专利名称：一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖制备方法及其联合疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种b型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜多糖制备方法。具体而言，本发明涉及一种b型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜多糖的纯化以及后续的结合疫苗制备，本发明还涉及该结合疫苗和其他抗原组分形成联合疫苗的制备方法。
背景技术：
b型流感嗜血杆菌(Hib)多糖结合疫苗适用于2月龄～5岁的婴幼儿，预防Hib所引起的脑膜炎、肺炎、败血症、蜂窝组织炎、关节炎、会厌炎等感染性疾病。据估计，Hib所致疾病在全世界范围内每年至少发生300万例和导致数十万人死亡。因此，世界卫生组织(WHO)推荐将Hib疫苗列入扩大免疫规划中，美国也将Hib疫苗列入推荐的儿童免疫程序中。
早在1933年，Fothergill和Wright即证实了Hib脑膜炎的发生率与年龄及体内的抗荚膜多糖抗体水平成反比。新生儿是通过胎盘传递获得血清杀菌抗体，从母体获得的抗体主要存在于小于6月龄的儿童，而2～5岁的小儿可产生天然抗体，因而6月龄～2岁是Hib感染的高峰。同时，Hib抗体具有型特异性的特点和保护作用。目前，世界上已有80多个国家应用Hib疫苗，很多国家已将其纳入儿童计划免疫之中。成功地用于预防，可使Hib疾病大大减少，乃至消失。自从1987年以来，美国将Hib结合疫苗广泛应用，Hib导致的5岁以下儿童疾病的发生率大大下降。从1987年以前的100/10万下降到近年来的1/10万。1998～2000年，每年仅有大约66例Hib病例。
在亚洲，Hib疾病及Hib疫苗的研制问题正在研究之中，目前我国尚未将Hib疫苗列入儿童计划免疫。从王亚娟等人的研究结果看，至少1/4的病例是由肺炎链球菌或Hib引起，儿童Hib的感染率较高，明显高于芬兰、美国、英国等。所以大规模针对这两种病原的疫苗对儿童应用可能对人口众多的中国是有益的。(王亚娟等，中国计划免疫2004年6月第10卷第3期第176页)在Hib疫苗制备过程中，荚膜多糖的制备是关键的步骤。纯化荚膜多糖，目前多采用沉淀法和凝胶层析法，或两者相结合的方法。凝胶层析法影响因素少，纯化环境温和，因而多糖破坏少，但费时费力，每次分离量少；而且，在相对分子质量估计不清楚时，凝胶的选择有一定困难。沉淀法多采用乙醇、丙酮及长链季铵盐类作沉淀剂，该方法无凝胶层析法的缺点，但纯化环境不够温和，影响因素亦较多。50年代，Scott首先发现十六烷基三甲基溴化铵(Cetavlon)对酸性多糖有较强的沉淀作用，能与多糖形成季胺络合物而沉淀多糖。目前，Cetavlon已广泛用于各种细菌荚膜多糖的纯化制备，但含有磷壁质酸的革兰阳性细菌或被磷壁质酸污染的荚膜多糖，不易被Cetavlon所沉淀。Cetavlon对酸性多糖沉淀作用较强，但对中性多糖、核酸和蛋白质等物质亦有不同程度的沉淀作用。因此，要获得成分均一、纯度较高的荚膜多糖，必须进一步去除可能一起沉淀的核酸或蛋白质类。
多糖的常规提取方法在我国是采用和流行性脑炎双球菌和伤寒Vi荚膜多糖提取相似的工艺，简述如下1)去核酸将己杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物用注射用水溶解，并加入适量1mol/L氯化钠(或2mol/L氯化钙)溶液，摇动或搅拌1小时，使多糖与十六烷基三甲溴化铵解离；加入乙醇至最终浓度为25％，2-8℃静置1-3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。2)沉淀多糖于上述上清液中加人冷却乙醇至最终浓度为80％，充分振摇使多糖沉淀，离心收集沉淀；沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后即为多糖粗制品。3)多糖纯化将多糖粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达5-20mg/ml；按1∶2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.1moI/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析(必要时或有条件时也可用其他方法去除内毒素)；加入乙醇至最终浓度为75％-80％，离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解，即为精制多糖原液。该流程的缺点是难以将提取物中的核酸含量控制在低于1％以下。(杨耀等，中国生物制品学杂志2002年第15卷第3期，第171页)难以获得符合规范的Hib多糖提取物，所以在该步骤予以改进以获得较高纯度的产物是有实际意义的。
国外已经公开的多糖纯化方法主要参考Anderson(1977，INFECTION ANDIMMUNITY， Vol.15，No.2，p.472-477)的方法，具体方法为，离心获得细菌培养液上清后加入十六烷基三甲溴化铵沉淀，测定多糖、核酸、蛋白含量后，过Sepharose 4B或2B体积为2.3×50cm柱子，液相为磷酸盐缓冲生理盐水，该方法仅适用小批量生产，其它缺点如前所述。
絮凝法虽已广泛用于发酵液离心或压滤前的预处理，但作为从预处理后清液分离提取多糖的技术，尚未在工业生产上成功应用，其主要原因是未能找到或合成性能好，成本低的絮凝剂。
电絮凝方法回收生物活性物质的回收处理是源于八十年代初，Volkova等人(U.S.S.R、P.SU 944527)用电絮凝方法处理维生素厂废液，结果表明在30V/cm电场下处理1分钟，除去了74.8％以上的悬浮固体，96.1％以上的醚溶性物质以及76.3％以上的蛋白质；Kumav等(Kumav H D et.al.Electrical flocculation of theunicellular green Algachlorella Vulgaris.Aquatic Botany.1981，11187-195)研究电絮凝单细胞绿藻时发现，在条件为3V/cm电场，30分钟，pH值＝7.0时，可将近90％绿藻从水中分离；近年来，絮凝法用于发酵液的预处理取得一些进展，如刘叶青等人研究用阴离子型高分子絮凝剂加碱式氯化铝絮凝碱性蛋白酶2709发酵液，改善过滤性能(Indust.Microbiol.Vol.17，No.1，P6，1988).赵铭及朱树新研究用阴离子型聚电解质加钙盐及磷酸盐絮凝α-淀粉酶发酵液，改善过滤性能(Indust.Microbiol.，Vol.17，No4，P9，1988)，认为处理效果较一般工厂采用的无机盐絮凝预处理效果好；赵兵等人(电场絮凝分离提取三大工业酶工艺，ZL90100012.4，1990)利用电絮凝方法提取了α-淀粉酶、碱性蛋白酶和糖化酶。但迄今为止，尚未见电絮凝方法提取荚膜多糖的工艺。
为了解决Hib荚膜多糖分离提取工艺存在的问题，提高其生产的经济效益，本发明提供了电絮凝技术分离提取Hib荚膜多糖的方法。我们发现，该方法能明显地提高Hib荚膜多糖的回收率，比传统的Hib荚膜多糖的回收方法提高20％以上。
本发明是从发酵液预处理后的上清液中，添加聚苯乙烯磷酸钠或聚酰胺为主絮凝剂，外加低压直流或低压交流电场强化絮凝效果，提高荚膜多糖活性回收率，减少絮凝剂用量，达到经济地分离提取Hib荚膜多糖的目的。
本发明的原理是提供电场对带电荷的多糖类物质理化性质发生影响，并提供微量电子给多糖分子，中和其表面电荷，使其部分析出，同添加少量无毒、价廉的上述絮凝剂以达到分离提取荚膜多糖的目的。絮凝剂同多糖分子荷电基因之间的静电中和、氢键、范德华力的作用和由此形成的“接桥”，促使多糖分子絮凝，结合成较大尺寸的微粒沉淀析出，同时，外加电场亦对增加絮凝速度和絮体强度起重要作用，并给上清液提供了微量电流，促进絮凝，从而进一步提高了荚膜多糖回收率，增加絮凝程度，减少多糖的损失。并且我们还发现添加少量辅絮凝剂，如聚丙烯酸钠、聚丙烯酰胺或十二烷基磷酸钠能起协同絮凝作用，使电絮凝效果更完善。
本发明详细描述本发明的目的在于提供一种电絮凝方法提取Hib荚膜多糖的工艺以及相关的联合疫苗配方。
本发明所采用B型流感嗜血杆菌国内筛选菌株，其菌株号为MH200201。
该菌株来源为常州市第二人民医院儿科患者，特点为菌株传代稳定性好，毒力低，荚膜多糖产量高。
本发明技术方案如下步骤(1)Hib菌培养和发酵采用通常的Hib菌培养基和温度条件，即由Anderson(1977，INFECTION AND IMMUNITY，Vol.15，No.2，p472-477)所公开的方法，具体地说培养基采用CY培养基，成分为每升含10g酪蛋白氨基酸，5g酵母提取物，5g葡萄糖，0.1mol磷酸盐缓冲液，pH7.6，并添加1mg二磷酸吡啶核苷酸(NAD)和1mg高铁血红素。培养温度为37℃，振荡速度为200rpm；直至停止生长后继续剧烈震摇培养8-10hrs。以10ml/L的终浓度加入福尔马林，4℃过夜。
(2)上述含Hib荚膜多糖的培养液4000×g离心10min，取上清。
(3)所得上清在4-12℃的条件下加入絮凝剂，包括主絮凝剂和辅助絮凝剂，调节搅拌速度为200rpm，施加强度为2-40V/cm电场，絮凝剂的加入量为50-500ppm，其搅拌及絮凝提取时间为30-120分钟；(4)电絮凝过程结束后，对电絮凝提取液进行静置澄清或离心过滤，获得Hib荚膜多糖粗品；(5)将获得的Hib荚膜多糖粗品进一步进行纯化，方法参照PWAnderson(1986，The Journal of Immunology，Vol 137，Issue 4，p1181-1186)即可获得Hib荚膜多糖产物；(6)以Hib荚膜多糖为半抗原，以破伤风类毒素为载体蛋白，利用溴化氰(CNBr)活化多糖，己二酰肼(ADH)为“间隔剂”，碳二亚胺(EDAC)为“连接剂”的结合工艺，能获得结构稳定、重复性好的结合疫苗，此项技术制得的多糖蛋白结合疫苗早在1987年就被美国FDA通过为儿童应用。已有的国内外Hib结合疫苗也大都采用此项技术，经检验各项质控指标均能达到WHO的质控要求。方法参照(Schneerson.R.et al.Preparation Characterization and Immunogenicity of Haemophilusinfluenzae type b polysaccharide-protein conjugates.The journal ofexperimental medicine 198052 361-376)报道。
(7)联合疫苗组合方法本发明通过Hib结合疫苗与DTP联合，给接种者和被接种者提供便利。
联合各种组分疫苗的方法包括各种组分疫苗简单联合的方法(国际公布号WO 99/13906和WO 00/7623)，在进行疫苗接种时用特殊设计的容器同时施用的方法(国际公布号WO 99/13906)和通过将疫苗的各种组分和配料混合到一个制剂中来制备联合疫苗。
所述主絮凝剂为聚苯乙烯磷酸钠或聚酰胺；所述辅助絮凝剂为聚丙烯酸钠、聚丙烯酰胺或十二烷基磷酸钠、聚苯乙烯磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠或磺甲基化聚丙烯酰胺；本发明在发酵液上清中加入絮凝剂，在电场作用下进行絮凝提取，其絮凝剂用量低，加入后仅起到絮凝核心的形成作用，多糖的絮凝析出主要靠电场作用和电极极提供的微电流，因而絮凝剂用量仅为50-500ppm，絮凝剂成本仅为乙醇沉淀的几分之一到几十分之一，从而显著降低荚膜多糖提取成本，而且产品纯度高。
本发明采用安全无毒的絮凝剂，提取后去除絮凝剂方法简单。
实施例1，用本发明的电絮凝方法提取b型流感嗜血杆菌的荚膜多糖，其步骤如下配制CY培养基1L，其成分为10g酪蛋白氨基酸，5g酵母提取物，5g葡萄糖，0.1mol磷酸盐缓冲液，pH7.6，并添加1mg二磷酸吡啶核苷酸(NAD)和1mg高铁血红素。培养温度为37℃，振荡速度为200rpm；直至停止生长后继续剧烈震摇培养8-10hrs。以10ml/L的终浓度加入福尔马林，4℃过夜。然后以4000×g于4℃离心10min，收集上清，测定多糖含量，将得到的上清液置入带圆筒型电极的搅拌容器中，冰浴或调节温度为4-12℃，pH调节至6.5，加入主絮凝剂壳聚糖至终浓度为200ppm，辅絮凝剂聚苯乙烯磺酸钠至终浓度为150ppm，电场强度为5V/cm，开启搅拌器，转速为800rpm，15min，然后静置60min，离心(4000×g，10min，4℃)，收获沉淀，获得荚膜多糖初制品，进行多糖含量测定，测定方法为orcinal方法(Kabat，E.A.，and M.M.Mayer.1961.ExperimentalImmunochemistry.2ndedition.C.C.Thomas，Springfield，IL.)，结果其荚膜多糖的回收率为91％。
实施例2提取Hib荚膜多糖的方法与步骤同实施例1，不同之处在于絮凝剂为160ppm的改性淀粉，絮凝提取温度为12℃，PH值为7，辅助絮凝剂的加入量为100ppm，搅拌容器中电场强度E＝20V/cm，电场作用时间20min，先以900rpm转速快速搅拌5分钟，再以30rpm转速慢速搅拌10分钟，其絮凝提取率为76％。
实施例3方法与步骤同实施例1，但絮凝提取温度为20℃，pH值为7，壳聚糖絮凝剂的加入量为420ppm的壳聚糖絮凝剂，搅拌容器中电场强度E＝30V/Cm，电场作用时间30min，先以900rpm转速快速搅拌5分钟，再以30rpm转速慢速搅拌10分钟，其絮凝提取率为62％。
实施例4方法与步骤同实施例1，但絮凝提取温度为40℃，主絮凝剂十二烷基苯磺酸钠的加入量为50ppm(终浓度)，辅絮凝剂加入量为50ppm，搅拌反应器中电场强度E＝20V/cm，电场作用时间20min，先以900rp。转速快速搅拌5分钟，再以30rpm转速慢速搅拌50分钟，当pH＝6时，其絮凝提取率为75.8％；实施例5方法与步骤同实施例1，但絮凝提取温度为20℃，pH＝5，主絮凝剂为在上清中加入300ppm磺甲基化聚丙烯酰胺，先以900rpm转速快速搅拌5分钟，再以30rpm转速慢速搅拌50分钟，电场作用时间为20min，当电场强度为10v/Cm，多糖絮凝率为50％；同样条件下，电场强度为20V/cm，多糖絮凝率为72.7％。
实施例6提取Hib荚膜多糖，方法与步骤同实施例1，但絮凝提取温度为10℃，pH＝7，主絮凝剂为200ppm壳聚糖絮凝剂和60ppm磺甲基化聚丙烯酰胺的辅絮凝剂，电场强度E＝20V/cm，电场作用时间20min，先以1500rpm转速快速搅拌5分钟，再以30rpm转速慢速搅拌50分钟，多糖絮凝率达到91.6％。
实施例7用本发明的方法电絮凝提取Hib荚膜多糖，方法与步骤同实施例1，但絮凝提取温度为25℃，pH＝6，主絮凝剂为240ppm壳聚糖絮凝剂，辅絮凝剂为160ppm磺甲基化聚丙烯酰胺，电场强度E＝20V/cm，电场作用时间30min，先以1200rpm转速快速搅拌5分钟，再以30rpm转速慢速搅拌90分钟，多糖絮凝率达到93.2％。
实施例8以溴化氰活化多糖，己二酰肼为间隔剂，经碳二亚胺缩合，使多糖与TT共价偶联。按1mg多糖溶液加入0.5mgCNBr，pH＝10.8，室温活化30min。加入己二酰肼(ADH)3.5mg2-8℃反应12小时，透析后加入等量的TT类毒素和EDAC，pH＝5.7，反应60min。用Sepharose CL-4B柱层析纯化CPS-TT结合物，收集高分子量结合物洗脱峰，去除小分子残余物，提高产品质量及安全性。洗脱峰用生理盐水(NaCl浓度0.85％。)稀释至含多糖≥20μg/ml。可以作为Hib结合疫苗，用于预防2月龄至5周岁儿童由B型流感嗜血杆菌所引起的脑膜炎、肺炎、败血症、蜂窝组织炎、关节炎、会厌炎等感染性疾病。
实施例9将实施例8的Hib结合疫苗可与无细胞百白破(DTaP)疫苗组合成联合疫苗使用。每1次人用剂量DTaP/Hib联合疫苗含有10微克Hib荚膜多糖，无细胞百日咳原液9μgPN，白喉类毒素12.5Lf，破伤风类毒素3.5Lf。
权利要求
1.一种的流感嗜血杆菌荚膜多糖及其联合疫苗制备方法，优选为b型流感嗜血杆菌。其特征为在其纯化过程中采用低浓度特殊的絮凝剂以及一定的电场条件获得其培养液中荚膜多糖组分，提高其收率，并降低成本。
2.根据权利要求1所述的流感嗜血杆菌荚膜多糖，其特征在于所述b型流感嗜血杆菌荚膜多糖来源于国内分离的菌株。
3.根据权利要求1所述的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖絮凝剂主要成分为具有活性氨基与羟基的阳离子生物絮凝剂或阴离子型絮凝剂或为它们混合絮凝剂，具体地所指的絮凝剂包括聚苯乙烯磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、磺甲基化聚丙烯酰胺和壳聚糖或改性淀粉。
4.按权利要求1所述的絮凝提取Hib荚膜多糖的方法，其特征在于，所述电场条件为在10-2000rpm搅拌速度下，加入絮凝剂，并在搅拌反应器中设置一对平板式电极，平板式电极的两极端接入直流或交流电源，在电场强度为2-40V/cm条件下对含荚膜多糖的浸提料液进行电场絮凝提取，絮凝剂的加入量为10-1000ppm，其搅拌及絮凝提取时间为30-120分钟。
5.所述联合疫苗特征为一分子Hib荚膜多糖经活化后在多个位点结合TT类毒素蛋白的结合物获得。
6.所述联合疫苗特征为Hib荚膜多糖组分在每一剂疫苗剂量中含量为2-50μg。
7.所述联合疫苗特征为使用磷酸铝佐剂吸附HibCPS-TT结合物或直接采用HibCPS-TT结合物经生理盐水稀释获得。
8.所述联合疫苗特征为优选与无细胞百日咳疫苗成分、白喉类毒素和破伤风类毒素组合成联合疫苗，用于以上病原相关疾病的预防。
全文摘要
本发明涉及一种改进的流感嗜血杆菌荚膜多糖及其联合疫苗制备方法。主要特点为对Hib荚膜多糖的纯化工艺进行改进，提高了多糖收率，降低其它杂质如核酸的含量，并减低成本，特别适合规模生产工艺要求。用该方法提取的Hib荚膜多糖用于和破伤风类毒素(TT)偶联形成结合物，此结合物可与多种疫苗组分混合组成多价疫苗，其中优选的组分为无细胞百日咳疫苗成分、白喉类毒素和破伤风类毒素。
文档编号A61P29/00GK101081296SQ200610081288
公开日2007年12月5日 申请日期2006年5月29日 优先权日2006年5月29日
发明者郑海发, 李贵凡, 阮承迈 申请人:北京民海生物科技有限公司