专利名称：用于杀伤肿瘤细胞的靶向性抗体复合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂，尤指一种微生物技术、纳米技术与电生孔技术相结合的生物制剂，具体地说是一种用于杀伤肿瘤细胞的靶向性抗体复合物及其制备方法。
背景技术：
癌症是一种发病率高、严重威胁生命和健康的疾病。医治癌症是医学上的重点。已有各种各样医治癌症的方法，如药物、手术、放射疗法等。但这些方法存在如下的缺点治疗周期长、疗效差，治疗多发转移病灶更难，对正常的细胞损伤严重、危险、昂贵等。近年来出现的光动力学疗法是一种利用光和化学药物(光敏剂血卟啉)共同治疗癌症的新方法。其中利用癌的抗体与血卟啉结合，使得药物自动结合到癌细胞的抗原上的导向技术使药效增加，对某些癌症显示了一定的疗效。但是光敏剂血卟啉及其衍生物在体内不稳定，对人体有害。而且作用时组织内一定要存在氧气，这些缺陷阻止了光动力学疗法的发展。
发明内容
本发明要解决的是现有技术存在的上述不足，提供一种能效高选择性地杀死肿瘤细胞新的生物制剂。解决上述问题采用的技术方案是用于杀伤肿瘤细胞的靶向性抗体复合物，其特征在于所述的复合物由肿瘤细胞抗体组装在具有光催化分解性能的纳米氧化物微粒上形成的。
已有研究发现，有些纳米氧化物微粒具有纳米生物学效应，这些纳米粒子在无光照条件下，对细胞没有杀伤作用，具有很好的生物相容性。但当在光(如紫外光)激发下，纳米粒子被激发产生光生电子和光生孔穴，并进一步产生强氧化性的自由基。这种自由基能分解有机分子，破坏生物组织，并最终导致介质中的细胞死亡。
本发明的抗体复合物，正是利用了这些具有光催化分解性能的纳米氧化物微粒的纳米生物学效应，将其与肿瘤细胞的特异抗体结合，然后通过抗体与抗原的特异性作用将纳米粒子自动选择性地结合到癌细胞上，这种自动靶向识别可在低浓度的溶液中大幅度增加癌细胞膜上吸附的纳米粒子的密度。而与正常细胞无涉。然后利用电脉冲的方法使癌细胞电生孔，把表面及其附近的纳米氧化物微粒置入癌细胞内。最后是用光(例如紫外光)照射使纳米粒子在癌细胞内进行光电化学分解及破坏细胞器，杀死癌细胞。这种方法可以大幅度提高光照杀癌细胞的选择性和效率，避免损伤正常细胞。
本发明可以根据各种癌细胞不同表面抗原，选择不同的特异性的单克隆抗体，制备出不同抗体和具有光催化分解性能的纳米氧化物微粒复合物，有望用于治疗血液中，脏器表面，甚至脏器内等部位的肿瘤。本发明采用免疫导向技术，在肿瘤治疗中具有高度的专一性、特异性；而由于采用光敏纳米金属氧化物技术，能杀伤各种瘤细胞，因而具有广谱性，更适应规模生产。
本发明的抗体复合物，所述的具有光催化分解性能的纳米氧化物微粒优选纳米TiO2或纳米ZnO。众所周知，纳米TiO2和ZnO是重要的宽禁带n-型半导体材料，若受到能量大于其禁带宽度的太阳光或荧光灯的照射，将激发TiO2和细胞的直接反应，即价带上的电子(e-)就会被激发到导带，在价带上产生相应的空穴(h+)，带负电的电子和带正电的空穴与吸附在半导体表面的H2O、O2发生反应，生成活性基团如·O-2，·OH等，它们有强大的氧化分解能力，可直接和细胞膜或细胞器反应，杀伤癌细胞。所述的具有光催化分解性能的纳米氧化物微粒的浓度为1μg/ml-100μg/ml。
目前，本发明采用鼠抗人单克隆抗体(亦可采用鼠Ig Fab段，基因重组抗体-人鼠嵌合型抗体等)是一类由单克隆的B淋巴细胞分泌的、能针对单一抗原决定簇的抗体。这种抗体是高选择性、高特异性的载体，当与纳米粒子耦合后，能特异性识别癌细胞膜抗原并与其结合，起到靶向性定位作用。所用人实体瘤单克隆抗体，可以是结肠直肠癌、肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤癌、膀胱癌、乳腺癌等任何一种单克隆抗体，我们可以根据不同的用途选择合适的单克隆抗体，然后将纳米粒子耦合到特异性的单克隆抗体上。
本发明的抗体复合物，在治疗癌症时利用电生孔技术将吸附在癌细胞膜上的抗体-纳米粒子复合物电击入细胞内，以提高了抗体-纳米粒子进入细胞的效率和数量。生物细胞膜是嵌有球形蛋白质的脂类二维排列的膜.细胞膜表面存在的微孔取决于电场和热运动的能量。其中电场能量是与细胞膜的跨膜电位相关的，对微孔的形成起着决定性的作用。微孔的半径一般很小，只允许小分子通过。细胞膜受到脉冲电场处理时，在膜上形成扩大的微孔，形成短暂的通透性结构，即所谓电生孔。电生孔生成的这种微孔能维持20多毫秒，最后因膜的流动性而闭合。体外培养的癌细胞在适宜大小的电压和持续时间电生孔后，吸附在其表面的抗体-纳米粒子复合物会更加容易进入细胞体内。在光照下从细胞内部光催化破坏组织，以提高对细胞的毒性。所用电脉冲的强度为100-5000V/cm，宽度为1μs-1s，次数为1-100次。
本发明的抗体复合物，在治疗癌症时除了采用传统的光动力作用中的可见辐射光外，还可采用紫外光、激光作为光动力的光源，以提高光动力学作用的效率。对体内的癌肿瘤可用光导纤维把引入体内对肿瘤进行照射。以杀灭癌细胞和肿瘤。
本发明还要提供一种用于杀伤肿瘤细胞的靶向性抗体复合物的制备方法，其特征在于按以下步骤进行1)制备具有光催化分解性能的纳米氧化物微粒悬浮液；2)将制备好的纳米氧化物微粒悬浮液放入已高压灭菌的管中，加入肿瘤细胞抗体溶液；3)搅拌、离心、洗涤，以去除未被吸附的肿瘤细胞抗体，得到特异性抗体与纳米粒子耦合的复合物。
所述的悬浮液按以下步骤制备将所述的氧化物经过球磨、超声分散后制成粒径在15-35nm左右的纳米微粒，再配制成浓度为1μg/ml-100μg/mL悬浮液，调节悬浮液的pH值为3～10，经高压灭菌后过0.45μm滤膜。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是纳米TiO2的扫描电镜图。
图2是荧光光谱(a)纳米TiO2悬浮液，(b)FITC标记的抗体溶液，(c)吸附了FITC标记的抗体的纳米TiO2。
图3是表面吸着了用FITC标记的抗体-纳米TiO2复合体的LoVo肠癌细胞的共聚焦荧光显微镜照片。
图4是紫外光照下经不同处理的肠癌细胞的存活率随照射时间的变化。(A)仅紫外光照射，(B)介质中添加纳米TiO2，(C)介质中添加抗体-纳米TiO2复合物。
图5是经抗体-纳米TiO2复合物加电穿孔技术处理过的不同细胞在紫外光照射下的存活率随照射时间的变化。(A)LoVo癌细胞，(B)正常TE353.sk细胞。光源为40W紫外灯。
图6是经抗体-纳米TiO2复合物加电穿孔技术处理过的不同细胞在紫外光照射下的存活率随照射时间的变化。(A)LoVo癌细胞，(B)正常TE353.sk细胞。光源为20W紫外灯。
具体实施例方式
实施例一采用TEM测量，纳米TiO2光敏剂经过球磨、超声分散后的粒径及形貌见参考图1。其粒径在15-35nm左右。配制成悬浮液(1μg/ml-100μg/mL)，调节悬浮液的pH值为3～10，高压灭菌后过0.45μm滤膜。将纳米粒子悬浮液放入已高压灭菌的管中，然后加入单克隆抗体溶液搅拌、离心、洗涤，以去除未被吸附的单克隆抗体，得到特异性抗体耦合的纳米粒子。为了观察CEA抗体在纳米TiO2上的吸附，CEA抗体可先与异硫氰酸荧光素(FITC)相结合按抗体量的1/100加入FITC，置4℃过夜，然后于PBS缓冲液中透析(2×8h，pH 7.4)去除未结合的游离荧光素。然后用上述方法把FITC标记的CEA抗体吸附在纳米TiO2上。采用荧光发射光谱证明抗CEA抗体与纳米TiO2粒子的结合，激发波长为490nm，发射波长为515nm(见图2)。
癌细胞LoVo用胰蛋白酶消化细胞进行传代培养，收集对数期的细胞用于实验，制成浓度为1×104-1×106cells/ml的单细胞悬浮液，细胞浓度用血球计数板测定。
将1-4ml细胞悬浮液分别接种于直径为35mm的无菌培养皿中，细胞贴壁后往培养皿中分别加入无纳米TiO2的对照溶液、纳米TiO2悬浮液、抗体-纳米TiO2悬浮液(其共聚焦荧光显微镜图见图3)，继续培养10-48h后用PBS洗涤三次，然后加入新鲜的培养液，再用20-40W的紫外灯照射，光强为1-6mW/cm2。
采用MTT法测定癌细胞的存活率。由图4可知，单独紫外光照就有杀癌细胞作用。经历60min光照后存活率为68％(曲线4A)。添加纳米TiO2后效率有所提高，60min光照后，肠癌细胞存活率为53％(曲线4B)。效率不很高的原因是所用纳米TiO2悬浮液的浓度很低，仅为3.12μg/mL。与纳米TiO2相比，抗体-纳米TiO2复合物能更有效地杀死结肠癌细胞，同样时间光照下结肠癌细胞的存活率降为39％(曲线4C)。这是由于纳米TiO2上的抗CEA抗体与结肠癌细胞抗原结合，使得更多的纳米TiO2被吸附到结肠癌细胞上，在紫外光照下能更直接杀死结肠癌细胞。由上述结果可知，在紫外灯光照下，抗体-纳米TiO2粒子复合物与纳米TiO2粒子相比较，对癌细胞有更好的光催化杀伤作用。
实例2(参考图5和图6)将纳米TiO2粒子悬浮液放入已高压灭菌的管中，然后加入单克隆抗体溶液搅拌，离心、洗涤，以去除未被吸附的单克隆抗体，得到特异性抗体耦合的纳米粒子。
各种细胞分别用胰蛋白酶消化细胞进行传代培养，收集对数期的细胞用于实验。制成浓度为1×104-1×106cells/ml的单细胞悬浮液，细胞浓度用血球计数板测定。
将1-4ml细胞悬浮液分别与相同体积的抗体-纳米TiO2悬浮液混合，以100-2000V/cm的电压脉冲5-20次后，每次脉冲时间为10-100μs。再将该细胞悬浮液接种于直径为35mm的无菌培养皿中，细胞贴壁后用PBS洗涤三次，加入新鲜的培养液，再用20-40W的紫外灯照射，光强为1-6mW/cm2。
采用MTT法测定细胞的存活率。由图5可知，在40W紫外灯光照30min光照后，抗体-纳米TiO2复合物+电穿孔技术处理过的LoVo细胞全部被杀死(曲线5A)，而TE353.sk细胞仍然有52％的存活率(曲线5B)。图6表示采用20W紫外灯照射55min后LoVo细胞全部被杀死(曲线6A)，而TE353.sk细胞仍然有49％的存活率(曲线6B)。这些结果说明在利用抗人CEA抗体与人癌细胞上CEA抗原结合的免疫高特异性后，显著提高了纳米TiO2的靶向性作用，提高了选择性。
应该理解到的是上述实施例只是对本发明的说明，而不是对本发明的限制，任何不超出本发明实质精神范围内的发明创造，均落入本发明的保护范围之内。
权利要求
1.用于杀伤肿瘤细胞的靶向性抗体复合物，其特征在于所述的复合物由肿瘤细胞抗体组装在具有光催化分解性能的纳米氧化物微粒上形成的。
2.如权利要求1所述的用于杀伤肿瘤细胞的靶向性抗体复合物，其特征在于所述的具有光催化分解性能的纳米氧化物微粒为纳米TiO2或纳米ZnO。
3.如权利要求2所述的用于杀伤肿瘤细胞的靶向性抗体复合物，其特征在于所述的纳米氧化物微粒的浓度为1μg/ml-100μg/ml。
4.如权利要求3所述的用于杀伤肿瘤细胞的靶向性抗体复合物，其特征在于所述的纳米氧化物微粒的粒径为15-35nm。
5.如权利要求4所述的用于杀伤肿瘤细胞的靶向性抗体复合物，其特征在于所述的纳米氧化物微粒浮液的pH值为3～10。
6.如权利要求1-5任何一项所述的用于杀伤肿瘤细胞的靶向性抗体复合物，其特征在于所述的肿瘤细胞抗体是结肠直肠癌、肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤癌、膀胱癌或乳腺癌的任何一种癌细胞抗体。
7.如权利要求1所述的用于杀伤肿瘤细胞的靶向性抗体复合物的制备方法，其特征在于按以下步骤进行1)制备具有光催化分解性能的纳米氧化物微粒悬浮液；2)将制备好的纳米氧化物微粒悬浮液放入已高压灭菌的管中，加入肿瘤细胞抗体溶液；3)搅拌、离心、洗涤，以去除未被吸附的肿瘤细胞抗体，得到特异性抗体与纳米粒子耦合的复合物。
8.如权利要求7所述的用于杀伤肿瘤细胞的靶向性抗体复合物的制备方法，其特征在于所述的悬浮液按以下步骤制备将所述的氧化物经过球磨、超声分散后制成粒径在15-35nm左右的纳米微粒，再配制成浓度为1μg/ml-100μg/mL悬浮液，调节悬浮液的pH值为3～10，经高压灭菌后过0.45μm滤膜。
全文摘要
本发明涉及一种用于杀伤肿瘤细胞的靶向性抗体复合物及其制备方法。所述的复合物由肿瘤细胞抗体组装在具有光催化分解性能的纳米氧化物微粒上形成的。本发明利用所述的氧化物微粒的纳米生物学效应，将其与肿瘤细胞的特异抗体结合，然后通过抗体与抗原的特异性作用将纳米粒子自动选择性地结合到癌细胞上，这种自动靶向识别可在低浓度的溶液中大幅度增加癌细胞膜上吸附的纳米粒子的密度。而与正常细胞无涉。然后利用电脉冲的方法使癌细胞电生孔，把表面及其附近的纳米氧化物微粒置入癌细胞内。最后是用光照射使纳米粒子在癌细胞内进行光电化学分解及破坏细胞器，杀死癌细胞。这种方法可以大幅度提高光照杀癌细胞的选择性和效率，避免损伤正常细胞。
文档编号A61P35/00GK1836729SQ20061005048
公开日2006年9月27日 申请日期2006年4月24日 优先权日2006年4月24日
发明者缪文良, 幺崇正, 缪逸男, 江志裕, 许娟, 孙毅, 陈春妹 申请人:杭州埃夫朗生化制品有限公司, 复旦大学