专利名称：一种硅调控丝蛋白/磷酸钙盐复合材料制备的方法
技术领域：
本发明涉及生物医用材料领域，特别涉及一种调控丝蛋白/磷酸钙盐复合材料制备的方法。
背景技术：
我国是蚕丝生产和出口大国，蚕丝纤维产量约占世界产量的80％。家蚕丝主要是由丝素和丝胶两部分组成，通过对天然蚕丝在低浓度肥皂水中煮沸可以去除丝胶而得到丝素。丝胶是一种球状蛋白，易溶于水，但它是一种潜在的过敏源，会引发TypeI型过敏反应。而丝素是天然蚕丝的主要组成部分，约占其总重量的70％，是一种纤维蛋白，具有良好的生物相容性。丝素由18种氨基酸组成，其中赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸为人体必须从体外摄取的八种氨基酸。因此，丝蛋白除了应用于纺织面料外，还广泛应用于生物医学领域，如缝合线，口服蛋白，控制缓释给药，人工皮肤，骨修复材料等。随着分子生物学和现代生物技术的不断发展，以及对各种丝蛋白不同分级结构和组成规律认识的不断提高，从分子水平设计及生物合成具有不同结构和特点的重组类丝状蛋白质已经成为可能(一种重组动物丝-RGD融合蛋白及其生物合成方法，申请号200610049415.3，公开号CN1807460)。
硬组织(骨、牙)替代材料是生物医学材料中的一大类，具有量大面广的特点。美国国内每年涉及骨置换的外科治疗已超过100万人次，而对我国这样一个人口众多的发展中国家，潜在的巨大需求是不言而喻的。体内骨组织是受细胞高度调节控制生长而成的生物矿化组织，由两大部分构成——有机质和无机质。成年人的有机质占30％，主要是骨胶原纤维束，它作为骨的网状支架，赋予骨的弹性和韧性；无机质，主要是羟基磷灰石结晶，另外还包括硅、镁、钾、钠、锌等矿质元素)占70％，决定骨骼的硬度及刚性特征，同时，羟基磷灰石结晶的纯度对其活性起着很大的作用。随着组织工程学的发展，国内外利用仿生自组装的概念，通过控制生物矿化过程，设计生物材料并将其用于骨组织的修复取得了较大的进步(S.I.Stupp；P.V.Braun，Molecular manipulation of microstructuresBiomaterials，ceramics，and semiconductors.Science，1997；2771242-1248)。当前，国内外的相关模拟生物矿化及相关骨组织工程材料的研究中，选用的蛋白质大多为I型胶原蛋白，这是因为天然骨中I型胶原蛋白是含量最多的有机基质。作为天然骨的成分，胶原蛋白虽然具有一定的优势，但它也有自身劣势。首先，目前骨材料中选用的胶原蛋白的提纯工艺复杂，低纯度胶原则容易引起炎症反应等问题；其次，目前临床应用较多的是哺乳动物牛肌腱中提取的胶原蛋白，存在着疯牛病等牲畜疾病与人交叉感染的潜在威胁。因此，利用胶原以外的有机基质，如丝蛋白，作为调制生物矿化的模板可能是一条理想的途径。
另一方面，硅广泛存在于人体各种组织和体液中，包括天然硬骨组织，对生命过程作用和健康、疾病的关系日益引起人们的重视。近年来，通过对硅的生物、生化代谢、毒理等一系列研究，已经初步表明它也是人类必需的微量元素之一，它的摄入、代谢不平衡与心血管、骨等疾病都有关。早在1970年，Carlisle就曾用电子微探针分析表明，硅集中于幼年骨狭窄生长活跃地区，该处与骨成熟有关，硅参加了骨钙化过程。年幼大鼠长骨与骨样组织间硅含量为0.01～0.06％，越接近骨小梁其含量越高，在骨小梁边缘处已高达0.12％(Edith M.Carlisle，SiliconA Possible Factor in BoneCalcification.Science，1970；167279-280)。近期Hing研究小组通过体内试验，发现含硅的羟基磷灰石多孔的组织支架能促进骨组织的生长和修复，并且含硅0.8％支架在体内保持最快的骨生长速度，并且由刚开始植入骨组织的表面区域到渐渐渗入到骨组织内部(Karin A.Hing，Effect ofsilicon level on rate，quality and progression of bone healing withinsilicate-substituted porous hydroxyapatite scaffolds，Biomaterials2006；275014-5026)。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种硅调控丝蛋白/磷酸钙盐复合材料制备的方法。
本发明的一种硅调控丝蛋白/磷酸钙盐复合材料制备的方法，该方法包括下列步骤(1)天然蚕丝纤维在肥皂水中煮沸30～60分钟，用蒸馏水充分洗涤后得去除丝胶后的丝蛋白；(2)将所得丝蛋白在30～70℃条件下，溶解于8～10mol/L的饱和溴化锂溶液，在蒸馏水中透析3天，得纯丝蛋白溶液；(3)在纯丝蛋白溶液中滴加含有钙离子的溶液，并且不断搅拌；(4)在步骤(3)的溶液中快速加入含硅的溶液；(5)在步骤(4)的溶液中滴加含有磷酸根离子的水溶液，并且不断搅拌，最终加入的钙离子与磷酸根离子物质的量比为1∶1～3∶1；最终丝素的质量百分比浓度为0.1％～25％，最终钙离子的物质的量浓度为0.05～1mol/L，最终硅离子质量百分含量为0.001％～5％，pH为4～10；(6)将步骤(5)的溶液搅拌1～10分钟，然后离心分离出沉淀，用去离子水洗涤去掉多余的盐分；(7)将步骤(6)的沉淀物放入真空干燥箱干燥，然后将固体物质研磨成干粉，即得丝蛋白/磷酸钙盐复合材料。
所述步骤(1)中肥皂水的重量百分比浓度0.1～1％。
所述步骤(2)中饱和溴化锂溶液的浓度为9mol/L。
所述步骤(3)中，所述含钙离子的溶液为氯化钙溶液或硝酸钙溶液。
所述步骤(4)中所述含硅的溶液为偏硅酸钠、氟硅酸铵、硅酸钙、氟硅酸、硅酸钾、硅酸、正硅酸乙酯、氟硅酸钠或硅酸钠水溶液。
所述步骤(5)中，所述磷酸根离子的水溶液为磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钠溶液、磷酸氢二钾溶液或磷酸二氢钾溶液。
所述步骤(5)中，所述最终硅含量高于0.005％。
所述步骤(3)、(5)中，向体系中滴加顺序可以改变为先加入磷酸根离子，再加入钙离子。
本发明可以通过改变体系中硅的最终质量百分比含量调控复合材料中的磷酸钙盐的种类。当硅含量不高于0.005％时，初始复合材料中的无机相是由多种磷酸钙盐，如羟基磷灰石、双水磷酸二钙、磷酸三钙、磷酸八钙、焦磷酸盐所组成，经过5-10小时后其无机相成分逐渐转变为以羟基磷灰石为主；当硅含量高于0.005％时，初始复合材料中的无机相即为羟基磷灰石。同时得到的复合材料尺寸达到纳米量级，所生成的复合材料具有良好的力学性能、生物相容性和生物活性，并且原料来源丰富，具有价格低廉的特点。
图1为本发明实施例中丝蛋白/磷酸钙盐复合材料的FT-IR图；图中a不含硅离子的复合材料；b含硅0.005％的复合材料；c含硅0.01％的复合材料；d含硅0.02％的复合材料。
图2为本发明实施例中丝蛋白/磷酸钙盐复合材料的XRD图；图中a不含硅离子的复合材料；b含硅0.005％的复合材料；c含硅0.01％复合材料。
图3为本发明实施例中不含硅的丝蛋白/磷酸钙盐复合材料的SEM图。
图4为本发明实施例中含硅0.01％的丝蛋白/磷酸钙盐复合材料的SEM图。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明本发明中所用的丝蛋白是指家蚕丝蛋白、野蚕丝蛋白、天蚕丝蛋白、蓖麻蚕丝蛋白、柞蚕丝蛋白、蜘蛛丝蛋白或转基因丝蛋白家蚕或转基因丝。使用前要将丝蛋白中的丝胶去除。将脱胶的丝蛋白溶解于9mol/L的饱和溴化锂水溶液中，然后将溶解的丝蛋白溶液进行透析除盐处理。
本发明中所用的含磷酸根离子的溶液为磷酸盐溶液，可以为磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钠溶液、磷酸氢二钾溶液、磷酸二氢钾溶液；所用的含钙离子的溶液为钙盐溶液，可以为氯化钙溶液、硝酸钙溶液；所用的含硅溶液为偏硅酸钠、氟硅酸铵、硅酸钙、氟硅酸、硅酸钾、硅酸、正硅酸乙酯、氟硅酸钠或硅酸钠水溶液。所用试剂均为分析纯。
实施例1(1)将重量百分比浓度为0.1％的天然蚕丝纤维放于肥皂水中煮沸30分钟，用蒸馏水充分洗涤后得去除丝胶后的丝蛋白；(2)将所得丝蛋白在50℃条件下，溶解于8mol/L的饱和溴化锂溶液，在蒸馏水中透析3天，得纯丝蛋白溶液；(3)在100ml重量百分比浓度为1.75％的丝蛋白溶液浓度中，滴加200ml浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液，一次性加入10ml浓度为0.12mol/L的Na2SiO3溶液，然后继续缓慢滴加100ml浓度为0.2mol/L的Na2HPO4溶液，滴加过程中用磁力搅拌器不断搅拌。
(4)在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加氢氧化钠溶液，直至pH值达到8.0。
(5)将上述体系静置，待上下分层后离心除去上清，得到的沉淀用去离子水洗涤除去多余的盐分后，放入真空干燥箱干燥(40-45℃)，然后将固体物质研磨成干粉，其中硅离子质量百分含量为0.3％。
实施例2(1)将重量百分比浓度为0.5％的天然蚕丝纤维放于肥皂水中煮沸40分钟，用蒸馏水充分洗涤后得去除丝胶后的丝蛋白；(2)将所得丝蛋白在70℃条件下，溶解于9mol/L的饱和溴化锂溶液，在蒸馏水中透析3天，得纯丝蛋白溶液；(3)在100ml测得丝素溶液浓度为1.75％中，滴加200ml浓度为0.2mol/L的Ca(NO3)2溶液后，一次性加入0.625ml浓度为0.12mol/L的K2SiO3溶液，然后继续缓慢滴加100ml浓度为0.15mol/L的NaH2PO4溶液，滴加过程中用磁力搅拌器不断搅拌。
(4)上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加氢氧化钠溶液，直至pH值达到4.0。
(5)将上述体系静置，待上下分层后离心除去上清，得到的沉淀用去离子水洗涤除去多余的盐分后，放入真空干燥箱干燥(40-45℃)，然后将固体物质研磨成干粉，其中硅离子质量百分含量为0.02％。
实施例3(1)将重量百分比浓度为1％的天然蚕丝纤维放于肥皂水中煮沸60分钟，用蒸馏水充分洗涤后得去除丝胶后的丝蛋白；(2)将所得丝蛋白在30℃条件下，溶解于10mol/L的饱和溴化锂溶液，在蒸馏水中透析3天，得纯丝蛋白溶液；(3)在100ml测得丝素溶液浓度为1.75％中，滴加100ml浓度为0.2mol/L的Na2HPO4溶液后，一次性加入0.313ml浓度为0.12mol/L的Na2SiO3溶液，然后继续缓慢滴加200ml浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液，滴加过程中用磁力搅拌器不断搅拌。
(4)上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加氢氧化钠溶液，直至pH值达到5.0。
(5)上述体系静置，待上下分层后离心除去上清，得到的沉淀用去离子水洗涤除去多余的盐分后，放入真空干燥箱干燥(40-45℃)，然后将固体物质研磨成干粉，其中硅离子质量百分含量为0.01％。
实施例4(1)将重量百分比浓度为0.5％的天然蚕丝纤维放于肥皂水中煮沸30分钟，用蒸馏水充分洗涤后得去除丝胶后的丝蛋白；(2)将所得丝蛋白在40℃条件下，溶解于9mol/L的饱和溴化锂溶液，在蒸馏水中透析3天，得纯丝蛋白溶液；(3)在100ml测得丝素溶液浓度为1.75％中，滴加200ml浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液后，一次性加入0.157ml浓度为0.12mol/L的Na2SiF4溶液，然后继续缓慢滴加100ml浓度为0.2mol/L的Na2HPO4溶液，滴加过程中用磁力搅拌器不断搅拌。
(4)上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加氢氧化钠溶液，直至pH值达到6.0。
(5)上述体系静置，待上下分层后离心除去上清，得到的沉淀用去离子水洗涤除去多余的盐分后，放入真空干燥箱干燥(40-45℃)，然后将固体物质研磨成干粉，其中硅离子质量百分含量为0.005％。
实施例5(1)将重量百分比浓度为0.5％的天然蚕丝纤维放于肥皂水中煮沸30分钟，用蒸馏水充分洗涤后得去除丝胶后的丝蛋白；(2)将所得丝蛋白在60℃条件下，溶解于9mol/L的饱和溴化锂溶液，在蒸馏水中透析3天，得纯丝蛋白溶液；(3)在100ml测得丝素溶液浓度为0.74％中，滴加200ml浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液后，一次性加入0.007ml浓度为0.12mol/L的(NH4)2SiF6溶液，然后继续缓慢滴加100ml浓度为0.15mol/L的K2HPO4溶液，滴加过程中用磁力搅拌器不断搅拌。
(4)上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加氢氧化钠溶液，直至pH值达到6.0。
(5)上述体系静置，待上下分层后离心除去上清，得到的沉淀用去离子水洗涤除去多余的盐分后，放入真空干燥箱干燥(40-45℃)，然后将固体物质研磨成干粉，其中硅离子质量百分含量为0.01％。
实施例6(1)将重量百分比浓度为0.5％的天然蚕丝纤维放于肥皂水中煮沸30分钟，用蒸馏水充分洗涤后得去除丝胶后的丝蛋白；(2)将所得丝蛋白在50℃条件下，溶解于9mol/L的饱和溴化锂溶液，在蒸馏水中透析3天，得纯丝蛋白溶液；(3)在100ml测得丝素溶液浓度为0.74％中，滴加200ml浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液后，缓慢滴加入0.007ml浓度为0.12mol/L的(NH4)2SiF6溶液，然后继续缓慢滴加100ml浓度为0.2mol/L的KH2PO4溶液，滴加过程中用磁力搅拌器不断搅拌。
(4)上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加氢氧化钠溶液，直至pH值达到9.0。
(5)上述体系静置，待上下分层后离心除去上清，得到的沉淀用去离子水洗涤除去多余的盐分后，放入真空干燥箱干燥(40-45℃)，然后将固体物质研磨成干粉，其中硅离子质量百分含量为0.01％。
实施例7(1)将重量百分比浓度为0.5％的天然蚕丝纤维放于肥皂水中煮沸30分钟，用蒸馏水充分洗涤后得去除丝胶后的丝蛋白；(2)将所得丝蛋白在55℃条件下，溶解于9mol/L的饱和溴化锂溶液，在蒸馏水中透析3天，得纯丝蛋白溶液；(3)在100ml测得丝素溶液浓度为0.74％中，滴加200ml浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液后，一次性加入3.5ml浓度为0.12mol/L的Na2SiO3溶液，然后继续缓慢滴加100ml浓度为0.2mol/L的KH2PO4溶液，滴加过程中用磁力搅拌器不断搅拌。
(4)上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加氢氧化钠溶液，直至pH值达到10.0。
(5)上述体系静置，待上下分层后离心除去上清，得到的沉淀用去离子水洗涤除去多余的盐分后，放入真空干燥箱干燥(40-45℃)，然后将固体物质研磨成干粉，其中硅离子质量百分含量为5％。
表1在不同硅含量的条件下生成的初始复合材料中磷酸钙盐的种类。
表2在不同硅含量的条件下最终生成羟基磷灰石所需要的时间。
从表1得出当硅含量不高于0.005％时，初始复合材料中的无机相是由多种磷酸钙盐，如羟基磷灰石、双水磷酸二钙、磷酸三钙、磷酸八钙、焦磷酸盐所组成，经过5-10小时后其无机相成分逐渐转变为以羟基磷灰石为主。当硅含量高于0.005％时，初始复合材料的无机相即为羟基磷灰石；该丝蛋白/磷酸钙盐复合材料具有良好的力学性能、生物相容性和生物活性。
从表2得出在硅含量超过0.005％时，初始复合材料的无机相即为羟基磷灰石，无需等待时间。
实施例结合图1说明在不含硅离子的复合材料中，有少量的羟基磷灰石的形成，随着硅含量的增加，羟基磷灰石的含量也随之增加。当硅含量达到0.01％或以上时，初始复合材料的无机相即为羟基磷灰石。
实施例结合图2说明在不含硅离子的复合材料中，仅有少量的羟基磷灰石的形成，当硅含量增加至0.005％时，羟基磷灰石的含量也随之增加。当硅含量达到0.01％时，初始复合材料的无机相即为羟基磷灰石。
实施例结合图3图3为不含硅的丝蛋白/磷酸钙盐复合材料的SEM图，由于丝蛋白与羟基磷灰石以外的磷酸盐不能形成良好的复合效果，呈现出片状磷酸盐结晶。
实施例结合图4图4为本发明实施例中含硅0.01％的丝蛋白/磷酸钙盐复合材料的SEM图，由于丝蛋白与羟基磷灰石的结合，形成具有纤维形貌的复合材料。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种调控的丝蛋白/磷酸钙盐复合材料制备的方法，其特征在于所述方法依次包括下列步骤(1)天然蚕丝纤维在肥皂水中煮沸30～60分钟，用蒸馏水充分洗涤后得去除丝胶后的丝蛋白；(2)将所得丝蛋白在30～70℃条件下，溶解于8～10mol/L的饱和溴化锂溶液，在蒸馏水中透析3天，得纯丝蛋白溶液；(3)在纯丝蛋白溶液中滴加含有钙离子的溶液，并且不断搅拌；(4)在步骤(3)的溶液中快速加入含硅的溶液；(5)在步骤(4)的溶液中滴加含有磷酸根离子的水溶液，并且不断搅拌，最终加入的钙离子与磷酸根离子物质的量比为1∶1～3∶1；最终丝素的质量百分比浓度为0.1％～25％，最终钙离子的物质的量浓度为0.05～1mol/L，最终硅离子质量百分含量为0.001％～5％，pH为4～10；(6)将步骤(5)的溶液搅拌1～10分钟，然后离心分离出沉淀，用去离子水洗涤去掉多余的盐分；(7)将步骤(6)的沉淀物放入真空干燥箱干燥，然后将固体物质研磨成干粉，即得丝蛋白/磷酸钙盐复合材料。
2.根据权利要求1所述的一种调控丝蛋白/磷酸钙盐复合材料制备的方法，其特征在于步骤(1)中肥皂水的重量百分比浓度0.1～1％。
3.根据权利要求1所述的一种调控丝蛋白/磷酸钙盐复合材料制备的方法，其特征在于步骤(2)中饱和溴化锂溶液的浓度为9mol/L。
4.根据权利要求1所述的一种调控丝蛋白/磷酸钙盐复合材料制备的方法，其特征在于步骤(3)中，所述含钙离子的溶液为氯化钙溶液或硝酸钙溶液。
5.根据权利要求1所述的一种调控丝蛋白/磷酸钙盐复合材料制备的方法，其特征在于步骤(4)中所述含硅的溶液为偏硅酸钠、氟硅酸铵、硅酸钙、氟硅酸、硅酸钾、硅酸、正硅酸乙酯、氟硅酸钠或硅酸钠水溶液。
6.根据权利要求1所述的一种调控丝蛋白/磷酸钙盐复合材料制备的方法，其特征在于步骤(5)中，所述磷酸根离子的水溶液为磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钠溶液、磷酸氢二钾溶液或磷酸二氢钾溶液。
7.根据权利要求1所述的一种调控丝蛋白/磷酸钙盐复合材料制备的方法，其特征在于步骤(5)中，所述最终硅含量高于0.005％。
8.根据权利要求1所述的一种调控丝蛋白/磷酸钙盐复合材料制备的方法，其特征在于所述步骤(3)、(5)中，向体系中滴加顺序可以改变为先加入磷酸根离子，再加入钙离子。
全文摘要
本发明公开了一种硅调控丝蛋白/磷酸钙盐复合材料制备的方法，包括煮天然蚕丝纤维，用蒸馏水洗涤去除丝胶；将丝蛋白溶解于饱和溴化锂溶液，透析得纯丝蛋白溶液；在纯丝蛋白溶液中滴加含有钙离子的溶液；快速加入含硅的溶液；滴加含有磷酸根离子的水溶液；搅拌后离心分离出沉淀，用去离子水洗涤去掉多余的盐分；将沉淀物干燥，将固体物质研磨成干粉，即得丝蛋白/磷酸钙盐复合材料。本发明通过改变体系中硅的最终质量百分比含量调控复合材料中的磷酸钙盐的种类；同时得到的复合材料尺寸达到纳米量级，所生成的复合材料具有良好的力学性能、生物相容性和生物活性，并且原料来源丰富，具有价格低廉的特点。
文档编号A61L27/54GK1919358SQ20061005341
公开日2007年2月28日 申请日期2006年9月15日 优先权日2006年9月15日
发明者姚菊明, 励丽, 孔祥东 申请人:浙江理工大学