佳液体培养基为KH2PO40.5g；NH4Cl 1.0g；Na2SO41.0g；MgSO4·7H2O 2.0g；70％(重量)乳酸钠5.0g；酵母膏1.0g；CaCl2·2H2O 0.1g；FeSO4·7H2O 0.5g；硫代乙醇酸纳0.1g；维生素C 0.1g；陈化海水或者人工海水1000mL；调pH7.2～7.4；其中人工海水配方为NaCl 25.0g，Na2SO44.0g，KCl 0.7g，NaHCO30.20g，KBr 0.10g，H3BO30.03g，NaF 0.003g，53mL 1.0mol/L MgCl2溶液，10mL1.0mol/l CaCl2溶液，0.90ml 0.1mol/L SrO2溶液，蒸馏水1000ml，pH调为7.2～7.4。
A.种子培养将液体培养基灌装到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶盖微旋紧以利透气，于高压消毒器中121℃、0.105mpa灭菌20min；冷却后接种海洋菌株DM18，并用无菌培养基补满，瓶盖旋紧不透气；将血清瓶于26～30℃恒温培养5～7天；B.扩大培养按体积比5～10％的种子培养液接种，利用密封培养容器，采取类同种子培养的过程大量培养海洋菌株DM18菌液，于26～30℃恒温培养10～15天；C.提取将完成扩大培养过程的菌液用等体积的乙酸乙酯连续抽提3次，抽提后的水相再用等体积的正丁醇连续抽提3次，提取液分别用旋转蒸发仪于60℃、减压蒸干，得两份干固体；D.提纯将以上两份干固体分别滴加少量甲醇溶解，拌入300目～400目硅胶，减压干燥后制成干样品上硅胶柱，用体积比为氯仿∶甲醇＝80∶1的洗脱液洗脱，采用枯草杆菌纸片法活性跟踪手段，跟踪活性洗脱峰；所得活性洗脱相蒸干后通过HPLC进一步纯化，使用C18反相柱，水和甲醇作为流动相，用体积浓度为5～100％的甲醇水溶液作洗脱液进行30分钟梯度洗脱，再用100％甲醇洗脱20分钟；并检测254nm紫外吸收，通过逐步活性跟踪，制备出活性峰组分，将含活性组分的洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得两份油状物。
本发明从海洋菌株DM18中提取得到的活性提取物，通过抗菌模型筛选，采用琼脂稀释法(叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程(第二版)，东南大学出版社，1997553～564)测定对枯草杆菌枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值，证实其培养液的乙酸乙酯提取相和正丁醇提取相均具有抗细菌活性乙酸乙酯相中制备出的活性组分抗枯草杆菌的MIC值为0.65μg/ml，抗金黄色葡萄球菌的MIC值为0.82μg/ml；正丁醇相中制备出的活性组分抗枯草杆菌的MIC值为1.35μg/ml，抗金黄色葡萄球菌的MIC值为0.94μg/ml。
利用本发明的活性提取物中的有效组分，可以用于制备抗细菌的药物。
具体实施例方式
下面的实施例可以帮助本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1.液体培养基为KH2PO40.5g；NH4Cl 1.0g；Na2SO41.0g；MgSO4·7H2O 2.0g；70％(重量)乳酸钠5.0g；酵母膏1.0g；CaCl2·2H2O 0.1g；FeSO4·7H2O 0.5g；硫代乙醇酸纳0.1g；维生素C 0.1g；陈化海水1000mL。
A.种子培养将液体培养基灌装到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶盖微旋紧以利透气，于高压消毒器中121℃、0.105mpa灭菌20min；冷却后接种海洋菌株DM18，并用无菌培养基补满，瓶盖旋紧不透气；将血清瓶于30℃恒温培养5天；B.扩大培养按体积比5～10％的种子培养液接种，采用厚质带盖玻璃瓶作培养容器，采取类同种子培养的过程大量培养海洋菌株DM18菌液，于26℃恒温培养15天；C.提取将完成扩大培养过程的菌液用等体积的乙酸乙酯连续抽提3次，抽提后的水相再用等体积的正丁醇连续抽提3次，提取液分别用旋转蒸发仪于60℃、减压蒸干，得两份干固体；D.提纯将以上两份干固体分别滴加少量甲醇溶解，拌入300目～400目硅胶，减压干燥后制成干样品上硅胶柱，用体积比为氯仿∶甲醇＝80∶1的洗脱液洗脱，采用枯草杆菌纸片法活性跟踪手段，跟踪活性洗脱峰；所得活性洗脱相蒸干后通过HPLC进一步纯化，使用C18反相柱，水和甲醇作为流动相，用体积浓度为5～100％的甲醇水溶液作洗脱液进行30分钟梯度洗脱，再用100％甲醇洗脱20分钟；并检测254nm紫外吸收，通过逐步活性跟踪，制备出活性峰组分，将含活性组分的洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得两份油状物。
实施例2.液体培养基为KH2PO40.5g；NH4Cl 1.0g；Na2SO41.0g；MgSO4·7H2O2.0g；70％(重量)乳酸钠5.0g；酵母膏1.0g；CaCl2·2H2O 0.1g；FeSO4·7H2O0.5g；硫代乙醇酸纳0.1g；维生素C 0.1g；人工海水1000mL；调pH7.2～7.4；其中人工海水配方为NaCl 25.0g，Na2SO44.0g，KCl 0.7g，NaHCO30.20g，KBr 0.10g，H3BO30.03g，NaF 0.003g，53mL1.0mol/L MgCl2溶液，10mL1.0mol/l CaCl2溶液，0.90ml 0.1mol/L SrO2溶液，蒸馏水1000ml，pH调为7.2～7.4。
A.种子培养将液体培养基灌装到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶盖微旋紧以利透气，于高压消毒器中121℃、0.105mpa灭菌20min；冷却后接种海洋菌株DM18，并用无菌培养基补满，瓶盖旋紧不透气；将血清瓶于26℃恒温培养7天；B.扩大培养按体积比5～10％的种子培养液接种，采用厚质带盖玻璃瓶作培养容器，采取类同种子培养的过程大量培养海洋菌株DM18菌液，于30℃恒温培养10天；C.提取将完成扩大培养过程的菌液用等体积的乙酸乙酯连续抽提3次，抽提后的水相再用等体积的正丁醇连续抽提3次，提取液分别用旋转蒸发仪于60℃、减压蒸干，得两份干固体；D.提纯将以上两份干固体分别滴加少量甲醇溶解，拌入300目～400目硅胶，减压干燥后制成干样品上硅胶柱，用体积比为氯仿∶甲醇＝80∶1的洗脱液洗脱，采用枯草杆菌纸片法活性跟踪手段，跟踪活性洗脱峰；所得活性洗脱相蒸干后通过HPLC进一步纯化，使用C18反相柱，水和甲醇作为流动相，用体积浓度为5～100％的甲醇水溶液作洗脱液进行30分钟梯度洗脱，再用100％甲醇洗脱20分钟；并检测254nm紫外吸收，通过逐步活性跟踪，制备出活性峰组分，将含活性组分的洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得两份油状物。
实施例3.液体培养基为KH2PO40.5g；NH4Cl 1.0g；Na2SO41.0g；MgSO4·7H2O2.0g；70％(重量)乳酸钠5.0g；酵母膏1.0g；CaCl2·2H2O 0.1g；FeSO4·7H2O0.5g；硫代乙醇酸纳0.1g；维生素C 0.1g；陈化海水1000mL。
A.种子培养将液体培养基灌装到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶盖微旋紧以利透气，于高压消毒器中121℃、0.105mpa灭菌20min；冷却后接种海洋菌株DM18，并用无菌培养基补满，瓶盖旋紧不透气；将血清瓶于28℃恒温培养6天；B.扩大培养按体积比5～10％的种子培养液接种，采用厚质带盖玻璃瓶作培养容器，采取类同种子培养的过程大量培养海洋菌株DM18菌液，于28℃恒温培养12天；C.提取将完成扩大培养过程的菌液用等体积的乙酸乙酯连续抽提3次，抽提后的水相再用等体积的正丁醇连续抽提3次，提取液分别用旋转蒸发仪于60℃、减压蒸干，得两份干固体；D.提纯将以上两份干固体分别滴加少量甲醇溶解，拌入300目～400目硅胶，减压干燥后制成干样品上硅胶柱，用体积比为氯仿∶甲醇＝80∶1的洗脱液洗脱，采用枯草杆菌纸片法活性跟踪手段，跟踪活性洗脱峰；所得活性洗脱相蒸干后通过HPLC进一步纯化，使用C18反相柱，水和甲醇作为流动相，用体积浓度为5～100％的甲醇水溶液作洗脱液进行30分钟梯度洗脱，再用100％甲醇洗脱20分钟；并检测254nm紫外吸收，通过逐步活性跟踪，制备出活性峰组分，将含活性组分的洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得两份油状物。
实施例4.活性组分活性测定结果。
采用琼脂稀释法(叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程(第二版)，东南大学出版社，1997553～564)测定对枯草杆菌枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值，证实其培养液的乙酸乙酯提取相和正丁醇提取相均具有抗细菌活性乙酸乙酯相中制备出的活性组分抗枯草杆菌的MIC值为0.65μg/ml，抗金黄色葡萄球菌的MIC值为0.82μg/ml；正丁醇相中制备出的活性组分抗枯草杆菌的MIC值为1.35μg/ml，抗金黄色葡萄球菌的MIC值为0.94μg/ml。
海洋菌株DM18的16S rDNA全基因序列表Organization Applicant----------------------Street沙河口区黄河路794号City大连市StateCountry中国PostalCodePhoneNumber0411-84109382FaxNumberEmailAddress<110>OrganizationName大连交通大学Application Project-------------------<120>Title一株严格厌氧海洋细菌的活性提取物及其制法和用途<130>AppFileReference无<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate＿＿-＿-＿Sequence--------<213>OrganismName<400>PreSequenceStringctgcccttat gatcgggata acagttggaa acggctgcta ataccggata cgctcaaaat60gaactttttg aggaaagatg gcctctgctt gcatgctatc acgtaaggat gagtccgcgt120cccattagct tgttggcggg gtaacggccc accaaggcat cgatgggtag ccgatttgag180aggatgatcg gccacactgg aactgaaaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg240gggaatattg cgcaatgggc gaaagcctga cgcagcgacg ccgcgtgagg gatgaaggtt300ttcggatcgt aaacctctgt cagaagggaa gaaactacgt tgtgctaatc agcagcgtac360tgacggtacc ttcaaaggaa gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga420gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgca cgtaggctgt agtgtaagtc480aggggtgaaa tcccacggct caaccgtgga actgcctttg atactgcaca acttgaatcc540
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权利要求
1.一株严格厌氧海洋细菌DM18 CGMCC No.1657培养液的活性提取物。
2.根据权利要求1所述的海洋菌株DM18培养液的活性提取物，其特征在于为乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物。
3.根据权利要求1或者2所述的海洋菌株DM18培养液的活性提取物，其特征在于A.液体培养基为KH2PO40.5g；NH4Cl 1.0g；Na2SO41.0g；MgSO4·7H2O 2.0g；70％(重量)乳酸钠5.0g；酵母膏1.0g；CaCl2·2H2O 0.1g；FeSO4·7H2O 0.5g；硫代乙醇酸纳0.1g；维生素C 0.1g；陈化海水或者人工海水1000mL；调pH7.2～7.4；其中，人工海水配方为NaCl 25.0g，Na2SO44.0g，KCl 0.7g，NaHCO30.20g，KBr 0.10g，H3BO30.03g，NaF 0.003g，53mL1.0mol/L MgCl2溶液，10mL1.0mol/l CaCl2溶液，0.90ml 0.1mol/L SrO2溶液，蒸馏水1000ml，pH调为7.2～7.4；B.培养条件温度为26～30℃，培养时间为5～15天。
4.一种权利要求2所述的海洋菌株DM18培养液的活性提取物的制备方法，其特征在于包括下列步骤A.种子培养将液体培养基灌装到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶盖微旋紧以利透气，于高压消毒器中121℃、0.105mpa灭菌20min；冷却后接种海洋菌株DM18，并用无菌培养基补满，瓶盖旋紧不透气；将血清瓶于26～30℃恒温培养5～7天；B.扩大培养按体积比5～10％的种子培养液接种，利用密封培养容器，采取类同种子培养的过程大量培养海洋菌株DM18菌液，于26～30℃恒温培养10～15天；C.提取将完成扩大培养过程的菌液用等体积的乙酸乙酯连续抽提3次，抽提后的水相再用等体积的正丁醇连续抽提3次，提取液分别用旋转蒸发仪于60℃、减压蒸干，得两份干固体；D.提纯将以上两份干固体分别滴加少量甲醇溶解，拌入300目～400目硅胶，减压干燥后制成干样品上硅胶柱，用体积比为氯仿∶甲醇＝80∶1的洗脱液洗脱，采用枯草杆菌纸片法活性跟踪手段，跟踪活性洗脱峰；所得活性洗脱相蒸干后通过HPLC进一步纯化，使用C18反相柱，水和甲醇作为流动相，用体积浓度为5～100％的甲醇水溶液作洗脱液进行30分钟梯度洗脱，再用100％甲醇洗脱20分钟；并检测254nm紫外吸收，通过逐步活性跟踪，制备出活性峰组分，将含活性组分的洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得两份油状物。
5.根据权利要求4所述的海洋菌株DM18培养液的活性提取物的制备方法，其特征在于液体培养基为KH2PO40.5g；NH4Cl 1.0g；Na2SO41.0g；MgSO4·7H2O2.0g；70％(重量)乳酸钠5.0g；酵母膏1.0g；CaCl2·2H2O 0.1g；FeSO4·7H2O0.5g；硫代乙醇酸纳0.1g；维生素C 0.1g；陈化海水或者人工海水1000mL；调pH7.2～7.4；其中人工海水配方为NaCl 25.0g，Na2SO44.0g，KCl 0.7g，NaHCO30.20g，KBr 0.10g，H3BO30.03g，NaF 0.003g，53mL 1.0mol/L MgCl2溶液，10mL 1.0mol/l CaCl2溶液，0.90ml 0.1mol/L SrO2溶液，蒸馏水1000ml，pH调为7.2～7.4。
6.权利要求1或者2所述的海洋菌株DM18培养液的活性提取物在制备抗细菌药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物领域，涉及一株严格厌氧活性海洋细菌、该菌株培养物的活性提取物及其制法，以及该提取物在抗细菌药物方面的应用价值。一株从中国黄海分离获得的海洋菌株DM18、鉴定为Desulfovibrio desulfuricans的扩大培养液，其乙酸乙酯提取相和正丁醇提取相经硅胶柱层析和反相高压液相分离，得到两个有效部分的油状物，对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌有抗性，具有作为抗细菌药物的潜在用途。
文档编号A61P31/04GK1891237SQ200610046178
公开日2007年1月10日 申请日期2006年3月27日 优先权日2006年3月27日
发明者穆军, 焦炳华, 梁占国, 吕红丽, 李彦生, 韦华生, 周荣丽 申请人:大连交通大学