专利名称：一种可稳定表达VEGF shRNA的载体pCD－VEGF的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可在哺乳动物细胞内稳定表达VEGF shRNA的载体；本发明还涉及所说载体在肿瘤治疗中的应用。
背景技术：
血管在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。当肿瘤长至1～2mm3时，需要有新血管的生成。新的血管将肿瘤与周围的循环系统连接起来，为肿瘤的生长提供必需的物质交换。此外，原发的肿瘤细胞也通过血管进入血液循环，造成肿瘤的转移。因此，血管新生是肿瘤生长、发展的必经之路，与肿瘤的发生、转移有着密切的关系，这就是许多肿瘤仅在新的血管生成之后才出现临床症状的原因。靶向血管生成的抗肿瘤治疗，具有常规化疗药物无法取代的优势例如肿瘤组织内部通常有较高的间质压，化疗药物很难到达肿瘤内部；某些药物即使到达了肿瘤内部，也由于内部缺氧环境不易发生氧化还原反应，难以发挥疗效；化疗药物几乎对体内所有快速分裂增殖的细胞包括癌细胞产生抑制或杀灭作用，即其缺乏对癌细胞增殖的特异性，在抑制癌细胞增殖的同时，对于骨髓细胞、胃肠粘膜上皮细胞及其他组织器官中快速分裂的细胞也会产生明显的毒副作用；由于肿瘤细胞的多样性及其基因的高突变性，使化疗药物对肿瘤尤其是已经发生转移的肿瘤疗效不佳。因此，抑制肿瘤血管生成已成为当前肿瘤治疗研究的一个新热点。
血管的生成受到多种调节因子的控制，其中血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)是一种主要的正调控因子。它是1989年由Ferrara等首先从牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中纯化出来的糖蛋白，是在胚胎发生和创伤愈合过程中启动血管形成的一个高度特异的有丝分裂原，也是一种有效的血管形成和血管通透性因子。1991年Tischer等首先阐明了人VEGF的基因结构，该基因为单一基因，长约14kb，由8个外显子和7个内含子构成。当转录成mRNA后，可剪切拼接成5种异构体VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206，下方数字分别代表组成该异构体的氨基酸数目。VEGF通过与细胞表面的受体结合，通过旁分泌或自分泌的方式来调节血管的生成。VEGF与肿瘤的侵袭、转移密切相关，VEGF表达高的肿瘤预后不良，常见的恶性肿瘤通常均有VEGF的过量表达。
迄今，以VEGF为靶点设计得到的药物主要有抗体、反义核酸及小分子抑制剂。美国FDA已批准一种抑制VEGF的单抗Avastin用于临床，但价格异常昂贵。而反义核酸本身具有一定局限性，由于其特异性不强及给药剂量偏高等问题，致使其进一步的应用研究进展缓慢。
RNA干扰现象最早在C.elegan中被发现，它是指双链RNA(dsRNA)特异性地诱导同源的mRNA降解，从而抑制靶蛋白的表达。外源的双链RNA在细胞内经过RNA酶III Dicer的切割，成为21～23nt的短干扰RNA(small interferingRNA，siRNA)，其特征为3’端有两个核苷酸突出的双链RNA。siRNA与核酸酶等蛋白组分相结合，形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC在ATP的作用下，引导siRNA的反义链与靶mRNA上的互补位置结合，切割靶mRNA，从而达到抑制靶基因表达的目的。虽然RNA干扰现象的发现还不到10年，但由于其作用的快速有效性和高度特异性，已成为特异性抑制基因表达的有效途径之一。
目前获得siRNA的方法主要有五种，即化学合成siRNA法、shRNA表达载体法、体外转录siRNA法(采用T7启动子)、RNaseIII(Dicer)切割长双链RNA法及PCR表达盒法。其中体外合成siRNA方法简便迅速，但合成成本较高，使其应用受到了限制。而shRNA表达载体法相对成本较低，具有可再生性，并在体内外均能达到良好的RNA干扰效果，已成为近年来越来越受到重视的一种RNA干扰技术。
本发明的目的是，提供一种可长效表达VEGF shRNA的质粒载体，以避免多次瞬时转染造成的繁琐操作和非特异性毒性，通过抑制VEGF的表达获得治疗肿瘤的更加效果。
发明内容
本发明所说的可稳定表达VEGF shRNA的载体pCD-VEGF，是由pcDNA3.0基本序列、人H1启动子和可表达VEGF shRNA的DNA模板序列所组成。
本发明构建了一个可在哺乳动物细胞内长时间表达VEGF shRNA的质粒载体pCD-VEGF。该质粒是建立在pcDNA3.0基本序列上，通过内切酶切割，除去了原有的CMV启动子，并连入可被RNA聚合酶III(PolIII)识别的人H1启动子，在其中连入一段含有VEGF反向互补序列的DNA模板，该模板在转染进入细胞经过转录后，形成shRNA(short hairpin RNA，即发夹结构RNA)，通过碱基互补作用，与VEGF mRNA靶序列结合，从而干扰VEGF基因的表达。ELISA和Western Blotting检测表明，对HT1080细胞转染连入了针对VEGF的干扰质粒pCD-VEGF并经稳定筛选后得到的单克隆细胞株HT1080-V3，其VEGF的表达水平明显低于对照细胞和转染了MOCK(即表达不针对任何特定基因的shRNA)质粒的阴性对照细胞HT1080-M，其VEGF表达量为对照组的25.4％，HT1080-M组的30.5％；Matrigel侵袭实验表明，pCD-VEGF抑制了HT1080细胞的侵袭能力，穿过基底膜的细胞数分别为对照组的26.8％和HT1080-M组28.9％；划痕实验结果表明，pCD-VEGF削弱了细胞的运动能力；体内试验结果表明，pCD-VEGF可显著抑制HT1080细胞在体内的生长，在接种后第24天，HT1080-V3组尚未出现可触摸的瘤块，此时HT1080-M组瘤块体积均值已达1000mm3，至第54天时，HT1080-V3组瘤块虽可触及，但体积均值仅为43.4mm3，说明本发明构建的pCD-VEGF效果明显优于对照组。
发明效果本发明根据RNA干扰基本原理，提供了一种可长效表达VEGF shRNA的质粒载体，以避免多次瞬时转染造成的繁琐操作和非特异性毒性，通过抑制VEGF的表达可获得治疗肿瘤的更佳效果。
图1质粒pCD-VEGF的结构示意2质粒pCD-VEGF的构建流程3各HT1080稳定株细胞培养上清中VEGF分泌量的比较(ELISA结果)其中HT1080为未转染任何质粒的对照组细胞；HT1080-M为筛选出的转染了pCD-MOCK质粒的阴性对照细胞；HT1080-V1、HT1080-V2、HT1080-V3和HT1080-V4分别为筛选出的转染了pCD-VEGF质粒的细胞。
图4各HT1080稳定株细胞VEGF表达量的比较(Western Blotting结果)
其中HT1080为未转染任何质粒的对照组细胞；HT1080-M为筛选出的转染了pCD-MOCK质粒的阴性对照细胞；HT1080-V1、HT1080-V2、HT1080-V3和HT1080-V4分别为筛选出的转染了pCD-VEGF质粒的细胞。
图5质粒pCD-VEGF减弱了细胞对基底膜的侵袭能力其中HT1080为未转染任何质粒的对照组细胞HT1080-M为筛选出的转染了pCD-MOCK质粒的阴性对照细胞；HT1080-V3为转染了pCD-VEGF质粒并且经筛选后持续低表达VEGF的细胞。
图6质粒pCD-VEGF减弱了细胞的运动能力其中HT1080为未转染任何质粒的对照组细胞HT1080-M为筛选出的转染了pCD-MOCK质粒的阴性对照细胞；HT1080-V3为转染了pCD-VEGF质粒并且经筛选后持续低表达VEGF的细胞。
图7VEGF低表达细胞株HT1080-V3的裸鼠体内成瘤性检测其中HT1080为未转染任何质粒的对照组细胞HT1080-M为筛选出的转染了pCD-MOCK质粒的阴性对照细胞；HT1080-V3为转染了pCD-VEGF质粒并且经筛选后持续低表达VEGF的细胞。
具体实施例方式本发明实施例中在强调所构建的发卡式短干扰RNA结构时用shRNA来表示，在强调短干扰RNA的效应时用siRNA来表示。
以下实施例仅为帮助本领域技术人员进一步理解本发明，但不限制本发明。
实施例1VEGF shRNA靶序列及其DNA模板的设计shRNA靶序列的选择，主要是遵循Tushl原则(Methods 2002，26199-213)，如尽量避免起始密码子下游50个核苷酸之内和终止密码子上游100个核苷酸之内的序列；由于5’或3’的非翻译区及起始密码子附近调节蛋白结合位点较多，所以一般也不选择这些部位；序列应避免过高的GC含量，并且在序列中应避免连续出现3个或3个以上的G，等等。
选择完之后需要进行Blast搜索，以确保靶序列与其它基因的同源性很低，尽可能保证设计的siRNA具有最大的特异性基因沉默效果及最小的非特异性毒性和脱靶(off-target)效应。
靶序列设计完毕后，需要按照现有规则(Science 2002，296550-553)合成shRNA的DNA模板，该模板包括正义、反义两条互补的短DNA单链，其正义链的基本单位为BamHI位点、靶序列正义链、9bp的环序列、靶序列反义链、连续6个T、HindIII位点，DNA模板总长64bp。
所设计的VEGF shRNA的mRNA靶序列和寡DNA序列如下mRNA靶序列5’-UGUGAAUGCAGACCAAAGA-3’(SEQ ID No 1)寡DNA序列正义链5’-GATCCCTGTGAATGCAGACCAAAGATTCAAGAGATCTTTGGTCTGCATTCACATTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID No 2)反义链5’-AGCTTTTCCAAAAAATGTGAATGCAGACCAAAGATCTCTTGAATCTTTGGTCTGCATTCACAGG-3’(SEQ ID No 3)本发明采用了一个靶序列不与任何基因同源的MOCK shRNA，使用的MOCK-shRNA的mRNA靶序列和寡DNA引物序列如下mRNA靶序列5’-GGAUAGUACGAGAUUACAC-3’寡DNA序列正义链5′-GATCCCGGATAGTACGAGATTACACTTCAAGAGAGTGTAATCTCGTACTATCCTTTTTTGGAAA-3′反义链5′-AGCTTTTCCAAAAAAGGATAGTACGAGATTACACTCTCTTGAAGTGTAATCTCGTACTATCCGG-3′
DNA序列中的划线部分表示转录后将在此处形成互补，形成发夹结构。所用DNA序列由赛百盛公司合成。将合成的DNA序列稀释至1μg/μl后，分别取2μl与46μl的退火缓冲液混合，退火，退火条件为90℃，3min；37℃，60min；-20℃保存备用。序列退火后形成的双链DNA的5’端有BamHI酶切位点的粘末端，3’端有HindIII酶切位点的粘末端，可以直接用于连接。
实施例2pCD-VEGF质粒的构建为了能使质粒在哺乳动物细胞内长时间持续表达，质粒载体中需要具有真核复制信号和启动子。为此，本发明选择了目前常用的真核表达载体pcDNA3.0的主要序列作为基本序列(图1)。为防止其原有的CMV启动子对shRNA序列的表达产生影响，采用限制性内切酶切割将CMV启动子去除，再连入用于shRNA表达的H1启动子，具体步骤如下1)、采用BamHI和BglII内切酶对pcDNA3.0进行双酶切，切去CMV启动子。由于pcDNA3.0上只有一个BamHI和一个BglII酶切位点，因此，酶切后电泳仅出现两条带，长度分别为0.9kb和4.5kb左右，低熔点胶电泳后回收4.5kb左右大片段，将其连接后，形成一个长度为4.5kb左右的环形质粒。
2)、在连接后的环形质粒中，存在一个EcoRI和一个XhoI限制性内切酶酶切位点，对该质粒用EcoRI和XhoI进行酶切，并回收大片段(4518bp)，同时对pCSH1-1质粒(专利申请号200510066531.1)用EcoRI和XhoI进行酶切，回收小片段(167bp)，将回收得到的大、小片段进行连接，在连入人H1启动子的同时，引入了BamHI和HindIII酶切位点，得到的质粒长度为4685bp。
3)、将上一步得到的质粒用BamH I和HindIII双酶切，除去其中原有BamHI-HindIII片段(64bp)，回收大片段(4621bp)，与人工合成的VEGF核苷酸(64bp)退火后形成的短双链DNA连接，获得质粒载体pCD-VEGF(4685bp)(图2)。
采用SP6反向序列测序，测得VEGF shRNA表达单位反义链序列为5’-AGCTTTTCCAAAAAATGTGAATGCAGACCAAAGATCTCTTGAATCTTTGGTCTGCATTCACAGG-3’，结果与设计序列(SEQ ID No 3)一致。采用类似方法构建对照MOCK shRNA表达序列的质粒，命名为pCD-MOCK。
实施例3干扰序列表达质粒的转染及持续表达shRNA序列的哺乳动物细胞株的筛选本发明采用LipofectAMINETM2000脂质体(Life Technologies，货号11668-027)转染人纤维肉瘤细胞株HT1080，转染的质粒质量(μg)和脂质体体积(μl)比例为1∶2.5。所用的质粒浓度为2μg/ml。所有操作均按脂质体说明书进行。转染完毕24小时后，给细胞换液，换成含400μg/ml G418的培养液。以后每隔2～3天给细胞换液。待对照组细胞(即未转染任何质粒组)全部死亡后，将转染pCD-VEGF质粒组的细胞和转染pCD-MOCK质粒组的的细胞消化下来，计数后，用选择性培养液(含400μg/ml G418及10％FBS的MEM-EBSS培养液)稀释，加入到96孔板中，使每个孔内的细胞≤1个。待细胞长满后，将96孔板中由单个细胞长出的克隆转移至24孔板，再依次转至6孔板和25cm2培养瓶中培养，长满后传代并进行鉴定。
实施例4持续低表达VEGF的HT1080细胞的筛选将挑出的细胞克隆进行ELISA分析和Western Blot检测，以筛选出VEGF表达最低的克隆。
1)、ELISA分析将挑出的各细胞克隆以每孔8万的细胞数铺于24孔板中，培养48小时后，换成含2％FBS的MEM-EBSS培养液，继续培养24小时，收集培养上清，14000g、4℃离心15分钟除去细胞碎片，-80℃冻存待测。同时对24孔中的细胞进行消化、计数。采用VEGF ELISA检测试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)对细胞培养上清中的VEGF含量进行检测，结果表明，HT1080-V3细胞株的VEGF分泌量最低，为对照组HT1080细胞的25.4％，HT1080-M组的30.5％(图3)。
2)、Western Blotting检测待挑出的各细胞克隆长满细胞培养瓶后，用新鲜配制的细胞裂解液(50mMTris-HCl，pH7.5；1％NP-40；150mM NaCl；1mg/ml aprotinin；1mg/ml leupeptin；1mM Na3VO4；1mM NaF)裂解细胞，收集细胞总蛋白，并定量。用10％的SDS-PAGE胶进行变性电泳分离各蛋白，半干转膜仪(Amersham Biosciences，HoeferTE 70)将蛋白转到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上。转完的膜浸于含5％(w/v)脱脂奶粉-TBS(10mM Tris HCl，pH 7.5，150mM NaCl)溶液中室温振摇封闭过夜。随后用TBS室温润洗5次，每次5分钟，将膜装入杂交袋，用含1％BSA(牛血清白蛋白)的TBS溶液稀释第一抗体，室温振摇，与膜孵育3小时后，再用TBS室温润洗5次，每次5分钟。将膜装入新的杂交袋内，用二抗(辣根过氧化物酶标记)室温孵育3小时，TBS室温润洗5次，每次5分钟。膜上滴加化学发光增强剂(Santa Cruz Biotechnology sc-2048)，按照试剂说明书进行操作，通过化学发光成像系统ChemiImager5500(Alpha Innotech.)捕获图像。抗体的稀释比例如下，兔多克隆VEGF抗体(Santa Cruz产品，sc-152)1/200稀释，羊多克隆Actin抗体(Santa Cruz产品，sc-1616)1/400稀释，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(ZB-2301)和辣根过氧化物酶标记的兔抗羊抗体(ZB-2306)1/2000稀释。结果表明，HT1080-V3细胞中VEGF的表达量最低(图4)，与ELISA分析一致。
上述两个实验均在质粒转染细胞3个月后进行，并且中途经历了细胞冻存和复苏过程，因此可以确认，pCD-VEGF可在HT1080细胞内长时间持续地表达出VEGF shRNA，从而抑制VEGF蛋白的分泌和表达。
实施例5Matrigel侵袭实验检测细胞对基底膜的侵袭能力采用Transwell小室培养系统进行检测。在Transwell小室8.0μm的聚碳酸酯膜上方光滑面涂上1mg/ml的Matrigel(一种可在体外模拟体内基底膜环境的基质)100μl，在37℃，5％CO2条件下干燥过夜。下室加入含有5μg/ml fibronectin(纤连蛋白)的培养液600μl。收集长至对数期的各组细胞，分别消化、吹打成单个细胞，计数，将105个细胞悬浮于含1％FBS的培养液100μl中，加入Transwell上室，轻轻摇晃，使其分布均匀。在37℃，5％CO2的条件下孵育20小时，取出上室，将膜进行H&E染色，并封片，于显微镜下计侵袭细胞数。每组细胞取10个随机视野，计平均数。结果表明，pCD-VEGF可显著抑制细胞的侵袭能力(图5)，穿过基底膜的HT1080-V3的细胞数仅为对照组HT1080的26.8％，HT1080-M组的28.9％。
实施例6划痕实验检测细胞的运动能力将对数生长期的各组细胞消化、计数，以1×105细胞/ml/孔铺于24孔板中，每组细胞设3个平行孔。细胞在37℃，5％CO2的条件下培养72小时，待细胞长至100％融合，用20μl微量移液枪头在24孔板中垂直划痕，划痕后用培养液冲洗两次，洗去细胞碎片，12小时后观察细胞伤痕合拢情况。结果表明，pCD-VEGF可削弱细胞的运动能力。12小时后，HT1080和HT1080-M组细胞变细变窄，逐渐被细胞覆盖，而HT1080-V3组细胞伤痕仍清晰可见(图6)。
实施例7体内成瘤性比较实验给裸鼠接种各组细胞，以评价pCD-VEGF对细胞的异种移植成瘤能力的影响。取对数生长期的HT1080-V3、HT1080-M和HT1080细胞消化、吹成单个细胞、计数，将细胞悬液接种于5周龄雌性BALB/c(nu/nu)裸小鼠右侧腋窝皮下，每只裸鼠接种量为200μl，无血清MEM-EBSS培养液中含有2×105细胞。每组接种8只裸鼠。肿瘤接种时记录裸鼠重量，每周2次。对照组在接种后一周左右出现可触摸的瘤块。通过测量可触摸肿瘤的长径(a)和短径(b)，以公式体积＝1/2ab2来计算肿瘤体积。每周测量3次。结果表明，HT1080-V3组细胞在裸鼠体内的成瘤性明显低于HT1080和HT1080-MOCK组(图7)。
权利要求
1.一种可稳定表达VEGF shRNA的载体pCD-VEGF，其特征是所说载体系由pcDNA3.0基本序列、人H1启动子和可表达VEGF shRNA的DNA模板序列所组成。
2.如权利要求1所述VEGF shRNA的载体pCD-VEGF，其特征是所说DNA模板序列是根据VEGF mRNA靶序列设计的，mRNA靶序列为5’-UGUGAAUGCAGACCAAAGA-3’(SEQ ID No 1)。
3.如权利要求1或2所述VEGF shRNA的载体pCD-VEGF，其特征是所说DNA模板序列系由寡DNA正义链和反义链序列组成，正义链5’-GATCCCTGTGAATGCAGACCAAAGATTCAAGAGATCTTTGGTCTGCATTCACATTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID No 2)；反义链5’-AGCTTTTCCAAAAAATGTGAATGCAGACCAAAGATCTCTTGAATCTTTGGTCTGCATTCACAGG-3’(SEQ ID No 3)。
4.如权利要求1所述VEGF shRNA的载体pCD-VEGF在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种可在哺乳动物细胞内稳定表达VEGF shRNA的载体以及所说载体在肿瘤细胞侵袭转移中的抑制作用，研究结果表明，针对VEGF基因设计的pCD－VEGF载体转染细胞后，可削弱细胞对基底膜的侵袭能力，降低细胞的运动能力，并且显著抑制肿瘤细胞在裸鼠体内的生长，预示pCD－VEGF有望开发成为一种有效的抗肿瘤新药。
文档编号A61P35/00GK1834254SQ20061007224
公开日2006年9月20日 申请日期2006年4月14日 优先权日2006年4月14日
发明者邵荣光, 张敏, 刘铁刚, 何红伟, 欧阳志钢, 张胜华 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所