专利名称：一种禽用三联灭活疫苗及制备方法
技术领域：
本发明涉及家禽类生物制药技术领域， 一种禽用三联灭活疫苗及制备方法 背彔技术
鸡减蛋综合症,简称EDS—76是一种腺病毒引起的传染性疾病，可使鸡群产 蛋率下降30% 50%，蛋壳破损率达40%以上；新城疫俗称鸡瘟，是由鸡新城 疫病毒引起的一种高度接触性传染病，主要经呼吸道和消化道感染，各种年龄 的鸡均可感染，以雏鸡最为严重发病率和死亡率可达80%以上；鸡传染性支气 管炎的病原为冠状病毒属传染性支气管炎病毒，本病只感染鸡，各种日龄及品 种鸡都可发病，40日龄以内的鸡多发，尤以雏鸡发病严重，本病一年四季都可 发生，但冬季为甚，鸡群过密，天气突变，通风不良，维生素及矿物质缺乏，词 料供应不足，均可促使本病发生；鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合症， 有人将该病列为给养鸡业带来巨大经济损失的三大主要病毒性传染病。
联苗是指不同种微生物或其代谢产物组成的疫苗，联苗可简化接种程序， 减少接种动物应激反应的次数，此外对于产蛋鸡,尤其是种鸡应尽可能避免或减 少在产蛋期间做免疫接种，而鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗主要是 在开产前使用，使用剂量与单苗相当，但其效力与单苗相同，具有使用简便、 接种程序简单等优点，减少疫苗的免疫次数，避免家禽产生不必要的应激，达 到事半功倍的效果，联苗复配最关键的是抗原最佳配比问题。
一般情况下，菌苗中细菌抗原浓度的提高，可在培养过程中注意，也可通 过浓縮的方法。常用的浓縮方法有离心沉淀法、氢氧化铝吸附沉淀法和羧甲基 纤维沉淀法，可使菌液浓縮l倍以上。
一般情况下，灭活是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力及致病性，但 应尽可能地不影响或少影响其免疫原性。灭活的方法包括物理方法和化学方法。
物理法如加热、射线照射等方法，化学法是用化学灭活剂进行的，是目前常用 的灭活方法。常用的灭活剂有甲醛、乙酰乙烯基亚胺、乙烯亚胺、e-丙酸内酯 等。甲醛的灭活原理是它能使微生物的蛋白质、核酸变性，导致死亡，但不明 显影响其免疫原性。
一般情况下，佐剂属于免疫增强剂中的一类，单独使用时一般没有免疫原 性，与抗原物质合并使用时，能增强抗原物质的免疫原性，增强机体的免疫应 答，或者改变机体免疫应答类型。选择佐剂的同时应考虑其免疫增强作用和安 全性。世界卫生组织及一些专家认为，生物制品的佐剂，应符合以下条件一 是无致癌性和辅助致癌作用；二是无毒性；三是吸附力强、易于吸收；四是不 含与机体有交叉免疫反应的物质，本身不引起机体的超敏反应，也不会与机体 自身物质结合引起不良反应导致损伤；五是能经1 2年保存不变质、不明显降 低效力、不出现不良反应。佐剂的类型一般由氢氧化铝胶、弗氏佐剂、白油佐 剂、矿物油、水花生油乳剂、吐温-80、司盘、左旋咪唑、脂质体等，与抗原混 合成悬浊状态，尽可能延长在注射部位的贮留时间，从而持续不断地刺激机体 免疫系统，以产生较强的免疫应答；可出现免疫增强的作用。
发明内容
为了解决目前鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合症引起的发病率高, 死亡率高的问题，本发明的目的是提供一种禽用三联灭活疫苗及制备方法，使 三种抗原间的免疫千扰尽最大可能降低，降低畜擒死亡率，减少养殖专业户的 损失，造福于人类。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案
所述的禽用三联灭活疫苗及制备方法，其采用生物组合配比，其中灭活 的3倍浓縮NDV La Sota株病毒液重量比8.0 12. 0%;灭活的3倍浓縮IBV M41 株病毒液8.0 12.0%;灭活的EDSAV127株病毒液9.0 14.0%;并配合以白油 50 70%,吐温-801 3%,司本-802 4%,硬脂酸铝1 3%，采用了纤维膜超 滤浓縮法，釆用低温灭活，采用新的佐剂，制成灭活疫苗的油苗。
该禽用三联灭活疫苗及制备方法，采用了纤维膜超滤浓縮法，可提髙免疫
抗原在疫苗终产品的浓度达3倍以上，纤维膜超滤浓縮装置，设有二级孔径不 同的纤维滤柱， 一级滤柱的纤维可滤除部分细菌和杂质，二级超滤株的中空纤 维可截留病毒粒子。
该禽用三联灭活疫苗及制备方法，IBV M41病毒液创新采用低温灭活，2-8 "C经120-145小时,并将浓縮后的DNV La sota和EDSAV127病毒液，分别加入 0.05 0.15%甲醛溶液，经35 38"灭活12 17小时，可彻底灭活病毒，并不 影响其免疫原性。
该禽用三联灭活疫苗及制备方法，采用的佐剂是白油、吐温-80、司盘，实
分混合均匀,不易分层，在371C条件下更稳定，黏度也低。
由于采用了如上所述的技术方案，本发明具有如下积极效果 其浓縮工艺可提高免疫抗原在疫苗终产品的浓度，本发明经过长期实验采 用纤维膜超滤浓縮法，可是使效价达大幅提高。
其灭活是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力及致病性，但尽可能地不 影响或少影响其免疫原性。本发明DNV La sota，采用0.05 0.15%甲醛溶 液,35 381C灭活12 17小时，IBV M41采用2-8C低温灭活120-145小时，可 彻底灭活病毒，并不影响其免疫原性。
其佐剂属于免疫增强剂中的一类，单独使用时一般没有免疫原性，与抗原 物质合并使用时，能增强抗原物质的免疫原性，增强机体的免疫应答，或者改 变机体免疫应答类型。选择佐剂的同时应考虑其免疫增强作用和安全性。世界 卫生组织及一些专家认为，生物制品的佐剂，应符合以下条件 一是无致癌性 和辅助致癌作用；二是无毒性三是吸附力强、易于吸收；四是不含与机体有 交叉免疫反应的物质，本身不引起机体的超敏反应，也不会与机体自身物质结 合引起不良反应导致损伤；五是能经1 2年保存不变质、不明显降低效力、不 出现不良反应。本发明采用的佐剂是白油、吐温-80、司盘等。实验证明含油相
和水相乳化剂的疫苗比仅含油相的疫苗免疫效果好，可使抗原充分混合均匀，
不易分层.在371C条件下更稳定，黏度也低。
本发明成品检验中传染性支气管炎检验采用血清学的方法判定效力，比常 规的功毒检测方法更为准确直观而且结果更可靠.
本发明在生产工艺中独创的将三种毒珠液同时接种同一鸡胚的方法比起两 种毒珠液分别接种鸡胚,节省了鸡胚的使用数量，减少了疫苗生产的操作步骤， 避免了毒种污染机会，而且省去了疫苗制作中的浓縮环节，可节省时间，提高效 率.本公司技术人员经过大量试验最终找到了三种毒珠液最佳的配合比例，并解 决了两种病毒液之间的互相干扰问题.可使一次接种代替的三次接种，本创新必 将掀起灭活苗生产史上的一次革命，使其效力与单苗相当，具有使用简便、接 种程序简单等优点。
具体实施方式
一
生产用毒种的制备NDV La Sota株和IBV M41株毒种分别适当稀释，分 别接种SPF鸡胚，EDSAV127毒珠种适当稀释接种10日龄鸭胚，孵育，收获.制 苗用病毒液的制备，NDV La Sota株和IBV M41株毒种分别适当稀释，分别接 种易感鸡胚，EDSAV127毒珠种适当稀释接种10日龄鸭胚,孵育；收活毒种.分 别浓縮、灭活.取制苗用NDV La Sota毒株液8.6%和IBV M41毒株液8.6%和 EDSAV127株毒种10.挑；加吐温-80制成水相、用白油、司本-80、硬脂酸铝制 成油相.水相与油相之比为1:1.5， 一起乳化，分装，帖签，装箱、入库。
具体实施方式
二
生产用毒种的制备NDV La Sota株和IBV M41株毒种分别适当稀释，分 别接种SPF鸡胚，EDSAV127毒珠种适当稀释接种10日龄鸭胚,孵育，收获；制 苗用病毒液的制备(NDV La Sota株和IBV M41株毒种分别适当稀释，分别接 种易感鸡胚，EDSAV127毒珠种适当稀释接种10日龄鸭胚，孵育，收活毒种.分 别浓縮，灭活，取制苗用NDV La Sota毒株液9. 6%， IBV 毒株液9. 6%, EDSAV127株毒种12.挑，加吐温-80制成水相，用白油、司本-80、硬脂酸铝制
成油相，水相与油相之比为1:2—起乳化.分装、帖签，装箱、入库.具体实施方式
三
生产用毒种的制备NDV La Sota株和IBV M41株毒种分别适当稀释，分 别接种SPF鸡胚，EDSAV127毒珠种适当稀释接种10日龄鸭胚，孵育，收获；制 苗用病毒液的制备NDV La Sota株和IBV M41株毒种分别适当稀释，分别接种 易感鸡胚，EDSAV127毒珠种适当稀释接种10日龄鸭胚，孵育，收活毒种；分别 浓縮，灭活，取制苗用NDV La Sota毒株液10.0%， IBV M41毒株液10.0%, EDSAV127 株毒种13.5%，加吐温-80制成水相；用白油、司本-80、硬脂酸铝制成油相， 水相与油相之比为1:2.5—起乳化，分装，帖签，装箱，入库。
具体实施方式
四
生产用毒种的制备NDV La Sota株、IBV M41株和EDSAV127毒种分别适 当稀释同时接种SPF鸡胚，孵育，收获；制苗用病毒液的制备NDV La Sota 株、IBV M41株和EDSAV127毒种分别适当稀释，同时接种易感鸡胚，孵育'，收 活毒种，灭活，加吐温-80制成水相，用白油、司本-80、硬脂酸铝制成油相， 水相与油相之比为1:2; —起乳化，分装，帖签,装箱，入库。
权利要求
1、一种禽用三联灭活疫苗及制备方法，其特征在于其采用生物组合配比，其中灭活的3倍浓缩NDV La Sota株病毒液重量比8.0～12.0％；灭活的3倍浓缩IBV M41株病毒液8.0～12.0％；灭活的EDSAV127株病毒液9.0～14.0％；并配合以白油50～70％，吐温-801～3％，司本-802～4％，硬脂酸铝1～3％，采用了纤维膜超滤浓缩法，采用低温灭活，采用新的佐剂，制成灭活疫苗的油苗。
2、 如权利要求1所述的禽用三联灭活疫苗及制备方法，其特征在于其采用 了纤维膜超滤浓縮法，纤维膜超滤浓縮装置，设有二级孔径不同的纤维滤柱，一 级滤柱的纤维可滤除部分细菌和杂质，二级超滤株的中空纤维可截留病毒粒子。
3、 如权利要求1所述的禽用三联灭活疫苗及制备方法，其特征在于其IBV M41病毒液创新采用低温灭活，2-81C，经120-145小时，并将浓縮后的DNVLa sota 和EDSAV127病毒液，分别加入0. 05 0.15%甲醛溶液，经35 38汇灭活12 17 小时，可彻底灭活病毒，并不影响其免疫原性。
4、 如权利要求1所述的禽用三联灭活疫苗及制备方法，其特征在于其采用 的佐剂是白油、吐温-80、司盘，实验证明含油相和水相乳化剂的疫苗比仅含油相 的疫苗免疫效果好，可使抗原充分混合均匀,不易分层，在371C条件下更稳定，黏 度也低。
5、 如权利要求1所述的禽用三联灭活疫苗及制备方法，其特征在于生产用 毒种的制备NDV La Sota株和IBV M41株毒种分别适当稀释，分别接种SPF鸡 胚，EDSAV127毒珠种适当稀释接种10日齡鸭胚，孵育，收获.制苗用病毒液的制 备，NDVLaSota株和IBVM41株毒种分别适当稀释，分别接种易感鸡胚，EDSAV127 毒珠种适当稀释接种10日龄鸭胚,孵育；收活毒种.分别浓縮、灭活.取制苗用NDV La Sota毒株液8.6%和IBV M41毒株液8.6%和EDSAV127株毒种10.挑；加吐温-80 制成水相、用白油、司本-80、硬脂酸铝制成油相.水相与油相之比为1:1.5，一 起乳化，分装，帖签,装箱、入库。
6、 如权利要求1所述的禽用三联灭活疫苗及制备方法，其特征在于生产用 毒种的制备NDV La Sota株和IBV M41株毒种分别适当稀释，分别接种SPF鸡 胚，EDSAV127毒珠种适当稀释接种10日龄鸭胚,孵育，收获；制苗用病毒液的制 备(NDV La Sota株和IBV M41株毒种分别适当稀释，分别接种易感鸡胚，EDSAV127 毒珠种适当稀释接种10日齡鸭胚，孵育，收活毒种.分别浓縮，灭活，取制苗用 NDV La Sota毒株液9. 69b， IBV M41毒株液9.6%, EDSAV127株毒种12. 8%，加吐 温-80制成水相，用白油、司本-80、硬脂酸铝制成油相，水相与油相之比为1:2-起乳化.分装、帖签，装箱、入库.
7、 如权利要求1所述的禽用三联灭活疫苗及制备方法，其特征在于生产用 毒种的制备NDV La Sota株和IBV M41株毒种分别适当稀释，分别接种SPF鸡 胚，EDSAV127毒珠种适当稀释接种10日齡鸭胚,孵育，收获；制苗用病毒液的制 备NDV La Sota株和IBV M41株毒种分别适当稀释，分别接种易感鸡胚，EDSAV127 毒珠种适当稀释接种10日龄鸭胚，孵育，收活毒种；分别浓縮，灭活，取制苗用 NDV La Sota毒株液10.0%， IBV M41毒株液10.0%， EDSAV127株毒种13. 5%，加 吐温-80制成水相;用白油、司本-80、硬脂酸铝制成油相,水相与油相之比为1:2. 5 一起乳化，分装，帖签，装箱，入库。
8、 如权利要求1所述的禽用三联灭活疫苗及制备方法，其特征在于生产用 毒种的制备NDV La Sota株、IBV M41株和EDSAV127毒种分别适当稀释同时接 种SPF鸡胚，孵育，收获；制苗用病毒液的制备NDVLaSota株、IBV M41株和 EDSAV127毒种分别适当稀释，同时接种易感鸡胚，孵育收活毒种，灭活，加吐 温-80制成水相，用白油、司本-80、硬脂酸铝制成油相，水相与油相之比为1:2; 一起乳化，分装，帖签,装箱，入库.
全文摘要
一种禽用三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于其采用生物组合配比，其中灭活的3倍浓缩NDV La Sota株病毒液重量比8.0～12.0％；灭活的3倍浓缩IBV M41株病毒液8.0～12.0％；灭活的EDSAV127株病毒液9.0～14.0％；并配合以白油50～70％，吐温-801～3％，司本-802～4％，硬脂酸铝1～3％，采用了纤维膜超滤浓缩法，采用低温灭活，采用新的佐剂，制成灭活疫苗的油苗。
文档编号A61K39/12GK101108249SQ20061004842
公开日2008年1月23日 申请日期2006年7月18日 优先权日2006年7月18日
发明者乔荣岑, 习向峰, 孙进忠, 孟照国, 张许科, 荣骏弓 申请人:洛阳普莱柯生物工程有限公司