专利名称：一种新型真菌胞外抗肿瘤、免疫调节活性多糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程，特别是涉及一种真菌胞外抗肿瘤、免疫调节活性多糖的制备方法。
背景技术：
姬松茸(Agaricus blazei Murrill)是一种食药兼用担子菌，属于蘑菇科，蘑菇属，其子实体和菌丝体中含有多糖、植物凝集素、核酸-蛋白复合物、甾醇类物质等生物活性物质。目前，姬松茸多糖的研究大多以子实体多糖或液态培养的菌丝体多糖为主，而对其发酵液多糖研究较少。
姬松茸多糖的主要生物活性为免疫调节、抗肿瘤活性，是理想的药品原料和功能性食品。但由于栽培条件要求高等因素，其子实体供应量远远不能满足市场需求。由于液态深层发酵具有生产周期短、可工厂化周年生产、便于管理等优点，对于姬松茸还可以克服培养周期长达三个月左右、对温湿度等栽培条件要求较为苛刻、而且固体栽培生物学效率低，产量不稳，病虫害发生较多等不利因素。因此，采用液态深层发酵的方法生产姬松茸多糖是解决之道。此法除可生产与姬松茸子实体营养价值相似的菌丝体外，还可获得含有大量活性物质的发酵液，其中丰富的多糖类物质目前尚未进行充分研究。以发酵液中生物活性多糖为基础生产的药品、功能性食品将有巨大的市场潜力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型真菌胞外抗肿瘤、免疫调节活性多糖的制备方法，利用液态发酵培养基对姬松茸菌株进行液体培养、胞外多糖分离、多糖纯化、活性检测。可以作为注射或口服免疫调节制剂的原料。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种新型真菌胞外抗肿瘤、免疫调节活性多糖的制备方法，其姬松茸液体培养基配方及培养条件为培养基配方蔗糖2-6％，豆粕0.5-1.5％，麸皮0.1-0.5％，生长因子0.1％，pH5.0-6.5；培养条件为培养温度25-32℃，摇床转速100-160rpm，装液量为25-100ml/250ml，培养时间5-7d。
如上所述的一种新型真菌胞外抗肿瘤、免疫调节活性多糖的制备方法，在利用发酵罐进行深层发酵时，以pH控制发酵有利于胞外多糖的生产；在罐压0.3~0.5Mpa，搅拌速度60-100rpm，空气流量0.4-1.0v/vmin，pH控制在5.0-6.5。
如上所述的一种新型真菌胞外抗肿瘤、免疫调节活性多糖的制备方法，依照上述方法制备的真菌胞外抗肿瘤、免疫调节活性多糖的结构为分子中葡萄糖和甘露糖的比例为3∶1，其主链由3个葡萄糖分子通过β-(1→6)糖苷键连在一起，再以α-(1→6)或β-(1→6)与甘露糖连接而构成，其结构如下
本发明的优点与效果是本发明真菌胞外抗肿瘤、免疫调节活性多糖的制备方法，利用液态发酵培养基对姬松茸菌株进行液体培养、胞外多糖分离、多糖纯化、活性检测。可获得含有大量活性物质的发酵液、丰富的多糖类物质。以发酵液中生物活性多糖为基础生产的药品、功能性食品将有巨大的市场潜力。可以作为注射或口服免疫调节制剂的原料。
图1为本发明多糖水解液的高效液相色谱图；图2为本发明多糖的红外光谱；图3为本发明多糖的13C-NMR谱图；图4为本发明多糖的1H-NMR谱图。
具体实施例方式
姬松茸液体培养或发酵培养基配方蔗糖2-6％，豆粕0.5-1.5％，麸皮0.1-0.5％，生长因子0.1％，pH5.0-6.5；最适培养条件为培养温度25-32℃，摇床转速100-160rpm，装液量为25-100ml/250ml，培养时间5-7d。在此条件下，姬松茸菌丝体的生物量和胞外多糖产量分别可达14.2g/L、1.35g/L。
在进行发酵罐深层发酵时，以pH控制发酵有利于胞外多糖的生产。在罐压0.3~0.5Mpa，搅拌速度60-100rpm，空气流量0.4-1.0v/vmin，pH控制在5.0-6.5的条件下，生物量和胞外多糖产量分别可达23.9g/L、2.4g/L。
胞外多糖分离将姬松茸发酵液离心或过滤，除去菌丝体，发酵液减压浓缩，加入冷乙醇沉淀，得出粗多糖。
多糖纯化粗多糖经过Sevag法脱蛋白、H2O2脱色、透析、DEAE-纤维素离子交换层析、Sephadex G-200凝胶过滤后，获得纯多糖。
如图所示图1由该多糖完全水解液的峰面积可知，该多糖分子中葡萄糖和甘露糖的比例约为3∶1。
图2该多糖在3406.75cm-1处有吸收峰，是O-H键的伸缩振动，表明多糖存在分子内和分子间的氢键；在2929.50cm-1处的强吸收峰表明分子中有糖类C-H键的伸缩振动；1647.38cm-1和1422.66cm-1处是多糖类的特征吸收峰；1149cm-1～1017cm-1之间的吸收峰是糖类C-O键的吸收峰；在810cm-1处有甘露糖的特征吸收峰；在749.99cm-1处有葡萄糖的特征吸收峰；573.70cm-1～416.56cm-1之间的吸收峰，尤其是416.56cm-1处的强吸收峰，是吡喃环碳骨架的吸收峰。930cm-1～950cm-1之间无吸收，890cm-1处有吸收，说明分子中有α型和β型糖苷键。
图3共振信号主要化学位移小于5.0ppm，且化学位移大于5.0处也有吸收峰，表明分子中以β型糖苷键为主，也含有α型糖苷键。δ值在4.95ppm处、5.2～5.4ppm处有吸收峰，表明分子中有葡萄糖和甘露糖。
图4δ值为100.3ppm、101.9ppm处有吸收峰，表明分子中含有葡萄糖和甘露糖；δ值为86.52ppm附近无吸收，表明无C3取代；δ在70～78ppm范围内有吸收，表明无C4取代；δ在60.6ppm、60.0ppm附近有吸收，表明不存在C6取代；而68.8ppm处的吸收峰是C6发生取代后的位移，表明分子中部分C6被取代，另一部分未被取代。
综合以上单糖组分HPLC分析、红外光谱分析和核磁共振分析结果，可知该多糖分子中葡萄糖和甘露糖的比例为3∶1，其主链由3个葡萄糖分子通过β-(1→6)糖苷键连在一起，再以α-(1→6)或β-(1→6)与甘露糖连接而构成。
权利要求
1.一种新型真菌胞外抗肿瘤、免疫调节活性多糖的制备方法，其特征在于姬松茸液体培养基配方及培养条件为培养基配方蔗糖2-6％，豆粕0.5-1.5％，麸皮0.1-0.5％，生长因子0.1％，pH5.0-6.5；培养条件为培养温度25-32℃，摇床转速100-160rpm，装液量为25-100ml/250ml，培养时间5-7d。
2.根据权利要求1所述的一种新型真菌胞外抗肿瘤、免疫调节活性多糖的制备方法，其特征在于在利用发酵罐进行深层发酵时，以pH控制发酵有利于胞外多糖的生产；在罐压0.3~0.5Mpa，搅拌速度60-100rpm，空气流量0.4-1.0v/vmin，pH控制在5.0-6.5。
3.根据权利要求1所述的一种新型真菌胞外抗肿瘤、免疫调节活性多糖的制备方法，其特征在于依照上述方法制备的真菌胞外抗肿瘤、免疫调节活性多糖的结构为分子中葡萄糖和甘露糖的比例为3∶1，其主链由3个葡萄糖分子通过β-(1→6)糖苷键连在一起，再以α-(1→6)或β-(1→6)与甘露糖连接而构成，其结构如下
全文摘要
一种新型真菌胞外抗肿瘤、免疫调节活性多糖的制备方法，涉及一种生物工程，其姬松茸液体培养基配方及培养条件为蔗糖2－6％，豆粕0.5－1.5％，麸皮0.1－0.5％，生长因子0.1％，pH5.0－6.5；培养温度25－32℃，摇床转速100－160rpm，装液量为25－100ml/250ml，培养时间5－7d。利用液态发酵培养基对姬松茸菌株进行液体培养、胞外多糖分离、多糖纯化、活性检测。可获得含有大量活性物质的发酵液、丰富的多糖类物质。以发酵液中生物活性多糖为基础生产的药品、功能性食品将有巨大的市场潜力。可以作为注射或口服免疫调节制剂的原料。
文档编号A61P37/02GK1900299SQ20061004723
公开日2007年1月24日 申请日期2006年7月19日 优先权日2006年7月19日
发明者张卉, 孙丽霞, 陶明明 申请人:沈阳化工学院