专利名称：金黄色葡萄球菌肠毒素i及制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物工程，涉及一种金黄色葡萄球菌肠毒素I(StaphylococcalEnterotoxin I，SEI)的制备以及用于刺激淋巴细胞增殖、抑制肿瘤细胞生长。具体的说，就是利用来源于金黄色葡萄球菌的编码SEI的基因与一种质粒载体重组，并将其转化至合适宿主进行表达，通过亲和纯化获得高纯度的重组SEI蛋白，并利用其超抗原活性应用于淋巴细胞增殖和肿瘤细胞抑制，并与作为目前临床上使用的金葡菌滤液制剂主要有效成分的金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC)进行活性比较。
背景技术：
1989年，超抗原的概念由瑞典科学家White提出，它是一类由细菌、病毒、寄生虫产生的对淋巴细胞有强大刺激功能的蛋白质，由于其对T淋巴细胞的激活能力是普通抗原的2000-50000倍，故称为超抗原。金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal Enterotoxin，SE)是目前全世界范围内广泛研究的一种超抗原。其中研究最为深入的主要包括A型金黄色葡萄球菌肠毒素(StaphylococcalEnterotoxin A，SEA)、B型金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal EnterotoxinB，SEB)、C2型金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal Enterotoxin C2，SEC2)等。
与普通抗原不同，肠毒素超抗原首先以完整分子结合于抗原提呈细胞(APC)表面的II类主要组织相容性复合体(MHC)的抗原结合沟槽外侧，而后与T细胞表面的抗原受体分子(TCR)的Vβ区结合，形成SE-MHC-TCR三分子复合物后大量激活T细胞。由此激活的T细胞可直接杀伤表达MHC-II类分子的肿瘤细胞，而对不表达MHC-II类分子的肿瘤细胞也可产生间接的杀伤效应。同时，被SE激活的CD4+T细胞可分泌大量细胞因子，如IL-2、IFN-γ、TNF-α等，对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用。IL-2等因子亦可激活NK细胞，使其发挥自然杀伤作用，IFN-γ、TNF-α等细胞因子还可促进肿瘤细胞的MHC-II类分子的表达，增强T细胞的识别。因此，经SE激活的T细胞能对肿瘤细胞和肿瘤组织产生高效的直接或者间接的杀伤作用。如Perabo等人证实经SEB刺激的外周血单核细胞(PBMC)能高效诱导人膀胱癌细胞株RT112细胞和RT4细胞调亡。Hedlund等人进行的体内实验表明，SEA激活T细胞使之增殖作用在每只小鼠0.1-100μg范围内呈剂量依赖关系，注射后1天出现最大效应，增殖效应维持4天。为提高在肿瘤治疗中的靶向性和特异性，人们针对不同肿瘤细胞表面特异性抗原，制备了多种相关抗原的单抗-超抗原融合蛋白或将单抗与超抗原偶联，大大增强了所激活的T细胞对肿瘤细胞和肿瘤组织的靶向性，使其能特异地杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。此外，人们还利用肿瘤细胞表面过度表达的受体的配体制备了配体-超抗原融合蛋白，有效地提高了由此激活的T细胞对肿瘤组织的靶向性。另外，将超抗原基因转染肿瘤细胞，将超抗原修饰的肿瘤细胞作为瘤苗继而免疫动物，亦获得了令人满意的抵抗肿瘤细胞再次攻击的效果。
在我国，以金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC)为主要有效成分的金黄色葡萄球菌滤液制剂作为肿瘤防化疗治疗的辅助药物应用于临床已有近十个年头，大量的临床数据证明使用后肿瘤患者的免疫能力获得了显著的提高，患者的食欲、睡眠以及全身状况均得到了明显好转。如罗锋等对35例浅表转移性肿瘤应用金葡菌滤液制剂进行局部治疗，治疗一个月后总有效率达82.9％。汤炜等通过对早期口腔癌采用局部金葡菌滤液制剂治疗及对晚期口腔癌应用金葡菌滤液制剂联合化疗，发现其可使大量淋巴细胞及纤维组织聚集在癌巢附近，并能观察到肿瘤细胞显著减少甚至部分病例肿瘤细胞消失。吴洁等将金葡菌滤液制剂作为化疗的辅助药物应用于食管癌治疗，结果显示与对照组相比，可明显升高白细胞，减轻胃肠道反应。
尽管目前以SEC为主要有效成分的金葡菌滤液制剂已取得广泛的应用，但由于制剂中存在着大量的蛋白质以及多肽类杂质，而主要有效成分肠毒素相对含量极低，使得一部分肿瘤患者在该制剂临床使用过程中出现了一定程度的相似副反应。如，李洪等报道了分别有28％和24％的肿瘤患者在使用金葡菌滤液制剂并联合卡铂治疗恶性胸腔积液过程中出现了发热和局部疼痛等副反应。刘秀英等在对鼻咽癌患者使用金葡菌滤液制剂联合放疗治疗的过程中观察到的主要副作用为中、低度发热，约占治疗组患者总数的5％。黎佳全等也报导了患者在应用金葡菌滤液制剂联合顺铂治疗恶性胸水过程中出现的主要副作用为发热，约占治疗组患者总数的65.5％。虽然这些副反应基本是暂时性的，症状可以自行缓解或者通过对症治疗进行消除，但仍然对肿瘤患者的治疗和康复造成了不良的影响。因此，对于目前金葡菌滤液制剂在临床应用中遇到的问题，需要制备高纯度的肠毒素并建立严格可控的质量标准逐步克服解决，以求减少在使用过程中产生的毒副作用并增强其肿瘤抑制疗效。目前，已经有人利用基因工程手段制备金黄色葡萄球菌肠毒素超抗原，如姜永强等将SEA、SEB、SEC1基因片段克隆至pBV220，在大肠杆菌中经热激诱导获得表达，但这些方法中纯化步骤均采用了离子交换的方法，存在吸附选择特异性差等弱点。徐明恺等将SEC2基因克隆至pET-28a中表达，但表达的重组产物比天然蛋白增加36个氨基酸，因此抗原决定簇及产物活性改变的可能性均较大。
发明内容
本发明的一个目的是提供了一种利用基因工程手段制备获得的重组金黄色葡萄球菌肠毒素I(Staphylococcal Enterotoxin I，SEI)，该蛋白属于一种超抗原，具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列。本发明利用其超抗原活性应用于体外促脾淋巴细胞增殖和以及体外抑制肿瘤细胞生长，并与金黄色葡萄球菌肠毒素C(Staphylococcal Enterotoxin C，SEC)进行超抗原活性比较。
本发明的另一个目的是提供重组金黄色葡萄球菌肠毒素I(SEI)的制备方法，本发明构建一种可用于表达金黄色葡萄球菌肠毒素I的重组质粒，该质粒由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列经过重组构建而成，质粒见说明书附图6。
本发明方法具体通过以下步骤实现(1)首先设计一对上下游引物SEQ ID NO.35’-caa tca taa ctt agt aaa ggaaat gcc-3’(上游引引物)，SEQ ID NO.45’-acg tac aca tta gcc cta gag act t-3’(下游引物)，以金黄色葡萄球菌(FRI 100)基因组为模板，采用PCR扩增获得编码SEI蛋白的基因片段，利用T-A克隆将其连入至pGEM-T质粒载体上的多克隆位点，成功构建pGEM-T-SEI重组质粒。通过测序证实获得的编码SEI蛋白的基因片段序列(见SEQ ID NO.2)与GenBank数据库中的编码相同蛋白质的基因序列(AY920267)完全一致。
(2)设计分别带有BamH I和Xho I酶切位点的上下游引物SEQ ID NO.55’-gtagga tcccaa ggt gat att ggt gta ggt-3′(上游引物，划线部分为BamH I酶切位点)，SEQ ID NO.65’-ggactc gagtta gtt act atc tac ata tga-3’(下游引物，划线部分为Xho I酶切位点)，以pGEM-T-SEI质粒为模板，采用PCR扩增获得两端带有酶切位点的编码肠毒素SEI蛋白的基因序列，将该基因片段用相应内切酶切割后与用相同内切酶处理后的pGEX-4T-1质粒相连接，成功构建表达质粒pGEX-4T-1-SEI。
(3)将pGEX-4T-1-SEI表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达带GST标签的GST-SEI融合蛋白。收获菌体并破碎后离心并收集上清。将菌体上清液与能特异结合GST的亲和填料充分混合，用洗脱液洗脱GST-SEI融合蛋白并收集，将收集到的融合蛋白与凝血酶在合适条件下充分反应，反应后的混合物再次与能特异结合GST的亲和填料充分混合，分离并收集经过纯化的SEI蛋白，取样电泳检测。能特征性地结合GST的亲和填料，优选偶联有谷胱甘肽的Glutathione Sepharose 4Fast Flow。经检测获得电泳纯的纯化产物后，将该纯化产物经过脱盐、冷冻干燥即得重组SEI冻干粉。
初始获得的蛋白为带有GST(谷胱甘肽转移酶)标签的融合蛋白GST-SEI，先利用亲和填料纯化该融合蛋白，进一步去除该标签后再次利用亲和填料纯化重组SEI蛋白。
初始获得的GST-SEI融合蛋白占细菌总蛋白含量的15-25％。
本发明的又一个目的是提供重组金黄色葡萄球菌肠毒素I在制备刺激淋巴细胞增殖、抑制肿瘤细胞生长药物中的应用。
通过前面方法制备获得电泳纯的SEI蛋白后，采用MTT法，以有丝分裂原ConA为阳性对照，建立合适的体外模型以观察重组SEI蛋白对ICR小鼠脾淋巴细胞的增殖作用以及受SEI刺激增殖的小鼠脾淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。应用此模型同时观察金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC)的超抗原活性并与重组SEI蛋白的活性进行比较，结果显示重组SEI蛋白具有典型的超抗原活性，并比SEC的作用更强。
本发明方法的特点是(1)提供了一种高纯度的重组SEI蛋白，利用体外小鼠脾淋巴细胞增殖实验和肿瘤细胞抑制实验证实该重组蛋白具有典型的超抗原活性，且较SEC更强。该重组蛋白在未被凝血酶切割前带有GST标签，适合亲和纯化，经凝血酶处理后的该蛋白质氨基酸序列及相应的核苷酸序列见SEQ ID NO.1，与相应的天然蛋白相比，该重组蛋白在N端增加了2个氨基酸残基；(2)提供了一种含有SEI基因的重组表达质粒pGEX-4T-1-SEI，该质粒由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2所示核苷酸融合构建而成，可转化入合适的表达宿主，它含有强启动子，在诱导剂诱导下可高效表达带有GST标签的GST-SEI融合蛋白；(3)使用含有由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2的核苷酸构建而成的表达质粒的工程菌，表达产物带有GST标签，并使用含有能特异结合GST的亲和填料来纯化该产物；(4)提供了一种工程菌，该菌株含有表达质粒pGEX-4T-1-SEI，在合适的诱导剂作用下可高效表达带有GST标签的GST-SEI融合蛋白。(5)适用于高效制备具有超抗原活性的高纯度肠毒素以及超抗原制剂的开发，用于肿瘤患者临床康复与治疗。
本发明方法对重组SEI进行了高效表达，表达强度占全菌蛋白的15-25％左右，且为可溶性表达，便于后续分离纯化。融合蛋白经凝血酶高效切割后，所得到的重组蛋白与相应的天然蛋白相比，只在N端多出2个氨基酸。本发明方法采用亲和层析对目的蛋白进行纯化，具有步骤简单，纯化速度快的特点，相比从金葡菌培养滤液中分离提取以及利用离子交换层析或分子筛层析等方法能获得高纯度的重组SEI蛋白。体外应用该蛋白刺激小鼠脾淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长，结果证明该目的蛋白具有典型的超抗原活性。鉴于在临床获得应用的金葡菌滤液制剂的主要有效成分为SEC，本发明通过比较证实重组SEI蛋白的超抗原活性较SEC更强，因此该重组SEI蛋白有望开发成为一种新的超抗原制剂用于肿瘤患者的临床康复和治疗。
在本说明书上下文中，除非特别指明，否则所引用的任何技术术语具有本领域普通技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明的实验方法是按照常规实验方法进行或按照供应商所建议的操作说明进行。
图1为PCR扩增所得编码SEI基因琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1核酸Marker，泳道2编码SEI蛋白基因PCR产物。
图2为PCR扩增后所测编码SEI基因序列测序结果图。
图3为重组pGEM-T-SEI质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1核酸Marker，泳道2重组pGEM-T-SEI质粒，泳道三重组pGEM-T-SEI质粒Nco I与Pst I双酶切产物。
图4为PCR扩增所得含酶切位点的编码SEI蛋白成熟肽基因琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1核酸Marker，泳道2含酶切位点的编码SEI蛋白成熟肽基因PCR产物。
图5为重组pGEX-4T-1-SEI质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1核酸Marker，泳道2重组pGEX-4T-1-SEI质粒，泳道三重组pGEX-4T-1-SEI质粒BamH I与Xho I双酶切产物。
图6为重组SEI表达质粒pGEX-4T-1-SEI示意图，标示的“sei”即为编码SEI蛋白基因序列插入位置。
图7为重组SEI在BL21(DE3)大肠杆菌中诱导表达电泳图，其中泳道1蛋白质Marker，泳道2经过诱导表达的菌体总蛋白。
图8为重组SEI纯化电泳图，其中泳道1蛋白质Marker，泳道2纯化后的重组SEI蛋白，泳道3纯化后的GST-SEI融合蛋白，泳道4Thrombin切割后的GST、SEI混合溶液。
图9为重组SEI与SEC对ICR小鼠脾淋巴细胞的增殖作用(48h)，与空白对照组相比**P＜0.01。
图10为重组SEI与SEC对耐阿霉素慢性髓原性白血病细胞(K562-AD)的抑制作用(48h)，与空白对照组相比***P＜0.001。
具体实施例方式
以下实施例提供了实现本发明的优选实施方案。本领域技术人员可以理解的是，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。下面的实施例中所公开的技术表示由本发明人所发现的技术，这些技术能有效实施本发明。不过，本领域技术人员可以理解，在不超出本发明的构思的前提下，可以对这些具体实施方案进行多种改变，仍然能获得相似的结果。
实施例1SEI的基因克隆和pGEM-T-SEI重组质粒的构建编码SEI蛋白的全长基因序列的PCR扩增设计如下一对引物序列SEQ ID NO.3(上游引物)5’-caa tca taa ctt agt aaa gga aat gcc-3’SEQ ID NO.4(下游引物)5’-acg tac aca tta gcc cta gag act t-3’以金黄色葡萄球菌(FRI 100)基因组模板，按照以下条件进行PCR扩增，扩增获得852bp的DNA片段，PCR结果凝胶电泳图参见图1。
PCR体系H2O 60μLBuffer(10×) 10μLMg2+(25mmol/L)8μLBSA(5mg/mL)10μLPrimer-up(25μmol/L) 4μLPrimer-down(25μmol/L) 4μLdNTP(20mmol/L) 2μLTemplate(Genome of FRI 100，10ng/μL) 1μLTaq Polymerase(5U/μL) 1μLPCR程序
1、95℃预变性3min2、95℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸1min3、依步骤2循环34次4、72℃延伸10min含编码SEI蛋白的全长基因序列的pGEM-T-SEI重组质粒的构建将PCR扩增所得的SEI全长基因克隆入pGEM-T质粒，转化至大肠杆菌DH5α中扩增。提取该重组质粒，经Nco I与Pst I酶切鉴定后送样测序，结果显示获得的编码SEI蛋白的基因全长序列与GenBank数据库的编码相同蛋白质的序列(AY920267)完全一致。测序结果参见图2。pGEM-T-SEI质粒酶切鉴定参见图3。
含内切酶位点的编码SEI成熟肽基因序列的PCR扩增设计如下一对引物序列SEQ ID NO.5(上游引物，划线部分为BamH I酶切位点)5’-gtagga tcccaaggt gat att ggt gta ggt-3′，SEQ ID NO.6(下游引物，划线部分为Xho I酶切位点)5’-ggactc gagtta gttact atc tac ata tga-3’，以含SEI全长基因的pGEM-T-SEI重组质粒作为模板，按照以下条件进行PCR扩增，扩增获得675bp的DNA片段，PCR结果参见图4。
PCR体系H2O 70μLBuffer(10×) 10μLMg2+(25mmol/L) 8μLPrimer-up(25μmol/L) 4μLPrimer-down(25μmol/L)4μLdNTP(20mmol/L)2μLTemplate(pGEM-T-SEI) 1μLTaq Polymerase(5U/μL)1μLPCR程序1、95℃预变性3min2、95℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸1min
3、依步骤2循环30次4、72℃延伸10min含编码SEI成熟肽基因的pGEX-4T-1-SEI重组表达质粒的构建用BamHI和Xho I分别酶切上述步骤中得到的含内切酶位点的编码SEI蛋白成熟肽的基因片段和pGEX-4T-1质粒。分别回收酶切后的含酶切位点的编码SEI成熟肽的基因片段以及pGEX-4T-1质粒酶切产物的大片段，并将两者连接，构建了表达质粒pGEX-4T-1-SEI。将该重组质粒转入大肠杆菌DH5α扩增并提取质粒，经过BamH I和Xho I酶切鉴定，结果表明目的基因片段已插入载体质粒，电泳结果参见图5。pGEX-4T-1-SEI质粒示意图参见图6。目的基因在pGEX-4T-1-SEI质粒上的详细序列见SEQ ID NO.1。
实施例2重组SEI的表达SEI表达菌株的构建从含有pGEX-4T-1-SEI重组质粒的大肠杆菌DH5α中提取该质粒，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，通过抗生素抗性筛选阳性克隆，获得可以大量表达GST-SEI融合蛋白的工程菌菌株。
融合蛋白GST-SEI的表达将上述工程菌单菌落接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养6h，作为种子液。将该种子液以1-5％的接种量接种于含氨苄青霉素的2×YT培养基中，37℃振荡培养4h，按0.01％-0.1％的体积比加入0.1mol/L IPTG诱导表达5h。
实施例3重组SEI的纯化样品的预处理经IPTG诱导的菌液4℃10000rpm离心，弃上清收集沉淀。沉淀用原菌液体积的1/10量的PBS重悬，将混悬液置FRENCH细胞破碎仪中，于700psi下破碎，悬液呈粘稠状。后用超声破碎仪继续超声破碎2min使核酸降解，菌体裂解液粘度降低。超声后向菌体裂解液中加入20％的Triton-100至终浓度为1％，充分混匀，冰浴静置30min。静置完毕后将菌体裂解液4℃12000rpm离心30min，取上清液低温保存待用。上清液取样进行SDS-PAGE检测，在分子量50kD处有较浓的条带，此即为诱导表达的GST-SEI融合蛋白。Quantity One图像分析软件显示该条带浓度大占总蛋白浓度的15-25％。经诱导后菌体裂解液蛋白电泳结果参见图7。
GST-SEI融合蛋白的纯化取1mL经过预处理的蛋白溶液，经0.45μm膜过滤后加入至预平衡的1mL Glutathione Sepharose 4Fast Flow柱中，轻轻混匀，结合30min后流尽液体。用PBS冲洗柱子3次，每次10mL，流尽液体。向柱中加入0.5mL还原型谷胱甘肽洗脱液，轻轻混匀。反应20min后收集溶液，用紫外分光光度计测蛋白浓度。重复上步的洗脱步骤直至蛋白浓度低于0.1mg/mL停止收集，结果显示各洗脱液组分中蛋白浓度呈正态分布。将各收集组分用SDS-PAGE检验纯度与浓度，结果显示纯化得到的GST-SEI融合蛋白为单一条带，分子量约50kD，电泳结果参见图8。
融合蛋白的切割将上述纯化得到的GST-SEI融合蛋白收集组分合并，经过脱盐柱或者用10000截留分子量的透析带透析，将溶液置换成含1.5mol/LNaCl、2.5mmol/LCaCl2的凝血酶缓冲溶液并同时去除溶液中的谷胱甘肽。每1mL蛋白溶液加入20mg/mL凝血酶2μL，25℃反应24h，取样电泳，检测酶切反应程度，酶切结果见图8。
重组SEI的纯化将反应后的蛋白溶液加入至预平衡的GlutathioneSepharose 4Fast Flow柱子中，轻轻混匀，静置20min后使液体流尽并收集。SDS-PAGE检测溶液中蛋白纯度与浓度。结果显示融合蛋白的GST标签已去除，在26KD分子量附近有单一条带，即为纯化的SEI蛋白，将纯化后的蛋白溶液脱盐后冻干保存。SEI纯化蛋白电泳结果参见图8。
实施例4MTT法测定重组SEI对ICR小鼠脾淋巴细胞的增殖作用以ICR小鼠的脾淋巴细胞为靶细胞，将其悬浮于含10％小牛血清的RPMIM1640培养液中，调整细胞浓度为5×106个/mL，每孔100μL铺于96孔板中，设调零孔(仅含培养基)、空白孔(脾淋巴细胞+培养基)、阳性对照孔(培养基+脾淋巴细胞+Con A)和实验孔(培养基+脾淋巴细胞+三个不同浓度梯度的SEI)，每种设四个复孔。其中，Con A终浓度为10μg/mL，SEI终浓度分别为1μg/mL、0.1μg/mL和0.01μg/mL。于铺板后44h在待测孔中加入10μL/孔的MTT溶液，小心吹打混匀后，培养箱中继续培养4h后，小心吸除上清，并加入120μL/孔的DMSO，吹打助溶后培养箱中放置10min，酶标仪双波长法(570nm为测定波长，630nm为参考波长)测定各孔OD570nm-OD630nm值，作图分析作用肠毒素对淋巴细胞的增殖作用，并用student t检验做统计分析。
各孔的吸光度与对照组相比，阳性对照Con A和0.01-1μg/mL SEI在作用48h后ICR小鼠脾淋巴细胞均有极显著增加(P＜0.01，同时随着药物浓度的增加作用效果也更显著(参见图9)。按相同实验方案检测SEC对ICR小鼠脾淋巴细胞的增殖作用，经比较，重组SEI对ICR小鼠脾淋巴细胞增殖作用比SEC更强。
实施例5MTT法测定重组肠毒素SEI的体外抑瘤活性设调零孔(仅含培养基)、肿瘤细胞对照孔(培养基+肿瘤细胞)、淋巴细胞本底释放孔[含空白孔(培养基+脾淋巴细胞)、阳性对照孔(培养基+脾淋巴细胞+Con A)和实验孔(培养基+脾淋巴细胞+四个不同浓度梯度的SEI)]以及抑瘤作用孔[含空白孔(培养基+脾淋巴细胞+肿瘤细胞)、阳性对照孔(培养基+脾淋巴细胞+肿瘤细胞+Con A)和实验孔(培养基+脾淋巴细胞+肿瘤细胞+四个不同浓度梯度的SEI)]，每种设三个复孔。其中，Con A终浓度为10μg/mL，SEI终浓度分别为1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL和0.001μg/mL，本底释放孔中5×106个/mL脾淋巴细胞以100μL/孔加入，肿瘤作用孔中5×106个/mL脾淋巴细胞和2.5×105个/mL耐阿霉素慢性髓原性白血病细胞(K562-AD)的混合悬液以100μL/孔加入到实验孔中，最后按用10％FCS RPMI 1640培养基稀释药物至要求浓度，50μL/孔加入各孔，并小心吹打混匀。
铺板后44h在待测孔中加入15μL/孔的MTT溶液，小心吹打混匀后，培养箱中继续培养4h后，小心吸除上清，并加入120μL/孔的DMSO，吹打助溶后培养箱中放置10min，酶标仪双波长法(570nm为测定波长，630nm为参考波长)测定各孔OD570nm-OD630nm值，仅含培养基的调零孔调零。按下式计算抑瘤率抑瘤率(％)＝100-[(抑瘤作用孔-淋巴细胞本底释放孔)/肿瘤细胞对照孔]×100，作图分析肠毒素对肿瘤细胞的抑制作用，并用student t检验做统计分析。
MTT法测定SEI体外抑瘤活性实验(各三只小鼠)，SEI以K562-AD作靶细胞，与不加药的抑瘤空白对照孔相比，阳性对照Con A和0.001-1mg/L的肠毒素I在作用48h后抑瘤率均有极显著的增高(P＜0.001)，同时随着药物浓度的增加作用效果也更显著(参见图10)。按相同实验方案检测SEC对K562-AD细胞的抑制作用，经比较，重组SEI对K562-AD细胞的抑制作用强于SEC。
本发明涉及的序列<110>浙江大学<120>金黄色葡萄球菌肠毒素I及制备和应用<160>6<210>1<211>660<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(660)<223>含部分凝血酶酶切位点序列的重组金黄色葡萄球菌肠毒素I<440>1gga tcc caa ggt gat att ggt gta ggt aac tta aga aat ttc tat45Gly Ser Gln Gly Asp Ile Gly Val Gly Asn Leu Arg Asn Phe Tyr1 5 10 15aca aaa cat gat tat ata gat tta aaa ggc gtc aca gat aaa aac90Thr Lys His Asp Tyr Ile Asp Leu Lys Gly Val Thr Asp Lys Asn16 20 25 30cta cct att gca aat caa ctt gaa ttt tca aca ggt acc aat gat135Leu Pro Ile Ala Asn Gln Leu Glu Phe Ser Thr Gly Thr Asn Asp31 35 40 45ttg atc tca gaa tct aat aat tgg gac gaa ata agt aaa ttt aaa180Leu Ile Ser Glu Ser Asn Asn Trp Asp Glu Ile Ser Lys Phe Lys46 50 55 60gga aag aaa ctg gat att ttt ggc att gat tat aat ggt cct tgt225Gly Lys Lys Leu Asp Ile Phe Gly Ile Asp Tyr Asn Gly Pro Cys61 65 70 75aaa tct aaa tac atg tat gga ggg gcc act tta tca gga caa tac270Lys Ser Lys Tyr Met Tyr Gly Gly Ala Thr Leu Ser Gly Gln Tyr76 80 85 90tta aat tct gct aga aaa atc cct att aat ctt tgg gtt aat ggc315Leu Asn Ser Ala Arg Lys Ile Pro Ile Asn Leu Trp Val Asn Gly91 95 100 105aaa cat aaa aca att tct act gac aaa ata gca act aat aaa aaa360Lys His Lys Thr Ile Ser Thr Asp Lys Ile Ala Thr Asn Lys Lys106 110 115 120
cta gta aca gct caa gaa att gat gtt aaa tta aga aga tat ctt405Leu Val Thr Ala Gln Glu Ile Asp Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu121 125 130 135caa gaa gaa tac aat ata tat ggt cat aat aac act ggt aaa ggc450Gln Glu Glu Tyr Asn Ile Tyr Gly His Asn Asn Thr Gly Lys Gly136 140 145 150aaa gaa tat gga tat aaa tct aaa ttt tat tca ggt ttt aat aat495Lys Glu Tyr Gly Tyr Lys Ser Lys phe Tyr Ser Gly Phe Asn Asn151 155 160 165ggg aaa gtt tta ttt cat tta aat aat gaa aaa tca ttt tca tat540Gly Lys Val Leu Phe His Leu Asn Asn Glu Lys Ser Phe Ser Tyr166 170 175 180gat ttg ttt tat aca gga gat gga ctg cct gta agt ttt ttg aaa585Asp Leu Phe Tyr Thr Gly Asp Gly Leu Pro Val Ser Phe Leu Lys181 185 190 195att tat gaa gat aat aaa ata ata gaa tct gaa aaa ttt cat ctt630Ile Tyr Glu Asp Asn Lys Ile Ile Glu Ser Glu Lys Phe His Leu196 200 205 210gat gtc gaa ata tca tat gta gat agt aac660Asp Val Glu Ile Ser Tyr Val Asp Ser Asn211 215 220<210>2<211>654<212>DNA<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)<220>
<221>CDS<222>(1)...(654)<223>克隆所得金黄色葡萄球菌肠毒素I<440>2caa ggt gat att ggt gta ggt aac tta aga aat ttc tat aca aaa45Gln Gly Asp Ile Gly Val Gly Asn Leu Arg Asn Phe Tyr Thr Lys1 5 10 15cat gat tat ata gat tta aaa ggc gtc aca gat aaa aac cta cct90His Asp Tyr Ile Asp Leu Lys Gly Val Thr Asp Lys Asn Leu Pro16 20 25 30
att gca aat caa ctt gaa ttt tca aca ggt acc aat gat ttg atc135Ile Ala Asn Gln Leu Glu Phe Ser Thr Gly Thr Asn Asp Leu Ile31 35 40 45tca gaa tct aat aat tgg gac gaa ata agt aaa ttt aaa gga aag180Ser Glu Ser Asn Asn Trp Asp Glu Ile Ser Lys Phe Lys Gly Lys46 50 55 60aaa ctg gat att ttt ggc att gat tat aat ggt cct tgt aaa tct225Lys Leu Asp Ile Phe Gly Ile Asp Tyr Asn Gly Pro Cys Lys Ser61 65 70 75aaa tac atg tat gga ggg gcc act tta tca gga caa tac tta aat270Lys Tyr Met Tyr Gly Gly Ala Thr Leu Ser Gly Gln Tyr Leu Asn76 80 85 90tct gct aga aaa atc cct att aat ctt tgg gtt aat ggc aaa cat315Ser Ala Arg Lys Ile Pro Ile Asn Leu Trp Val Asn Gly Lys His91 95 100 105aaa aca att tct act gac aaa ata gca act aat aaa aaa cta gta360Lys Thr Ile Ser Thr Asp Lys Ile Ala Thr Asn Lys Lys Leu Val106 110 115 120aca gct caa gaa att gat gtt aaa tta aga aga tat ctt caa gaa405Thr Ala Gln Glu Ile Asp Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Gln Glu121 125 130 135gaa tac aat ata tat ggt cat aat aac act ggt aaa ggc aaa gaa450Glu Tyr Asn Ile Tyr Gly His Asn Asn Thr Gly Lys Gly Lys Glu136 140 145 150tat gga tat aaa tct aaa ttt tat tca ggt ttt aat aat ggg aaa495Tyr Gly Tyr Lys Ser Lys Phe Tyr Ser Gly Phe Asn Asn Gly Lys151 155 160 165gtt tta ttt cat tta aat aat gaa aaa tca ttt tca tat gat ttg540Val Leu Phe His Leu Asn Asn Glu Lys Ser Phe Ser Tyr Asp Leu166 170 175 180ttt tat aca gga gat gga ctg cct gta agt ttt ttg aaa att tat585Phe Tyr Thr Gly Asp Gly Leu Pro Val Ser Phe Leu Lys Ile Tyr181 185 190 195gaa gat aat aaa ata ata gaa tct gaa aaa ttt cat ctt gat gtc630
Glu Asp Asn Lys Ile Ile Glu Ser Glu Lys Phe His Leu Asp Val196 200 205 210gaa ata tca tat gta gat agt aac654Glu Ile Ser Tyr Val Asp Ser Asn211 215 218<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>从金黄色葡萄球菌基因组中扩增金黄色葡萄球菌肠毒素I基因所用的上游引物<440>3caa tca taa ctt agt aaa gga aat gcc<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>从金黄色葡萄球菌基因组中扩增金黄色葡萄球菌肠毒素I基因所用的下游引物<440>4acg tac aca tta gcc cta gag act t<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>向金黄色葡萄球菌肠毒素I基因两端添加酶切位点所用的上游引物<440>5gta gga tcc caa ggt gat att ggt gta ggt<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>向金黄色葡萄球菌肠毒素I基因两端添加酶切位点所用的下游引物<440>6gga ctc gag tta gtt act atc tac ata tga
权利要求
1.一种金黄色葡萄球菌肠毒素I，该蛋白为一种超抗原，具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌肠毒素I的制备方法，具体通过以下步骤实现(1)以金黄色葡萄球菌基因组作为模板，按照常规方法进行PCR扩增，通过基因测序证实获得的目的基因片段序列与GenBank数据库中的编码相同蛋白质的基因序列(AY920267)完全一致，将编码SEI蛋白的基因序列连入pGEM-T载体；(2)在该基因两端添加BamH I和Xho I酶切位点并利用亚克隆技术构建pGEX-4T-1-SEI重组质粒，将该质粒转入大肠杆菌后，采用常规方法IPTG诱导蛋白表达”采用常规方法IPTG诱导蛋白表达；(3)利用能特异性地结合GST的亲和纯化填料纯化重组SEI蛋白，电泳鉴定结果显示获得了高纯度的重组SEI蛋白；其特征是步骤(1)用于扩增编码肠毒素SEI基因的上下游引物是SEQ ID NO.35’-caa tca taa ctt agt aaa gga aat gcc-3’，SEQ ID NO.45’-acg tac aca tta gcc cta gag act t-3’；步骤(2)用于扩增含带有BamH I和Xho I酶切位点的编码肠毒素SEI成熟肽基因的上下游引物是SEQ ID NO.55’gtagga tcccaa ggt gat att ggt gtaggt-3′，划线部分为BamH I酶切位点；SEQ ID NO.65’ggactc gagtta gtt act atctac ata tga-3’，划线部分为Xho I酶切位点；pGEX-4T-1-SEI重组质粒是由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列经过重组构建而成；步骤(3)适合质粒pGEX-4T-1-SEI原核表达系统表达蛋白的宿主，选用大肠杆菌BL21。
3.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌肠毒素I的制备方法，其特征是初始获得的蛋白为带有谷胱甘肽转移酶标签的融合蛋白GST-SEI，先利用亲和填料纯化该融合蛋白，进一步去除该标签后再次利用亲和填料纯化重组SEI蛋白。
4.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌肠毒素I的制备方法，其特征是初始获得的GST-SEI融合蛋白占细菌总蛋白含量的15-25％。
5.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌肠毒素I在制备刺激淋巴细胞增殖药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌肠毒素I在制备抑制肿瘤细胞生长药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种利用基因工程手段制备获得的重组金黄色葡萄球菌肠毒素I，该蛋白属于一种超抗原，具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列。该重组质粒由pGEX－4T－1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列经过重组构建而成。体外实验结果显示，制备的高纯度的重组SEI蛋白可高效刺激小鼠脾淋巴细胞增殖并呈现剂量依赖关系，受其刺激的小鼠脾淋巴细胞对肿瘤细胞有显著的杀伤作用。与目前作为金葡菌滤液制剂主要有效成分的金黄色葡萄球菌肠毒素C相比，重组SEI蛋白具有更好的超抗原活性，可制备成为一种能有效抑制肿瘤生长的超抗原制剂，用于肿瘤患者临床康复与治疗。
文档编号A61K39/085GK1900119SQ200610052649
公开日2007年1月24日 申请日期2006年7月26日 优先权日2006年7月26日
发明者丁丁, 李丹曦, 潘映秋, 陈枢青 申请人:浙江大学