真菌细胞壁合成基因的制作方法

专利名称：真菌细胞壁合成基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码参与真菌细胞壁合成的蛋白质的DNA，由该DNA编码的蛋白质，检查某些化合物是否对GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运中所涉及的转运过程产生影响的方法，以及对GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运中所涉及的转运过程产生影响的抗真菌剂。
背景技术：
近年来，由于老人以及因高强度化疗等而导致的免疫受损患者的数目的增加，机会感染的管理变得比以往更重要。由假丝酵母(Candida)、曲霉菌(Aspergillus)、隐球菌(Cryptococcus)等导致的深部真菌感染占这种机会感染的一部分，其比例正年复一年地增加。由众多无毒细菌导致的机会感染接连发生的事实表明，只要存在降低病人免疫功能的疾病，传染性疾病就不会终止。尽管在即将到来的老龄社会中传染病控制的策略(包括细菌耐药性的问题)将是至关紧要的问题之一，但是目前存在的有效治疗药物还相当少。
到目前为止，治疗真菌感染的药物的开发主要基于下列策略，即通过化学方法修饰已知的结构来制备新的化合物。但是，由于耐药性细菌的出现等问题，所以迫切需要开发基于新机理的新药物。
考虑到这种状况，本发明人瞄准了治疗药物种类不充分的抗真菌剂领域中的一种新途径。换言之，本发明人的工作集中在通过阻止病原体发挥致病性来影响感染的发作、发展和持续。为了避免感染的建立和发展，本发明人认为最有效的途径是抑制对宿主的粘附(这是感染建立的第一步)，以及随后的定居。另外，还实施了一种崭新的方法，即抑制粘附因子本身的表达。
为了抑制粘附因子的表达，本发明人将其注意力指向如下假设细胞壁糖蛋白如粘附因子首先通过GPI(糖基磷脂酰肌醇)-锚定在细胞膜上，然后再转运到细胞壁上(图1)。迄今，已经发现30或更多的细胞壁糖蛋白(包括粘附配体)是通过GPI-锚定转运的(称之为GPI-锚定蛋白质)。因此，发明人想到，如果该转运步骤受到抑制，则极有可能抑制粘附因子和构成细胞壁的主要蛋白质在细胞壁上的表达(Hamada K et al，Mol.Gen.Genet.，25853-59，1998)。已经报道过，GPI-锚定蛋白质存在于假丝酵母中，其为一种致病性的真菌(Kapteyn JC et al，Eur.J.Cell Biol.，65402-407，1994)。
本发明人开始了他们的研究，同时确信，抑制细胞壁合成的新抗真菌剂可以通过抑制真菌细胞膜中存在的GPI-锚定蛋白质转运到细胞壁的过程来制备。

发明内容
本发明的目的是开发抗真菌剂，该抗真菌剂通过抑制细胞壁糖蛋白的表达，抑制细胞壁的装配及与细胞的粘附，以及阻止病原体表现出致病性，而体现出抵抗感染发作、发展和持续的作用。
为了筛选抑制GPI-锚定蛋白质到细胞壁之转运过程的化合物，本发明人制备了采用融合蛋白的报告系统，该融合蛋白包括报告酶和存在于CWP2(GPI-锚定蛋白质之一)的C-末端的转运信号(Van Der Vaat JM et al，J.Bacteriol.，1773104-3110，1995)。
构建包含分泌信号基因+报告酶基因+CWP2 C-末端基因(存在或缺失)的DNA，并在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达融合蛋白，经证实，当CWP2C-末端存在时，可在细胞壁中检测到报告酶的活性；当CWP2C-末端不存在时，可在培养物上清液中检测到报告酶的活性。因此，可以预言，如果GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程受到试样的抑制，报告酶在细胞壁中的活性将会减少，或者报告酶的活性将会在培养物上清液中发现。因而，抑制GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程的化合物的筛选是利用该报告系统开始的。
从采用该报告系统的筛选中发现了若干抑制GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程的化合物。有代表性的实例如式(Ia)所示的化合物。
前述式(Ia)所示的化合物(下文中称之为“化合物(Ia)”)抑制酿酒酵母和白色假丝酵母(Candida albicans)的生长，而且在前述化合物(Ia)存在下培养的白色假丝酵母表现出弱的粘附到细胞上的活性。这样，可以确定前述的化合物(Ia)适于本发明的最初目的，即基于对GPI-锚定蛋白质向细胞壁转运的系统的抑制，发现一种因为抑制真菌粘附素的表达而抑制真菌粘附的化合物。此外，通过透射电子显微镜观察可以证实，在前述化合物(Ia)的存在下培养的白色假丝酵母在其细胞壁合成中有异常。
本发明人证实，采用前述的化合物(Ia)可以制备基于抑制GPI-锚定蛋白质向细胞壁转运过程的机制的抗真菌剂。
此外，为了确定前述化合物(Ia)所作用的目标蛋白，本发明人检索了赋予前述化合物(Ia)以抗性的基因。
将酿酒酵母基因的质粒库引入酿酒酵母中，并通过过表达收集对前述化合物(Ia)表现出抗性的质粒。然后克隆抗性基因，测定核苷酸序列，并将该基因命名为GWT1(SEQ ID NO1)。在过表达GWT1基因产物的酿酒酵母中，具有GPI-锚定蛋白质之C-末端的前述报告酶转运到细胞壁上，即使在前述化合物(Ia)存在时也是如此。此外，通过透射电镜观察证实，即使存在前述的化合物(Ia)，细胞壁也是正常的。
而且，当将点突变随机地引入酿酒酵母染色体组的DNA上，并分离出对前述化合物(Ia)表现出特异抗性的突变菌株R1和R5时，在R1突变菌株中发现涉及GWT1基因第405号密码子自GTC变为ATC的点突变，以及在R5突变菌株中发现第140号密码子自GGG变为AGG的点突变。由于在这些突变的GWT1基因引入GWT1基因已被破坏的菌株时发现对前述化合物(Ia)的抗性，所以可以单独用GWT1基因来解释对该化合物的抗性。因此，这暗示前述化合物(Ia)直接作用于GWT1基因产物，以抑制GWT1蛋白的功能。
通过类似的方法，克隆白色假丝酵母的抗性基因(SEQ ID NO3和5)，测定核苷酸序列，并将该基因命名为CaGWT1。
此外，利用GWT1进行数据库同源检索，揭示了粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中的同源物(SEQ ID NO27)。再者，基于酿酒酵母、粟酒裂殖唐酵母和白色假丝酵母的GWT1基因编码的蛋白质中高度保守区的序列设计引物，经PCR产生烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中的同源物(SEQ ID NO39和41)。而且，基于对GWT1的数据库同源检索发现的序列进行PCR，发现了新形隐球酵母(Cryptococcus neoformans)中的同源物(SEQ ID NO54和58)。
更具体地，本发明涉及下列内容。
1.一种编码蛋白质的DNA，当该DNA过量表达在真菌中时，所述蛋白质具有赋予真菌耐受式(Ia)所示化合物的活性，其中该DNA选自(a)编码包含SEQ ID NO2，4，6，28，40或59氨基酸序列的蛋白质的DNA，(b)包含SEQ ID NO1，3，5，27，39，41，54或58核苷酸序列的DNA，(c)在严谨条件下与包含SEQ ID NO1，3，5，27，39，41，54或58核苷酸序列的DNA杂交的DNA，(d)编码包含SEQ ID NO2，4，6，28，40或59氨基酸序列的蛋白质的DNA，所述氨基酸序列中，增加、缺失、取代和/或插入一个或多个氨基酸，及(e)利用SEQ ID NO29和31或者SEQ ID NO29和30为引物扩增的DNA 2.一种编码蛋白质的DNA，该蛋白质因为该DNA的功能缺陷而具有降低真菌细胞壁中GPI-锚定蛋白质的量的活性，其中该DNA选自(a)编码包含SEQ ID NO2，4，6，28，40或59氨基酸序列的蛋白质的DNA，(b)包含SEQ ID NO1，3，5，27，39，41，54或58核苷酸序列的DNA，(c)在严谨条件下与包含SEQ ID NO1，3，5，27，39，41，54或58核苷酸序列的DNA杂交的DNA，
(d)编码包含SEQ ID NO2，4，6，28，40或59氨基酸序列的蛋白质的DNA，所述氨基酸序列中，增加、缺失、取代和/或插入一个或多个氨基酸，及(e)利用SEQ ID NO29和31或者SEQ ID NO29和30为引物扩增的DNA，其中，“严谨条件”是指，例如，在65℃下于4×SSC中进行杂交，然后在65℃下于0.1×SSC中洗涤1小时；或者在另一方法中，“严谨条件”为42℃下于50％甲酰胺中的4×SSC；或者，在65℃下于PerfectHybTM(TOYOBO)溶液中杂交2.5小时，然后(i)在25℃下于2×SSC，0.05％SDS溶液中洗涤5分钟，(ii)在25℃下于2×SSC，0.05％SDS溶液中洗涤15分钟，及(iii)在50℃下于0.1×SSC，0.1％SDS溶液中洗涤20分钟；“DNA功能缺陷”可以发生在DNA的功能基因产物未表达时或者表达减少时，例如利用同源重组技术嵌入与DNA编码区无关的DNA如选择标记；以及单独或联合应用下列任一方法定量源于真菌细胞壁中GPI-锚定蛋白质的蛋白质的减少(i)反映GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程的报告系统，(ii)定量细胞壁中GPI-锚定蛋白质的ELISA，(iii)GPI-锚定蛋白质活性如附着动物细胞的活性的测量，或者(iv)通过透射电镜观察真菌细胞最外层的絮状纤维结构。
3.通过项1或2的DNA编码的蛋白质。
4.其中插入了项1或2的DNA的载体。
5.包含项1或2的DNA或者项4的载体的转化体。
6.项5的转化体，其为过量表达项3的蛋白质的真菌。
7.一种真菌，其中项3的蛋白质的功能有缺陷。
8.一种制备项3的蛋白质的方法，该方法包括培养项5的转化体，并由该转化体或其培养上清液收集所表达的蛋白质的步骤。
9.一种与项3的蛋白质结合的抗体。
10.一种筛选具有抗真菌作用的化合物的方法，其中该方法包括以下步骤(a)使试样与项3的蛋白质接触；(b)检测该蛋白质与试样之间的结合活性；及(c)选取具有与该蛋白质结合活性的化合物。
11.一种筛选具有抗真菌作用的化合物的方法，其中该方法包括以下步骤(a)使试样与过量表达项3的蛋白质的真菌接触；(b)检测GPI-锚定蛋白质到真菌细胞壁上的转运量；及(c)选出下述化合物，其使得步骤(b)中所检测的GPI-锚定蛋白质到真菌细胞壁上的转运量比试样与未过量表达项3的蛋白质接触时所检测到的转运量减少，其中，通过检测细胞生长速度的降低、膨胀或温度敏感性，或者通过检测源于细胞壁中GPI-锚定蛋白质的蛋白质的减少，优选通过检测源于细胞壁上GPI-锚定蛋白质的蛋白质的减少，可以检测因为试样而导致的转运到细胞壁上的GPI-锚定蛋白质的量的降低；而且，利用下列任一方法或其组合，可定量源于真菌细胞壁中GPI-锚定蛋白质的蛋白质的减少(i)反映GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程的报告系统，(ii)定量细胞壁中一类GPI-锚定蛋白质的ELISA，(iii)测量GPI-锚定蛋白质活性如附着动物细胞的活性，或者(iv)通过透射电子显微镜观察真菌细胞最外层的絮状纤维结构。
12.一种具有抗真菌作用的化合物，其是通过项10或11的筛选方法分离的。
13.一种抗真菌剂，其包含抑制GPI-锚定蛋白到真菌细胞壁的转运的化合物作为活性成分。
14.一种抗真菌剂，其包含项9的抗体或者项12的化合物作为活性成分。
15.项13的抗真菌剂，其包含下列通式(I)所示的化合物或其盐或其水合物作为活性成分，在式(I)中 [R1a和R2a彼此相同或相异并且单独代表氢原子，卤原子，羟基，硝基，氰基，三氟甲基，三氟甲氧基，取代或未取代的C1-6烷基，C2-6链烯基，C2-6炔基，取代或未取代的C1-6烷氧基，或者下式所示的基团
(其中X1代表单键，羰基，或者式-S(O)2-所示的基团；R5a和R6a彼此相同或相异并且代表氢原子或者取代或未取代的C1-6烷基)。而且，R1a和R2a可以一起形成选自下列的稠环取代或未取代的苯环，取代或未取代的吡啶环，取代或未取代的吡咯环，取代或未取代的噻吩环，取代或未取代的呋喃环，取代或未取代的哒嗪环，取代或未取代的嘧啶环，取代或未取代的吡嗪环，取代或未取代的咪唑环，取代或未取代的唑环，取代或未取代的噻唑环，取代或未取代的吡唑环，取代或未取代的异唑环，取代或未取代的异噻唑环，取代或未取代的环己烷环，及取代或未取代的环戊烷环；R3a和R4a彼此相同或相异并且单独代表氢原子，卤原子，羟基，硝基，氰基，羧基，甲酰基，肟基，三氟甲基，三氟甲氧基，C1-6烷基，C1-6烷氧基，C2-6链烯基，C2-6炔基，式-C(O)NR7aR7b(其中R7a和R7b彼此相同或相异并且单独代表氢原子，或者C1-6烷基)，式-CO2R7a(其中R7a的定义同上)，式-S(O)nR7a(其中n代表0～2的整数，R7a的定义同上)，式-S(O)2NR7aR7b(其中R7a和R7b的定义同上)所示的基团，下式的基团 (其中X2代表单键，羰基，或者式-S(O)2-所示的基团；R5b和R6b彼此相同或相异，并且代表氢原子，取代或未取代的C1-6烷基，或者取代或未取代的C6-14芳基)，或者下式的基团-Z1-Z2(其中Z1代表单键，氧原子，1，2-亚乙烯基或者亚乙炔基；Z2代表单键，或者被0～4个取代基取代或未取代的C1-6烷基)。R3a和R4a可以共同代表亚甲二氧基，或者1，2-亚乙二氧基，作为选择，R3a和R4a可以一起形成选自下列的稠环取代或未取代的苯环，取代或未取代的吡啶环，取代或未取代的吡咯环，取代或未取代的噻吩环，取代或未取代的呋喃环，取代或未取代的哒嗪环，取代或未取代的嘧啶环，取代或未取代的吡嗪环，取代或未取代的咪唑环，取代或未取代的唑环，取代或未取代的噻唑环，取代或未取代的吡唑环，取代或未取代的异唑环，取代或未取代的异噻唑环，取代或未取代的环己烷环，及取代或未取代的环戊烷环，但是R1a和R2a均代表氢原子的情况除外]。
16.项13所述的抗真菌剂，其包含下式的化合物(Ia)作为活性成分 17.通式(II)所示的化合物，或者它的盐或水合物，在式(II)中， [Ar代表选自式(IIIa)至(IIIf)的取代基 (其中K代表硫原子，氧原子，或者式-NH-所示的基团；R1b和R2b彼此相同或相异，并且单独代表氢原子，卤原子，羟基，硝基，氰基，三氟甲基，三氟甲氧基，下式所示的基团 (其中X3代表单键，羰基，或者式-S(O)2-所示的基团；R5c和R6c彼此相同或相异，并且代表氢原子，或者取代或未取代的C1-6烷基)，或者式-X4-R8a(其中X4代表单键，氧原子，或硫原子；R8a代表C1-6烷基，C2-6链烯基，C2-6炔基，C3-8环烷基，或者C3-8环烯基)所示的基团。作为选择，R1b和R2b可以一起形成亚甲二氧基，或者1，2-亚乙二氧基)；R3b和R4b彼此相同或相异并且单独代表氢原子，卤原子，羟基，硝基，氰基，羧基，甲酰基，肟基，三氟甲基，三氟甲氧基，C1-6烷基，C1-6烷氧基，C2-6链烯基，C2-6炔基，或者下式所示的基团-Z1b-Z2b(其中Z1b代表单键，1，2-亚乙烯基或亚乙炔基；Z2b代表单键，或者被0～4个取代基取代或未取代的C1-6烷基)；下列情况除外(1)Ar代表前述的式(IIId)，其中R1b和R2b均为氢原子，(2)至少一个R3b或R4b代表氢原子，而另一个为氢原子，甲氧基，羟基，甲基，苄氧基，或者卤原子，及Ar代表前述的式(IIIc)，其中R1b和R2b两个均代表氢原子或甲氧基，(3)至少一个R3b或R4b代表氢原子，而另一个为氢原子，羟基，甲氧基，或苄氧基，及Ar代表前述的式(IIIc)，其中R1b和R2b两个均代表羟基或苄氧基，或者(4)Ar代表前述的式(IIId)，其中R1b为氢原子，且R2b为甲酰基，羟甲基，或者甲氧基羰基]。
18.项17的化合物，或者它的盐或水合物，其中Ar代表下式 (其中R1c代表氢原子，取代或未取代的C1-6烷基，或苄基)，并且排除R3b代表氢原子时的情形。
19.通式(IIIc2)所示的化合物，或者它的盐或水合物，在式(IIIc2)中， [R1b和R2b的定义同上，但下列情况除外(1)R1b代表式R1c-O-(其中R1c的定义同上)所示的基团，R2b为氢原子，且R3b代表氢原子，(2)至少一个R3b或R4b代表氢原子，而另一个为氢原子，甲氧基，羟基，甲基，苄氧基，或卤原子，且R1b和R2b两个均代表氢原子或甲氧基，或者(3)至少一个R3b或R4b代表氢原子，而另一个为氢原子，羟基，甲氧基，或苄氧基，且R1b和R2b两个均代表羟基或苄氧基]。
20.项17的抗真菌剂，其具有抗真菌作用。
21.项15的抗真菌剂，其中R3a和R4a至少一个代表下列各式所示的基团式-C(O)NR7aR7b(其中R7a和R7b的定义同上)，式-CO2R7a(其中R7a的定义同上)，式-S(O)nR7a(其中n代表0～2的整数，R7a定义同上)，式-S(O)2NR7aR7b(其中R7a和R7b的定义同上)，下式 (其中X2，R5b，及R6b的定义同上)，或者被1～4个取代基取代或未取代的C1-6烷氧基，或者R3a和R4a共同代表亚甲二氧基或1，2-亚乙二氧基。
22.项15所述的抗真菌剂，其中该具有抗真菌作用的化合物为(1)1-苄基异喹啉，(2)1-(4-溴苄基)异喹啉，(3)1-(4-氯苄基)异喹啉，(4)1-(4-氟苄基)异喹啉，(5)1-(4-碘苄基)异喹啉，(6)1-(3-甲基苄基)异喹啉，(7)1-(4-甲基苄基)异喹啉，(8)1-(3，4-二甲基苄基)异喹啉，(9)1-(3-甲氧基苄基)异喹啉，(10)1-(4-甲氧基苄基)异喹啉，(11)1-(3，4-亚甲二氧基苄基)异喹啉，(12)1-(4-苄氧基苄基)异喹啉，(13)1-(4-氰基苄基)异喹啉，(14)1-(4-硝基苄基)异喹啉，(15)1-(4-氨基苄基)异喹啉，(16)1-(4-甲氧基苄基)-6，7-二氯-异喹啉，(17)1-(4-甲氧基-2-硝基-苄基)-异喹啉，(18)1-(4-甲氧基苄基)-6，7-亚甲二氧基-异喹啉，(19)1-(2-氨基-4-甲氧基-苄基)异喹啉，(20)1-(4-甲氧基苄基)-7-羟基-6-甲氧基-异喹啉，(21)1-(4-苄氧基苄基)-6，7-二甲氧基-异喹啉，(22)1-(4-甲氧基苄基)6，7-二甲氧基-异喹啉，(23)1(4-甲氧基-2-硝基-苄基)-异喹啉，(24)3-[4-(1-异喹啉基甲基)苯氧基]丁腈，(25)1-[4-(2，2，3，3-四氟丙氧基)苄基]异喹啉，(26)1-[4-(2-哌啶子基乙氧基)苄基]异喹啉，(27)4-(1-异喹啉基甲基)苯基(2-吗啉基乙基)醚，(28)1-[4-(2-甲氧基乙氧基)苄基]异喹啉，(29)N-{2-[4-(1-异喹啉基甲基)苯氧基]乙基}-N，N-二甲胺，(30)1-[4-(苯乙氧基)苄基]异喹啉，(31)1-{4-[(2-甲基烯丙基)氧基]苄基}异喹啉，(32)1-(4-异丁氧基苄基)异喹啉，(33)1-[4-(2-苯氧基乙氧基)苄基]异喹啉，(34)2-[4-(1-异喹啉基甲基)苯氧基]乙酸甲酯，(35)2-[4-(1-异喹啉基甲基)苯氧基]-1-乙醇，(36)N-{2-[4-(1-异喹啉基甲基)苯氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯，(37)1-{4-[3-(四氢-2H-2-吡喃氧基)丙氧基]苄基}异喹啉，(38)2-[4-(1-异喹啉基甲基)苯氧基]-1-乙胺，(39)1-[4-(3-哌啶子基丙氧基)苄基]异喹啉，(40)3-[4-(1-异喹啉基甲基)苯氧基]-1-丙醇，(41)1-[4-(2-乙基丁氧基)苄基]异喹啉，(42)4-[4-(1-异喹啉基甲基)苯氧基]丁酸，(43)1-(4-{3-[(4-苄基哌啶子基)磺酰基]丙氧基}苄基)异喹啉，(44)1-(4-{3-[4-(4-氯苯基)哌啶子基]丙氧基}苄基)异喹啉，(45)4-(1-异喹啉基甲基)苯胺，(46)N-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]丁酰胺，(47)N-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]丙酰胺，(48)N-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-1-乙磺酰胺，(49)N-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-N-甲基-乙磺酰胺，(50)N-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-N-甲胺，(51)N-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-N-丙胺，或者(52)N-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-N-甲基-N-丙胺。
23.一种治疗真菌感染的方法，包括将治疗有效量的项13～22中任一项的抗真菌剂给药于哺乳动物。
下面将通过解释本说明书中所提到的术语、符号等的意义，更详细地说明本发明。
在本说明书中，为了方便，化合物的结构式可以代表某些异构体，但是，本发明包括所有的几何异构体，基于不对称碳原子的光学异构体，立体异构体，源于化合物结构的互变异构体，以及各种异构体的混合物，本发明不受为了方便而构建的化学式的代表物的限制，而且可以为各种异构体中的任意一种或其混合物。因此，可能存在光活性物质和分子中具有不对称碳原子的外消旋物质，但是在本发明中没有特别的限制，并且包括它们中的任何一种。此外，可能存在多晶形现象，对此同样没有任何限制，晶形可以是任何晶形之一或者其混合物，而且可以是无水物或水合物。
此外，本发明的化合物包括在体内代谢之后如在氧化之后，还原之后，水解之后，或者偶联之后具有抗真菌作用的化合物。再者，本发明还包括那些在体内代谢之后如氧化之后，还原之后，以及水解之后产生本发明的化合物的化合物。
本说明书中的“C1-6烷基”是指直链或支链的烷基，其中碳的数目为1～6，具体实例包括甲基，乙基，异丙基，正丙基，正丁基，异丁基，叔丁基，正戊基，异戊基，新戊基，正己基，1-甲基丙基，1，2-二甲基丙基，2-乙基丙基，1-甲基-2-乙基丙基，1-乙基-2-甲基丙基，1，1，2-三甲基丙基，1-甲基丁基，2-甲基丁基，1，1-二甲基丁基，2，2-二甲基丁基，2-乙基丁基，1，3-二甲基丁基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，等等。
本说明书中的“C2-6链烯基”是指直链或支链的链烯基，其中碳的数目为2～6，具体实例包括乙烯基，烯丙基，1-丙烯基，异丙烯基，1-丁烯-1-基，1-丁烯-2-基，1-丁烯-3-基，2-丁烯-1-基，2-丁烯-2-基，等等。
本说明书中的“C2-6炔基”是指直链或支链的炔基，其中碳的数目为2～6，其具体实例包括乙炔基，1-丙炔基，2-丙炔基，丁炔基，戊炔基，己炔基，等等。
本说明书中的“C1-6烷氧基”是指连接在上面所定义的“C1-6烷基”上的氧基，其具体实例包括甲氧基，乙氧基，正丙氧基，异丙氧基，正丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，正戊氧基，异戊氧基，仲戊氧基，叔戊氧基，新戊氧基，1-甲基丁氧基，2-甲基丁氧基，1，1-二甲基丙氧基，1，2-二甲基丙氧基，正己氧基，异己氧基，1-甲基戊氧基，2-甲基戊氧基，3-甲基戊氧基，1，1-二甲基丁氧基，1，2-二甲基丁氧基，2，2-二甲基丁氧基，1，3-二甲基丁氧基，2，3-二甲基丁氧基，3，3-二甲基丁氧基，1-乙基丁氧基，2-乙基丁氧基，1，1，2-三甲基丙氧基，1，2，2-三甲基丙氧基，1-乙基-1-甲基丙氧基，1-乙基-2-甲基丙氧基，等等。
本说明书中的“C6-14芳基”是指芳环基团，其中碳的数目为6～14，其具体实例包括苯基，1-萘基，2-萘基，as-indacenyl group，s-indacenyl group，二氢苊基，等等。
本说明书中的“卤原子”是指氟原子，氯原子，溴原子，及碘原子。
本说明书中的“取代或未取代的”是指“可取代的位置上可以具有一个或多个取代基的任意组合”，具体的取代基的实例包括氢原子，卤素，硝基，氰基，羟基，巯基，羟烷基，羧基，C1-6烷氧基羰基，C2-7酰氨基，C1-6烷氨基，吡啶基，C1-6烷基亚磺酰基，C1-6烷基磺酰基，C1-6烷基氨磺酰基，C1-6烷基氨亚磺酰基，C1-6烷基氨次磺酰基(sulfenamoyl)，四氢吡喃基，C1-6烷基氨甲酰基，或者式-X4-R8a(其中X4代表单键，氧原子或硫原子；R8a代表C1-6烷基，C2-6链烯基，C2-6炔基，C6-14芳基，C3-8环烷基或C3-8环烯基)，等等。
“可以被0～4个取代基所取代”与“可取代的位置上可以具有1～4个取代基的任意组合”的意义相同，且取代基的定义同上。
本发明中的“盐”是指药学上可接受的盐，并且没有任何特殊的限制，只要该盐是与本发明的化合物形成的加成盐，且其优选实例为卤族酸盐如氢氟化物，氢氯化物，氢溴化物，及氢碘化物；无机酸盐如硫酸盐，硝酸盐，高氯酸盐，磷酸盐，碳酸盐，及碳酸氢盐；有机羧酸盐如乙酸盐，草酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，及富马酸盐；有机磺酸盐如甲磺酸盐，三氟甲磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，甲苯磺酸盐，及樟脑磺酸盐；氨基酸盐如天门冬氨酸盐，及谷氨酸盐；胺盐如三甲胺盐，三乙胺盐，普鲁卡因盐，吡啶盐，及苯乙基苯甲基胺盐；碱金属盐如钠盐，及钾盐；碱土金属盐如镁盐和钙盐；等等。
在下文中将要描述1.获得参与细胞壁合成的蛋白质的编码DNA的方法，2.检查试样是否影响GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程的方法，以及3.获得本发明的前述化合物(Ia)的方法。
1.获得参与细胞壁合成的蛋白质的编码DNA的方法下文中将描述(1)获得编码蛋白质的DNA的方法，所述蛋白质通过在真菌中过表达而赋予对前述化合物(Ia)的抗性；(2)获得在严谨条件下与SEQID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的DNA杂交的DNA的方法；(3)基于同源检索获得编码参与真菌细胞壁合成的蛋白质的DNA的方法；及(4)获得过表达或者缺乏赋予对前述化合物(Ia)的抗性所需的蛋白的真菌的方法。
(1)获得编码蛋白质的DNA的方法，所述蛋白质通过在真菌中过表达而赋予对前述化合物(Ia)的抗性这里，“真菌”是指属于接合菌门(Zygomycota)，子囊菌门(Ascomycota)，担子菌门(Basidiomycota)及半知菌门(Deuteromycota)的真菌。优选的真菌为致病性真菌，毛霉菌(Mucor)，糖酵母属(Saccharomyces)，假丝酵母属(Candida)，隐球酵母属(Cryptococcus)，丝孢酵母属(Trichosposon)，鳞斑霉属(Malassezia)，曲霉属(Aspergillus)，发癣菌属(Trichophyton)，小孢子菌属(Microsporum)，孢子丝菌属(Sporothrix)，芽生菌属(Blastmyces)，球孢菌属(Coccidioides)，副球孢子菌属(Paracoccidioides)，青霉属(Penicillinium)或镰孢属(Fusarium)，更优选的真菌为白色假丝酵母，C.glabrata，新形隐球酵母或烟曲霉。便于进行遗传分析的酿酒酵母和粟酒裂殖唐酵母，也是优选的菌株。
将真菌基因的质粒库引入真菌中。可以由ATCC(ATCC的信息编号为37323)得到酿酒酵母和粟酒裂殖唐酵母的质粒库，而白色假丝酵母的质粒库则可以根据Navaro-Garcia，F.et al，Mol.Cell.Biol.，152197-2206，1995的方法来制备。将所得的质粒库通过Gietz，D.et al，Nucl.Acids Res.201425，1992的方法引入真菌中。作为选择，可以使用例如YEASTMAKERTM酵母转化系统(Clontech)等试剂盒。
在前述化合物(Ia)的存在下培养其中引入了质粒库的真菌。具体地，在包含浓度为1.56～25μg/ml，优选为1.56～6.25μg/ml，更优选为3.125μg/ml的前述化合物(Ia)的琼脂培养基中接种已经引入了质粒库的真菌，培养适当长的时间，即在30～42℃培养2～5天，或优选在37℃培养3天。在包含前述化合物(Ia)的培养基中进一步培养通过增殖形成的菌落，并由增殖的真菌细胞中提纯质粒。质粒的提纯可以根据例如METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.194169-182(1991)的方法来进行。
优选直接测定所得质粒的核苷酸序列，但是如果需要，可以克隆至适于核苷酸序列测定的载体例如pBluescript II及pUC19中，然后再完成核苷酸序列的测定。核苷酸序列可以根据例如ABI377系统(PE applied Biosystems)手册的方法进行测定。
在本发明的实施例中，全部27个独立获得的酿酒酵母菌落，以及30个白色假丝酵母菌落中的28个菌落均包含本发明的DNA。只有一个赋予对前述化合物(Ia)的抗性的基因存在于这些真菌中，而且该基因可以通过前述的方法而得到。
(2)获得在严谨条件下与SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的DNA杂交的DNA的方法根据本发明，获得编码参与真菌细胞壁合成的蛋白质的DNA的方法包括以酿酒酵母染色体组的DNA为模板，由SEQ ID NO1的核苷酸序列的信息设计引物，或者以白色假丝酵母染色体组的DNA为模板，由SEQ IDNO3或SEQ ID NO5的核苷酸序列的信息设计引物，然后进行PCR，并将扩增的DNA克隆到适宜的载体如pBlueScript中。按照将要扩增的区域的需要设计引物，优选长度为15个或更多个碱基对(bp)，更优选为20个或更多个碱基对，且某些情况下，可以增加后续DNA构建所必需的序列(如限制酶位点)。PCR的条件可以根据引物长度、将要扩增的区域的长度及将要使用的DNA模板的量等因素而适当地确定。例如，编码真菌中参与细胞壁合成的蛋白的DNA可以采用200ng的白色假丝酵母染色体组DNA为模板，采用SEQ ID NO21和SEQ ID NO22为引物，在94℃4分钟→(94℃30秒→68℃5分钟)×35循环→72℃4分钟的条件下得到。
通过PCR得到的DNA可以用作获得其它类型真菌DNA的探针，该其它类型的真菌DNA与编码参与细胞壁之合成的蛋白的DNA具有同源性。具体地，例如，为了获得编码参与酿酒酵母细胞壁合成的蛋白质的白色假丝酵母的同源基因，可以采用酿酒酵母的染色体组DNA为模板，并以通过PCR得到的DNA为探针，由白色假丝酵母的基因组文库或cDNA文库克隆出在严谨条件下杂交的DNA。这里，严谨条件是指例如在65℃于4×SSC中杂交，然后在0.1×SSC中于65℃洗涤1小时。此外，另一严谨条件是指42℃于50％甲酰胺中的4×SSC。作为选择，下列条件也是允许的，例如在65℃于PerfectHybTM(TOYOBO)溶液中杂交2.5小时，然后1)在25℃于2×SSC，0.05％SDS溶液中洗涤5分钟，2)在25℃于2×SSC，0.05％SDS溶液中洗涤15分钟，及3)在50℃于0.1×SSC，0.1％SDS溶液中洗涤20分钟。
通过Southern印迹分析，本发明的实施例证实，白色假丝酵母中仅有一种基因与SEQ ID NO1的DNA杂交，并且示出了对该基因的克隆。从上述方法，可以得到与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3杂交的DNA。
(3)基于同源检索获得编码参与真菌细胞壁合成的蛋白质的DNA的方法本发明揭示了酿酒酵母，白色假丝酵母，粟酒裂殖唐酵母，烟曲霉，及新形隐球酵母的GWT1同源物。据认为，这些基因中的保守区对于GWT1基因产物展示其功能是重要的，并且可以在其它真菌中也是保守的。
因此，编码参与真菌细胞壁合成的蛋白质的DNA可以根据下列方法得到基于保守区的氨基酸序列构建探针再实施杂交，或者根据该序列设计引物再实施PCR。PCR引物可以具有任何序列，只要将其设计成编码保守区即可，但是优选SEQ ID NO29和31或者优选SEQ ID NO29和30。
此外，作为另一种方法，编码参与真菌细胞壁合成的蛋白质的DNA可以通过下列方法得到在登记于数据库中的基因片段中找出与GWT1同源的核苷酸序列，然后根据该核苷酸序列设计引物，采用cDNA或染色体组DNA进行PCR。
根据所得序列获得全长基因的PCR方法的实例包括如3′-RACE，5′-RACE，以及反向PCR等技术，也可以通过杂交选择包含邻接序列的克隆。全长基因可以通过组合这些技术而得到。
(4)获得过表达或者缺乏赋予对前述化合物(Ia)的抗性所需的蛋白的真菌的方法过量表达赋予对本发明前述化合物(Ia)的抗性的蛋白质的真菌，优选酿酒酵母，可以通过将表达该蛋白的表达载体插入真菌染色体的特定位置上的方法而得到，例如其中SEQ ID NO1的DNA与启动子的下游相连的表达载体，该启动子可以强制地将蛋白质表达在真菌中，优选芽殖酵母烯醇酶基因(ENO1)的启动子。插入法可以通过如下步骤进行例如将所需的序列插到pRS304(Sikorski RS et al，Genetics.122(1)19-27，1989)的多克隆位点，构建用于整合的载体，并将该载体引入真菌中。详见METHODS INENZYMOLOGY Vol.194281-301(1991)。
此外，过量表达的白色假丝酵母菌株可以通过将SEQ ID NO3或SEQID NO5的基因引入白色假丝酵母的表达载体如pCARS1和pRM1(Pla J etal，Yeast 121677-1702，1996)中，然后转化白色假丝酵母(Sanglard D et al，Antimicrobiol.Agents Chemother.402300-2305，1996)而得到。
本发明的缺乏赋予对前述化合物(Ia)的抗性的基因的真菌，优选酿酒酵母，可以通过下列方法得到，但并不仅限于下列方法。
利用标记基因(优选粟酒裂殖唐酵母的his5基因)作模板，采用引物来进行PCR扩增，引物被设计成使得PCR产物包含将要缺失的基因(在酿酒酵母的情况中，为SEQ ID NO1的基因序列)两端30个碱基对或更多，优选40个碱基对或更多。PCR产物可以提纯并引入到真菌中，然后在对应于标记基因的选择培养基(如对应于his5的his-)中培养，得到缺失菌株。
此外，通过惯常方法，基于SEQ ID NO3或SEQ ID NO5的核苷酸序列信息，用hisG-URA3-hisG表达盒(Fonzi WA et al，Genetics 134717-728，1993)得到白色假丝酵母的缺失菌株。
2.检查试样是否影响GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程的方法通过下列方法可以确定试样是否抑制GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程，或者试样是否抑制GPI-锚定蛋白质在真菌表面的表达(1)一种利用了报告酶的方法，(2)一种利用了与真菌细胞壁表面糖蛋白反应的抗体的方法，(3)检查对动物细胞的粘附活性的方法，及(4)采用光学显微镜或电子显微镜观察真菌的方法。
利用下述(1)～(4)的方法，优选利用(1)～(4)的方法的组合来判断试样是否抑制GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程或者GPI-锚定蛋白质在真菌表面的表达。此外，当由本发明的DNA编码的蛋白质过量表达于真菌中时，在抑制程度减小或不再能观察到抑制的情况下，可以判定试样影响GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程。
下面将描述方法(1)～(4)。
(1)采用报告酶进行的方法GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程可通过示踪实验定量如用放射性同位素标记GPI-锚定蛋白质，然后对真菌细胞壁级分进行分离，与GPI-锚定蛋白质的抗体进行免疫沉淀反应。也可以用另一种方法更简便的定量表达由各种GPI-锚定蛋白质中常见的、被认为起转运信号作用的C-末端序列与便于测量的酶(报告酶)形成的融合蛋白，对真菌细胞壁级分进行分离，然后采用报告系统测量每一级分的酶活性(Van Berkel MAA et al，FEBS Letters，349135-138，1994)。在下文中，将要解释一种采用报告酶进行的方法，但是本发明并不仅限于此。
首先，构建报告基因并将其引入真菌中。报告基因是这样构建的连接能在真菌中起作用的启动子序列，然后依次连接编码信号序列、报告酶和GPI-锚定蛋白质C-末端序列的DNA，使得读框匹配。启动子序列的实例包括如GAL10及ENO1等启动子的那些序列。信号序列的实例包括如α-因子，转化酶，溶菌酶等的序列。报告酶的实例是β-内酰胺酶，溶菌酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶等。可以使用易于检出的绿色荧光蛋白(GFP)，即便它不具有酶活性。GPI-锚定蛋白质C-末端序列的实例是α-凝集素C-末端序列，CWP2C-末端序列等。此外，优选将适宜的选择标记物如LEU2和URA3插到包含所构建的报告基因的载体中。
将所构建的报告基因通过适宜的方法插到真菌中，如乙酸锂方法(GietzD et al，Nucl.Acids Res.201425，1992)，并且在需要时通过适于选择标记物的方法(如适于LEU2的Leu-培养基，以及适于URA3的Ura-培养基)进行培养，然后挑选其中引入了DNA的真菌。
通过下列方法检查试样是否影响GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程。
在试样存在时，于适宜的条件下(如30℃ 48小时)培养引入了报告基因的真菌。培养之后，离心分离培养物上清液，并测量培养物上清液级分的报告酶活性。洗涤剩余的细胞级分，然后通过适当的方法分离细胞壁成分，例如用葡聚糖酶降解细胞壁的葡聚糖，然后测量细胞壁级分和细胞质级分的报告酶活性。该试验可以如下简单地进行通过离心分离，然后在不洗涤细胞的情况下按比例计算来源于培养物上清液级分但残留在细胞级分中的报告酶的量，从细胞级分的报告酶的量中减去此量，从而确定细胞级分中报告酶的量。
如果证实试样具有增加培养物上清液级分中报告酶活性的活性(活性/细胞)，或者具有降低细胞壁级分中报告酶活性的活性(活性/细胞)，那么就可以判定试样对GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程有影响。
(2)采用与真菌细胞壁表面糖蛋白反应的抗体进行的方法对于试样是否影响GPI-锚定蛋白质在真菌表面层的表达，可以通过采用与所述蛋白质反应的抗体定量真菌细胞壁中的GPI-锚定蛋白质来检测。
例如，可以由GPI-锚定蛋白质的氨基酸序列预测抗体的抗原决定簇，所述GPI-锚定蛋白质的实例如α-凝集素，Cwp2p及Alslp(Chen MH et al，J.Biol.Chem.，27026168-26177，1995；Van Der Vaat JM et al，J.Bacteriol.，1773104-3110，1995；Hoyer LL et al，Mol.Microbiol.，1539-54，1995)，合成该区的肽，将其与具有抗原性的物质如载体蛋白结合，然后可以通过免疫兔子等得到多克隆抗体，也可以通过免疫小鼠等得到单克隆抗体。更优选家兔的针对Alslp肽的多克隆抗体。
在可供选择的方法中，可以通过用真菌(优选过量表达如α-凝集素，Cwp2p及Alslp等GPI-锚定蛋白质的真菌)免疫小鼠等获得抗GPI-锚定蛋白质的单克隆抗体，在某些情况下，可以用部分纯化GPI-锚定蛋白质进行免疫，并通过ELISA，Western印迹分析等选择经融合产生的克隆。
通过下列方法可以检查试样是否影响GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程，以及试样是否减少来源于细胞壁中GPI-锚定蛋白质的蛋白量。
在试样存在时，于适宜的条件下(如30℃48小时)培养真菌。通过离心法收集所培养的真菌并将细胞破碎，优选采用玻璃珠。优选用SDS离心提取洗涤过的破碎细胞，然后洗涤沉淀物。提取之后，用降解葡聚糖的酶，优选葡聚糖酶处理破碎的细胞，其经过离心处理的上清液即为GPI-锚定蛋白质样品。
将抗-Alslp肽的抗体通过4℃培养过夜而包被在96-孔板上。用洗涤溶液，优选含0.05％Tween 20的PBS(PBST)，洗涤之后，用封闭96-孔板非特异性吸附位点的试剂，优选BSA和明胶等蛋白质，更优选BlockAce进行封闭。用洗涤溶液，优选PBST，再次洗涤之后，有时在加入适当稀释的GPI-锚定蛋白质样品之后，在室温进行适当长时间如2小时的反应。用洗涤溶液，优选PBST，洗涤之后，使对抗酶标记的白色假丝酵母的抗体，优选HRP-标记的抗-假丝酵母抗体，在室温反应适当长的时间如2小时。标记方法可以是酶标记法或放射性同位素标记法。用洗涤溶液，优选PBST，洗涤之后，通过适于标记类型即酶标记的方法计算GPI-锚定蛋白质样品中Alslp的量，加入底物溶液，然后终止反应，测量在490nm处的吸光度。
(3)检查对动物细胞的粘附活性的方法通过测量真菌细胞壁中GPI-锚定蛋白质的活性，优选通过测量真菌对动物细胞等的粘附活性，可以检查试样是否影响GPI-锚定蛋白质在真菌表面的表达。除了参与粘附动物细胞的Alslp，Hwplp等之外，参与交配的α-凝集素，参与酵母聚集的Flolp等也称作GPI-锚定蛋白质。在下文中，将详细解释采用真菌对动物细胞的粘附活性进行检测的方法，但是本发明并不仅限于此。
真菌选用对细胞具有粘附活性的真菌，优选的真菌为白色假丝酵母。哺乳动物细胞采用粘附真菌的细胞，优选小肠上皮细胞。培养哺乳动物细胞并通过适当的方法如乙醇固定法将其固定。接种试样和已经培养适当长时间(如30℃培养48小时)的真菌，培养一定长的时间(如在30℃培养1小时)之后，移出培养物上清液，用缓冲液洗涤，加载至琼脂培养基，如SabouraudDextrose Agar培养基(Difco)。在30℃培养过夜之后，计数菌落的数目，并计算粘附率。
如果观察到一种试样使真菌粘附细胞而形成的菌落数目与未经该试样处理的真菌相比降低，则可以判定该试样已经影响了GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程。
(4)采用光学显微镜或电子显微镜观察真菌的方法可以通过用电子显微镜观察真菌细胞壁的结构来检查试样是否影响GPI-锚定蛋白质在真菌表面的表达。
在试样存在的条件下，将真菌如白色假丝酵母培养一定长的时间，例如30℃培养48小时，用透射电子显微镜观察超精细的形态结构。这里，采用透射电子显微镜进行的观察可以通过例如根据Electron Microscope ChartManual(Medical Publishing Center)的方法来进行。据认为，具有高电子密度且通过透射电子显微镜显像可以观察到的真菌细胞最外层絮状纤维结构是具有GPI-锚定蛋白质作为其构成成分的表面糖蛋白层，它不受其它现有抗真菌剂的影响。与未经处理的细胞相比，当真菌细胞最外层的这种絮状纤维结构(其具有高电子密度)消失，留下具有高电子密度的微层时，可以判定所述试样已经影响GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程。
当在透射电子显微镜以及光学显微镜下观察到真菌细胞大量溶胀且出芽(分裂)受到抑制的图像时，可以判定试样对细胞壁有影响。
下面式(I)所示的本发明的化合物 (其中各符号的定义同上)可以采用目前已知的常规有机化学反应来合成。例如，它可以通过下列方法来合成。
制备方法(1) 在上面各式中，X为离去基团如卤素基团和酰基。R3c的定义与R3a相同。式中其它符号的定义同上。
步骤A1制备Reissert化合物(V)的方法。该化合物可以根据文献中的反应条件来制备，如Org.Synth.，VI，115(1988)；Heterocycles，36(11)，2489(1993)；J.Chem.Soc.(C)，666(1969)；或者J.Heterocycl.Chem.，29(5)，1165(1992)。具体地，反应物为例如苯甲酰氯与氰化钾的组合。
步骤A2烷基化步骤。化合物(VI)可以通过化合物(V)与取代的苯甲基卤衍生物，取代的甲磺酸苄酯衍生物等在碱的存在下进行反应而制备。所述碱的具体实例包括氢化钠，氢氧化钠。
步骤A3水解反应步骤。化合物(I)可以通过在碱的存在下水解化合物(VI)来制备。
方法A是通过步骤A1，步骤A2，及步骤A3制备化合物(I)的方法。
步骤B1将化合物(V)转化成化合物(VII)的步骤。化合物(VII)可以通过化合物(V)与取代的苯甲醛在碱和相转移催化剂的存在下反应来制备。所述碱的实例包括氢氧化钠和氢氧化钾。所述相转移催化剂的实例包括三乙基苄基氯化铵。
步骤B2将醇氧化成酮的步骤。酮衍生物(VIII)可以采用醇到酮的氧化反应中常用的氧化剂和反应条件来制备。具体地，氧化剂为例如二氧化锰，二氧化铬，或者苯醌。
步骤B3将酮还原成亚甲基的步骤。亚甲基衍生物(I)可以采用酮衍生物(VIII)到亚甲基衍生物(I)的还原反应中常用的还原剂组合来制备。所述还原剂组合的实例包括水合肼与氢氧化钠或氢氧化钾，和三乙基硅烷与三氟化硼，或三氟甲磺酸。
方法B是通过步骤A1，步骤B1，步骤B2，及步骤B3制备化合物(I)的方法。
步骤C1羟基卤化或酰化的步骤。化合物(IX)可以通过卤化剂或酰化剂与化合物(VII)的反应来制备。卤化剂的实例包括亚硫酰氯，浓盐酸，及三溴化磷。此外，酰化剂的实例包括酰卤如乙酰氯和酸酐如乙酸酐。
步骤C2
卤素基团或酰基的还原性消除反应步骤。化合物(I)可以通过例如采用催化剂进行化合物(IX)的氢消除反应来制备。
所述催化剂的实例包括钯-碳。
方法C是通过步骤A1，步骤B1，步骤C1，及步骤C2制备化合物(I)的方法。
制备方法(2)式(I)所示的本发明的化合物还可以通过下面的方法来合成。
式中，X为离去基团如卤素基团和酰基。其它符号的定义同上。
步骤D1进行Grignard反应及随后的酸水解反应的步骤。化合物(VIII)可以通过化合物(X)与取代或未取代的苯基Grignard试剂反应，然后在酸存在下水解来制备。
步骤D2亚甲基衍生物(I)可以由酮衍生物(VIII)按类似于步骤B3的条件来制备。
方法D是通过步骤D1和步骤D2制备化合物(I)的方法。
步骤E1酮到醇的还原反应步骤。化合物(VII)可以从化合物(VII)开始，采用酮到醇的还原反应中常用的还原剂和反应条件来制备。所述还原剂的具体实例包括硼氢化钠和氢化铝锂。
步骤E2在类似于步骤C1的条件下，卤化或酰化的衍生物(IX)可以由醇衍生物(VII)来制备。
步骤E3在类似于步骤C2的还原性消除反应的条件下，化合物(I)可以由化合物(IX)来制备。
方法E是通过步骤D1，步骤E1，步骤E2，及步骤E3制备化合物(I)的方法。
制备方法(3)式(I)所示的本发明的化合物还可以通过下面的方法来合成。
式中各符号的定义同上。
步骤F1氯化反应步骤。化合物(XII)可以通过化合物(XI)与氯化试剂反应来制备。氯化试剂的实例包括三氯氧磷和亚硫酰氯。
步骤F2与Grignard试剂偶联反应的步骤。化合物(I)可以通过化合物(XII)与取代或未取代的苄基Grignard试剂在催化剂存在下反应来制备，反应条件依据文献如Arch.Pharm，314，156(1981)。所述催化剂的实例包括[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯合镍(II)。
方法F是通过步骤F1和步骤F2制备化合物(I)的方法。
制备方法(4)式(I)所示的本发明的化合物可以通过下列方法来合成，该化合物中的R1a和R2a一起形成如苯环，吡啶环，吡咯环，噻吩环，呋喃环，环己烷环或者环戊烷环等稠环的。
式中各符号的定义同上。
其中形成异喹啉环的制备方法示例如下。
步骤G1进行缩合反应及随后的还原反应的步骤。化合物(XIV)可以通过取代或未取代的苯甲醛衍生物(XIII)与硝基甲烷之间的缩合反应，以及随后的硝基还原反应来制备。还原硝基所使用的试剂的实例包括钯-碳与甲酸铵的组合，以及氢化铝锂。
步骤G2形成酰胺键的反应。化合物(XV)可以利用酰胺键形成反应的偶联试剂通过化合物(XIV)与取代或未取代的苯乙酰氯反应而制备。所述偶联试剂的实例包括N，N′-二环己基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的组合，N，N′-二环己基碳二亚胺与N-羟基苯并三唑的组合，以及1，1′-羰基二咪唑。
步骤G3环化反应步骤。化合物(XV)可以根据文献中的反应条件来制备，所述文献如Organic Reaction，6，74(1951)；J.Hetetocyclic Chem.，30，1581(1993)。该反应的试剂的实例包括三氯氧磷和多聚磷酸。
方法G是通过步骤G1，步骤G2，及步骤G3制备化合物(I)的方法。
制备方法(5-1)替换通过前述制备方法合成的化合物(I)的取代基R3a或R4a(5-1)用氨基，酰胺基，磺酰胺基等替换所述取代基。
式中各符号的定义同上。
步骤H1硝基的还原反应。化合物(XVII)可以利用还原硝基常用的方法，通过还原化合物(XVI)来制备。所述还原方法的实例为钯-碳或氢氧化钯催化的氢化还原，以及通过铁-氯化铵、铁-盐酸、铁-乙酸等进行的还原。
步骤H2进行酰化或磺酰化反应的步骤。化合物(XVIII)可以通过用酰氯或酸酐处理化合物(XVII)来制备。
方法H是通过步骤H1和步骤H2制备化合物(XVIII)的方法。
式中各符号的定义同上。
步骤I1还原氨化反应步骤。化合物(XX)可以根据文献中的反应条件由化合物(XIX)与取代或未取代的醛来制备，所述的文献如J.Am.Chem.Soc.，93，2897(1971)；Comprehensive Organic Synthese，8，25(1991)；Tetrahedron，40，1783(1984)；及Tetrahedron，41，5307(1985)。所述还原氨化试剂的实例包括三乙酰氧基硼氢化钠，氰基三硼氢化钠，硼烷-吡啶复合物，以及钯-碳/氢。
步骤I2进行酰化、磺酰化或还原氨化反应的步骤。化合物(XXIa)或者化合物(XXIb)可以采用酰氯或酸酐由化合物(XX)制备。化合物(XXIc)可以通过进行类似于步骤I1的还原氨化反应来制备。
方法I是通过步骤I1和步骤I2制备化合物(XXIa)，化合物(XXIb)，或者化合物(XXIc)的方法。
制备方法(5-2)替换通过前述制备方法合成的化合物(I)的取代基R3a或R4a(5-2)用羟基，烷氧基等替换所述取代基。
式中各符号的定义同上。
步骤J1化合物(XXIII)可以根据文献中的反应条件通过去甲基化反应由化合物(XXII)来制备，所述文献如Bull.Chem.Soc.Jpn.，44，1986(1971)；Org.Synth.，Collect.Vol.V，412(1073)；J.Am.Chem.Soc.，78，1380(1956)；或者J.Org.Chem.，42，2761(1977)。在去甲基化反应中使用的试剂的实例包括47％的氢溴酸水溶液，三溴化硼，盐酸吡啶，以及碘代三甲基硅烷。
步骤J2烷基化反应步骤。化合物(XXIV)可以通过化合物(XXIII)与取代或未取代的烷基卤化物，取代或未取代的甲磺酸烷基酯等在碱存在下的反应来制备。
方法J是通过步骤J1和步骤J2制备化合物(XXIV)的方法。
制备方法(5-3)替换通过前述制备方法合成的化合物(I)的取代基R3a或R4a(5-3)用1，2-亚乙烯基，亚乙炔基，烷基等替换所述取代基。
式中各符号的定义同上。
步骤K1三氟甲磺酰化(triflation)反应的步骤。化合物(XXV)可以通过化合物(XXIII)与三氟甲磺酸酐在碱存在下的反应来制备。
步骤K2与炔偶联反应的步骤。化合物(XXVI)可以通过化合物(XXV)与炔衍生物在钯膦复合物，碘化铜和碱的存在下的偶联来制备。制备该反应体系中钯膦复合物的试剂的实例包括钯-碳与三苯基膦的组合，四(三苯基膦)合钯(O)与三苯基膦，二氯三苯基膦合钯(II)，乙酸钯(II)与三(邻甲基苯基)膦，以及乙酸钯(II)与1，1′-双(二苯基膦)二茂铁。所述碱的实例包括三乙胺，哌啶，吡啶，及碳酸钾。根据反应，还可以使用氯化锂。
步骤K3进行不饱和烃之还原反应的步骤。化合物(XXVIIa)或者化合物(XXVIIb)可以通过例如采用催化剂的催化氢化反应由化合物(XXVI)来制备。所述催化剂的实例包括钯-碳，氢氧化钯，氧化钯，及钯-碳-碳酸钙。
X denotes a leaving group，such as a halogen group and trifluorosulfonate.
Method L式中各符号的定义同上。
步骤L1与烯烃之偶联反应(Heck反应)的步骤。化合物(XXVIIa)可以根据文献反应条件利用催化剂(如，钯络合物及其配位体)由化合物(XXVIII)来制备，所述文献如J.Org.Chem.，37，2320(1972)；Org.Reactions.，27，345(1982)；Comprehensive Organic Synthesis，Vol.4，833(1991)；钯Reagents andCatalysts，125(1995)；Chem.Commun.，1287(1984)；Tetrahedron Lett，26，2667(1985)；及Tetrahedron Lett，31，2463(1990)。该反应所使用的催化剂组合(钯络合物及其配位体)的实例包括乙酸钯(II)与1，1′-双(二苯基膦)二茂铁，以及乙酸钯(II)与三(邻甲基苯基)膦。三级碱的实例包括三乙胺，二异丙基乙胺，以及1，8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯。化合物(XXVIII)中的X代表离去基团，如卤素基团和三氟甲磺酰氧基。
步骤L2化合物(XXVIIb)可以根据类似于步骤K3的不饱和烃还原反应的条件由化合物(XXVIIa)来制备。
方法L是通过步骤L1制备化合物(XXVIIa)，然后通过步骤L2制备化合物(XXVIIb)的方法。
式(I)所示的本发明的化合物的各种异构体可以利用普通的分离技术(例如重结晶，色谱法等)进行纯化与分离。
本发明的化合物或其盐或其水合物可以直接给药于哺乳动物(优选人)。它们还可以通过常规方法配制成片剂，粉剂，细粒剂，颗粒剂，包衣片剂，胶囊，糖桨，锭剂，吸入剂，栓剂，注射剂，软膏剂，眼膏，滴眼剂，滴鼻剂，滴耳剂，泥罨剂，洗剂等，然后给药。对于药物制剂，可以使用药物制剂常用的助剂(例如，填充剂，粘结剂，润滑剂，着色剂，调味剂，以及需要时的稳定剂，乳化剂，吸收促进剂，表面活性剂，pH调节剂，防腐剂，抗氧剂等)。药物制剂可以用常规方法，通过将通常用作药剂成分的各组份混合来制备。例如，经口的制剂可以如此制备将本发明的化合物或其药用盐与填充剂以及需要时的粘结剂，崩解剂，润滑剂，着色剂，调味剂等混合，并通过普通方法将该混合物配制成粉剂，细粒剂，颗粒剂，片剂，包衣片剂，胶囊等。这些组分的实例包括动物脂肪和植物油，如大豆油，牛脂，以及合成甘油酯；烃，如液体石蜡，角鲨烯，以及固体石蜡；酯油，如肉豆蔻酸辛基十二醇酯和肉豆蔻酸异丙酯；高级醇，如十六醇十八醇混合物以及二十二醇；硅氧烷树脂；硅油；表面活性剂，如聚氧乙烯脂肪酸酯，山梨聚糖脂肪酸酯，甘油脂肪酸酯，聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，聚氧乙烯硬化的蓖麻油，以及聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物；水溶性大分子，如羟乙基纤维素，聚丙烯酸，羧基乙烯基聚合物，聚乙二醇，聚乙烯基吡咯烷酮，以及甲基纤维素；低级醇，如乙醇和异丙醇；多元醇，如甘油，丙二醇，二丙二醇，以及山梨醇；糖，如葡萄糖和蔗糖；无机粉末，如硅酸酐，硅酸铝镁，以及硅酸铝；纯水等。填充剂的实例包括乳糖，玉米淀粉，精制白糖，葡萄糖，甘露醇，山梨醇，结晶纤维素，以及二氧化硅。粘结剂的实例包括聚乙烯醇，聚乙烯醚，甲基纤维素，乙基纤维素，阿拉伯树胶，黄芪胶，明胶，虫胶，羟丙基甲基纤维素，羟丙基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙二醇聚氧乙烯嵌段聚合物，以及葡甲胺。崩解剂的实例包括淀粉，琼脂，粉状明胶，结晶纤维素，碳酸钙，碳酸氢钠，柠檬酸钙，糊精，果胶，以及羧甲基纤维素钙。润滑剂的实例包括硬脂酸镁，滑石，聚乙二醇，二氧化硅，以及硬化的植物油。着色剂的实例为那些允许加入药物中的着色剂。调味剂的实例包括可可粉，l-薄荷醇，芳香分散剂，薄荷油，冰片，以及肉桂粉。对于这些片剂和颗粒剂当然可以使用糖衣，必要时还可使用其它适宜的包衣。此外，液体制剂如糖浆和注射剂可以采用常规方法通过将pH调节剂，稳定剂，等渗剂等，以及需要时的增溶助剂，稳定剂等加到本发明的化合物或其药用盐中来制备。制备外用制剂的方法没有限制，而且可以通过常规方法来制备。也就是说，用于制剂的基础材料可以选自药物、准药物、化妆品等常用的各种材料。具体地，可使用的基础材料的实例为动物脂肪和植物油，矿物油，酯油，蜡，高级醇，脂肪酸，硅油，表面活性剂，磷脂，醇，多元醇，水溶性大分子，粘土矿，以及纯化水。需要时，可以添加pH调节剂，抗氧化剂，螯合剂，防腐剂和抗真菌剂，着色物质，香味剂等，但是，本发明的外用制剂的基础材料并不仅限于此。再者，如果需要，还可以混入具有不同诱导作用的组分，血流促进剂，杀真菌剂，消炎剂，细胞活化剂，维生素，氨基酸，保湿剂，以及角质裂解剂。上述基础材料按外用制剂常用浓度的量加入。
施用本发明的化合物或其盐或其水合物时，对其形式没有特别的限制，它们可以根据常用的方法经口或经非胃肠道途径给药。它们可以配制成如片剂，粉剂，细粒剂，胶囊，糖浆，锭剂，吸入剂，栓剂，注射剂，软膏剂，眼膏，滴眼剂，滴鼻剂，滴耳剂，泥罨剂，以及洗剂等剂型。本发明的药物组合物的剂量可以根据症状轻重、年龄、性别、体重、剂型、盐的类型、疾病的具体类型等适当地选择。
将治愈有效量的本发明的抗真菌剂给药于患者。这里，“治疗有效量”是指产生所需药理效果并且有效地恢复或缓解所要治疗的患者之症状的药物量。视患者的体重、疾病类型、症状轻重、患者的年龄、性别、对药物的敏感性等，上述剂量可以显著地不同。通常，成人的日剂量为大约0.03～1000mg，优选0.1～500mg，更优选0.1～100mg，并且每日给药一次或几次，或者每若干天给药一次或几次。注射剂量一般为约1～3000μg/kg，优选为约3～1000μg/kg。


图1是GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程的示意图。GPI(糖基磷脂酰肌醇)-锚定蛋白质首先锚定在GPI上，然后再转运至细胞壁。
图2图示前述化合物(Ia)在酿酒酵母报告系统中的活性。当前述化合物(Ia)以0.39～1.56μg/ml的浓度存在时，培养物上清液级分中的头孢菌素酶活性增加而细胞壁级分的此酶活性中降低，当浓度为3.13μg/ml或更高时，则观察到生长抑制。
图3图示前述化合物(Ia)对白色假丝酵母与动物细胞的粘附的影响。即使在未能观察到生长抑制的1.56μg/ml浓度下，白色假丝酵母到动物细胞的粘附也有大约一半受到了抑制。
图4是前述化合物(Ia)对白色假丝酵母的Alslp抗原量的影响。当前述化合物(Ia)以0.1～0.39μg/ml的浓度存在时，培养物上清液级分中Alslp抗原量增加而细胞壁级分中该抗原量减少。
图5是用GWT1基因作为探针对白色假丝酵母基因进行Southern印迹分析的照片。经EcoRI处理后在6.5kb处，经HindIII处理后在4.0kb处，经EcoRI-HindIII后处理在2.0kb处，经EcoRI-PstI处理后在2.5kb处，都分别观察到单一泳带，预期白色假丝酵母中抗前述化合物(Ia)的抗性基因的同源物以单个基因的形式存在。
图6示过量表达GWT1基因产物的酿酒酵母中，前述化合物(Ia)的活性。在酿酒酵母CW63菌株(图中的“W/T”)中，即使前述化合物(Ia)在导致培养物上清液级分中头孢菌素酶活性增加而细胞壁级分中该酶活性降低的浓度下(0.39～1.56μg/ml)，也未在酿酒酵母CW63/GWT1菌株，及酿酒酵母CW63菌株中观察到这种效果，甚至在导致生长受到抑制的前述浓度(＞3.13μg/ml)下，也未在酿酒酵母CW63/GWT1菌株(图中的“O/E”)中观察到生长抑制。
图7是酿酒酵母，粟酒裂殖唐酵母，及白色假丝酵母的GWT1基因编码的蛋白质中高度保守区的图谱。
具体实施例方式下面将参照实施例详细地说明本发明，但是本发明并不受这些实施例的限制。
实施例A1构建报告基因并将其引入酿酒酵母(1)构建溶菌酶为报告酶的报告基因用包含ENO1启动子+分泌信号+溶菌酶基因的pESH质粒(IchikawaK et al，Biosci.Biotech.Biochem.，57(10)，1686-1690，1993)作为模板，以SEQ ID NO8和SEQ ID NO9的寡核苷酸为引物，通过PCR扩增包含启动子序列的溶菌酶基因，并将其亚克隆到pCR-Script SK(+)的SalI-EcoRI位点中(a)。此外，用酿酒酵母染色体DNA作模板，以SEQ ID NO10和SEQID NO11的寡核苷酸为引物，通过PCR扩增CWP2基因，并将其亚克隆到pUC19的EcoRI-HindIII位点中(b)。类似地，用pYES2(INVITROGEN)作模板，以SEQ ID NO12和SEQ ID NO13的寡核苷酸为引物，通过PCR扩增CYC1终止子，并将其亚克隆到pUC19的新引入的NotI-KpnI位点中(c)。
下一步，将用SalI-EcoRI切除的溶菌酶基因(a)，以及用EcoRI-HindIII切除的CWP2基因(b)插到pESH的SalI-HindIII切割位点。最后，通过下述步骤制备pRLW63T用BamHI-HindIII切割包含ENO1启动子+分泌信号+溶菌酶基因+CWP2基因的基因，将其插入pRS306整合载体(Sikorski RS etal，Genetics.122(1)19-27，1989)，然后将HindIII-KpnI切割的CYC1终止子(c)插到HindIII-KpnI切割位点中。
(2)构建头孢菌素酶为报告酶的报告基因用前述pESH作模板，用ENO1启动子C-末端+分泌信号部分(d)作模板，以SEQ ID NO14和SEQ ID NO15的寡核苷酸为引物，通过PCR扩增包含启动子序列和分泌信号部分的DNA，并将其亚克隆到新引入pUC19中的BamHI-NotI位点中(d)。此外，用弗劳地氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)染色体DNA作模板，以SEQ ID NO16和SEQ ID NO17的寡核苷酸为引物，通过PCR扩增头孢菌素酶基因，并将其亚克隆到新引入pUC19中的NspV-XbaI位点中(e)。类似地，用酿酒酵母染色体DNA作模板，以SEQ IDNO18和SEQ ID NO19的寡核苷酸为引物，通过PCR扩增CWP2基因，并将其亚克隆到pUC19的XbaI-HindIII位点中(f)。
通过将pESH的BamHI-SalI片段插到其中已经插入了(d)的质粒的BamHI-SalI切割位点，制得全长的ENO1启动子+分泌信号部分之后，用NspV-XbaI切割头孢菌素酶基因，用XbaI-HindIII切割CWP2基因，将这两种基因插到NspV-HindIII切割位点中。之后，通过下列步骤制备pRCW63T用EcoRI-HindIII切割，将该片段插到前述pRS306中，然后将CYC1终止子插入HindIII-KpnI切割位点。
(3)将报告基因引入酿酒酵母中在10ml YPD培养基中30℃振荡培养酿酒酵母G2-10菌株，在对数生长晚期收集细胞(2～5×107细胞/ml)。用无菌水洗涤之后，通过乙酸锂方法引入上述的pRLW63T和pRCW63T，所述乙酸锂方法采用YEASTMAKERTM酵母转化系统(Clontech)(参照YEASTMAKERTM酵母转化系统用户手册)。采用pRLW63T和pRCW63T，其中的URA3基因分别用EcoRV和ApaI切割。在SD(Ura-)培养基中30℃培养3天，所得菌落在YPD培养基中培养。
当确认溶菌酶和头孢菌素酶活性的定位时，二者的活性主要定位于细胞壁中，并且确认CWP2的C-末端序列的作用是作为向细胞壁转运的信号。
实施例A2通过酿酒酵母报告系统筛选药物由于使用头孢菌素酶的酶反应的灵敏性优于使用溶菌酶的酶反应的灵敏性，所以采用引入了pRCW63T的酿酒酵母(酿酒酵母CW63菌株)筛选化合物。
在YPD液体培养基中30℃静止培养48小时之后，将酵母细胞培养物用YPD液体培养基稀释100倍(3～5×105细胞/ml)，并将其以75μl/孔的等分试样接种在V-形底的96-孔板(含有25μl/孔的稀释试样)中，30℃静止培养48小时。将该板离心之后，取样25μl的上清液，并置于平底的96-孔板中，以此作为培养物上清液级分。
使沉淀的细胞悬浮，并按75μl/孔的等份加入用2.4M山梨醇制备的酶解酶(Seikagaku Corporation)溶液，30℃反应1小时。将该板离心之后，取样10μl的上清液，并置于平底的96-孔板中，加入15μl的磷酸盐缓冲液，将其用作细胞壁级分。
通过下列方法测量培养基和细胞壁级分中的头孢菌素酶活性将200μMnitrocefin溶液加到已集中的样品中，经过一定时间之后，用柠檬酸缓冲液中止反应，然后测量在490nm处的吸光度。
此外，通过目测法测定试样存在下的真菌生长。
图2表明，当前述化合物(Ia)以0.39～1.56μg/ml的浓度存在时，培养物上清液级分中的头孢菌素酶活性增加，而细胞壁级分中的该酶活性降低。依照这种方式，将增加在培养物上清液级分中头孢菌素酶活性又降低细胞壁级分中头孢菌素酶活性的化合物视为抑制GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程的化合物。
实施例A3利用假丝酵母与动物细胞的粘附筛选药物将IEC-18细胞(1×105细胞/ml于包含10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的D-MEM培养基(Nissui Pharmaceutical)中)的3毫升等分试样置于6-孔板的每个孔中。将该板在二氧化碳气体培养箱中于37℃培养3天，取出培养物上清液，并进行乙醇固定。
将在包含各种浓度的试样的Sabouraud葡萄糖液体培养基中于30℃培养48小时的白色假丝酵母调整到4×102细胞/ml，并将1ml接种到平板的每个孔中，所述孔中已培养了固相IEC-18细胞。30℃培养1小时之后，取出培养物上清液，用PBS洗涤，然后在上层覆盖2ml的Sabouraud葡萄糖琼脂培养基(Difco)。30℃培养过夜之后，计数成熟菌落(CFU)并计算粘附率。
图3表明，即使前述化合物(Ia)的浓度为1.56μg/ml，且其中未能观察到生长抑制，白色假丝酵母对动物细胞的粘附也有大约一半受到抑制。与未经处理的白色假丝酵母相比，将减少细胞粘附型CFU的试样视为抑制白色假丝酵母与动物细胞的粘附的化合物。
实施例A4利用通过ELISA定量的GPI-锚定蛋白质的量筛选药物(1)抗-Alslp肽抗体的制备用与KLH偶联的合成肽SEQ ID NO20使家兔免疫。将所得抗血清进行亲和纯化，用IgG级分作为抗-Alslp肽抗体。
(2)通过ELISA利用抗-Alslp肽抗体筛选药物将白色假丝酵母在包含各种浓度的试样的Sabouraud葡萄糖液体培养基(5ml)中30℃培养48小时，离心收集细胞，洗涤，然后悬浮于300μl的Tris-HCl缓冲液中。将悬浮的细胞转移至装有玻璃珠的微型试管中，并通过将搅拌1分钟且冰上冷却1分钟的循环重复10项进行破碎。破碎的细胞洗涤后，用2％的SDS在95℃抽提10分钟，离心，然后用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀物5次。向该沉淀物中加入0.5ml 5μg/ml的酶解酶溶液，37℃反应1小时，用离心所得上清液作为GPI-锚定蛋白质样品。
用50μl抗-Alslp肽抗体(40μg/ml)包被96-孔板并于4℃过夜。待用包含0.05％Tween 20的PBS(PBST)洗涤5次之后，用25％的BlockAce在室温封闭2小时。用PBST洗涤3次之后，使50μl 2-倍系列稀释的GPI-锚定蛋白样品在室温反应2小时。用PBST洗涤5次之后，使100μl稀释1000倍的HRP-标记的抗-假丝酵母抗体(ViroStat)室温反应2小时，然后在用PBST洗涤5次之后，立即加入75μl底物溶液。中止反应之后，测量490nm的吸光度。
图4表明，当前述化合物(Ia)以0.1～0.39μg/ml的浓度存在时，Alslp抗原的量在培养物上清液级分中增加，且在细胞壁级分中减少。按照这种方式，将增加培养物上清液中Alslp量或者降低细胞壁级分中Alslp量(与未经所述化合物处理的白色假丝酵母中的Alslp量相比，其通过ELISA测量)的化合物视为抑制白色假丝酵母中GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程的化合物。
实施例A5通过电子显微镜观察在试样存在下培养的白色假丝酵母的细胞壁将白色假丝酵母在包含各种浓度的试样的Sabouraud葡萄糖液体培养基(5ml)中30℃培养48小时，然后离心并收集，通过高锰酸钾固定法将其固定，观测其透射电子显微镜图像。
在细胞的最外层观察到具有高电子密度的絮状纤维结构，并认为它是具有GPI-锚定蛋白质为其构成成分的表层糖蛋白层。该絮状纤维结构不受其它现有的抗真菌剂的影响。
与未经处理的细胞相比，在前述化合物(Ia)存在下培养的白色假丝酵母中，细胞的最外层具有高电子密度的絮状纤维结构消失，留下少量具有高电子密度的层。照此，当真菌细胞最外层具有高电子密度的絮状纤维结构消失时，则将试样视为影响GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程的化合物。
实施例A6筛选酿酒酵母的抗前述化合物(Ia)的抗性基因由ATCC得到酿酒酵母基因的质粒文库(ATCC编号37323)。
在10ml的YPD培养基培养酿酒酵母G2-10菌株30℃振荡，在对数生长晚期收获细胞(1～2×107细胞/ml)。用无菌水洗涤细胞之后，通过乙酸锂方法引入酿酒酵母基因的质粒文库，所述乙酸锂方法采用YEASTMAKERTM酵母转化系统(Clontech)(参照YEASTMAKERTM酵母转化系统用户手册)，将所得细胞涂布在SD(Leu-)板上，得到大约80,000个菌落。收集和稀释菌落，并将其涂布在包含浓度为1.56μg/ml和3.125μg/ml的前述化合物(Ia)的SD(Leu-)板上，致使每个板上有570,000个菌落。随后，通过在37℃培养72小时，得到抗性克隆。
挑选27个克隆，通过METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.194169-182(1991)的方法收集质粒，分析插入子，结果发现所有27个克隆均包含相同的片段。
采用ABI377系统(PE Applied Biosystems)测定核苷酸序列，结果发现SEQ ID NO1所示DNA就是赋予对前述化合物(Ia)的抗性的DNA，将其命名为GWT1。
实施例A7酿酒酵母GWT1基因的白色假丝酵母同源物的Southern印迹分析样品如下制备用EcoRI(TaKaRa)，HindIII(TaKaRa)，BamHI(TOYOBO)，或者PstI(New England Biolabs)(包括2种酶的组合)处理25μg的白色假丝酵母染色体组DNA 16小时，然后通过乙醇沉淀法浓缩，并溶解于25μl的无菌水中。将25微克用所述限制性内切酶消化的染色体组DNA通过0.75％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，并将其转移至尼龙膜(GeneScreenPLUS/NEN)。
通过随机引物法，用α-33P-dCTP标记20ng大约1.5kb的SEQ ID NO1的DNA片段，由此制得探针，并用GeneQuant柱(Amersham-Pharmacia)进行纯化。
按下列方法进行杂交将膜浸泡在10ml PerfectHybTM(TOYOBO)溶液中，在65℃预培养1小时，然后加入上述标记过的探针，并于65℃培养2.5小时。按下列进行洗涤1)2×SSC，0.05％SDS溶液，于25℃洗涤5分钟，2)2×SSC，0.05％SDS溶液，于25℃洗涤15分钟，及3)0.1×SSC，0.1％SDS溶液，于50℃洗涤20分钟。将经洗涤的膜用Saran Wrap包裹起来，并与成像底片(FUJI)在室温接触12小时，用BAS2000(FUJI)捕集转移到成像底片的图像，且对图像进行分析。
结果，经EcoRI处理后在6.5kb处，经HindIII处理后在4.0kb处，经EcoRI-HindIII后处理在2.0kb处，经EcoRI-PstI处理后在2.5kb处，都分别观察到单一泳带(图5)，而且预期白色假丝酵母中抗前述化合物(Ia)的抗性基因的同源物以单个基因的形式存在。
实施例A8筛选白色假丝酵母的抗前述化合物(Ia)的抗性基因根据Navaro-Garcia F et al，Mol.Cell.Biol.，152197-2206，1995的方法制备白色假丝酵母的染色体组文库。具体地，用Sau3AI部分地消化白色假丝酵母的染色体组DNA，然后收集大约3～5个DNA片段，并将其插到YEp352穿梭载体的BamHI位点中。
在30℃，于10ml的YPD培养基中振荡培养酿酒酵母G2-10菌株，并在对数生长晚期收集细胞(2～5×107细胞/ml)。用无菌水洗涤细胞之后，通过乙酸锂方法引入白色假丝酵母的染色体组文库，所述乙酸锂方法采用YEASTMAKERTM酵母转化系统(Clontech)(参照YEASTMAKERTM酵母转化系统用户手册)，将所得细胞涂布在SD(Urra-)板上，得到大约25,000个菌落。收集和稀释菌落，并将其涂布在包含浓度为1.56μg/ml的前述化合物(Ia)的SD板上，致使每个板上有500,000个菌落。其后，通过在30℃培养6小时，然后将其转移到37℃并培养66小时，得到抗性克隆。
挑选30个克隆并通过METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.194169-182(1991)的方法收集质粒，分析插入片段，结果发出30个克隆中有28个克隆包含相同的片段。
采用ABI377系统(PE Applied Biosystems)测定核苷酸序列，结果发现SEQ ID NO3所示DNA就是赋予对前述化合物(Ia)的抗性的DNA。
实施例A9由白色假丝酵母的临床分离物克隆前述化合物(Ia)的抗性基因的同源物进行PCR扩增采用由本发明人保存的白色假丝酵母的临床分离物纯化制得的染色体组DNA作为模板，并以SEQ ID NO21和SEQ ID NO22为引物。由全部三个独立的PCR样品扩增大约1.6kb的DNA片段，纯化已扩增的片段，将其亚克隆到pT7-Blue载体(Novagen)中，并测定核苷酸序列，由此发现SEQ ID NO5的DNA序列。该序列在三个位置不同于实施例A7的DNA序列(SEQ ID NO3)。
此外，在斯坦福大学序列中心(Stanford University Sequence Center(http//sequence-www.stanford.edu/))测定的白色假丝酵母基因的核苷酸序列中，发现实施例A7的DNA的同源物(SEQ ID NO7)，该序列在四个位置不同于实施例A7的DNA序列(SEQ ID NO3)。
实施例A10构建过量表达GWT1基因产物的酿酒酵母进行PCR扩增，采用由实施例A6所得抗前述化合物(Ia)的抗性克隆纯化制得的质粒作为模板，并以SEQ ID NO23和SEQ ID NO24为引物。将用PvuII切割的PCR产物插到得自实施例A1的pRLW63T的SalI-HindIII切割位点中。将完整插入物用BamHI-KpnI切割，并插到pRS304的MCS(多克隆位点)中(Sikorski RS et al，Genetics.122(1)19-27，1989)，制得用于整合的载体。
根据实施例A1的方法培养酿酒酵母CW63菌株，该菌株具有头孢菌素酶基因作为报告基因，用EcoRV切割整合载体的TRP1，然后通过实施例A1的方法进行转化。过量表达GWT1的菌株(酿酒酵母CW63/GWT1菌株)通过在SD(Trp-)培养基中于30℃培养3天而得到。
除了对前述化合物(Ia)表现出抗性之外，过量表达GWT1的菌株与野生型菌株没有什么不同，而且对其它抗真菌剂，放线菌酮，苯菌灵，及两性霉素B敏感。
实施例A11构建缺少GWT1基因的酿酒酵母突变体通过PCR扩增两端均包含GWT1序列的His5盒，所用模板为粟酒裂殖唐酵母的his5基因(Longtine MS et al，Yeast，14953-961，1998)，以SEQ IDNO25和SEQ ID NO26为引物。
培养酿酒酵母G2-10并根据实施例A1的方法收集细胞，且根据实施例A1的方法转化前述的PCR产物。通过在SD(His-)培养基中于30℃培养5-7天，得到缺乏GWT1的菌株。
尽管缺乏GWT1的菌株表现出生长非常缓慢，但却暗示其生长不受前述化合物(Ia)的影响，且该GWT1基因产物即为所述化合物的靶。此外，缺乏GWT1的菌株具有如下特征其不能在高温下生长；细胞是溶胀的；以及通过透射电子显微镜观察时，具有高电子密度的真菌细胞最外层的絮状纤维结构已经消失。
实施例A12前述化合物(Ia)在过量表达GWT1基因产物的酿酒酵母中的活性利用酿酒酵母CW63菌株和引入了GWT1基因的酿酒酵母CW63/GWT1，通过实施例A2中所述的方法检测前述化合物(Ia)的活性。
结果，即使前述化合物(Ia)的浓度(0.39～1.56μg/ml)使得在酿酒酵母CW63菌株中头孢菌素酶在培养物上清液级分中的活性增加，在细胞壁级分中的活性减小，也未在酿酒酵母CW63/GWT1菌株中观察到任何影响，甚至在前述化合物(Ia)的浓度(＞3.13μg/ml)使得酿酒酵母CW63菌株的生长受到抑制时，仍未观察到酿酒酵母CW63/GWT1菌株的生长抑制(图6)。
实施例A13(4-丁基苯基)(1-异喹啉基)酮的合成在氮气氛下，将1-溴-4-丁基苯(2.29ml，13.0mmol)加到镁(338mg，13.9mmol)与四氢呋喃(6.5ml)的混合溶液中，并加入催化剂量的1，2-二溴乙烷作为引发剂，回流搅拌10分钟。将该溶液冷却至0℃，加入1-异喹啉腈(1.0g，6.49mmol)的四氢呋喃溶液，并于室温下再搅拌1小时，且于70℃下搅拌3小时。其后，再次将溶液冷却至0℃，加入浓盐酸(2.56ml)和甲醇(11ml)，然后回流2小时。将浓缩的剩余物溶解于5N氢氧化钠和甲苯，并通过硅藻土(celite)进行过滤。分出滤液的甲苯层，用水洗涤，用硫酸镁干燥，并浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化得到1.72g的标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.93(3H，t)，1.32-1.43(2H，m)，1.58-1.66(2H，m)，2.68(2H，t)，7.28(2H，d)，7.61(1H，td)，7.74(1H，td)，7.80(1H，d)，7.87(2H，d)，7.92(1H，d)，8.20(1H，d)，8.60(1H，d)实施例A14前述式(Ia)的化合物{1-(4-丁基苄基)异喹啉}的合成将实施例A13的化合物(1.72g，5.95mmol)，一水合肼(836mg，16.7mmol)，及氢氧化钾(769mg，13.7mmol)加到二乙二醇(8.5ml)中，并在80℃下搅拌1小时，在160℃下搅拌3.5小时，在200℃下搅拌1小时。冷却至室温，加冰水并用乙酸乙酯萃取。将其用水洗涤，然后用硫酸镁干燥，并浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化得到914mg前述式(Ia)的化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.26-1.36(2H，m)，1.50-1.59(2H，m)，2.53(2H，t)，4.64(2H，s)，7.06(2H，d)，7.19(2H，d)，7.53(1H，td)，7.56(1H，d)，7.64(1H，td)，7.81(1H，d)，8.18(1H，dd，)，8.50(1H，d)实施例A15制备前述式(Ia)的化合物{1-(4-丁基苄基)异喹啉}的另一种方法在氮气氛和-16℃下，向60％氢化钠(16mg，0.40mmol)的二甲基甲酰胺(1.8ml)溶液中滴加根据文献Org.Synth.，VI，115(1988)合成的1-氰基-2-苯甲酰基-1，2-二氢异喹啉(100mg，0.38mmol)的二甲基甲酰胺(3.6ml)溶液和4-正丁基苄基氯化物(70mg，0.38mmol)，并在室温下进一步搅拌30分钟。加水，将其浓缩，并向该剩余物中加入甲苯和水。用水洗涤甲苯层，通过碳酸钾干燥，并浓缩。向剩余物的乙醇(1.6ml)溶液中加入50％的氢氧化钠水溶液(0.63ml)，并将其回流2小时。浓缩之后，加入甲苯和水。用水洗涤甲苯层，用碳酸钙干燥，然后浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化得到18mg前述式(Ia)的化合物。
实施例A16克隆酿酒酵母GWT1基因的白色假丝酵母同源物通过0.75％琼脂糖凝胶电泳分离经HindIII(TaKaRa)处理16小时的白色假丝酵母染色体组DNA(25μg)，从凝胶中回收大小约3.5～4.5kb的DNA片段。将回收的DNA片段插到pKF3载体(TaKaRa)的HindIII位点中，制备假丝酵母基因组文库。
利用所制备的文库，大约10,000个菌落出现在LB/氨苄青霉素板上，采用Colony/Plaque Screen(NEN)膜进行菌落转移，然后进行杂交。通过随机引物法，用α-33P-dCTP标记20ngSEQ ID NO1的大约1.5kb的DNA片段，制备探针，采用GeneQuant柱(Amersham-Pharmacia)进行纯化。
按下列步骤进行杂交将所述的膜在PerfectHybTM(TOYOBO)溶液中于65℃培养1小时，然后加入上述标记过的探针，并于65℃进一步培养2.5小时。进行下面的洗涤(i)2×SSC，0.05％SDS溶液，在25℃洗涤5分钟，(ii)2×SSC，0.05％SDS溶液，在25℃洗涤15分钟，及(iii)0.1×SSC，0.1％SDS溶液，在50℃洗涤20分钟。将洗涤过的膜用Saran Wrap包裹，在室温下与X-射线胶片(KONICA)接触24小时，然后显影。将对应于曝光点的大肠杆菌菌落分离出来，并进行二次筛选。每个LB/Ampicillin板上将出现约200个分离的菌落，按类似于一次筛选时的方式进行菌落转移，然后进行杂交。杂交的条件与第一次筛选时的条件相同。
结果，分离出与探针强烈反应的大肠杆菌单菌落。由该菌落收集质粒，测定其所包含的序列，结果发现了与在实施例A9中揭示的序列(SEQ ID NO5)相同的序列(假丝酵母GWT1的序列)，推测其为白色假丝酵母同源物。
实施例A17酿酒酵母GWT1基因的粟酒裂殖唐酵母同源物通过数据库检索，发现了与酿酒酵母GWT1基因具有同源性的粟酒裂殖唐酵母基因(SEQ ID NO27，其基因产物的氨基酸序列为SEQ ID NO28)，并将其视为GWT1的粟酒裂殖唐酵母同源物。
实施例A18克隆酿酒酵母GWT1基因的烟曲霉同源物通过遗传序列分析，本发明人在酿酒酵母，粟酒裂殖唐酵母，及白色假丝酵母的GWT1基因编码的蛋白质中发现两个高度保守区(图7)。根据假定的编码该保守区氨基酸序列的DNA，设计引物SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，及SEQ ID NO31。进行PCR扩增，采用1μl购自STRATAGENE的文库(烟曲霉cDNA文库#937053)作为模板，并采用SEQ ID NO29和SEQ IDNO31为引物。此外，采用1μg该扩增的样品作模板且采用SEQ ID NO29和SEQ ID NO30引物进行嵌套式-PCR，结果证实了大约250kb的单个片段的扩增。测定该片段的序列，获得与酿酒酵母的GWT1基因具有同源性的新序列(示于SEQ ID NO32中)，并假定其为烟曲霉的同源物。
为了获得全长cDNA，根据扩增片段的序列设计引物SEQ ID NO33和SEQ ID NO34。此外，还设计了该文库的基因插入位点以外的引物，即SEQ ID NO35和SEQ ID NO36。采用烟曲霉cDNA文库为模板，并采用SEQ ID NO33和SEQ ID NO35引物组或SEQ ID NO34和SEQ ID NO36引物组进行PCR，结果证实扩增了大约1kb的DNA片段(两个引物组都是如此)。测量这些片段的核苷酸序列，得到与酿酒酵母的GWT1基因高度同源的新序列(示于SEQ ID NO1中)。由于该序列的完整基因与酿酒酵母，粟酒裂殖唐酵母，及白色假丝酵母的GWT1基因高度同源，所以强烈暗示该序列为烟曲霉的同源物。
为了克隆烟曲霉的完整同源物，根据所得的序列重新设计下列引物对应于起始密码子上游序列的引物SEQ ID NO37，以及对应于终止密码子下游序列的引物SEQ ID NO38。用烟曲霉cDNA文库(STRATAGENE)和烟曲霉染色体组文库(STRATAGENE)为模板，并采用SEQ ID NO37和SEQ IDNO38为引物进行35轮PCR，结果使用两个模板都检测出大约1.6kb的单个扩增片段。直接测序该片段的核苷酸序列，从cDNA文库中发现了示于SEQ ID NO39中的核苷酸序列，并认为该核苷酸序列编码包含501个氨基酸的蛋白质，如SEQ ID NO40中所示。此外，从染色体组文库中发现核苷酸序列SEQ ID NO41，并发现其具有在同一位置上包含77个碱基对的内含子。
实施例A19克隆酿酒酵母GWT1基因的隐球菌同源物1)数据库检索在数据库中搜索与酿酒酵母GWT1基因具有同源性的基因，结果从斯坦福大学的基因组中心的服务器(http//baggage.stanford.edu/cgi-misc/cneoformans/)上发现了序列502042C05.x1。此外，还从美国俄克拉荷马大学(Oklahoma University)的服务器(http//www.genome.ou.edu/cneo_blast.html)上发现了序列b6e06cn.f1。
2)采用染色体组DNA为模板进行的PCR根据序列502042C05.x1构建引物SEQ ID NO42，并根据序列b6e06cn.f1构建引物SEQ ID NO43。当采用隐球菌(新形隐球酵母)的染色体组DNA为模板，利用引物SEQ ID NO42及引物SEQ ID NO43进行PCR扩增时，检测到大约2kb的扩增片段。当检测该片段的核苷酸序列时，得到与酿酒酵母的GWT1基因同源的新序列，如SEQ ID NO44中所示。
为了获得隐球菌GWT1基因起始密码子上游的序列，根据序列502042C05.x1构建引物SEQ ID NO45，并根据序列SEQ ID NO44构建引物SEQ ID NO46。当采用隐球菌的染色体组DNA为模板，利用引物SEQID NO45及引物SEQ ID NO46进行PCR扩增时，检测到大约500bp的扩增片段。当检测该片段的核苷酸序列时，得到SEQ ID NO47的序列，并且发现该序列与SEQ ID NO44重叠。
3)3′-RACE为了得到隐球菌GWT1基因的3′-末端序列，进行3′-RACE。用衔接了-引物SEQ ID NO48(基于16μg从隐球菌中提取的总RNA)引发，并采用SuperScript II逆转录酶(GIBCO/BRL)来进行逆转录，并制备随后将成为RT-PCR模板的单链cDNA。采用该单链cDNA为模板，并利用引物SEQ IDNO49和SEQ ID NO50进行35个循环的PCR，结果检测到大约1.2kb的扩增片段。当采用直接测序法分析该片段的核苷酸序列时，得到示于SEQID NO51中与酿酒酵母GWT1基因同源的新序列。
4)全长染色体组DNA的PCR利用根据SEQ ID NO47设计的引物SEQ ID NO52，以及根据SEQID NO51设计的引物SEQ ID NO53，以隐球菌的染色体组DNA为模板，对三个独立的制剂进行35个PCR循环。结果，从全部三个独立的试管中检测到大约2kb的扩增片段，因此，将它们中的每一个单独地进行直接测序，并测定它们的全部核苷酸序列。结果，三个独立的序列完全匹配，得到包含SEQ ID NO54所示的隐球菌全长GWT1基因同源物的序列。
5)cDNA序列的测定将来源于SEQ ID NO54中所示的基因组的隐球菌GWT1基因的序列，与通过3′-RACE得到的cDNA序列51进行比较，结果表明在两个位置存在内含子。此外，由于ATG起始密码子之后的开放式读框不连续，所以暗示存在另一个内含子。因此，从假定的氨基酸序列和剪接供体/受体序列预言cDNA结构，并将引物SEQ ID NO55和SEQ ID NO56设计在预期的外显子连接处。利用上述引物，并以来源于隐球菌的单链cDNA为模板，进行35个循环的PCR，结果证实扩增了大约1.4kb的片段。在采用直接测序法测定该片段的核苷酸序列时，得到序列SEQ ID NO57，并与SEQ ID NO54进行比较，暗示隐球菌GWT1基因的cDNA序列具有SEQ ID NO58的结构。由于该序列在某些区域显示出与酿酒酵母，粟酒裂殖唐酵母，白色假丝酵母，及烟曲霉的GWT1基因的高度同源性，所以强烈暗示该序列为隐球菌的同源物。
实施例A20赋予对前述式(Ia)所示化合物的抗性的遗传突变用甲磺酸乙酯处理因引入pRLW63T而以溶菌酶基因为报告基因的酿酒酵母LW63菌株，然后在前述式(Ia)化合物的浓度为1.56，3.13，及6.25μg/ml的SD培养基中于37℃培养3天，得到5个抗性突变菌株(R1～R5)。在它们当中，发现R1突变菌株和R5突变菌株因为单个基因的突变而获得了针对前述式(Ia)化合物的特异性抗性。为了确认这两种突变菌株在GWT1基因上是否具有突变，从两种突变菌株中提取染色体组DNA，并测定GWT1基因部分的核苷酸序列。结果，在R1突变菌株中，1213位的鸟嘌呤已变异为腺嘌呤。此外，在R5突变菌株中，418位的鸟嘌呤已变异为腺嘌呤。因此，这表明，在R1突变菌株中，第405个氨基酸(异亮氨酸)已经变成缬氨酸，而在R5突变菌株中，第140个氨基酸(甘氨酸)已经变成精氨酸。
下一步，为了确认这些突变是否获得对前述式(Ia)化合物的特异抗性的原因，采用来源于这两种突变菌株的染色体组DNA作为模板，并采用引物SEQ ID NO60和61分离突变的GWT1基因(R1或R5)。同时，分离GWT1启动子区(SEQ ID NO62)和终止子区(SEQ ID NO63)，将GWT1基因启动子，突变的GWT1基因ORF，以及GWT1基因终止子插到pRS316载体中，并构建表达突变的GWT1基因的单个拷贝的质粒(pRS316GWT1-R1，pRS316GWT1-R5)。将其引入仅仅单个GWT1基因拷贝被破坏的二倍体菌株(WDG1)中。通过在孢子形成培养基上培养菌落，形成孢子，并通过进行四分体分析，得到其中染色体上的GWT1基因已被破坏而且携带前述质粒的克隆。当将其在包含前述式(Ia)化合物的培养基中培养时，观察到了对前述式(Ia)化合物的抗性，类似于原始的R1突变菌株和R5突变菌株。综上所述说明，通过发生在GWT1基因上的伴随氨基酸突变的点突变，赋予了对前述式(Ia)化合物的特异性抗性，并且强烈暗示该化合物通过直接与GWT1蛋白质的结合而抑制GWT1蛋白的功能。
本发明的化合物可以通过例如下列方法来制备。但是，这些实施例仅用于说明，任何情况下，本发明的化合物都不仅限于在下述具体实例中制备的那些化合物。
实施例B11-(氯甲基)-4-正丁基苯 将亚硫酰氯(2.5ml，34mmol)加到4-正丁基苄基醇(2.0g，12mmol)的乙醚(25ml)溶液中，并将该混合物在室温下搅拌3小时。浓缩该混合物之后，通过用苯共沸蒸馏除去过量的亚硫酰氯得到标题化合物(2.3g)。该化合物无需纯化即可用于下列反应。
实施例B21-(4-丁基苄基)异喹啉 在氮气氛和-16℃下，将根据Org.Synth.，VI，115(1988)合成的1-氰基-2-苯甲酰基-1，2-二氢异喹啉(100mg，0.38mmol)与4-正丁基苄基氯(70mg，0.38mmol)的二甲基甲酰胺(3.6ml)溶液滴加到60％氢化钠(16mg，0.40mmol)的二甲基甲酰胺(1.8ml)溶液中，并将该混合物在室温下搅拌30分钟。加水，将该混合物在减压下浓缩，向剩余物中加入甲苯和水。用水洗涤甲苯层，用碳酸钾干燥，然后减压浓缩。将50％氢氧化钠水溶液(0.63ml)加到剩余物的乙醇(1.6ml)溶液中。将该混合物加热回流2小时并浓缩，然后加入甲苯和水。用水洗涤甲苯层，用碳酸钙干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化得到标题化合物(18mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.26-1.36(2H，m)，1.50-1.59(2H，m)，2.53(2H，t)，4.64(2H，s)，7.06(2H，d)，7.19(2H，d)，7.53(1H，td)，7.56(1H，d)，7.64(1H，td)，7.81(1H，d)，8.18(1H，dd)，8.50(1H，d)实施例B3(4-丁基苯基)(1-异喹啉基)酮 在氮气氛下，将1-溴-4-丁基苯(2.29ml，13mmol)和作为引发剂的催化剂量的1，2-二溴乙烷加到镁(338mg，14mmol)与四氢呋喃(6.5ml)的混合溶液中，并将该混合物回流搅拌10分钟。将该混合物冷却至0℃，加入1-异喹啉腈(1.0g，6.5mmol)的四氢呋喃溶液，并将该混合物在室温下搅拌1小时，然后在70℃下搅拌3小时。其后，将该混合物再次冷却至0℃，加入浓盐酸(2.6ml)和甲醇(11ml)，并将该混合物加热回流2小时。将该混合物浓缩之后，将剩余物溶解于5N氢氧化钠和甲苯，并通过硅藻土过滤。分出滤液的甲苯层，用水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化得到标题化合物(1.7g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.93(3H，t)，1.32-1.43(2H，m)，1.58-1.66(2H，m)，2.68(2H，t)，7.28(2H，d)，7.61(1H，td)，7.74(1H，td)，7.80(1H，d)，7.87(2H，d)，7.92(1H，d)，8.20(1H，d)，8.60(1H，d)实施例B4可供选择的制备1-(4-丁基苄基)异喹啉的方法将实施例B3的化合物(1.7g，6.0mmol)，一水合肼(836mg，17mmol)，及氢氧化钾(769mg，14mmol)加到二乙二醇(8.5ml)中，并将该混合物在80℃下搅拌1小时，在160℃下搅拌3.5小时，然后在200℃下搅拌1小时。将该混合物冷却至室温，加入冰水，并用乙酸乙酯进行萃取。萃取物用水洗涤，用无水硫酸镁干燥，并减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化得到标题化合物(914mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.26-1.36(2H，m)，1.50-1.59(2H，m)，2.53(2H，t)，4.64(2H，s)，7.06(2H，d)，7.19(2H，d)，7.53(1H，td)，7.56(1H，d)，7.64(1H，td)，7.81(1H，d)，8.18(1H，dd)，8.50(1H，d)实施例B51-(4-乙基苄基)异喹啉 利用对乙基苄基氯，按与实施例B2相同的方式得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.18(3H，t)，2.57(2H，q)，4.64(2H，s)，7.08(2H，d)，7.20(2H，d)，7.50-7.55(2H，m)，7.61-7.65(1H，m)，7.80(1H，d)，8.16-8.18(1H，m)，8.49(1H，d)实施例B6(4-丙基苯基)甲醇 将硼氢化钠(2.9g，76mmol)与浓硫酸的乙醚溶液(通过将2.0ml浓硫酸加到4.0ml的乙醚中而制备)滴加到已经冷却至0℃的对正丙基苯甲酸(5.0g，32mmol)的四氢呋喃(20ml)溶液中，同时保持反应体系的温度低于20℃，然后将该混合物在室温下搅拌3小时。待混合物在冰上冷却之后，加入甲醇和1N氢氧化钠，并用乙酸乙酯萃取该混合物。乙酸乙酯层用饱和盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩，得到标题化合物(4.33g)。该化合物无需纯化即可用于下列反应。
实施例B71-(氯甲基)-4-丙基苯 按与实施例B1相同的方式，通过处理实施例B6的化合物，得到标题化合物。该化合物无需纯化即可用于下列反应。
实施例B81-(4-丙基苄基)异喹啉 按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B7的化合物得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.55-1.61(2H，m)，2.51(2H，t)，4.64(2H，s)，7.06(2H，d)，7.19(2H，d)，7.51-7.55(2H，m)，7.61-7.65(1H，m)，7.81(1H，d)，8.17(1H，dd)，8.49(1H，d)实施例B9(4-戊基苯基)甲醇 按与实施例B6相同的方式，通过还原4-正戊基苯甲酸，得到标题化合物。
实施例B101-(氯甲基)-4-戊基苯 按与实施例B1相同的方式，通过处理实施例B9的化合物，得到标题化合物。该化合物无需纯化即可用于下列反应。
实施例B111-(4-戊基苄基)异喹啉 按与实施例B2相同的方式，通过实施例B10的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.86(3H，t)，1.26-1.33(4H，m)，1.52-1.59(2H，m)，2.52(2H，t)，4.64(2H，s)，7.06(2H，d)，7.18(2H，d)，7.50-7.55(2H，m)，7.61-7.65(1H，m)，7.80(1H，d)，8.17(1H，dd)，8.49(1H，d)实施例B12(4-己基苯基)甲醇 按与实施例B6相同的方式，通过还原4-正己基苯甲酸，得到标题化合物。该化合物无需纯化即可用于下列反应。
实施例B131-(氯甲基)-4-己基苯 按与实施例B1相同的方式，通过处理实施例B12的化合物，得到标题化合物。该化合物无需纯化即可用于下列反应。
实施例B141-(4-己基苄基)异喹啉 按与实施例B2相同的方式，通过处理的实施例B13化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.86(3H，t)，1.26-1.31(6H，m)，1.51-1.58(2H，m)，2.52(2H，t)，4.63(2H，s)，7.06(2H，d)，7.18(2H，d)，7.50-7.55(2H，m)，7.61-7.65(1H，m)，7.80(1H，d)，8.17(1H，dd)，8.49(1H，d)实施例B151-(4-异丙基苄基)异喹啉 按与实施例B2相同的方式，通过处理对异丙基苄基氯，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.19(6H，d)，2.80-2.87(1H，m)，4.64(2H，s)，7.11(2H，d)，7.21(2H，d)，7.51-7.56(2H，m)，7.61-7.65(1H，m)，7.81(1H，d)，8.19(1H，dd)，8.50(1H，d)实施例B161-[4-(叔丁基)苄基]异喹啉 按与实施例B2相同的方式，通过处理4-叔丁基苄基氯，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.26(9H，s)，4.64(2H，s)，7.22(2H，d)，7.27(2H，d)，7.52-7.56(2H，m)，7.62-7.66(1H，m)，7.81(1H，d)，8.19(1H，dd)，8.50(1H，d)实施例B17(4-异丁基苯基)甲醇 按与实施例B6相同的方式，通过还原4-异丁基苯甲酸，得到标题化合物。该化合物无需进一步纯化即可用于下列反应。
实施例B18
1-(氯甲基)-4-异丁基苯 按与实施例B1相同的方式，通过处理实施例B17的化合物，得到标题化合物。该化合物无需进一步纯化即可用于下列反应。
实施例B191-(4-异丁基苄基)异喹啉 按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B18的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.86(6H，d)，1.75-1.83(1H，m)，2.39(2H，d)，4.66(2H，s)，7.02(2H，d)，7.18(2H，d)，7.52-7.58(2H，m)，7.63-7.67(1H，m)，7.82(1H，d)，8.18(1H，d)，8.50(1H，d)实施例B201-(氯甲基)-4-(三氟甲基)苯 按与实施例B1相同的方式，通过处理4-三氟甲基苄基醇，得到标题化合物。该化合物无需进一步纯化即可用于下列反应。
实施例B211-[4-(三氟甲基)苄基]异喹啉 按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B20的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.73(2H，s)，7.39(2H，d)，7.51(2H，d)，7.54-7.60(2H，m)，7.65-7.69(1H，m)，7.84(1H，d)，8.09-8.10(1H，m)，8.51(1H，d)实施例B221-(氯甲基)-4-(三氟甲氧基)苯 按与实施例B1相同的方式，通过处理4-三氟甲氧基苄基醇，得到标题化合物。该化合物无需进一步纯化即可用于下列反应。
实施例B231-[4-(三氟甲氧基)苄基]异喹啉 按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B22的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.67(2H，s)，7.10(2H，d)，7.27(2H，d)，7.54-7.59(2H，m)，7.64-7.68(1H，m)，7.84(1H，d)，8.11(1H，dd)，8.50(1H，d)实施例B241-(氯甲基)-2-碘苯 将甲磺酰氯(2.0ml，29mmol)和三乙胺(3.6ml，26mmol)加到冷却至0℃的邻碘苄基醇(5.0g，21mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液中，并将混合物在该温度下搅拌19小时。加入5％的碳酸氢钠水溶液，并用二氯甲烷萃取所得的混合物。将二氯甲烷层用无水硫酸镁干燥并减压浓缩，得到标题化合物(5.34g)。
实施例B251-(2-碘苄基)异喹啉
按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B24的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.74(2H，s)，6.81-6.84(1H，m)，6.87-6.92(1H，m)，7.11-7.15(1H，m)，7.55-7.57(1H，m)，7.60(1H，d)，7.64-7.68(1H，m)，7.83-7.86(1H，m)，7.89-7.91(1H，m)，8.00-8.02(1H，m)，8.50(1H，d)实施例B261-[2-(2-苯基-1-乙炔基)苄基]异喹啉 在氮气氛下，将四(三苯基膦)合钯(58mg，0.05mmol)与乙炔基苯(204mg，2.0mmol)的吡咯烷(1.5ml)溶液加到实施例B25的化合物(345mg，1.07mmol)的吡咯烷(1.5ml)溶液中，并将该混合物在80℃下搅拌3小时。将该混合物冷却至室温，用乙酸乙酯稀释，用饱和的氯化铵水溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(280mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.95(2H，s)，6.98-7.06(2H，m)，7.10-7.21(2H，m)，7.31-7.35(3H，m)，7.48-7.51(3H，m)，7.57-7.65(2H，m)，7.82(1H，d)，8.25(1H，d)，8.52(1H，d)实施例B271-(2-苯基乙基苄基)异喹啉
将钯-碳(10％，230mg)加到实施例B26的化合物(280mg，0.88mmol)的四氢呋喃(30ml)溶液中，并在氢气氛(1atm)下将该混合物在室温下搅拌3小时。滤除催化剂并减压浓缩所得滤液。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(162mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.90-2.94(2H，m)，3.07-3.10(2H，m)，4.67(2H，s)，6.80(1H，d)，7.02-7.06(1H，m)，7.15-7.30(7H，m)，7.49-7.53(1H，m)，7.58(1H，d)，7.64-7.68(1H，m)，7.84(1H，d)，7.95(1H，d)，8.50(1H，d)实施例B281-{2-[4-(四氢-2H-2-吡喃氧基)-1-丁炔基]苄基}-异喹啉 在氮气氛下，将四(三苯基膦)合钯(58mg，0.05mmol)与2-(3-丁炔氧基)-四氢-2H-吡喃(208mg，2.0mmol)的吡咯烷(1.5ml)溶液加到实施例B25的化合物(345mg，1.07mmol)的吡咯烷(1.5ml)溶液中，并将该混合物在室温下搅拌4天，且于80℃下搅拌30分钟。将该混合物冷却至室温，用乙酸乙酯稀释，用饱和的氯化铵水溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(277mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.42-1.60(4H，m)，1.64-1.68(1H，m)，1.75-1.81(1H，m)，2.76-2.80(2H，m)，3.46-3.51(1H，m)，3.60-3.66(1H，m)，3.85-3.95(2H，m)，4.64-4.66(1H，m)，4.85(2H，s)，6.95-6.98(1H，m)，7.05-7.13(2H，m)，7.44-7.46(1H，m)，7.49-7.53(1H，m)，7.56(1H，d)，7.60-7.65(1H，m)，7.80-7.82(1H，m)，8.15-8.18(1H，m)，8.49-8.51(1H，m)实施例B294-[2-(1-异喹啉基甲基)苯基]-3-丁炔-1-醇 待将实施例B28的化合物(200mg，0.54mmol)冷却至0℃之后，加入盐酸-甲醇溶液(10％，5ml)，并将该混合物搅拌15分钟。加入饱和的碳酸氢钠水溶液，并用乙酸乙酯萃取该混合物。乙酸乙酯层用无水硫酸镁干燥并减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(86mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.72(2H，t)，3.53-3.60(1H，brs)，3.85(2H，t)，4.85(2H，s)，7.12-7.15(2H，m)，7.22-7.24(1H，m)，7.42-7.44(1H，m)，7.55-7.59(2H，m)，7.63-7.67(1H，m)，7.81(1H，d)，8.30(1H，m)，8.46(1H，m)实施例B304-[2-(1-异喹啉基甲基)苯基]-1-丁醇 将钯-碳(10％，10mg)加到实施例B29的化合物(44mg，0.15mmol)的四氢呋喃(5ml)溶液中，并在氢气氛下(1atm)将该混合物在室温下搅拌1小时。滤除催化剂之后，将滤液减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(18mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.61-1.75(4H，m)，2.33(1H，brs)，2.77(2H，t)，3.67(2H，t)，4.70(2H，s)，6.91(1H，d)，7.02-7.06(1H，m)，7.12-7.16(1H，m)，7.19-7.21(1H，m)，7.50-7.55(1H，m)，7.57(1H，d)，7.63-7.67(1H，d)，7.83(1H，d)，8.09(1H，d)，8.47(1H，d)实施例311-溴-2-(氯甲基)苯 按与实施例B1相同的方式，通过处理溴苄基醇，得到标题化合物。
实施例B321-(4-溴苄基)异喹啉
按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B31的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.61(2H，s)，7.14-7.16(2H，m)，7.35-7.39(2H，m)，7.52-7.58(2H，m)，7.63-7.67(1H，m)，7.82(1H，d)，8.07-8.10(1H，m)，8.49(1H，d)实施例B33(E)-3-[4-(异喹啉基甲基)苯基]-2-丙酸乙酯 在氮气氛下，将三(2-甲基苯基)膦(20mg，0.067mmol)，乙酸钯(II)(7.5mg，0.034mmol)，及三乙胺(70μl，0.50mmol)加到实施例B32的化合物(100mg，0.34mmol)与丙酸乙烯酯(73μl，0.67mmol)的二甲基甲酰胺(1.0ml)溶液中，并将该混合物在100℃下搅拌4小时。待将该混合物冷却至室温之后，加水，并用乙酸乙酯萃取该混合物。有机层用水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(74mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.32(3H，t)，4.24(2H，q)，4.69(2H，s)，6.36(1H，d)，7.29(2H，d)，7.42(2H，d)，7.53-7.67(4H，m)，7.83(1H，d)，8.11-8.13(1H，m)，8.50(1H，d)实施例B343-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]丙酸乙酯 将钯-碳(10％，20mg)加到实施例B33的化合物(71mg，0.22mmol)的甲醇(5.0ml)溶液中，并在大气压大小的氢气氛下，将该反应混合物于室温搅拌5.5小时。从反应混合物中滤除催化剂之后，将滤液减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(52mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.20(3H，t)，2.56(2H，t)，2.88(2H，t)，4.09(2H，q)，4.64(2H，s)，7.09(2H，d)，7.20(2H，d)，7.51-7.57(2H，m)，7.62-7.66(1H，m)，7.82(1H，d)，8.15(1H，dd)，8.50(1H，d)实施例B353-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-1-丙醇 在氮气氛下，将氢化铝锂(6mg，0.16mmol)加到冷却至0℃的四氢呋喃(1.0ml)中。进一步加入实施例B34的化合物(46mg，0.14mmol)的四氢呋喃(1.0ml)溶液，并将反应混合物在该温度下搅拌3小时。向反应混合物中加入甲醇与水(9∶1，1.0ml)的混合溶液，进一步加入饱和的氯化铵水溶液，然后用氯仿萃取该混合物。有机层用无水硫酸镁干燥并减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(22mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.30-1.35(1H，brs)，1.81-1.88(2H，m)，2.64(2H，t)，3.62-3.65(2H，m)，4.64(2H，s)，7.09(2H，d)，7.20(2H，d)，7.51-7.57(2H，m)，7.62-7.66(1H，m)，7.81(1H，d)，8.16-8.18(1H，m)，8.49(1H，d)实施例361-异喹啉基(4-甲氧基苯基)酮 在氮气氛下，将4-溴苯甲醚(15.3ml，122mmol)和催化剂量的1，2-二溴乙烷(引发剂)加到镁(3059mg，125.8mmol)与四氢呋喃(20ml)的混合溶液中，并在加热回流下搅拌反应混合物45分钟。将该混合物冷却至0℃，并向其中滴加1-异喹啉腈(10.78g，69.9mmol)的四氢呋喃(30ml)溶液，且将该混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物在冰上冷却，加入浓盐酸(24ml)和甲醇(120ml)，并将该混合物加热回流1.5小时。在冰上冷却之后，通过加入氢氧化钠水溶液将混合物的pH调整至8，用乙醚萃取，用饱和盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(15.87g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.88(3H，s)，6.95(2H，d)，7.61(1H，dd)，7.74(1H，dd)，7.76(1H，d)，7.85(2H，d)，8.17(1H，dd)，8.60(1H，d)。
实施例B371-异喹啉基(4-甲氧基苯基)甲醇 将硼氢化钠(1855mg)加到冰冷却的实施例B36的化合物(8608mg)的乙醇(170ml)溶液中，并将该混合物在室温下搅拌35分钟。进一步加入硼氢化钠(957mg)，并将反应混合物在40℃下搅拌40分钟。将反应混合物减压浓缩，加水，并用乙醚萃取该混合物。有机层用水和饱和盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。所得标题化合物(7881mg)无需进一步纯化即可用于下面的反应。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)3.66(3H，s)，6.30-6.32(1H，brs)，6.81(2H，d)，7.28(2H，d)，7.54(1H，dd)，7.68(1H，dd)，7.76(1H，d)，7.94(1H，d)，8.37(1H，d)，8.47(1H，d)。
在MR光谱中未观察到羟基的质子。
实施例B381-异喹啉基(4-甲氧基苯基)乙酸甲酯 将乙酸酐(20ml)加到实施例B37的化合物(7881mg)的吡啶(100ml)溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌4小时。将反应混合物减压浓缩，并用甲苯共沸蒸馏。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(8.79g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.22(3H，s)，3.76(3H，s)，6.84(2H，d)，7.39(2H，d)，7.54(1H，dd)，7.56(1H，s)，7.60(1H，d)，7.64(1H，dd)，7，82(1H，d)，8.19(1H，d)，8.57(1H，d)。
实施例B391-(4-甲氧基苄基)异喹啉
将钯-碳(10％，4.0g)加到实施例B38的化合物(8.79g)的甲醇(150ml)溶液中，并在大气压大小的氢气氛下，将该混合物在室温下搅拌5.5小时。通过硅藻土滤除催化剂，并将滤液减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(4.48g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.74(3H，s)，4.61(2H，s)，6.79(2H，d)，7.21(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.56(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.80(1H，d)，8.16(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B404-(1-异喹啉基甲基)苯酚 将氢溴酸水溶液(47％，40ml)加到实施例B39的化合物(2185mg)中，并将该反应混合物加热回流14小时。将反应混合物冷却至室温，进一步在冰上冷却，用50％的氢氧化钠水溶液中和，并用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯层用水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。所得粉末经石油醚洗涤之后，得到标题化合物(1822mg)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)4.48(2H，s)，6.61(2H，d)，7.07(2H，d)，7.60(1H，dd)，7.68(1H，d)，7.71(1H，dd)，7.92(1H，d)，8.27(1H，d)，8.41(1H，d)，9.19(1H，brs)。
实施例B414-(1-异喹啉基甲基)三氟甲磺酸苯酯 将三氟甲磺酸酐(0.55ml)滴加到冰冷的实施例B40的化合物(513mg)的吡啶(10ml)溶液中，并将反应混合物在该温度下搅拌45分钟。加冰之后，用乙醚萃取反应混合物。有机层用水和饱和盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(546mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.69(2H，s)，7.16(2H，d)，7.35(2H，d)，7.57(1H，dd)，7，60(1H，d)，7.68(1H，dd)，7.85(1H，d)，8.09(1H，d)，8.50(1H，d)。
实施例B421-[4-(2-苯基-1-乙炔基)苄基]异喹啉 将苯乙炔(53μl)，乙酸钯(9mg)，1，1′-二(二苯基膦)二茂铁(67mg)，碘化铜(I)(3mg)，氯化锂(20mg)，及三乙胺(50μl)加到已经脱气并置于氮气中的实施例B41的化合物(88mg)的N，N-二甲基甲酰胺(2.0ml)溶液中，将该混合物在80℃下搅拌8小时。待混合物冷却至室温之后，加水，并用乙酸乙酯萃取该混合物。有机层用水和饱和盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(53mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.69(2H，s)，7.12-7.32(3H，m)，7.25(2H，d)，7.42(2H，d)，7.43-7.52(2H，m)，7.54(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.83(1H，d)，8.10(1H，d)，8.51(1H，d)。
实施例B431-(4-苯乙基苄基)异喹啉 将钯-碳催化剂(10％，20mg)加到实施例B42的化合物(45mg)的四氢呋喃(2ml)溶液中，并在大气压大小的氢气氛下，将该混合物于室温下搅拌2小时。通过硅藻土滤除催化剂，并将滤液减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(23mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.78-2.90(4H，m)，4.64(2H，s)，7.07(2H，d)，7.10-7.20(5H，m)，7.22(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.55(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.80(1H，d)，8.15(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B441-[4-(4-苯基-1-丁炔基)苄基]异喹啉 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物和4-苯基-1-丁炔，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.65(2H，t)，2.88(2H，t)，4.68(2H，s)，7.12-7.40(9H，m)，7.50-7.70(3H，m)，7.80-7.88(1H，m)，8.00-8.10(1H，m)，8.48-8.51(1H，m)。
实施例B451-[4-(4-苯基-1-丁基)苄基]异喹啉 按与实施例B43相同的方式，通过处理实施例B44的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.55-1.80(4H，m)，2.50-2.65(4H，m)，4.68(2H，s)，7.00-7.30(9H，m)，7.52(1H，dd)，7.56(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.15(1H，d)，8.50(1H，d)。
实施例461-{4-[4-(四氢-2H-2-吡喃氧基)-1-丁炔基]苄基}-异喹啉
按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物和2-(3-丁炔氧基)四氢-2H-吡喃，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.48-1.90(6H，m)，2.67(2H，t)，3.49-3.55(1H，m)，3.60(1H，dd)，3.65-3.94(2H，m)，4.66(2H，s)，4.65-4.70(1H，m)，7.14-7.20(2H，m)，7.23-7.30(2H，m)，7.53(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.10(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B474-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-3-丁炔-1-醇 将实施例B46的化合物(1048mg)溶解于10％的盐酸-甲醇溶液(50ml)，并将该反应混合物在室温下搅拌1.5小时。将反应混合物在冰上冷却，加入饱和的碳酸氢钠水溶液，并用乙酸乙酯萃取所得的混合物。有机层用水和饱和盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(666mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.65(2H，t)，3.77(2H，t)，4.65(2H，s)，7.18(2H，d)，7.29(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.07(1H，d)，8.49(1H，d)。
在NMR光谱中未观察到羟基的质子。
实施例B484-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-1-丁醇
按与实施例B43相同的方式，通过处理实施例B47的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.50-1.70(4H，m)，2.57(2H，t)，3.62(2H，t)，4.64(2H，s)，7.06(2H，d)，7.18(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.55(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.80(1H，d)，8.16(1H，d)，8.49(1H，d)。
在NMR光谱中未观察到羟基的质子。
实施例491-[4-(3-环戊基-1-丙炔基)苄基]异喹啉 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与3-环戊基-1-丙炔，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.25-1.35(2H，m)，1.45-1.70(6H，m)，1.75-1.85(2H，m)，2.05-2.13(1H，m)，4.65(2H，s)，7.17(2H，d)，7.27(2H，d)，7.51(1H，dd)，7.56(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.08(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B501-[4-(3-环戊基丙基)苄基]异喹啉 按与实施例B43相同的方式，通过处理实施例B49的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.25-1.74(13H，m)，2.49-2.54(2H，m)，4.64(2H，s)，7.06(2H，d)，7.18(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.55(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.80(1H，d)，8.17(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B514-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-甲基-3-丁炔-2-醇
按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与2-甲基-3-丁炔-2-醇，得到标题化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)1.35(1H，s)，1.40(6H，s)，4.62(2H，s)，7.20-7.30(4H，m)，7.61(1H，dd)，7.71(1H，d)，7.69-7.76(1H，m)，7.95(1H，d)，8.26(1H，d)，8.42(1H，d)。
实施例B524-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-甲基-2-丁醇 按与实施例B43相同的方式，通过处理实施例B51的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.25(6H，s)，1.70-1.77(2H，m)，2.60-2.67(2H，m)，4.64(2H，s)，7.08(2H，d)，7.19(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.55(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.80(1H，d)，8.16(1H，d)，8.49(1H，d)。
在NMR光谱中未观察到羟基的质子。
实施例B531-[4-(3-甲氧基-1-丙炔基)苄基]异喹啉 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与甲基丙炔基醚，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.42(3H，s)，4.29(2H，s)，4.66(2H，s)，7.21(2H，d)，7.34(2H，d)，7.54(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.65(1H，dd)7.82(1H，d)，8.10(1H，d)8.49(1H，d)。
实施例B541-[4-(3-甲氧基丙基)苄基]异喹啉 按与实施例B43相同的方式，通过处理实施例B53的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.78-1.87(2H，m)，2.06(2H，t)，3.31(3H，s)，3.35(2H，t)，4.64(2H，s)，7.07(2H，d)，7.22(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.55(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.17(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B551-{4-[2-(2-吡啶基)-1-乙炔基]苄基}异喹啉 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与2-乙炔基吡啶，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.71(2H，s)，7.20-7.25(2H，m)，7.29(2H，d)，7.48-7.53(1H，m)，7.51(2H，d)，7.57(1H，dd)，7.61(1H，d)，7.67(1H，dd)，7.85(1H，d)，8.13(1H，d)，8.53(1H，d)，8.59-8.63(1H，m)。
实施例B561-{4-[2-(2-吡啶基)乙基]苄基}异喹啉
按与实施例B43相同的方式，通过处理实施例B55的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.94-3.06(4H，m)，4.64(2H，s)，7.04(1H，d)，7.09(1H，dd)，7.09(2H，d)，7.18(2H，d)，7.53(1H，ddd)，7.54(1H，dd)，7.55(1H，d)，7.64(1H，d)，7.81(1H，d)，8.15(1H，d)，8.49(1H，d)，8.53(1H，dd)。
实施例B571-{4-[2-(3-吡啶基)-1-乙炔基]苄基}异喹啉 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与3-乙炔基吡啶，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.69(2H，s)，7.27(2H，d)，7.31(1H，dd)，7.43(2H，d)，7.55(1H，dd)，7.59(1H，d)，7.66(1H，dd)，7.82(1H，ddd)，7.83(1H，d)，8.10(1H，d)，8.51(1H，d)，8.60(1H，dd)，8.77(1H，d)。
实施例B581-{4-[2-(3-吡啶基)乙基]苄基}异喹啉 按与实施例B43相同的方式，通过处理实施例B57的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.80-2.90(4H，m)，4.65(2H，s)，7.04(2H，d)，7.15(1H，dd)，7.19(2H，d)，7.39(1H，dd)，7.54(1H，dd)，7.56(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.15(1H，d)，8.40(1H，d)，8.42(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B59N-(2-丙炔基)乙酰胺
将吡啶(16.3ml)和乙酸酐(10.4ml)加到冰冷却的丙炔基胺(3023mg)的二氯甲烷(30ml)溶液中，并将该反应混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物倒在冰上，用乙酸乙酯萃取，依次用1N盐酸，饱和的碳酸氢钠水溶液，及饱和的盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后通过硅胶进行过滤。将滤液减压浓缩，得到标题化合物(743mg)。所得化合物无需进一步纯化即可用于下面的反应。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)1.79(3H，s)，3.07(1H，t)，3.81(2H，d)，8.25(1H，brs)。
实施例B60N-{3-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-丙炔基}乙酰胺 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与实施例B59的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)1.79(3H，s)，4.04(2H，s)，4.61(2H，s)，7.45-7.68(4H，m)，7.68-7.75(2H，m)，7.90-8.00(1H，m)，8.25-8.38(2H，m)，8.40-8.45(1H，m)。
实施例B61N-{3-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]丙基}乙酰胺 按与实施例B43相同的方式，通过处理实施例B60的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.95(3H，s)，1.74-1.84(2H，m)，2.55(2H，t)，3.25(2H，dt)，4.68(2H，s)，7.10(2H，d)，7.18(2H，d)，7.20-7.28(1H，m)，7.50-7.58(2H，m)，7.60-7.68(1H，m)，7.75-7.85(1H，m)，8.10-8.16(1H，m)，8.45-8.50(1H，m)。
实施例B62N-(2-丙炔基)甲磺酰胺 将三乙胺(9.77ml)加到冰冷却的丙炔基胺(3023mg)的二氯甲烷(30ml)溶液中。滴加甲磺酰氯(5.19ml)之后，将反应混合物在该温度下搅拌3小时，温暖至室温，进一步搅拌2小时。将冰架的反应混合物中，所的混合物用乙酸乙酯萃取，用饱和盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，并减压浓缩。将剩余物溶解于甲醇(120ml)，加入碳酸钾(11.7g)，并将反应混合物在室温下搅拌3小时。将反应混合物减压浓缩，在冰冷却下用稀盐酸中和，然后用乙酸乙酯萃取。萃取液用饱和盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(6.67g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.39(1H，t)，3.10(3H，s)，3.99(2H，dd)，4.60(1H，brs)。
实施例B63N-{3-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-丙炔基}-甲磺酰胺 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与实施例B62的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)2.97(3H，s)，4.00(2H，d)，4.63(2H，s)，7.25-7.37(4H，m)，7.57(1H，t)，7.62(1H，dd)，7.71(1H，d)，7.73(1H，dd)，7.94(1H，d)，8.28(1H，d)，8.42(1H，d)。
实施例B64N-{3-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]丙基}甲磺酰胺
按与实施例B43相同的方式，通过处理实施例B63的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.80-1.90(2H，m)，2.62(2H，t)，2.89(3H，s)，3.11(2H，dt)，4.25(1H，brs)，4.64(2H，s)，7.05(2H，d)，7.20(2H，d)，7.50(1H，dd)，7.56(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.15(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B651-{4-[3-(乙基磺酰基)-1-丙炔基]苄基}异喹啉 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与丙炔基乙基硫化物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.30(3H，t)，2.73(2H，q)，3.47(2H，s)，4.67(2H，s)，7.20-7.32(4H，m)，7.52(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.08(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B66N-(2-丙炔基)氨基甲酸叔丁酯 将焦碳酸二叔丁酯(di-t-butyl-dicarbonate)(10.84g)的四氢呋喃(20ml)溶液滴加到冰冷却的丙炔基胺(3040mg)的四氢呋喃(20ml)溶液中，将混合物的温度逐步升高至室温，并将反应混合物搅拌20小时。加水之后，将反应混合物用乙酸乙酯萃取，用饱和盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩得到标题化合物(9.34g)。所得化合物无需进一步纯化即可用于下面的反应。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)1.36(9H，s)，3.04(1H，t)，3.62-3.70(2H，m)，7.20-7.30(1H，m)
实施例B67N-{3-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-丙炔基}-氨基甲酸叔丁酯 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与实施例B66的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.45(9H，s)，4.06-4.13(2H，m)，4.66(2H，s)，7.19(2H，d)，7.20-7.28(1H，m)，7.29(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.08(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B68N-{3-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]丙基}氨基甲酸叔丁酯 按与实施例B43相同的方式，通过处理实施例B67的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.43(9H，s)，1.70-1.81(2H，m)，2.54-2.60(2H，m)，3.01-3.20(2H，m)，4.47-4.57(1H，m)，4.65(2H，s)，7.07(2H，d)，7.21(2H，d)，7.55(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.83(1H，d)，8.18(1H，d)，8.51(1H，d)。
实施例B693-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-丙炔-1-胺 将三氟乙酸(0.3ml)加到冰冷却的实施例B67的化合物(4mg)的二氯甲烷(0.6ml)溶液中，并将反应混合物在该温度下搅拌1小时。加入饱和的碳酸氢钠水溶液之后，将反应混合物用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(4mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.60-3.68(2H，m)，4.66(2H，s)，7.19(2H，d)，7.29(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.56(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.10(1H，d)，8.49(1H，d)。
在NMR光谱中未观察到胺质子。
实施例B703-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-1-丙胺 按与实施例B69相同的方式，通过处理实施例B68的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.20-1.30(2H，m)，1.78-1.88(2H，m)，2.45-2.52(2H，m)，2.73-2.81(2H，m)，4.55(2H，s)，6.94(2H，d)，7.08(2H，d)，7.50(1H，dd)，7.51(1H，d)，7.61(1H，dd)，7.76(1H，d)，8.10(1H，d)，8.38(1H，d)。
实施例B71N-甲基-N-(2-丙炔基)乙酰胺 按与实施例B59相同的方式，通过处理N-甲基-N-(2-丙炔基)胺，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.11(2.1H，s)，2.17(0.9H，s)，2.21(0.7H，t)，2.31(0.3H，t)，3.00(0.9H，s)，3.08(2.1H，s)，4.04(0.6H，d)，4.23(1.4H，d)。
所得化合物包含该酰胺的几何异构体的7∶3混合物。
实施例B72N-{3-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-丙炔基}-N-甲基-乙酰胺
按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与实施例B71的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.10(1.8H，s)，2.11(1.2H，s)，3.01(1.2H，s)，3.10(1.8H，s)，4.21(1.2H，s)，4.41(0.8H，s)，4.67(2H，s)，7.18-7.23(2H，m)，7.29-7.32(2H，m)，7.53(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.09(1H，d)，8.49(1H，d)。
所得化合物包含该酰胺的几何异构体的3∶2混合物。
实施例B73N-{3-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]丙基}-N1-甲基乙酰胺 按与实施例B43相同的方式，通过处理实施例B72的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.70-1.90(2H，m)，1.89(1.5H，s)，2.03(1.5H，s)，2.50-2.59(2H，m)，2.88(1.5H，s)，2.91(1.5H，s)，3.20-3.25(1H，m)，3.36-3.40(1H，m)，4.66(2H，s)，7.03-7.10(2H，m)，7.18-7.30(2H，m)，7.53(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.66(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.17(1H，d)，8.50(1H，d)。
所得化合物包含该酰胺的几何异构体的1∶1混合物。
实施例B74N-甲基-N-(2-丙炔基)甲磺酰胺 将三乙胺(6.55ml)加到冰冷却的N-甲基-N-(2-丙炔基)胺(2603mg)的二氯甲烷(25ml)溶液中。进一步滴加甲磺酰氯(3.50ml)，将反应混合物在该温度下搅拌1小时，然后在室温性爱进一步搅拌2小时。加冰之后，将反应混合物用乙酸乙酯萃取，依次用1N盐酸，饱和的碳酸氢钠水溶液，及饱和的盐水，用无水硫酸镁干燥，然后通过硅胶进行过滤。将滤液减压浓缩，得到标题化合物(4522mg)。所得化合物无需进一步纯化即可用于下面的反应。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.41(1H，t)，2.93(3H，s)，2.96(3H，s)，4.09(2H，d)。
实施例B75N-{3-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-丙炔基}-N-甲基甲磺酰胺 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与实施例B74的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.95(3H，s)，2.97(3H，s)，4.26(2H，s)，4.68(2H，s)，7.24(2H，d)，7.31(2H，d)，7.55(1H，dd)，7.59(1H，d)，7.66(1H，dd)，7.83(1H，d)，8.10(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B76N-{3-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]丙基}-N-甲基甲磺酰胺 按与实施例B43相同的方式，处理实施例B75的化合物，所得剩余物通过LC-MS[洗脱剂含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液含0.1％三氟乙酸的水溶液＝1∶99～100∶0/20-分钟循环，流速20ml/分钟，柱子YMC CombiprepODS-AM，Φ20mm×50mm(长)]纯化与分离，得到标题化合物。
MS m/z(ESIMH+)369.2实施例B775-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-4-戊炔-2-醇
按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与4-戊炔-2-醇，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.27(3H，t)，2.38-2.62(2H，m)，3.95-4.03(1H，m)，4.65(2H，s)，7.19(2H，d)，7.29(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.08(1H，d)，8.48(1H，d)。
在NMR光谱中未观察到羟基的质子。
实施例B785-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-戊醇 按与实施例B43相同的方式处理实施例B77的化合物，所得剩余物通过LC-MS[洗脱剂含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液含0.1％三氟乙酸的水溶液＝1∶99～100∶0/20-分钟循环，流速20ml/分钟，柱子YMC Combiprep ODS-AM，Φ20mm×50mm(长)]纯化与分离，得到标题化合物。
MS m/z(ESIMH+)306.2实施例B793-丁基苯酚 按与实施例B40相同的方式，通过处理1-丁基-3-甲氧基苯，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.94(3H，t)，1.30-1.55(2H，m)，1.55-1.62(2H，m)，2.56(2H，t)，4.76(1H，brs)，6.63(1H，dd)，6.66(1H，d)，6.75(1H，d)，7.12(1H，dd)。
实施例B80
1-丁基-3-(甲氧基甲氧基)苯 将60％分散于矿物油(102mg)中的氢化钠溶液加到冰冷却的实施例B79的化合物(318mg)的二甲基甲酰胺(5ml)溶液中，并将反应混合物在室温下搅拌30分钟。再次将混合物在冰上冷却，加入氯甲基甲基醚(0.18ml)，并将该反应混合物在室温下搅拌12小时。加水之后，将反应混合物用乙酸乙酯萃取，用饱和的碳酸氢钠水溶液及饱和的盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后通过硅胶进行过滤。将滤液减压浓缩，得到标题化合物(341mg)。所得化合物无需进一步纯化即可用于下面的反应。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.94(3H，t)，1.30-1.42(2H，m)，1.55-2.04(2H，m)，2.58(2H，t)，3.49(3H，s)，5.17(2H，s)，6.80-6.87(3H，m)，7.18(1H，dd)。
实施例B814-丁基-2-(甲氧基甲氧基)苯甲醛 将叔丁基锂的戊烷溶液(1.51M，10.6ml)滴加到冷却至-20℃的实施例B80的化合物(2396mg)的石油醚溶液中，将该反应混合物在-10℃～0℃的温度下搅拌1.5小时。将反应混合物冷却至-70℃，加入无水乙醚(17ml)和二甲基甲酰胺(1.91ml)，并将所得混合物在该温度下搅拌3小时，然后再在室温下搅拌1小时。将反应混合物在冰上冷却，加入饱和的氯化铵水溶液，并将该混合物用乙酸乙酯萃取。萃取液用饱和盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化得到标题化合物(1821mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.94(3H，t)，1.32-1.42(2H，m)，1.57-1.65(2H，m)，2.64(2H，t)，3.54(3H，s)，5.29(2H，s)，6.91(1H，d)，7.01(1H，s)，7.76(1H，d)，10.44(1H，s)。
实施例B82 (1-异喹啉基)甲醇 将氢氧化钠水溶液(50％，1.4ml)加到1-氰基-苯甲酰基-1，2-二氢异喹啉(815mg)(根据Org.Synth.，IV，155(1988)合成的)，实施例B81的化合物(869mg)，以及三乙基苄基氯化铵(7mg)的二氯甲烷(1.6ml)溶液中，使反应混合物在水浴中进行10分钟的超声波处理。加入二氯甲烷(8.3ml)和乙醇(4.4ml)之后，将反应混合物再在水浴中进行85分钟的超声波处理。加水并用二氯甲烷萃取所得反应混合物。萃取液用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(1144mg)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)0.86(3H，t)，1.22-1.31(2H，m)，1.44-1.52(2H，m)，2.44-2.51(2H，m)，3.16(3H，s)，5.10(1H，d)，5.12(1H，d)，6.72(1H，s)，6.75(1H，d)，6.84(1H，s)，7.21(1H，d)，7.61(1H，dd)，7.72(1H，dd)，7.74(1H，d)，7.95(1H，d)，8.31(1H，d)，8.42(1H，d)。
在NMR光谱中未观察到羟基的质子。
实施例B83[4-丁基-2-(甲氧基甲氧基)苯基](1-异喹啉基)乙酸甲酯 按与实施例B38相同的方式，通过处理实施例B82的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.28-1.40(2H，m)，1.50-1.60(2H，m)，2.22(3H，s)，2.54(2H，t)，3.41(3H，s)，5.22(1H，d)，5.26(1H，d)，6.77(1H，d)，6.94(1H，s)，7.29(1H，d)，7.55(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.70(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.05(1H，s)，8.35(1H，d)，8.55(1H，d)。
实施例B841-[4-丁基-2-(甲氧基甲氧基)苄基]异喹啉
按与实施例B39相同的方式，通过处理实施例B83的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.28-1.37(2H，m)，1.50-1.58(2H，m)，2.53(2H，t)，3.46(3H，s)，4.65(2H，s)，5.24(2H，s)，6.66(1H，dd)，6.89(1H，d)，6.92(1H，d)，7.51(1H，dd)，7.53(IH，d)，7.62(1H，dd)，7.79(1H，d)，8.23(1H，d)，8.47(1H，d)。
实施例B855-丁基-2-(1-异喹啉基甲基)苯酚 将5N盐酸(1.0ml)加到实施例B84的化合物(88mg)的甲醇(1.5ml)溶液中，并将该混合物在室温下搅拌14小时。将反应混合物用5N的氢氧化钠水溶液中和，用磷酸盐缓冲液将pH调整至6.8，并用乙酸乙酯萃取。萃取液用无水硫酸镁干燥并减压浓缩，得到标题化合物(44mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.23-1.37(2H，m)，1.48-1.60(2H，m)，2.51(2H，t)，4.56(2H，s)，6.65(1H，dd)，6.82(1H，d)，7.21(1H，d)，7.55(1H，d)，7.68(1H，dd)，7.72(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.35(1H，d)，8.44(1H，d)。
在NMR光谱中未观察到羟基的质子。
实施例B86N-{3-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-丙炔基}-N，N-二甲基胺 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与1-二甲基氨基-2-丙炔，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.04(3H，s)，2.34(3H，s)，3.47(2H，s)，4.66(2H，s)，7.20(2H，d)，7.32(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.56(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.10(1H，d)，8.50(1H，d)。
实施例B871-{4-[3-(四氢-2H-2-吡喃氧基)-1-丙炔基]苄基)异喹啉 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与四氢-2-(2-丙炔氧基)-2H-吡喃，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.45-1.85(6H，m)，3.50-3.60(1H，m)，3.84-3.90(1H，m)，4.42(1H，d)，4.48(1H，d)，4.66(2H，8)，4.87(1H，dd)，7.15-7.21(2H，m)，7.33-7.36(2H，m)，7.50-7.70(3H，m)，7.81-7.86(1H，m)，8.07-8.10(1H，m)，8.48-8.51(1H，m)。
实施例B883-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-丙炔-1-醇 按与实施例B47相同的方式，通过处理实施例B87的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.20-1.30(1H，m)，4.46(2H，s)，4.67(2H，s)，7.23(2H，d)，7.31(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.83(1H，d)，8.09(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B89N，N-二甲基-4-戊炔酰胺
将二甲胺(2M的四氢呋喃溶液，8.53ml)，三乙胺(2.59ml)，及1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(3221mg)加到4-戊炔酸(552mg)的二氯甲烷(150ml)溶液中，并将该混合物在室温下搅拌24小时。反应混合物依次用1N盐酸，饱和的碳酸氢钠水溶液，水，及饱和的盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩，得到标题化合物(129mg)。所得化合物无需进一步纯化即可用于下面的反应。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.96-1.99(1H，m)，2.50-2.60(4H，m)，2.96(3H，s)，3.02(3H，s)。
实施例B90N，N-二甲基-5-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-4-戊炔酰胺 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与实施例B89的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.59-2.64(2H，m)，2.71-2.75(2H，m)，2.96(3H，s)，3.03(3H，s)，4.66(2H，s)，7.18(2H，d)，7.28(2H，d)，7.43-7.70(3H，m)，7.90(1H，d)，8.09(1H，d)，8.50(1H，d)。
实施例B911-甲基-2-丙炔基四氢-2H-2-吡喃基醚 将3，4-二氢-2H-吡喃(7.15ml)和对甲苯磺酸吡啶盐(2187mg)加到3-丁炔-2-醇(3051mg)的二氯甲烷(150ml)溶液中，并将该混合物在室温下搅拌29小时。反应混合物依次用饱和的碳酸氢钠水溶液，水，及饱和的盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(4698mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.45(1.05H，d)，1.48(1.95H，d)，1.50-1.90(6H，m)，2.37(0.65H，d)，2.43(0.35H，d)，3.50-3.60(1.3H，m)，3.80-3.86(0.7H，m)，4.4-3-4.50(0.35H，m)，4.52-4.60(0.65H，m)，4.77(0.35H，t)，4.94(0.65H，t)。
实施例B921-{4-[3-(四氢-2H-2-吡喃氧基)-1-丁炔基]苄基}异喹啉 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与实施例B91的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.40-1.80(6H，m)，1.49(1.05H，d)，1.52(1.95H，d)，3.49-3.60(1H，m)，3.80-3.88(0.65H，m)，3.99-4.06(0.35H，m)，4.65(2H，s)，4.74(1H，q)，4.83(0.35H，t)，4.97(0.65H，t)，7.18-7.22(2H，m)，7.32(2H，d)，7.54(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.08(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B934-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-3-丁炔-2-醇 按与实施例B47相同的方式，通过处理实施例B92的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.53(3H，d)，2.15(1H，brs)，4.68(2H，s)，4.72(1H，q)，7.21(2H，d)，7.31(2H，d)，7.54(1H，dd)，7.59(1H，d)，7.66(1H，dd)，7.84(1H，d)，8.10(1H，d)，8.51(1H，d)。
实施例B94
4-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-丁醇 按与实施例B43相同的方式处理实施例B93的化合物，所得剩余物通过LC-MS[洗脱剂含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液含0.1％三氟乙酸的水溶液＝1∶99～100∶0/20-分钟循环，流速20ml/分钟，柱子YMC Combiprep ODS-AM，Φ20mm×50mm(长)]纯化与分离，得到标题化合物。
MS m/z(ESIMH+)292.2实施例B952-甲基-4-戊炔-2-醇 将乙炔化锂-乙二胺复合物逐步加到冷却至0℃的1，1-二甲基环氧乙烷(1889mg)于四氢呋喃(13ml)和二甲亚砜(20ml)的混合溶液中，将该反应混合物在0℃下搅拌5小时。加水之后，将反应混合物用乙酸乙酯萃取，用饱和盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后通过硅胶进行过滤。将滤液减压浓缩，得到标题化合物(3316mg)。该化合物无需进一步纯化即可用于下列反应。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.33(6H，s)，2.09(1H，t)，2.38(2H，t)。
在NMR光谱中未观察到羟基的质子。
实施例B965-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-甲基-4-戊炔-2-醇 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与实施例B95的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)1.18(6H，s)，2.28(1H，s)，2.42(2H，s)，4.62(2H，s)，7.10-7.30(4H，m)，7.62(1H，dd)，7.71(1H，d)，7.72(1H，dd)，7.94(1H，d)，8.27(1H，d)，8.42(1H，d)。
实施例B975-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-甲基-2-戊醇 按与实施例B43相同的方式，处理实施例B96的化合物，所得剩余物通过LC-MS[洗脱剂含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液含0.1％三氟乙酸的水溶液＝1∶99～100∶0/20-分钟循环，流速20ml/分钟，柱子YMC CombiprepODS-AM，Φ20mm×50mm(长)]纯化与分离，得到标题化合物。
MS m/z(ESIMH+)320.2实施例B984-苄氧基-2-(甲氧基甲氧基)苯甲醛 将N，N-二异丙基乙基胺(1.98ml)和氯甲基甲基醚(0.76ml)加到4-苄氧基-2-羟基苯甲醛(2071mg)的四氢呋喃(30ml)溶液中，并在加热回流下将该反应混合物搅拌19小时。进一步加入N，N-二异丙基乙基胺(2.7ml)和氯甲基甲基醚(1.04ml)，并再次将所的混合物化热回流搅拌10小时。加水之后，将反应混合物用乙酸乙酯萃取，用饱和的氯化铵水溶液及饱和的盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后通过硅胶和氧化铝过滤。将滤液减压浓缩，得到标题化合物(2470mg)。该化合物无需纯化即可用于下列反应。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.52(3H，s)，5.12(2H，s)，5.27(2H，s)，6.68(1H，dd)，6.80(1H，d)，7.33-7.45(5H，m)，7.82(1H，d)，10.33(1H，s)。
实施例B99[4-(苄氧基)-2-(甲氧基甲氧基)苯基](1-异喹啉基)甲醇
按与实施例B82相同的方式，通过处理实施例B98的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)3.16(3H，s)，5.01(2H，s)，5.11(1H，d)，5.14(1H，d)，6.59(1H，dd)，6.66-6.70(2H，m)，7.18(1H，d)，7.31(1H，d)，7.34-7.42(4H，m)，7.61(1H，dd)，7.71(1H，d)，7.75(1H，d)，7.95(1H，d)，8.28(1H，d)，8.43(1H，d)。
在NMR光谱中未观察到羟基的质子。
实施例B100[4-(苄氧基)-2-(甲氧基甲氧基)苯基](1-异喹啉基)乙酸甲酯 按与实施例B38相同的方式，通过处理实施例B99的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.21(3H，s)，3.42(3H，s)，4.98(1H，d)，5.00(1H，d)，5.21-5.27(2H，m)，6.54(1H，dd)，6.81(1H，d)，7.25(1H，d)，7.30-7.41(5H，m)，7.53(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.80(1H，d)，8.00(1H，s)，8.29(1H，d)，8.55(1H，d)。
实施例B1014-(1-异喹啉基甲基)-3-(甲氧基甲氧基)苯酚 按与实施例B39相同的方式，通过处理实施例B100的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)3.36(3H，s)，4.44(2H，s)，5.17(2H，s)，6.22(1H，d)，6.52(1H，s)，6.67(1H，d)，7.57-7.76(3H，m)，7.92(1H，d)，8.22(1H，d)，8.37(1H，d)，9.24(1H，brs)。
实施例B1024-(1-异喹啉基甲基)-3-(甲氧基甲氧基)苯基三氟甲磺酸酯 按与实施例B41相同的方式，通过处理实施例B101的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.43(3H，s)，4.65(2H，s)，5.24(2H，s)，6.77(1H，dd)，7.04(1H，d)，7.07(1H，d)，7.54-7.61(2H，m)，7.67(1H，dd)，7.84(1H，d)，8.16(1H，d)，8.47(1H，d)。
实施例B1031-{2-(甲氧基甲氧基)-[4-(四氢-2H-2-吡喃氧基)-1-丁炔基]苄基}异喹啉 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B102的化合物与2-(3-丁炔氧基)四氢-2H-吡喃，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.51-1.90(6H，m)，2.68(2H，t)，3.50(3H，s)，3.49-3.55(1H，m)，3.58-3.65(1H，m)，3.84-3.94(2H，m)，4.63-4.68(1H，m)，4.65(2H，s)，5.23(2H，s)，6.76(1H，dd)，7.04(1H，d)，7.07(1H，d)，7.49-7.69(3H，m)，7.81(1H，d)，8.14(1H，d)，8.47(1H，d)。
实施例B1045-(4-羟基-1-丁炔基)-2-(1-异喹啉基甲基)苯酚
按与实施例B85相同的方式，通过处理实施例B103的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.80(1H，brs)，2.66(2H，t)，3.73-3.82(2H，m)，4.58(2H，s)，6.87(1H，d)，7.04(1H，s)，7.23(1H，d)，7.60(1H，d)，7.69-7.78(2H，m)，7.86(1H，d)，8.37(1H，d)，8.42(1H，d)。
在NMR光谱中未发现酚羟基的质子。
实施例B1051-(叔丁基)-1，1-二甲基甲硅烷基{4-[4-(1-异喹啉基甲基)-苯基]-2-甲基-3-丁炔基}醚 将三苯基膦(18.37g)加到冰冷却的四溴化碳(11.19g)的二氯甲烷(60ml)溶液中，并将反应混合物在该温度下搅拌1小时。滴加3-{[1-(叔丁基)-1，1-二甲基甲硅烷基]氧基}-2-甲基丙醇(根据Tetrahedron Lett.，4347(1979)制备)的二氯甲烷(14ml)溶液，并将所得反应混合物进一步搅拌1小时。将反应混合物用二氯甲烷稀释，依次用饱和的碳酸氢钠水溶液，饱和的氯化铵水溶液及饱和的盐水洗涤，用硫酸镁干燥，然后减压浓缩。向剩余物中加入乙醚，滤除不溶物，并将滤液减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到叔丁基[(4，4-二溴-2-甲基-3-丁烯基)氧基]-二甲基硅烷(2385mg)。
下一步，将2.47M的正丁基锂己烷溶液(3.15ml)滴加到冷却至-70℃的叔丁基[(4，4-二溴-2-甲基-3-丁烯基)氧基]二甲基硅烷(1326mg)的四氢呋喃(10ml)溶液中，并将混合物在该温度下搅拌1小时。进一步加入饱和的氯化铵水溶液，并将所得的混合物温暖至室温。加水之后，用乙醚萃取反应混合物。乙醚层用饱和盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后通过硅胶进行过滤。将滤液减压浓缩。按与实施例B42相同的方式，处理所得剩余物和实施例B41的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.07(6H，s)，0.90(9H，s)，1.18(3H，d)，2.70-2.80(1H，m)，3.47(1H，dd)，3.70(1H，dd)，4.65(2H，s)，7.16(2H，d)，7.27(2H，d)，7.51(1H，dd)，7.56(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.07(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B1064-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-甲基-3-丁炔-1-醇 按与实施例B47相同的方式，通过处理实施例B105的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(DMS0-d6)δ(ppm)1.11(3H，d)，2.60-2.70(1H，m)，3.28(1H，d)，3.44(1H，d)，4.58(2H，s)，4.85-4.90(1H，m)，7.23(4H，s)，7.61(1H，dd)，7.70(1H，d)，7.71(1H，dd)，7.93(1H，d)，8.25(1H，d)，8.42(1H，d)。
实施例B1071-{[1-(叔丁基)-1，1-二甲基甲硅烷基]氧基}-3-丁炔-2-醇 在氮气氛下，将乙炔基溴化镁的四氢呋喃溶液(0.5M，90ml)加到冷却至-78℃的无水四氢呋喃(20ml)中。滴加叔丁基二甲基甲硅烷氧基乙醛(6000mg)的四氢呋喃(30ml)溶液，并将所得的混合物在-78℃下搅拌45分钟，温暖至室温，搅拌1小时40分钟，然后在冰上冷却。加入饱和的氯化铵水溶液之后，用乙醚萃取反应混合物，用水及饱和的盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后通过硅胶进行过滤。将滤液减压浓缩，得到标题化合物(8.55g)。该化合物无需纯化即可用于下列反应。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.08(6H，s)，0.91(9H，s)，2.43(1H，d)，2.60-2.66(1H，m)，3.65-3.70(1H，m)，3.73-3.81(1H，m)，4.38-4.42(1H，m)。
实施例B1081-{[1-(叔丁基)-1，1-二甲基甲硅烷基]氧基}甲基)-2-丙炔基乙酸酯 按与实施例B38相同的方式，通过处理实施例B107的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.08(6H，s)，0.90(9H，s)，2.11(3H，s)，2.44(1H，d)，3.80-3.88(2H，m)，5.41-5.55(1H，m)。
实施例B1094-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-3-丁炔-1，2-二醇 按与实施例B42相同的方式，处理实施例B41的化合物和实施例B108的化合物，得到偶联产物。按与实施例B47相同的方式，通过去除偶联产物的羟基保护基，得到标题化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)3.40-3.45(1H，m)，3.70-3.82(1H，m)，4.30-4.35(1H，m)，4.63(2H，s)，4.90(1H，t)，5.46(1H，d)，7.25-7.30(4H，m)，7.62(1H，dd)，7.71(1H，d)，7.73(1H，dd)，7.94(1H，d)，8.28(1H，d)，8.43(1H，d)。
实施例B1101-{4-[2-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-1-乙炔基]苄基}-异喹啉 将2，2-二甲氧基丙烷(0.36ml)，10-樟脑磺酸(43mg)，及分子筛(4)加到实施例B109的化合物(34mg)的二甲基甲酰胺(2ml)溶液中，并将该反应混合物在75℃下搅拌9小时。加入饱和的碳酸钠水溶液之后，将反应混合物用乙酸乙酯萃取，用水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(14mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.40(3H，s)，1.50(3H，s)，3.97(1H，dd)，4.21(1H，dd)，4.66(2H，s)，4.91(1H，dd)，7.19(2H，d)，7.32(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.65-7.78(2H，m)，8.08(1H，d)，8.09(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B111叔丁基{[2-(1-乙氧基乙氧基)-3-丁炔基]氧基}二甲基硅烷 将乙基乙烯基醚(1.21ml)and对甲苯磺酸吡啶盐(317mg)加到1-{[1-(叔丁基)-1，1-二甲基甲硅烷基]氧基}-3-丁炔-2-醇(1687mg)的二氯甲烷(90ml)溶液中，并将该混合物在室温下搅拌1小时。二氯甲烷层用饱和的碳酸氢钠水溶液及饱和的盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩，得到标题化合物(1962mg)。该化合物无需纯化即可用于下列反应。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)0.00(6H，s)，0.81(9H，s)，1.01-1.07(3H，m)，1.10-1.20(1H，m)，1.18(3H，d)，3.35-3.63(4H，m)，4.18-4.27(1H，m)，4.74(0.5H，q)，4.81(0.5H，q)。
实施例B1121-{4-[4-{[1-(叔丁基)-1，1-二甲基甲硅烷基]氧基}-3-(1-乙氧基乙氧基)-1-丁炔基]苄基}异喹啉 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与实施例B111的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)0.00(6H，s)，0.80(9H，s)，1.01-1.05(3H，m)，1.19(3H，d)，3.39-3.70(4H，m)，4.41(0.5H，t)，4.48(0.5H，t)，4.59(2H，s)，4.79(0.5H，q)，4.87(0.5H，q)，7.20-7.30(4H，m)，7.58(1H，dd)，7.68(1H，d)，7.69(1H，dd)，7.91(1H，d)，8.24(1H，d)，8.38(1H，d)。
实施例B1131-{[1-(叔丁基)-1，1-二甲基甲硅烷基]氧基}4-[4-(1-异喹啉基-甲基)苯基]-3-丁炔-2-醇 将对甲苯磺酸吡啶盐(486mg)加到实施例B112的化合物(474mg)的甲醇(15ml)溶液中，并将该混合物在室温下搅拌24小时。加入乙酸乙酯之后，将反应混合物用饱和的碳酸氢钠水溶液及饱和的盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(265mg)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)0.01(6H，s)，0.82(9H，s)，3.55-3.62(2H，m)，4.30-4.39(1H，m)，4.61(2H，s)，5.51(1H，d)，7.20-7.27(4H，m)，7.50-7.63(1H，m)，7.67-7.74(2H，m)，7.92(1H，d)，8.27(1H，d)，8.41(1H，d)。
实施例B1141-(叔丁基)-1，1-二甲基甲硅烷基{2-氟-4-[4-(1-异喹啉基-甲基)苯基]-3-丁炔基}醚 在氮气氛下，将实施例B113的化合物(116mg)的二氯甲烷(2ml)溶液滴加到冷却至-78℃的(二乙基氨基)三氟化硫(44μl)的二氯甲烷(2ml)溶液中。搅拌15分钟之后，将反应混合物在室温下再搅拌8小时。加入饱和的碳酸氢钠水溶液，所得的反应混合物用二氯甲烷萃取。二氯甲烷层用水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(42mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.10(6H，s)，0.91(9H，s)，3.83-4.00(2H，m)，4.67(2H，s)，5.17(1H，ddd)，7.22(2H，d)，7.34(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.83(1H，d)，8.08(1H，d)，8.50(1H，d)。
实施例B1152-氟-4-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-3-丁炔-1-醇 按与实施例B47相同的方式，通过处理实施例B114的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.31(1H，brs)，3.77-3.95(2H，m)，4.67(2H，s)，5.35(1H，ddd)，7.22(2H，d)，7.35(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.83(1H，d)，8.07(1H，d)，8.50(1H，d)。
实施例B1161-(叔丁基)-1，1-二甲基甲硅烷基{6-[4-(1-异喹啉基甲基)-苯基]-5-己炔基}醚 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与叔丁基(5-己炔基氧基)二甲基硅烷，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.04(6H，s)，0.88(9H，s)，1.55-1.70(4H，m)，2.39(2H，t)，3.64(2H，t)，4.65(2H，s)，7.17(2H，d)，7.27(2H，d)，7.51(1H，dd)，7.55(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.08(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B1176-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-5-己炔-1-醇
按与实施例B47相同的方式，通过处理实施例B116的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.60-1.80(4H，m)，2.42(2H，t)，3.69(2H，t)，4.65(2H，s)，7.17(2H，d)，7.27(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.08(1H，d)，8.49(1H，d)。
在NMR光谱中未观察到羟基的质子。
实施例B1186-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-1-己醇 按与实施例B43相同的方式处理实施例B117的化合物，所得剩余物通过LC-MS[洗脱剂含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液含0.1％三氟乙酸的水溶液＝1∶99～100∶0/20-分钟循环，流速20ml/分钟，柱子YMC Combiprep ODS-AM，Φ20mm×50mm(长)]纯化与分离，得到标题化合物。
MS m/z(ESIMH+)320.2实施例B1192-(4-戊炔氧基)四氢-2H-吡喃 按与实施例B91相同的方式，通过处理4-戊炔-1-醇，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.50-1.90(8H，m)，1.95(1H，t)，2.30-2.35(2H，m)，3.46-3.54(2H，m)，3.80-3.90(2H，m)，4.60(1H，dd)。
实施例B1201-{4-[5-(四氢-2H-2-吡喃氧基)-1-戊炔基]苄基}-异喹啉
按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与实施例B119的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.49-1.90(8H，m)，2.49(2H，t)，3.47-3.54(2H，m)，3.82-3.90(2H，m)，4.60(1H，dd)，4.65(2H，s)，7.17(2H，d)，7.27(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.09(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B1215-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-4-戊炔-1-醇 按与实施例B47相同的方式，通过处理实施例B120的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.80-1.88(2H，m)，2.51(2H，t)，3.80(2H，t)，4.65(2H，s)，7.18(2H，d)，7.29(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.09(1H，d)，8.49(1H，d)。
在NMR光谱中未观察到羟基的质子。
实施例B1225-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-4-戊炔基氰化物 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与5-氰基-1-戊炔，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.85-1.98(2H，m)，2.40-2.60(4H，m)，4.66(2H，s)，7.20(2H，d)，7.28(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.83(1H，d)，8.09(1H，d)，8.50(1H，d)。
实施例B1231-[4-(3-甲基-1-丁炔基)苄基]异喹啉 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与3-甲基-1-丁炔，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.23(6H，d)，2.70-2.78(1H，m)，4.65(2H，s)，7.18(2H，d)，7.28(2H，d)，7.51(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.08(1H，d)，8.50(1H，d)。
实施例B1241-[4-(5-甲基-1-己炔基)苄基]异喹啉 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与5-甲基-1-己炔，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.91(6H，d)，1.47(2H，dt)，1.68-1.77(1H，m)，2.37(2H，t)，4.65(2H，s)，7.17(2H，d)，7.28(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.09(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B1254-戊炔酰胺 将1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(6775mg)和碳酸氢铵(5905mg)加到4-戊炔酸(2446mg)的氯仿(75ml)溶液中，并将该混合物在室温下搅拌17.5小时。将反应混合物用硅藻土过滤并减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(249mg)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)2.21(2H，t)，2.29-2.33(2H，m)，2.73(1H，t)，6.78-6.88(1H，m)，7.28-7.38(1H，m)。
实施例B1265-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-4-戊炔酸酰胺 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与实施例B125的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)2.51(2H，t)，2.85(2H，t)，3.70(2H，brs)，4.59(2H，s)，7.05(2H，d)，7.23(2H，d)，7.61(1H，dd)，7.70(1H，d)，7.72(1H，dd)，7.94(1H，d)，8.30(1H，d)，8.43(1H，d)。
实施例B1274-戊炔酸叔丁酯 将苄基三乙基氯化铵(5.92g)，碳酸钾(93.4g)，及叔丁基溴(143ml)加到4-戊炔酸(2550mg)的N，N-二甲基乙酰胺(230ml)溶液中，并将该反应混合物在55℃下搅拌24小时。加水之后，将反应混合物用乙酸乙酯萃取，用水洗涤，用无水氯化镁干燥，然后通过硅胶进行过滤。将滤液减压浓缩，得到标题化合物(2.10g)。该化合物无需纯化即可用于下列反应。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.46(9H，s)，1.96-1.97(1H，m)，2.45-2.47(4H，m)。
实施例B1285-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-4-戊炔酸叔丁酯
按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B41的化合物与实施例B127的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.45(9H，s)，2.49(2H，t)，2.64(2H，t)，4.64(2H，s)，7.21(2H，d)，7.26(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.09(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B1295-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-4-戊炔酸 按与实施例B69相同的方式，处理实施例B128的化合物，所得剩余物通过LC-MS[洗脱剂含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液含0.1％三氟乙酸的水溶液＝1∶99～100∶0/20-分钟循环，流速20ml/分钟，柱子YMC CombiprepODS-AM，Φ20mm×50mm(长)]纯化与分离，得到标题化合物。
MS m/z(ESIMH+)316.1下列的化合物合成如下。即根据实施例B33，用下述各种反应物处理实施例B41的化合物，得到标题化合物。该各种反应物为丙烯酰胺，N，N-二甲基丙烯酰胺，丙烯酸叔丁酯，及甲基乙烯基砜。此外，将按此方式得到的偶联产物进行实施例B39的还原或者实施例B40的叔丁酯去保护，或者二者均进行。所得产物通过硅胶柱色谱或通过LC-MS[洗脱剂含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液含0.1％三氟乙酸的水溶液＝1∶99～100∶0/20-分钟循环，流速20ml/分钟，色谱柱YMC Combiprep ODS-AM，20mm(Φ)×50mm(长)]进行纯化。
实施例B130
(E)-3-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-丙烯酰胺 MS m/z(ESIMH+)289.3实施例B1313-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-丙酰胺 MS m/z(ESIMH+)291.2实施例B132N，N-二甲基-(E)-3-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-丙烯酰胺 MS m/z(ESIMH+)317.3实施例B133N，N-二甲基-3-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]丙酰胺 MS m/z(ESIMH+)319.1实施例B134(E)-3-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-丙烯酸叔丁酯
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.51(9H，s)，4.68(2H，s)，6.28(1H，d)，7.27(2H，d)，7.39(2H，d)，7.49-7.60(3H，m)，7.65(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.11(1H，d)，8.50(1H，d)。
实施例B135(E)-3-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-2-丙烯酸 MS m/z(ESIMH+)290.2实施例B1363-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]丙酸叔丁酯 1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.37(9H，s)，2.47(2H，t)，2.83(2H，t)，4.64(2H，s)，7.07(2H，d)，7.19(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.56(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.14(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B1373-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]丙酸 MS m/z(ESIMH+)292.1
实施例B138(E)-2-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-1-乙烯基甲基砜 MS m/z(ESIMH+)324.1实施例B1391-{4-[2-(甲基磺酰基)乙基]苄基}异喹啉 MS m/z(ESIMH+)326.1实施例B1402-苯甲酰基-6，7-二甲氧基-1，2-二氢-1-异喹啉腈 将氰化钾(1.0g，16mmol)水溶液(2.3ml)和苯甲酰氯(1.1ml，9.5mmol)加到6，7-二甲氧基异喹啉(1.0g，5.3mmol)的二氯甲烷(6.0ml)溶液中，其是根据Tetrahedron，37(23)，3977(1981)合成的，并将该反应混合物在加热回流下搅拌2小时。将反应混合物冷却至室温，用硅藻土过滤，并用二氯甲烷和水洗涤。分出滤液之后，二氯甲烷层依次用水，2N盐酸，水，及2N氢氧化钠洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(573mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.92(3H，s)，3.94(3H，s)，5.99(1H，d)，6.51-6.55(2H，m)，6.73(1H，s)，6.85(1H，s)，7.45-7.49(2H，m)，7.53-7.56(1H，m)，7.58-7.61(2H，m)实施例B1411-(4-丁基苄基)-6，7-二甲氧基异喹啉
按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B140的化合物与实施例B1的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.51-1.58(2H，m)，2.54(2H，t)，3.88(3H，s)，4.01(3H，s)，4.57(2H，s)，7.05(1H，s)，7.07(2H，d)，7.19(2H，d)，7.32(1H，s)，7.43(1H，d)，8.37(1H，d)实施例B1421-(3-甲氧基苯基)-2-硝基-1-乙醇 将氢氧化钠水溶液(1.5g氢氧化钠(37mmol)溶解于15ml水)滴加到间甲氧基苯甲醛(5.0g，37mmol)与硝基甲烷(4.0ml，73mmol)的甲醇(50ml)溶液中，同时保持溶液的温度不高于30℃。然后将反应混合物在室温下搅拌4小时。在冰上冷却之后，加入乙酸水溶液(将冰醋酸(37mmol)溶解于250ml水)，所得反应混合物用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯层依次用水和5％的碳酸氢钠水溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(6.09g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.83(3H，s)，4.52(1H，dd)，4.61(1H，dd)，4.76-4.78(1H，m)，5.44-5.48(1H，m)，6.90(1H，dd)，6.96-6.98(2H，m)，7.25-7.34(1H，m)实施例B1432-氨基-1-(3-甲氧基苯基)-1-乙醇 将钯-碳(10％，0.64g)和甲酸铵(4.8g)加到实施例B142的化合物(3.0g，15mmol)于四氢呋喃(43ml)和甲醇(43ml)的混合溶液中，并将该混合物在室温下搅拌18小时。滤出催化剂，用乙醚稀释滤液，通过过滤除去沉淀物，并浓缩所得滤液，进而得到标题化合物(1.82g)。该化合物无需纯化即可用于下列反应。
实施例B1442-(4-丁基苯基)乙酸 将亚硫酰氯(4.7ml，66mmol)滴加到4-正丁基苄基醇(9.6g，59mmol)的乙醚(120ml)溶液中，并将该混合物在室温下搅拌2小时。减压下除去溶剂，并通过用苯共沸蒸馏除去过量的亚硫酰氯。将剩余物溶解于二甲基亚砜(50ml)，向该溶液中加入氰化钠(86g，1.8mol)和四正丁基碘化铵(2.2g，5.9mmol)，并将所得混合物在室温下搅拌16小时。加水，并用乙酸乙酯萃取该混合物。乙酸乙酯层依次用水及饱和的盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到正丁基苯基乙腈(8.2g)，其为黄色的油状物。下一步，将浓硫酸(48ml)滴加到水(58ml)中，并将该溶液冷却至50℃，将上面得到的正丁基苯基乙腈(8.2g)滴加到该溶液中。将所得混合物在加热回流下搅拌16小时。冷却至室温之后，通过过滤收集沉淀的结晶，用水洗涤，并将其溶解于0.1N的氢氧化钠水溶液(200ml)中。加入苏长岩(Norit)(5g)，并将该混合物搅拌回流2小时。通过硅藻土滤出苏长岩之后，将滤液冷却至室温并用1N盐酸酸化，以沉淀结晶。通过过滤收集沉淀的介晶，用水洗涤，并干燥，得到标题化合物(3.5g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.93(3H，t)，1.30-1.40(2H，m)，1.53-1.62(2H，m)，2.59(2H，t)，3.62(2H，s)，7.15(2H，d)，7.20(2H，d)在NMR光谱中未发现羧基的OH。
实施例B145N-[2-羟基-2-(3-甲氧基苯基)乙基]-2-(4-丁基苯基)-乙酰胺 将亚硫酰氯(0.76ml，10mmol)加到实施例B144的化合物(1.0g，5.2mmol)的苯(10ml)溶液中，并将该混合物回流搅拌2小时。浓缩之后，通过苯的共沸蒸馏除去过量的亚硫酰氯。将所得剩余物与实施例B143的化合物(0.87g，5.2mmol)溶解于乙醚(5ml)，向其中加入氢氧化钠水溶液(0.21g的氢氧化钠溶解于4.2ml水)，并在室温下剧烈搅拌该混合物30分钟。分出乙醚层并减压浓缩，得到标题化合物(600mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.94(3H，t)，1.31-1.40(2H，m)，1.57-1.63(2H，m)，2.60(2H，m)，3.30-3.37(1H，m)，3.56(2H，s)，3.60-3.66(1H，m)，3.80(3H，s)，3.81(1H，d)，4.79-4.81(1H，m)，6.80-6.89(3H，m)，7.10(2H，d)，7.16(2H，d)，7.20-7.25(1H，m)实施例B1461-(4-丁基苄基)-6-甲氧基异喹啉 将三氯氧磷(1.6ml)加到实施例B145的化合物(600mg，1.7mmol)的乙腈(15ml)溶液中，并将该混合物回流搅拌1小时30分钟。将该混合物在冰上冷却，用5％的碳酸氢钠水溶液使之呈碱性，用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(82mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.58(2H，m)，2.53(2H，t)，3.92(3H，s)，4.57(2H，s)，7.05-7.07(3H，m)，7.13-7.18(3H，m)，7.45(1H，d)，8.06(1H，d)，8.41(1H，d)实施例1471-(4-丁基苄基)-6-异喹啉醇 将47％的氢溴酸溶液加到实施例B146的化合物(82mg)中，并将该混合物回流搅拌19小时。将该混合物减压浓缩，加水，并将所得混合物用碳酸钠中和，以沉淀结晶。滤集所得结晶，用水洗涤，然后干燥，得到标题化合物(74mg)。
1H-NMR(CD3OD)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.25-1.34(2H，m)，1.49-1.57(2H，m)，2.52(2H，t)，4.63(2H，s)，7.03-7.13(6H，m)，7.49(1H，d)，8.10(1H，d)，8.18(1H，d)
实施例B1481-(4-丁基苄基)-6-丙氧基异喹啉 将碳酸银(40mg，0.14mmol)加到实施例B147的化合物(20mg，0.069mmol)与1-碘丙烷(0.4ml，4.1mmol)的甲苯(1.0ml)溶液中，并于暗处将该混合物在50℃下搅拌4小时。冷却至室温之后，将该混合物通过硅藻土过滤，并用甲苯与甲醇(9∶1)的混合溶液洗涤。将所得滤液减压浓缩，并将所得剩余物用硅胶柱色谱进行纯化，得到标题化合物(13mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.08(3H，t)，1.30-1.33(2H，m)，1.51-1.57(2H，m)，1.86-1.91(2H，m)，2.54(2H，t)，4.05(2H，t)，4.58(2H，s)，7.05-7.07(3H，m)，7.14-7.18(3H，m)，7.43-7.44(1H，m)，8.05-8.07(1H，m)，8.40-8.41(1H，m)实施例B1491-(4-丁基苄基)-6-(2-哌啶子基乙氧基)异喹啉 按与实施例148相同的方式，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.26-1.36(2H，m)，1.46-1.57(8H，m)，2.50-2.54(6H，m)，2.83-2.86(2H，m)，4.23(2H，t)，4.56(2H，s)，7.04-7.06(3H，m)，7.13-7.17(3H，m)，7.43(1H，d)，8.04(1H，d)，8.40(1H，d)实施例B150N-({[1-(4-丁基苄基)-6-异喹啉基]氧基}乙基)-N，N-二甲基胺 按与实施例148相同的方式，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.26-1.36(2H，m)，1.49-1.57(2H，m)，2.37(6H，s)，2.52(2H，t)，2.80(2H，t)，4.19(2H，t)，4.57(2H，s)，7.04-7.06(3H，m)，7.15-7.19(3H，m)，7.43(1H，d)，8.05(1H，d)，8.40(1H，d)实施例B1512-苯甲酰基-7-甲氧基-1，2-二氢-1-异喹啉腈 按与实施例B 140相同的方式处理7-甲氧基异喹啉(其是根据Tetrahedron，27，1253(1971)合成的)，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.87(3H，s)，6.03(1H，brd)，6.56-6.54(2H，m)，6.90(1H，s)，6.95(1H，dd)，7.17(1H，d)，7.46-7.50(2H，m)，7.54-7.62(3H，m)实施例B1521-(4-丁基苄基)-7-甲氧基异喹啉 按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B1的化合物与实施例B151的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.56-1.58(2H，m)，2.55(2H，t)，3.82(3H，s)，4.59(2H，s)，7.07(2H，d)，7.20(2H，d)，7.26-7.29(1H，m)，7.35(1H，d)，7.49(1H，d)，7.70(1H，d)，8.38-8.40(1H，m)实施例B1531-(4-溴苄基)-7-甲氧基异喹啉 按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B31的化合物与实施例B151的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.84(3H，s)，4.57(2H，s)，7.14-7.16(2H，m)，7.26(1H，s)，7.29-7.32(1H，m)，7.37-7.39(2H，m)，7.51(1H，d)，7.73(1H，d)，8.39(1H，d)实施例B1541-(4-丁基苄基)-7-异喹啉醇 按与实施例B147相同的方式，通过处理实施例B152的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)0.83(3H，t)，1.21-1.26(2H，m)，1.44-1.48(2H，m)，4.68(2H，s)，7.11(2H，d)，7.18(2H，d)，7.59-7.62(2H，m)，8.10-8.17(2H，m)，8.38(1H，d)，10.9(1H，brs)(丁基的两个亚甲基质子与DMSO信号重叠，不能观测到)实施例B1551-(4-丁基苄基)-7-异喹啉基三氟甲磺酸酯 将4-硝基苯酚三氟甲磺酸酯(0.72g，2.7mmol)(其是根据J.Org.Chem.，64，7638(1999)合成的)，及碳酸钾(1.1g，8.1mmol)加到实施例B154的化合物(1.0g，2.7mmol)的二甲基甲酰胺(30ml)溶液中，并将该混合物在室温下搅拌2小时。加水之后，所的混合物用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯层用1N的氢氧化钠及饱和的盐水洗涤，用硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(1.0g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.27-1.37(2H，m)，1.51-1.59(2H，m)，2.54(2H，t)，5.10(2H，s)，6.38(1H，s)，6.95(2H，d)，7.04(2H，d)，7.44(1H，d)，7.55(1H，d)，7.75(1H，d)，8.45(1H，d)实施例B1561-(4-丁基苄基)-7-异喹啉腈
在氮气氛下，将氰化锌(215mg，1.8mmol)，四(三苯基膦)合钯(41mg，0.035mmol)，及氯化锂(120mg，2.8mmol)加到实施例B155的化合物(400mg，0.95mmol)的二甲基甲酰胺(2ml)溶液中，并将该混合物在120℃下搅拌2小时。冷却至室温之后，加入饱和的碳酸氢钠，并用乙酸乙酯萃取所得的混合物。乙酸乙酯层用饱和盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(71mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.26-1.35(2H，m)，1.47-1.55(2H，m)，2.50(2H，t)，4.91(2H，s)，6.97(2H，d)，7.07(2H，d)，7.28-7.3l(1H，m)，7.42(1H，d)，7.51(1H，d)，7.74(1H，d)，8.34(1H，d)实施例B1571-(4-丁基苄基)-7-[2-(1，1，1-三甲基甲硅烷基)-1-乙炔基]-异喹啉 将乙酸钯(11mg，0.047mmol)，1，1′-双(二苯基膦)二茂铁(72mg，0.13mmol)，及氯化锂(25mg，0.59mmol)加到实施例B155的化合物(100mg，0.24mmol)与三甲基甲硅烷基乙炔(65μl，0.47mmol)的二甲基甲酰胺(3.0ml)溶液中，将该反应体系用氮气吹洗。加入三乙胺(59μl，0.43mmol)和碘化铜(2mg，0.018mmol)，并将该混合物在80℃下搅拌21小时，然后冷却至室温。加入水和乙酸乙酯进行分配，乙酸乙酯层用水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(7.0mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.28-0.32(9H，m)，0.92(3H，t)，1.32-1.38(2H，m)，1.54-1.57(2H，m)，2.57(2H，t)，4.63(2H，s)，7.10(2H，d)，7.20(2H，d)，7.52(1H，d)，7.67-7.69(1H，m)，7.75(1H，d)，8.34(1H，d)，8.51(1H，d)实施例B1581-(4-丁基苄基)-7-(1-乙炔基)异喹啉
将碳酸钾(13mg，0.094mmol)加到实施例B157的化合物(6mg，0.016mmol)的甲醇(1.0ml)溶液中，并将该混合物在室温下搅拌1小时。减压浓缩之后，所得剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(3.0mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.91(3H，t)，1.29-1.38(2H，m)，1.52-1.57(2H，m)，2.55(2H，t)，3.19(1H，s)，4.62(2H，s)，7.09(2H，d)，7.20(2H，d)，7.53(1H，d)，7.67-7.69(1H，m)，7.77(1H，d)，8.36(1H，s)，8.52(1H，d)实施例B1591-(4-丁基苄基)-7-乙基异喹啉 将钯-碳(10％，5.0mg)加到实施例B158的化合物(2.0mg)的四氢呋喃(2.0ml)溶液中，并将该混合物在氮气氛(1atm)下于室温搅拌1小时。滤除催化剂，并浓缩滤液。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(0.21mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(6H，t)，1.25-1.32(2H，m)，1.48-1.57(2H，m)，2.53(2H，t)，2.80(2H，q)，4.62(2H，s)，7.06(2H，d)，7.20(2H，d)，7.49-7.52(2H，m)，7.73(1H，d)，7.95(1H，s)，8.43(1H，d)实施例B1601-(4-丁基苄基)-7-[4-(四氢-2H-2-吡喃氧基)-1-丁炔基]-异喹啉 将乙酸钯(11mg，0.047mmol)，1，1′-双(二苯基膦)二茂铁(72mg，0.13mmol)，及氯化锂(25mg，0.59mmol)加到实施例B155的化合物(100mg，0.24mmol)与2-(3-丁炔氧基)四氢-2H-吡喃(73mg，0.47mmol)的二甲基甲酰胺(3.0ml)溶液中，并用氮气吹洗该反应体系。同时，加入三乙胺(59μl，0.43mmol)和碘化铜(2mg，0.018mmol)，并将所的混合物在80℃下搅拌24小时。将该混合物冷却至室温，加水，并用乙酸乙酯萃取所得的混合物。乙酸乙酯层用水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(25mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.28-1.38(2H，m)，1.52-1.67(6H，m)，1.72-1.79(1H，m)，1.79-1.88(1H，m)，2.54(2H，t)，2.78(2H，t)，3.53-3.56(1H，m)，3.66-3.72(1H，m)，3.91-3.99(2H，m)，4.60(2H，s)，4.71-4.73(1H，m)，7.08(2H，d)，7.19(2H，d)，7.50(1H，d)，7.59-7.62(1H，m)，7.72(1H，d)，8.24(1H，s)，8.48(1H，d)实施例B1614-[1-(4-丁基苄基)-7-异喹啉基]-3-丁炔-1-醇 按与实施例B29相同的方式，通过处理实施例B160的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.39(2H，m)，1.51-1.57(2H，m)，1.83(1H，brs)，2.55(2H，t)，2.75(2H，t)，3.84-3.89(2H，m)，4.60(2H，s)，7.08(2H，d)，7.18(2H，d)，7.50(1H，d)，7.60-7.62(1H，m)，7.73(1H，d)，8.25(1H，s)，8.48(1H，d)实施例B1624-[1-(4-丁基苄基)-7-异喹啉基]-1-丁醇 按与实施例B30相同的方式，通过处理实施例B161的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.28-1.36(2H，m)，1.50-1.59(4H，m)，1.67-1.77(3H，m)，2.53(2H，t)，2.79(2H，t)，3.63(2H，t)，4.62(2H，s)，7.06(2H，d)，7.18(2H，d)，7.47-7.52(2H，m)，7.73(1H，d)，7.92(1H，s)，8.43(1H，d)
实施例B1631-(4-丁基苄基)-7-丙氧基异喹啉 按与实施例B148相同的方式，通过处理实施例B154的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.05(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.56(2H，m)，1.76-1.84(2H，m)，2.53(2H，t)，3.92(2H，t)，4.58(2H，s)，7.06(2H，d)，7.19(2H，d)，7.26-7.29(1H，m)，7.34(1H，d)，7.48(1H，d)，7.70(1H，d)，8.38(1H，d)实施例B1641-(4-丁基苄基)-7-(2-哌啶子基乙氧基)异喹啉 按与实施例B148相同的方式，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.43-1.58(4H，m)，1.61-1.69(4H，m)，2.51-2.55(6H，m)，2.79(2H，t)，4.11(2H，t)，4.57(2H，s)，7.06(2H，d)，7.18(2H，d)，7.28-7.30(1H，m)，7.36(1H，d)，7.48(1H，d)，7.70(1H，d)，8.38(1H，d)实施例B165N-(2-{[1-(4-丁基苄基)-7-异喹啉基]氧基}乙基)-N，N-二甲基胺 按与实施例B148相同的方式，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.57(2H，m)，2.35(6H，s)，2.53(2H，t)，2.75(2H，t)，4.06(2H，t)，4.58(2H，s)，7.06(2H，d)，7.18(2H，d)，7.30-7.33(1H，m)，7.36(1H，d)，7.48(1H，d)，7.70(1H，d)，8.39(1H，d)实施例B1661-(4-丁基苄基)-7-异喹啉基-(2-吗啉基乙基)醚 按与实施例B148相同的方式，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.58(2H，m)，2.51-2.58(6H，m)，2.81(2H，t)，3.75(4H，t)，4.11(2H，t)，4.58(2H，s)，7.06(2H，d)，7.17(2H，d)，7.28-7.31(1H，m)，7.35(1H，d)，7.49(1H，d)，7.71(1H，d)，8.39(1H，d)实施例B1677-(苄氧基)-1-(4-丁基苄基)异喹啉 按与实施例B148相同的方式，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.54(2H，m)，2.54(2H，t)，4.54(2H，s)，5.06(2H，s)，7.05(2H，d)，7.14(2H，d)，7.34-7.43(7H，m)，7.49(1H，d)，7.72(1H，d)，8.39(1H，d)实施例B1681-(4-丁基苄基)-7-(2-吡啶基甲氧基)异喹啉 按与实施例B148相同的方式，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.49-1.57(2H，m)，2.52(2H，t)，4.51(2H，s)，5.25(2H，s)，7.02(2H，d)，7.14(2H，d)，7.24-7.27(1H，m)，7.40(1H，dd)，7.47-7.50(3H，m)，7.68-7.72(1H，d)，7.74(1H，d)，8.39(1H，d)，8.64-8.66(1H，m)
实施例B1691-(4-丁基苄基)-7-(3-吡啶基甲氧基)异喹啉 按与实施例B148相同的方式，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.58(2H，m)，2.54(2H，t)，4.57(2H，s)，5.06(2H，s)，7.07(2H，d)，7.15(2H，d)，7.31-7.36(2H，m)，7.42(1H，d)，7.51(1H，d)，7.74-7.76(2H，m)，8.42(1H，d)，8.61-8.62(1H，m)，8.69-8.70(1H，m)实施例B1701-(4-丁基苄基)-7-(4-吡啶基甲氧基)异喹啉 按与实施例B148相同的方式，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.56(2H，m)，2.54(2H，t)，4.53(2H，s)，5.09(2H，s)，7.04(2H，d)，7.09(2H，d)，7.33-7.39(4H，m)，7.51(1H，d)，7.76(1H，d)，8.41(1H，d)，8.63-8.64(2H，m)实施例B1711-(4-丁基苄基)-7-[(2-甲氧基苄基)氧基]异喹啉 按与实施例B148相同的方式，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.57(2H，m)，2.53(2H，t)，3.82(3H，s)，4.52(2H，s)，5.04(2H，s)，6.88-6.91(1H，m)，6.99-7.02(2H，m)，7.05(2H，d)，7.14(2H，d)，7.32(1H，t)，7.36(1H，dd)，7.43(1H，d)，7.48(1H，d)，7.72(1H，d)，8.39(1H，d)
实施例B1721-(4-丁基苄基)-7-[(3-甲氧基苄基)氧基]异喹啉 按与实施例B148相同的方式，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.56(2H，m)，2.53(2H，t)，3.90(3H，s)，4.53(2H，s)，5.16(2H，s)，6.93-6.98(2H，m)，7.03(2H，d)，7.15(2H，d)，7.30-7.35(1H，m)，7.37(1H，dd)，7.41-7.43(1H，m)，7.47(1H，d)，7.51(1H，d)，7.71(1H，d)，8.37(1H，d)实施例B1731-(4-丁基苄基)-7-[(4-甲氧基苄基)氧基]异喹啉 按与实施例B148相同的方式，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.37(2H，m)，1.51-1.57(2H，m)，2.54(2H，t)，3.83(3H，s)，4.55(2H，s)，4.99(2H，s)，6.93(2H，d)，7.06(2H，d)，7.15(2H，d)，7.32-7.36(3H，m)，7.44(1H，d)，7.48(1H，d)，7.71(1H，d)，8.38(1H，d)实施例B1747-(1，3-苯并二氧戊环(Benzodioxol)-5-基甲氧基)-1-(4-丁基苄基)异喹啉 按与实施例B148相同的方式，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.37(2H，m)，1.51-1.57(2H，m)，2.54(2H，t)，4.55(2H，s)，4.95(2H，s)，5.98(2H，s)，6.82(1H，d)，6.88(1H，dd)，6.92(1H，d)，7.06(2H，d)，7.15(2H，d)，7.33(1H，dd)，7.42(1H，d)，7.48(1H，d)，7.72(1H，d)，8.39(1H，d)
实施例B1751-(4-丁基苄基)-7-[(2-硝基苄基)氧基]异喹啉 按与实施例B148相同的方式，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.87(3H，t)，1.26-1.34(2H，m)，1.48-1.56(2H，m)，2.51(2H，t)，4.53(2H，s)，5.49(2H，s)，7.03(2H，d)，7.14(2H，d)，7.40(1H，dd)，7.430-7.434(1H，m)，7.45-7.49(1H，m)，7.51(1H，d)，7.64-7.68(1H，m)，7.76(1H，d)，7.85-7.87(1H，m)，8.22-8.24(1H，d)，8.41(1H，d)实施例B1761-(4-丁基苄基)-7-[(3-硝基苄基)氧基]异喹啉 按与实施例B148相同的方式，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.56(2H，m)，2.54(2H，t)，4.55(2H，s)，5.14(2H，s)，7.05(2H，d)，7.11(2H，d)，7.37-7.40(2H，m)，7.51(1H，d)，7.55-7.59(1H，m)，7.73-7.78(2H，m)，8.19-8.22(1H，m)，8.32-8.33(1H，m)，8.42(1H，d)实施例B1771-(4-丁基苄基)-7-(苯乙氧基)异喹啉 按与实施例B148相同的方式，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.26-1.36(2H，m)，1.49-1.57(2H，m)，2.52(2H，t)，3.10(2H，t)，4.18(2H，t)，4.56(2H，s)，7.04(2H，d)，7.16(2H，d)，7.26-7.28(4H，m)，7.33-7.35(3H，m)，7.48(1H，d)，7.70(1H，d)，8.38-8.39(1H，m)
实施例B1781-(4-丁基苄基)-7-(3-苯基丙氧基)异喹啉 按与实施例B148相同的方式，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.49-1.57(2H，m)，2.09-2.15(2H，m)，2.52(2H，t)，2.82(2H，t)，3.97(2H，t)，4.55(2H，s)，7.04(2H，d)，7.16(2H，d)，7.20-7.23(3H，m)，7.27-7.33(4H，m)，7.48(1H，d)，7.70(1H，d)，8.38(1H，d)实施例B1791-(4-丁基苄基)-7-(2-环己基乙氧基)异喹啉 按与实施例B148相同的方式，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，0.94-1.02(2H，m)，1.17-1.36(4H，m)，1.36-1.57(4H，m)，1.65-1.76(7H，m)，2.53(2H，t)，3.98(2H，t)，4.58(2H，s)，7.06(2H，d)，7.19(2H，d)，7.25-7.28(1H，m)，7.33(1H，d)，7.47(1H，d)，7.69(1H，d)，8.37(1H，d)实施例B1806-苯甲酰基-5，6-二氢[1，3]二氧戊环[4，5-g]异喹啉-5-腈 按与实施例B140相同的方式，通过处理[1，3]二氧戊环[4，5-g]异喹啉，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)5.94-5.96(1H，m)，6.03(1H，d)，6.04(1H，d)，6.47-6.54(2H，m)，6.70(1H，s)，6.83(1H，s)，7.45-7.49(2H，m)，7.54-7.62(3H，m)实施例B181
5-(4-丁基苄基)[1，3]二氧戊环[4，5-g]异喹啉 按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B180的化合物与实施例B1的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.28-1.37(2H，m)，1.51-1.57(2H，m)，2.54(2H，t)，4.50(2H，s)，6.05(2H，s)，7.05-7.07(3H，m)，7.16(2H，d)，7.38(7.40(2H，m)，8.35(1H，d)实施例B1822-苯甲酰基-6-溴-1，2-二氢-1-异喹啉腈 按与实施例B140相同的方式，通过处理6-溴异喹啉(其是根据J.Am.Chem.Soc.，183(1942)合成的)，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)6.01(1H，d)，6.53(1H，brs)，6.70(1H，brd)，7.24(1H，d)，7.33(1H，d)，7.47-7.51(3H，m)，7.56(3H，m)实施例B1836-溴-1-(4-丁基苄基)异喹啉 按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B182的化合物与实施例B1的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.58(2H，m)，2.53(2H，t)，4.60(2H，s)，7.06(2H，d)，7.15(2H，d)，7.46(1H，d)，7.59(1H，q)，7.98(1H，d)，8.02(1H，d)，8.51(1H，d)实施例B1842-苯甲酰基-5-溴-1，2-二氢-1-异喹啉腈与2-苯甲酰基-7-溴-1，2-二氢-1-异喹啉腈的混合物
按与实施例B140相同的方式，通过处理5-或7-溴异喹啉(其是根据J.Am.Chem.Soc.，61，183(1939)合成的)，得到标题化合物。所得化合物无需分离与纯化即可用于下列反应。
实施例B1857-溴-1-(4-丁基苄基)异喹啉 按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B184的化合物与实施例B1的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.28-1.37(2H，m)，1.51-1.58(2H，m)，2.55(2H，t)，4.58(2H，s)，7.09(2H，d)，7.18(2H，d)，7.51-7.53(1H，m)，7.69-7.70(2H，m)，8.33-8.34(1H，m)，8.52(1H，d)实施例B1865-苯甲酰基-4，5-二氢噻吩并[3，2-c]吡啶-4-腈 按与实施例B140相同的方式，通过处理噻吩并[3，2-c]吡啶(其是根据J.Heterocycl.Chem.，30，183(1993)合成的)，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)6.05(1H，d)，6.57(1H，brd)，6.66(1H，s)，7.07(1H，d)，7.32(1H，d)，7.46-7.50(2H，m)，7.54-7.62(3H，m)实施例B1874-(4-丁基苄基)噻吩并[3，2-c]吡啶 按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B186的化合物与实施例B1的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.27-1.37(2H，m)，1.51-1.59(2H，m)，2.54(2H，t)，4.47(2H，s)，7.07(2H，d)，7.19(2H，d)，7.42(1H，d)，7.47(1H，dd)，7.68(1H，d)，8.41(1H，d)实施例B1884-(4-甲氧基苄基)噻吩并[3，2-c]吡啶 按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B186的化合物与4-甲氧基苄基氯，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.75(3H，s)，4.44(2H，s)，6.79-6.82(2H，m)，7.19-7.22(2H，m)，7.43(1H，d)，7.46(1H，dd)，7.68(1H，d)，8.41(1H，d)实施例B1894-(噻吩并[3，2-c]吡啶-4-基甲基)苯基三氟甲磺酸酯 将三溴化硼的二氯甲烷溶液(1.0M，10ml，10mmol)滴加到冷却至0℃的实施例B188的化合物(510mg，2.0mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中，并将反应混合物在该温度下搅拌1.5小时。通过加入饱和的碳酸氢钠水溶液使该反应混合物呈弱碱性，用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。将所得剩余物溶解于吡啶，并将所得溶液冷却至0℃。向其中滴加三氟甲磺酸酐(0.34ml，2.1mmol)之后，将混合物在该温度下搅拌2小时，倒在冰上，用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(312mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.52(2H，s)，7.16-7.18(2H，m)，7.36(2H，m)，7.43-7.44(1H，m)，7.49(1H，d)，7.73(1H，d)，8.42(1H，d)实施例B190
4-(4-溴苄基)噻吩并[3，2-c]吡啶 按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B186的化合物与实施例B31的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.45(2H，s)，7.14-7.16(2H，m)，7.37-7.39(2H，m)，7.41-7.43(1H，m)，7.45(1H，d)，7.71(1H，d)，8.41(1H，d)实施例B1914-(4-溴-2-氟苄基)噻吩并[3，2-c]吡啶 按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B186的化合物与4-溴-2-氟苄基溴，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.46(2H，s)，7.11(1H，t)，7.15-7.18(1H，m)，7.22-7.25(1H，m)，7.47(1H，d)，7.49(1H，d)，7.71(1H，d)，8.41(1H，d)实施例B1924-{4-[4-(四氢-2H-2-吡喃氧基)-1-丁炔基]苄基}噻吩并[3，2-c]吡啶 按与实施例B42相同的方式，通过处理实施例B189的化合物与2-(3-丁炔氧基)四氢-2H-吡喃，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.40-1.90(6H，m)，2.69(2H，t)，3.45-3.65(2H，m)，3.78-3.95(2H，m)，4.48(2H，s)，4.66-4.69(1H，m)，7.18(2H，d)，7.27(2H，d)，7.41(1H，d)，7.44(1H，d)，7.70(1H，d)，8.41(1H，d)。
实施例B1934-[4-(噻吩并[3，2-c]吡啶-4-基甲基)苯基]-3-丁炔-1-醇
按与实施例B47相同的方式，通过处理实施例B192的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.67(2H，t)，3.79(2H，t)，4.50(2H，s)，7.20(2H，d)，7.32(2H，d)，7.41(1H，d)，7.44(1H，d)，7.71(1H，d)，8.42(1H，d)。
在NMR光谱中未观察到羟基的质子。
实施例B1946-苯甲酰基-6，7-二氢噻吩并[2，3-c]吡啶-7-腈 按与实施例B140相同的方式，通过处理噻吩并[2，3-c]吡啶(其是根据J.Heterocycl.Chem.，30，183(1993)合成的)，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)6.07(1H，d)，6.56(1H，brd)，6.75(1H，s)，6.97(1H，d)，7.37(1H，d)，7.46-7.51(2H，m)，7.54-7.64(3H，m)实施例B1957-(4-丁基苄基)噻吩并[2，3-c]吡啶 按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B194的化合物与实施例B1的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.28-1.37(2H，m)，1.51-1.59(2H，m)，2.55(2H，t)，4.40(2H，s)，7.09(2H，d)，7.28(2H，d)，7.34(1H，d)，7.57(1H，d)，7.62(1H，d)，8.47(1H，d)实施例B1967-(4-甲氧基苄基)噻吩并[2，3-c]吡啶
按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B194的化合物与4-甲氧基苄基氯，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.76(3H，s)，4.38(2H，s)，6.81-6.g3(2H，m)，7.28-7.30(2H，m)，7.35(1H，d)，7.57(1H，d)，7.62(1H，d)，8.47(1H，d)实施例B1974-(噻吩并[2，3-c]吡啶-7-基甲基)苯基三氟甲磺酸酯 按与实施例B1相同的方式89，通过处理实施例B196的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.44(2H，s)，7.17-7.19(2H，m)，7.38-7.40(1H，m)，7.44-7.46(2H，m)，7.61(1H，d)，7.65-7.67(1H，m)，8.47-8.49(1H，m)实施例B1987-(4-溴苄基)噻吩并[2，3-c]吡啶 按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B194的化合物与实施例B31的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.37(2H，s)，7.23-7.25(2H，m)，7.37(1H，d)，7.39-7.41(2H，m)，7.59(1H，d)，7.63-7.65(1H，m)，8.47(1H，d)实施例B1997-(4-溴-2-氟苄基)噻吩并[2，3-c]吡啶
按与实施例B2相同的方式，通过处理实施例B194的化合物与4-溴-2-氟苄基溴，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.40-4.41(2H，m)，7.12-7.20(2H，m)，7.23-7.26(1H，m)，7.37-7.39(1H，m)，7.59-7.62(1H，m)，7.65-7.67(1H，m)，8.45-8.47(1H，m)实施例B2007-{4-[4-(四氢-2H-2-吡喃氧基)-1-丁炔基]苄基}噻吩并[2，3-c]吡啶 按与实施例B42相同的方式通过处理实施例B197的化合物与2-(3-丁炔氧基)四氢-2H-吡喃，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.50-1.90(6H，m)，2.69(2H，t)，3.49-3.54(1H，m)，3.58-3.65(1H，m)，3.85-3.95(2H，m)，4.41(2H，s)，4.68(1H，t)，7.26-7.31(4H，m)，7.36(1H，d)，7.58(1H，d)，7.63(1H，d)，8.47(1H，d)。
实施例B2014-[4-(噻吩并[2，3-c]吡啶-7-基甲基)苯基]-3-丁炔-1-醇 按与实施例B47相同的方式，通过处理实施例B200的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.99(1H，brs)，2.67(2H，t)，3.79(2H，t)，4.42(2H，s)，7.27-7.34(4H，m)，7.36(1H，d)，7.59(1H，d)，7.64(1H，d)，8.47(1H，d)。
实施例B2022-氯-3-(甲氧基甲氧基)吡啶 在氮气氛下，将氢化钠(66％，633mg，17.4mmol)加到冰冷却的2-氯-3-羟基吡啶(2.05g，15.8mmol)的四氢呋喃(30ml)溶液中，并将反应混合物在该温度下搅拌15分钟。加入氯甲基甲基醚(1.32ml，17.4mmol)，并将所得反应混合物在该温度下搅拌30分钟，然后再在室温下搅拌2小时。加水之后，将反应混合物用乙酸乙酯萃取，用饱和盐水洗涤，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(2.44g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.53(3H，s)，5.28(2H，s)，7.19(1H，dd)，7.49(1H，dd)，8.06(1H，dd)实施例B2032-氯-4-碘-3-(甲氧基甲氧基)吡啶 在氮气氛下，将实施例B202的化合物(1.40g，8.06mmol)的乙醚(8ml)溶液滴加到冷却至-78℃的1.51M叔丁基锂-正戊烷溶液(8.01ml，12.1mmol)的乙醚(15ml)溶液中，并将反应混合物在该温度下搅拌15分钟。加碘(3.07g，12.1mmol)之后，将反应混合物逐渐温暖至室温。进一步加入三氟甲磺酸钠溶液，并分出乙醚层，用饱和盐水洗涤，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(356mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.73(3H，s)，5.22(2H，s)，7.69(1H，d)，7.80(1H，d)实施例B2047-氯呋喃并[2，3-c]吡啶 将三甲基甲硅烷基乙炔(28.3μl，0.201mmol)和三乙胺(59.8μl，0.429mmol)加到实施例B203的化合物(36.6mg，0.143mmol)，四(三苯基膦)合钯(16.5mg，0.0143mmol)，及碘化铜(I)(2.7mg，0.014mmol)的二甲基甲酰胺(1.5ml)溶液中，并将该混合物在50℃下搅拌4小时。待将该混合物冷却至室温之后，向其中加水，并用乙酸乙酯萃取所得的混合物，用饱和盐水洗涤，然后减压浓缩。将剩余物溶解于甲醇(5ml)，向其中加入碳酸钾(100mg，0.724mmol)，并将所的混合物在室温下搅拌1小时。加水之后，用乙醚萃取该混合物，用饱和盐水洗涤，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(5.5mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)6.89(1H，d)，7.51(1H，d)，7.83(1H，d)，8.21(1H，d)实施例B2054-丁基苄基氯化镁 通过加热回流引发实施例B1的化合物(1.04g，5.69mmol)，镁(761mg，31.3mmol)，及催化剂量的1，2-二溴乙烷的乙醚(11ml)混合溶液。移除热源之后，以使该反应混合物保持温和回流的方式向其中滴加实施例B1的化合物(4.16g，22.8mmol)的乙醚(60ml)溶液，并将该混合物加热回流30分钟。将混合物冷却至室温，得到标题化合物，其为0.4M的乙醚溶液。将该溶液本身用于下列反应。
实施例B2067-(4-丁基苄基)呋喃并[2，3-c]吡啶 将实施例B205的化合物(300μl，0.1mmol)加到实施例B204的化合物(5.0mg，0.033mmol)与[1，1′-双(二苯基膦)二茂铁]二氯合镍(II)(4.5mg，0.0065mmol)的四氢呋喃(1ml)溶液中，并将该混合物在50℃下搅拌1小时。待将该混合物冷却至室温之后，向其中加入乙酸乙酯。将所得混合物用饱和的氯化铵水溶液及饱和的盐水洗涤，然后减压浓缩。剩余物经NH-硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(2.9mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.29-1.35(2H，m)，1.50-1.58(2H，m)，2.54(2H，t)，4.40(2H，s)，6.78(1H，d)，7.08(2H，d)，7.30(2H，d)，7.40(1H，d)，7.72(1H，d)，8.34(1H，d)实施例B2077-(4-丁基苄基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶 在冰冷却下，将实施例B205的化合物(800μl，0.3mmol)加到1-氯吡咯并吡啶(19.4mg，0.127mmol)(其是根据H07-165，708A方法，由2-氯-3-氨基吡啶合成的)，及二氯(二苯基膦丙烷)合镍(6.9mg，0.013mmol)的四氢呋喃(1ml)溶液中，并将该混合物在加热回流下搅拌4小时。待将其冷却至室温之后，向其中加入乙酸乙酯。将所得混合物用饱和的氯化铵水溶液及饱和的盐水洗涤，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(7.1mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.91(3H，t)，1.31-1.37(2H，m)，1.55-1.59(2H，m)，2.58(2H，t)，4.44(2H，s)，6.50(1H，d)，7.12(2H，d)，7.18(1H，d)，7.22(2H，d)，7.45(1H，d)，8.21(1H，d)在NMR光谱中未观察到NH质子。
实施例B2084-(4-丁基苄基)-1-咪唑并[4，5-c]吡啶 将实施例B205的化合物(3.45ml，1.38mmol)加到1-氯咪唑并吡啶(88.6mg，0.577mmol)(其是根据J.Heterocycl.Chem.，2，196(1965)中所述的方法由4-氨基-2-氯吡啶合成的)，及二氯(二苯基膦丙烷)合镍(31.3mg，0.0577mmol)的四氢呋喃(2ml)溶液中，并将该混合物在加热回流下搅拌2小时。待将其冷却至室温之后，向其中加入乙酸乙酯。所的混合物通过硅胶过滤并减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(64.2mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.86(3H，t)，1.23-1.32(2H，m)，1.44-1.52(2H，m)，2.47(2H，t)，4.56(2H，s)，7.02(2H，d)，7.19(2H，d)，7.34(1H，d)，8.00(1H，s)，8.25-8.27(1H，m)在NMR光谱中未观察到NH质子实施例B2094-溴-1-异喹啉醇 将溴(1.78ml，34.5mmol)加到冰冷却的1-羟基异喹啉(5.01g，34.5mmol)的乙酸(50ml)溶液中，并将该混合物在室温下搅拌2小时。加入水，乙酸乙酯，及四氢呋喃，并用滤纸过滤所得的反应混合物。有机层用饱和盐水洗涤并减压浓缩。剩余物经乙酸乙酯与己烷的重结晶，得到标题化合物(6.19g)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)7.56(1H，s)，7.59-7.63(1H，m)，7.76-7.78(1H，m)，7.84-7.89(1H，m)，8.23-8.26(1H，m)，11.59(1H，br s)实施例B2101，4-二溴异喹啉 将实施例B209的化合物(1.40g，8.06mmol)与三溴化磷(6ml)的混合溶液在150℃下搅拌1小时，然后再加热回流1小时。将反应混合物冷却至室温，倒在冰上，然后温暖至室温。加入乙酸乙酯，并将所的混合物用饱和盐水洗涤且减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(845mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)7.76-7.80(1H，m)，7.86-7.90(1H，m)，8.19(1H，d)，8.31-8.34(1H，m)，8.48(1H，s)实施例B2114-溴-1-(4-丁基苄基)异喹啉 将实施例B205的化合物(2.5ml，1mmol)加到实施例B210的化合物(200mg，0.697mmol)与[1，1′-双(二苯基膦)二茂铁]二氯合镍(II)(75.6mg，0.139mmol)的四氢呋喃(2ml)溶液中，并将该混合物在室温下搅拌30分钟。加入乙酸乙酯之后，将所得混合物依次用饱和的氯化铵水溶液，饱和的碳酸氢钠水溶液，及饱和的盐水洗涤，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(98mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.29-1.34(2H，m)，1.51-1.60(2H，m)，2.53(2H，t)，4.59(2H，s)，7.06(2H，d)，7.16(2H，d)，7.57-7.61(1H，m)，7.73-7.77(1H，m)，8.15-8.19(2H，m)，8.69(1H，s)实施例B2121-(4-丁基苄基)-5，6，7，8-四氢异喹啉 将实施例B211的化合物(13.0mg，0.0367mmol)溶解于乙酸乙酯与甲醇的混合溶液中(1∶1，1ml)，加入10％的钯-碳(含50％的水，13mg)，并将该混合物在大气压大小的氢气氛下于室温搅拌12小时。待用氮气吹洗反应体系之后，通过硅藻土滤除催化剂。将所得滤液减压浓缩，得到标题化合物(8.8mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.28-1.38(2H，m)，1.52-1.59(2H，m)，1.74-1.82(4H，m)，2.55(2H，t)，2.66(2H，t)，2.81(2H，t)，4.26(2H，s)，7.07-7.15(5H，m)，8.32(1H，d)实施例B2131-[2-(苯基)苄基]异喹啉 按与实施例B2相同的方式，通过处理代替正丁基苄基氯的2-苯基苄基溴，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.62(2H，s)，7.05(1H，d)，7.16(1H，dd)，7.22-7.50(8H，m)，7.52(1H，d)，7.58(1H，dd)，7.65(1H，d)，7.76(1H，d)，8.47(1H，d)。
实施例B2141-[4-氟-2-(三氟甲基)苄基]异喹啉 按与实施例B2相同的方式，通过处理代替正丁基苄基氯的4-氟-2-(三氟甲基)苄基，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.83(2H，s)，6.87(1H，dd)，7.01(1H，ddd)，7.43(1H，dd)，7.54(1H，dd)，7.61(1H，d)，7.67(1H，dd)，7.85(1H，d)，7.96(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B2151，3-苯并二氧戊环-4-基-(1-异喹啉基)甲醇 按与实施例B82相同的方式，通过处理2，3-亚甲二氧基苯甲醛，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)5.97-5.99(1H，m)，6.09(1H，brs)，6.20-6.40(1H，m)，6.54-6.60(2H，m)，6.65-6.70(2H，m)，7.52(1H，dd)，7.63(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.84(1H，d)，8.04(1H，d)，8.53(1H，d)。
实施例B2161，3-苯并二氧戊环-4-基-(1-异喹啉基)甲基乙酸酯 按与实施例B38相同的方式，通过处理实施例B215的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.23(3H，s)，5.98-6.02(2H，m)，6.74-6.79(1H，m)，6.90-6.93(1H，m)，7.15-7.19(1H，m)，7.23-7.28(1H，m)，7.58(1H，dd)，7.60(1H，d)，7.66(1H，dd)，7.83(1H，d)，8.28(1H，d)，8.57(1H，d)。
实施例B2171-(1，3-苯并二氧戊环-4-基甲基)异喹啉 按与实施例B39相同的方式，通过处理实施例B216的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.62(2H，s)，6.02(2H，s)，6.64-6.70(3H，m)，7.57(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.66(1H，dd)，7.83(1H，d)，8.23(1H，d)，8.50(1H，d)。
实施例B2181-(1-萘甲基)异喹啉 按与实施例B2相同的方式，通过处理代替正丁基苄基氯的1-(氯甲基)萘，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)5.13(2H，s)，6.96(1H，d)，7.29(1H，d)，7.45-7.67(5H，m)，7.72(1H，d)，7.84-7.90(2H，m)，8.08(1H，d)，8.26(1H，d)，8.52(1H，d)。
实施例B2193-溴苯基丁酸酯 将正丁酰氯(7.25ml)加到冰冷却的3-溴苯酚(10.0g)的吡啶(50ml)溶液中，并将反应混合物在该温度下搅拌3小时，然后再在室温下搅拌3.5小时。加冰之后，将反应混合物用乙酸乙酯萃取，用1N盐酸和水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(12.77g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.04(3H，t)，1.72-1.82(2H，m)，2.54(2H，t)，7.04(1H，dd)，7.22-7.29(2H，m)，7.36(1H，d)。
实施例B2201-(4-溴-2-羟基苯基)-1-丁酮 在氮气氛下，将三氯化铝(10.51g)加到实施例B219的化合物(12.77g)的氯苯(70ml)溶液中，并将该反应混合物在加热回流下搅拌9小时。待反应混合物冷却至室温之后，向其中加冰。所得混合物用乙酸乙酯萃取，用水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。如此得到的化合物无需进一步纯化即可用于下面的反应。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.91(3H，t)，1.53-1.65(2H，m)，3.00(2H，t)，7.02(1H，dd)，7.19(1H，d)，7.78(1H，d)，12.50(1H，s)。
实施例B2211-(4-溴-2-甲氧基苯基)-1-丁酮 将碳酸钾(9.07g)和碘甲烷(3.92ml)加到实施例B220的化合物(13.30g)的丙酮(75ml)溶液中，并将该反应混合物在加热回流下搅拌4小时。用硅藻土过滤反应混合物，加入乙醚以通过过滤除去不溶物，并将滤液减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(9.52g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.95(3H，t)，1.64-1.74(2H，m)，2.91(2H，t)，3.90(3H，s)，7.10(1H，d)，7.14(1H，dd)，7.54(1H，d)。
实施例B2224-溴-1-丁基-2-甲氧基苯 按与实施例B3相同的方式，通过处理实施例B221的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.92(3H，t)，1.29-1.39(2H，m)，1.48-1.56(2H，m)，2.54(2H，t)，3.81(3H，s)，6.95(1H，s)，6.96-7.02(2H，m)。
实施例B223(4-丁基-3-甲氧基苯基)(1-异喹啉基)酮 按与实施例B36相同的方式，通过处理实施例B222的化合物，得到包含标题化合物的混合物。
该混合物无需分离与纯化即可用于下面的反应。
实施例B224(4-丁基-3-甲氧基苯基)(1-异喹啉基)甲醇 按与实施例B37相同的方式，通过处理实施例B223的化合物，得到包含标题化合物的混合物。
该混合物无需分离与纯化即可用于下面的反应。
实施例B225(4-丁基-3-甲氧基苯基)(1-异喹啉基)甲基乙酸酯 按与实施例B38相同的方式，通过处理实施例B224的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.24-1.38(2H，m)，1.46-1.60(2H，m)，2.24(3H，s)，2.54(2H，t)，3.76(3H，s)，6.97(1H，s)，6.98(1H，d)，7.06(1H，d)，7.53-7.67(4H，m)，7.83(1H，d)，8.26(1H，d)，8.58(1H，d)。
实施例B226
1-(4-丁基-3-甲氧基苄基)异喹啉 按与实施例B39相同的方式，通过处理实施例B225的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.38(2H，t)，1.45-1.54(2H，t)，2.52(2H，t)，3.72(3H，s)，4.63(2H，s)，6.78(1H，d)，6.79(1H，s)，6.99(1H，d)，7.53(1H，dd)，7.55(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.80(1H，d)，8.19(1H，d)，8.49(1H，d)。
实施例B2272-丁基-5-(1-异喹啉基甲基)苯酚 按与实施例B40相同的方式，通过处理实施例B226的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.91(3H，t)，1.30-1.40(2H，m)，1.52-1.65(2H，m)，2.55(2H，t)，4.55(2H，s)，6.46(1H，brs)，6.85(1H，d)，7.03(1H，d)，7.32-7.40(1H，m)，7.55(1H，dd)，7.68(1H，dd)，7.81(1H，d)，7.94-8.05(1H，m)，8.14(1H，d)。
在NMR光谱中未发现酚羟基的质子。
实施例B2282-溴-3-(甲氧基甲氧基)吡啶 按与实施例B202相同的方式，利用2-溴-3-羟基吡啶合成标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.53(3H，s)，5.29(2H，s)，7.19-7.23(1H，m)，7.42-7.45(1H，m)，8.04-8.06(1H，m)实施例B229
2-(4-丁基苄基)-3-(甲氧基甲氧基)吡啶 将实施例B205的化合物(7ml，3mmol)加到冰冷却的实施例B228的化合物(524mg，2.40mmol)与二氯(二苯基膦丙烷)合镍(65.0mg，0.120mmol)的四氢呋喃(10ml)溶液中，并将该混合物在加热回流下搅拌5小时。待将其冷却至室温之后，加入乙酸乙酯。所得混合物依次用饱和的氯化铵水溶液，饱和的碳酸氢钠水溶液，及饱和的盐水洗涤，然后减压浓缩。剩余物通过NH-硅胶过滤。减压浓缩之后，将剩余物溶解于甲醇(15ml)，加入三乙胺(500μl，3.59mmol)和10％钯-碳(含水50％，50mg)，并在大气压大小的氢气氛下将所得混合物于室温搅拌3小时。待用氮气吹洗反应体系之后，通过硅藻土滤除催化剂，并将滤液减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(280mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.28-1.34(2H，m)，1.52-1.58(2H，m)，2.53(2H，t)，3.33(3H，s)，4.16(2H，s)，5.16(2H，s)，7.04-7.10(3H，m)，7.20(2H，d)，7.33-7.35(1H，m)，8.19-8.20(1H，m)实施例B2302-(4-丁基苄基)-3-吡啶醇 将三氟乙酸(1ml)加到实施例B229的化合物(256mg，0.849mmol)的二氯甲烷(5ml)溶液中，并将该反应混合物在室温下搅拌过夜。加入饱和的碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯之后，将反应混合物用饱和盐水洗涤并减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(182mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.28-1.37(2H，m)，1.51-1.58(2H，m)，2.54(2H，t)，4.20(2H，s)，7.02-7.08(4H，m)，7.22(2H，d)，8.08-8.09(1H，m)在NMR光谱中未观察到酚羟基的质子。
实施例B2312-(4-丁基苄基)-3-甲氧基吡啶 将碳酸钾(33.0mg，0.239mmol)和碘甲烷(14.9μl，0.239mmol)加到实施例B230的化合物(19.2mg，0.0796mmol)的丙酮(1ml)溶液中，并将该混合物在室温下搅拌3小时。加入乙酸乙酯之后，将反应混合物用饱和盐水洗涤并减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(1.47mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.32-1.34(2H，m)，1.53-1.57(2H，m)，2.54(2H，t)，3.82(3H，s)，4.14(2H，s)，7.06(2H，d)，7.10-7.11(2H，m)，7.21(2H，d)，8.12-8.14(1H，m)实施例B2322-(4-丁基苄基)-3-氯吡啶 将实施例B205的化合物(12ml，5mmol)加到冰冷却的2，3-二氯吡啶(525mg，3.55mmol)与二氯(二苯基膦丙烷)合镍(96.2mg，0.178mmol)的四氢呋喃(4ml)混合溶液中，并将该混合物在室温下搅拌1小时。加入乙酸乙酯之后，将反应混合物依次用饱和的氯化铵水溶液，饱和的碳酸氢钠水溶液，及饱和的盐水洗涤，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(199mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.91(3H，t)，1.29-1.38(2H，m)，1.52-1.60(2H，m)，2.56(2H，t)，4.28(2H，s)，7.08-7.13(3H，m)，7.21(2H，d)，7.64(1H，dd)，8.46(1H，dd)实施例B2332-(4-丁基苄基)-3-乙基吡啶
将乙基氯化镁(0.97M，102μl，0.993mmol)加到实施例B232的化合物(12.9mg，0.0496mmol)与二氯(二苯基膦二茂铁)合镍(3.4mg，0.0050mmol)的四氢呋喃(1ml)混合溶液中。将反应混合物在50℃下搅拌1小时，然后再加热回流2小时。待将反应混合物冷却至室温之后，向其中加入乙酸乙酯。将反应混合物用饱和的氯化铵水溶液及饱和的盐水洗涤，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(3.29mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90-0.93(6H，m)，1.30-1.37(2H，m)，1.54-1.59(2H，m)，2.55-2.59(4H，m)，4.12(2H，s)，7.05-7.18(5H，m)，7.55-7.59(1H，m)，8.53-8.55(1H，m)实施例B234N-(2-溴-3-吡啶基)氨基甲酸叔丁酯 将N-溴琥珀酰亚胺(7.51g，42.2mmol)加到冰冷却的3-氨基吡啶(3.97g，42.2mmol)的二甲基甲酰胺(25ml)混合溶液中，并将反应混合物在该温度下搅拌30分钟。加入乙酸乙酯之后，将反应混合物用饱和盐水洗涤并减压浓缩。将剩余物的二氯甲烷(20ml)溶液在冰上冷却，然后向该溶液中加入三乙胺(3.74ml，26.8mmol)，催化剂量的二甲基氨基吡啶，及焦碳酸二叔丁酯(3.08ml，13.4mmol)，并将该混合物在室温下搅拌过夜。减压浓缩之后，剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(344mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.55(9H，s)，7.03(1H，brs)，7.25(1H，dd)，8.03(1H，dd)，8.46(1H，d)实施例B2352-溴-3-(N-叔丁氧基羰基-N-甲基)氨基吡啶 将碘甲烷(157μl，2.52mmol)与66％的氢化钠(91.6mg，2.52mmol)加到冰冷却的实施例B234的化合物(344mg，1.26mmol)的二甲基甲酰胺(5ml)溶液中，并将反应混合物在该温度下搅拌40分钟。加入乙酸乙酯之后，反应混合物用饱和盐水洗涤并通过硅胶过滤。将有机层减压浓缩，得到标题化合物(356mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.36(9H，s)，3.17(3H，s)，7.30(1H，dd)，7.55(1H，d)，8.30(1H，dd)实施例B236N-[2-(4-丁基苄基)-3-吡啶基]-N-甲基胺 向按与实施例B211相同的方式，通过将4-丁基苄基引入实施例B235的化合物(62.8mg，0.219mmol)中而得到的化合物的二氯甲烷溶液中(2ml)加入三氟乙酸(2ml)。将该混合物在室温下搅拌1小时，然后将其滴加到碳酸氢钠水溶液中。加入乙酸乙酯之后，将混合物用饱和盐水洗涤并减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(29.7mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.91(3H，t)，1.29-1.38(2H，m)，1.53-1.60(2H，m)，2.56(2H，t)，2.72(3H，s)，3.63(1H，br s)，4.09(2H，s)，6.86(1H，d)，7.08-7.12(5H，m)，7.98(1H，dd)实施例B237N-[2-(4-丁基苄基)-3-吡啶基]-N，N-二甲基胺 将乙酸(12.1μl，0.211mmol)，37％福尔马林(15.8μl，0.211mmol)，及三乙酰氧基硼氢化钠(44.7mg，0.211mmol)加到冰冷却的实施例B236的化合物(26.8mg，0.105mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液中，并将该混合物在室温下搅拌30分钟。加入乙酸乙酯之后，将混合物用饱和的碳酸氢钠水溶液及饱和的盐水洗涤并减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(23.3mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.91(3H，t)，1.30-1.36(2H，m)，1.52-1.59(2H，m)，2.55(2H，t)，2.67(6H，s)，4.24(2H，s)，7.06(2H，d)，7.10(1H，dd)，7.18(2H，d)，7.40(1H，dd)，8.27(1H，dd)实施例B2382-(4-丁基苄基)-4-甲氧基吡啶 按与实施例B211相同的方式，利用2-氯-4-甲氧基吡啶，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.91(3H，t)，1.31-1.37(2H，m)，1.53-1.59(2H，m)，2.57(2H，t)，3.78(3H，s)，4.06(2H，s)，6.61-6.65(2H，m)，7.11(2H，d)，7.17(2H，d)，8.36(1H，d)实施例B2392-(4-丁基苄基)-4-氯吡啶 将三氯氧磷(57.0μl，0.612mmol)加到冰冷却的实施例B238的化合物(52.0mg，0.204mmol)的二甲基甲酰胺(1ml)溶液中，并将该反应混合物在100℃下搅拌8小时。将反应混合物冷却，倒在冰上，并温暖至室温。加入乙酸乙酯之后，将混合物用饱和的碳酸氢钠水溶液及饱和的盐水洗涤，然后减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(2.29mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.92(3H，t)，1.31-1.38(2H，m)，1.53-1.61(2H，m)，2.59(2H，t)，4.10(2H，s)，7.12-.18(6H，m)，8.44(1H，d)实施例B2402-氯-3-甲氧基吡啶 按与实施例B231相同的方式，利用2-氯-3-羟基吡啶，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.93(3H，s)，7.21-7.22(2H，m)，7.99-8.01(1H，m)实施例B2412-氯-3，4-二甲氧基吡啶 在氮气氛下，将二异丙基胺(84.0μl，0.599mmol)与实施例B240的化合物(860mg，5.99mmol)的四氢呋喃(4ml)溶液加到冷却至-78℃的1.06M苯基锂环戊烷-乙醚溶液的四氢呋喃(11ml)溶液中。将该反应混合物在-40℃下搅拌1小时，然后再在-18℃下搅拌20分钟。再次将反应混合物冷却至-78℃，向其中滴加三甲氧基硼酸酯(2.04ml，18.0mmol)，并将所得的混合物在0℃下搅拌20分钟。在该温度下，依次加入氨水(29％，30ml)，氯化铵(4.5g)，及过氧化氢水溶液(30％，12ml)，并将该混合物在室温下搅拌2小时。加入饱和的硫代硫酸钠，乙酸和乙酸乙酯，并将混合物用饱和盐水洗涤。通过硅胶过滤得到乙酸乙酯层，并减压浓缩。所得剩余物按与实施例B231相同的方式进行处理，得到标题化合物(31.3mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.89(3H，s)，3.94(3H，s)，6.82(1H，d)，8.05(1H，d)实施例B2422-(4-丁基苄基)-3，4-二甲氧基吡啶 按与实施例B206相同的方式，利用实施例B241的化合物，得到标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.26-1.35(2H，m)，1.53-1.57(2H，m)，2.54(2H，t)，3.70(3H，s)，3.89(3H，s)，4.12(2H，s)，6.72(1H，d)，7.06(2H，d)，7.21(2H，d)，8.20(1H，d)实施例B2432，4-二(4-丁基苄基)-3-甲氧基吡啶
在氮气氛下将实施例B240的化合物(436mg，3.04mmol)的乙醚(2ml)溶液加到冷却至-78℃的1.43M叔丁基锂正戊烷溶液(2.76ml，3.95mmol)的乙醚(5ml)溶液中，并将反应混合物在该温度下搅拌30分钟。进一步加入四甲基乙二胺(688μl，4.56mmol)与六氯乙烷(719mg，3.04mmol)的乙醚(3ml)溶液，并将反应混合物在该温度下搅拌1小时。逐渐温暖至室温之后，加入乙酸乙酯，并将混合物用饱和盐水洗涤。减压浓缩经硅胶过滤得到的乙酸乙酯层。所得剩余物按与实施例B206相同的方式进行处理，得到标题化合物(10.1mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89-0.94(6H，m)，1.31-1.37(4H，m)，1.52-1.62(4H，m)，2.53-2.59(4H，m)，3.74(3H，s)，4.07(2H，s)，4.13(2H，s)，6.84(1H，d)，6.98(1H，d)，7.04-7.22(8H，m)实施例B2442-(4-溴-2-氟苄基)-3-(甲氧基甲氧基)吡啶 在氮气氛下，将实施例B228的化合物(422mg，1.94mmol)的四氢呋喃(3ml)溶液加到冷却至-78℃的2.47M正丁基锂己烷溶液(862μl，2.13mmol)的四氢呋喃(3ml)溶液中，并将反应混合物在该温度下搅拌1小时。加入溴化铜(I)(139mg，0.968mmol)之后，将反应混合物在0℃下搅拌1小时，并再次冷却至-78℃。下一步，加入4-溴-2-氟苄基溴(259mg，0.968mmol)，将所得混合物在0℃下搅拌1小时。进一步加入四甲基乙二胺(584μl，3.88mmol)，并将所得反应混合物在该温度下搅拌1小时。向反应混合物中加入乙醚氨水溶液，有机层用饱和盐水洗涤并减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(81.0mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.38(3H，s)，4.17(2H，s)，5.18(2H，s)，7.04(1H，t)，7.11-7.22(3H，m)，7.38(1H，dd)，8.19(1H，dd)实施例B2452-(4-溴-2-氟苄基)-3-吡啶醇 将三氟乙酸(1ml)加到实施例B244的化合物(134mg，0.411mmol)的二氯甲烷(4ml)溶液中，并将该反应混合物在室温下搅拌过夜。该混合物用饱和的碳酸氢钠水溶液中和之后，加入乙酸乙酯。乙酸乙酯层用饱和盐水洗涤并减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(97.5mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.17(2H，s)，7.10-7.24(5H，m)，8.15(1H，t)在NMR光谱中未发现酚羟基的质子。
实施例B2462-(4-溴-2-氟苄基)-3-甲氧基吡啶 将碳酸钾(38.7mg，0.280mmol)和碘甲烷(10.5μl，0.168mmol)加到实施例B245的化合物(15.8mg，0.0560mmol)的二甲基甲酰胺(1ml)溶液中，并将该混合物在室温下搅拌2小时。加入乙酸乙酯之后，将反应混合物用饱和的盐水洗涤并减压浓缩。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到标题化合物(14.0mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.82(3H，s)，4.15(2H，s)，7.03(1H，t)，7.12-7.22(4H，m)，8.13(1H，dd)实施例B的系列化合物是按与实施例B246相同的方式合成的，并通过LC-MS[洗脱液含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液含0.1％三氟乙酸的水溶液＝1∶99～100∶0/20-分钟循环，流速20ml/分钟，色谱柱YMC CombiprepODS-AM，20mm(Φ)×50mm(长)]进行纯化。
实施例B247
2-(4-溴-2-氟苄基)-3-乙氧基吡啶 MS m/z(ESIMH+)310.0实施例B2482-(4-溴-2-氟苄基)-3-丙氧基吡啶 MS m/z(ESIMH+)324.0实施例B2492-(4-溴-2-氟苄基)-3-丁氧基吡啶 MS m/z(ESIMH+)338.1实施例B2502-(4-溴-2-氟苄基)-3-(戊基氧基)吡啶 MS m/z(ESIMH+)352.1实施例B2512-(4-溴-2-氟苄基)-3-(己基氧基)吡啶
MH+S m/z(ESIMH+)366.0实施例B2522-(4-溴-2-氟苄基)-3-(2-氟乙氧基)吡啶 MS m/z(ESIMH+)328.0实施例B2532-(4-溴-2-氟苄基)-3-(3-氟丙氧基)吡啶 MS m/z(ESIMH+)342.0实施例B2542-(4-溴-2-氟苄基)-3-异丙氧基吡啶 MS m/z(ESIMH+)324.0实施例B2552-(4-溴-2-氟苄基)-3-(2，2，2-三氟乙氧基)吡啶 MS m/z(ESIMH+)364.0实施例B2562-(4-溴-2-氟苄基)-3-(3，3，3-三氟丙氧基)吡啶

MS m/z(ESIMH+)378.0实施例B257利用实施例A2的酿酒酵母报告系统评价化合物。与化合物未经处理时所获得的浓度相比，将细胞壁级分中头孢菌素酶活性变成50％或更小时的浓度定义为IC50值。有代表性的化合物的效果示于表1中。
表1

工业实用性本发明公开了编码参与GPI-锚定蛋白质到细胞壁之转运过程的蛋白质的基因。此外，本发明还公开了筛选抑制这些蛋白质活性的化合物的方法，本发明还公开了抑制这种活性的有代表性的化合物。
利用这些新的化合物，本发明表明可以提供具有新的抑制GPI-锚定蛋白质到细胞壁之转运过程机制的抗真菌剂。
序列表<110>卫材株式会社(Eisai Co.，Ltd.)<120>真菌细胞壁合成基因<130>E1-A0101Y1P<150>JP 2000-206968<151>2000-07-07<150>JP 2000-316027<151>2000-10-17<160>63<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1497<212>DNA<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1494)<400>1atg gca aca gta cat cag aag aat atg tcg act tta aaa cag aga aaa 48Met Ala Thr Val His Gln Lys Asn Met Ser Thr Leu Lys Gln Arg Lys1 5 10 15gag gac ttt gtg aca ggg ctc aat ggc ggt tct ata aca gaa att aac 96Glu Asp Phe Val Thr Gly Leu Asn Gly Gly Ser Ile Thr Glu Ile Asn20 25 30gca gtg aca tca att gct ttg gta act tac ata tca tgg aac tta ttg 144Ala Val Thr Ser Ile Ala Leu Val Thr Tyr Ile Ser Trp Asn Leu Leu35 40 45aaa aat tcc aac ctt atg cct cct ggc att tcc agc gtg caa tac ata 192Lys Asn Ser Asn Leu Met Pro Pro Gly Ile Ser Ser Val Gln Tyr Ile50 55 60att gat ttt gca ttg aac tgg gtt gct ttg ctt cta tct att act att 240Ile Asp Phe Ala Leu Asn Trp Val Ala Leu Leu Leu Ser Ile Thr Ile65 70 75 80tat gct agt gaa cca tac ctt cta aac acg cta ata ctg tta cct tgt 288
Tyr Ala Ser Glu Pro Tyr Leu Leu Asn Thr Leu Ile Leu Leu Pro Cys85 90 95ttg ctc gca ttc ata tat gga aaa ttt act agc tcg agt aaa cct tct336Leu Leu Ala Phe Ile Tyr Gly Lys Phe Thr Ser Ser Ser Lys Pro Ser100 105 110aat cca ata tac aat aaa aaa aaa atg att aca cag cgg ttc caa cta384Asn Pro Ile Tyr Asn Lys Lys Lys Met Ile Thr Gln Arg Phe Gln Leu115 120 125gaa aaa aag ccg tat att act gcg tat cgt ggt ggg atg ctt att ctg432Glu Lys Lys Pro Tyr Ile Thr Ala Tyr Arg Gly Gly Met Leu Ile Leu130 135 140act gct att gcc atc ttg gct gta gat ttt cca att ttc cca agg agg480Thr Ala Ile Ala Ile Leu Ala Val Asp Phe Pro Ile Phe Pro Arg Arg145 150 155 160ttt gcc aag gtg gaa act tgg ggg aca tcc ctg atg gat ctt ggt gta528Phe Ala Lys Val Glu Thr Trp Gly Thr Ser Leu Met Asp Leu Gly Val165 170 175gga tca ttc gtt ttc agt aac ggt att gtt tct tct agg gca ctg ttg576Gly Ser Phe Val Phe Ser Asn Gly Ile Val Ser Ser Arg Ala Leu Leu180 185 190aaa aac cta agc ttg aag agt aaa ccc agc ttc tta aaa aat gca ttt624Lys Asn Leu Ser Leu Lys Ser Lys Pro Ser Phe Leu Lys Asn Ala Phe195 200 205aat gcc tta aaa tca gga gga act cta ttg ttc cta gga ttg ctg agg672Asn Ala Leu Lys Ser Gly Gly Thr Leu Leu Phe Leu Gly Leu Leu Arg210 215 220ttg ttt ttt gta aaa aat ttg gaa tat caa gaa cat gtc aca gaa tat720Leu Phe Phe Val Lys Asn Leu Glu Tyr Gln Glu His Val Thr Glu Tyr225 230 235 240ggg gtt cat tgg aat ttt ttt atc acc cta tca ttg ttg cca ctt gta768Gly Val His Trp Asn Phe Phe Ile Thr Leu Ser Leu Leu Pro Leu Val245 250 255ttg acc ttt att gat ccc gtc aca aga atg gtt cca cgc tgc tca att816Leu Thr Phe Ile Asp Pro Val Thr Arg Met Val Pro Arg Cys Ser Ile260 265 270gca ata ttc att tca tgc att tat gaa tgg cta ctt tta aag gac gat864Ala Ile Phe Ile Ser Cys Ile Tyr Glu Trp Leu Leu Leu Lys Asp Asp275 280 285cgc act tta aac ttt tta att ttg gct gat aga aat tgt ttc ttc agt912Arg Thr Leu Asn Phe Leu Ile Leu Ala Asp Arg Asn Cys Phe Phe Ser290 295 300gct aat aga gaa ggc atc ttc tca ttt cta ggt tat tgc tcg att ttt960Ala Asn Arg Glu Gly Ile Phe Ser Phe Leu Gly Tyr Cys Ser Ile Phe305 310 315 320
ctt tgg ggc caa aac acg gga ttt tac ttg ttg gga aat aaa cca act 1008Leu Trp Gly Gln Asn Thr Gly Phe Tyr Leu Leu Gly Asn Lys Pro Thr325 330 335tta aac aat ctt tat aag cct tct acg caa gac gta gtt gca gca tca 1056Leu Asn Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Gln Asp Val Val Ala Ala Ser340 345 350aag aag tct tcg act tgg gac tat tgg act tca gta acc cca tta agt 1104Lys Lys Ser Ser Thr Trp Asp Tyr Trp Thr Ser Val Thr Pro Leu Ser355 360 365ggc ctc tgt ata tgg agt aca att ttt ctt gtt atc agc cag ttg gtt 1152Gly Leu Cys Ile Trp Ser Thr Ile Phe Leu Val Ile Ser Gln Leu Val370 375 380ttt caa tac cat cct tat agt gtt tca aga agg ttt gct aac tta cca 1200Phe Gln Tyr His Pro Tyr Ser Val Ser Arg Arg Phe Ala Asn Leu Pro385 390 395 400tat act ttg tgg gtc att act tat aat tta cta ttt ttg act ggg tac 1248Tyr Thr Leu Trp Val Ile Thr Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Thr Gly Tyr405 410 415tgc ttg act gac aaa att ttc ggt aat tct tcg gaa tat tat aaa gtt 1296Cys Leu Thr Asp Lys Ile Phe Gly Asn Ser Set Glu Tyr Tyr Lys Val420 425 430gcc gaa tgc ttg gaa tca atc aac tcc aat ggg ttg ttt tta ttt ttg 1344Ala Glu Cys Leu Glu Ser Ile Asn Ser Asn Gly Leu Phe Leu Phe Leu435 440 445ttg gca aat gtc tct act ggt tta gtc aat atg tct atg gtc acg ata 1392Leu Ala Asn Val Ser Thr Gly Leu Val Asn Met Ser Met Val Thr Ile450 455 460gat tct tca ccc tta aaa tca ttc ctg gtt ttg ttg gca tac tgc tca 1440Asp Ser Ser Pro Leu Lys Ser Phe Leu Val Leu Leu Ala Tyr Cys Ser465 470 475 480ttc ata gct gtc ata tcg gtt ttc ttg tat aga aaa aga ata ttc att 1488Phe Ile Ala Val Ile Ser Val Phe Leu Tyr Arg Lys Arg Ile Phe Ile485 490 495aag cta taa 1497Lys Leu<210>2<211>498<212>PRT<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>2Met Ala Thr Val His Gln Lys Asn Met Ser Thr Leu Lys Gln Arg Lys
1 5 10 15Glu Asp Phe Val Thr Gly Leu Asn Gly Gly Ser Ile Thr Glu Ile Asn20 25 30Ala Val Thr Ser Ile Ala Leu Val Thr Tyr Ile Ser Trp Asn Leu Leu35 40 45Lys Asn Ser Asn Leu Met Pro Pro Gly Ile Ser Ser Val Gln Tyr Ile50 55 60Ile Asp Phe Ala Leu Asn Trp Val Ala Leu Leu Leu Ser Ile Thr Ile65 70 75 80Tyr Ala Ser Glu Pro Tyr Leu Leu Asn Thr Leu Ile Leu Leu Pro Cys85 90 95Leu Leu Ala Phe Ile Tyr Gly Lys Phe Thr Ser Ser Ser Lys Pro Ser100 105 110Asn Pro Ile Tyr Asn Lys Lys Lys Met Ile Thr Gln Arg Phe Gln Leu115 120 125Glu Lys Lys Pro Tyr Ile Thr Ala Tyr Arg Gly Gly Met Leu Ile Leu130 135 140Thr Ala Ile Ala Ile Leu Ala Val Asp Phe Pro Ile Phe Pro Arg Arg145 150 155 160Phe Ala Lys Val Glu Thr Trp Gly Thr Ser Leu Met Asp Leu Gly Val165 170 175Gly Ser Phe Val Phe Ser Asn Gly Ile Val Ser Ser Arg Ala Leu Leu180 185 190Lys Asn Leu Ser Leu Lys Ser Lys Pro Ser Phe Leu Lys Asn Ala Phe195 200 205Asn Ala Leu Lys Ser Gly Gly Thr Leu Leu Phe Leu Gly Leu Leu Arg210 215 220Leu Phe Phe Val Lys Asn Leu Glu Tyr Gln Glu His Val Thr Glu Tyr225 230 235 240Gly Val His Trp Asn Phe Phe Ile Thr Leu Ser Leu Leu Pro Leu Val245 250 255Leu Thr Phe Ile Asp Pro Val Thr Arg Met Val Pro Arg Cys Ser Ile260 265 270Ala Ile Phe Ile Ser Cys Ile Tyr Glu Trp Leu Leu Leu Lys Asp Asp275 280 285Arg Thr Leu Asn Phe Leu Ile Leu Ala Asp Arg Asn Cys Phe Phe Ser290 295 300Ala Asn Arg Glu Gly Ile Phe Ser Phe Leu Gly Tyr Cys Ser Ile Phe305 310 315 320Leu Trp Gly Gln Asn Thr Gly Phe Tyr Leu Leu Gly Asn Lys Pro Thr325 330 335Leu Asn Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Gln Asp Val Val Ala Ala Ser340 345 350Lys Lys Ser Ser Thr Trp Asp Tyr Trp Thr Ser Val Thr Pro Leu Ser
355 360 365Gly Leu Cys Ile Trp Ser Thr Ile Phe Leu Val Ile Ser Gln Leu Val370 375 380Phe Gln Tyr His Pro Tyr Ser Val Ser Arg Arg Phe Ala Asn Leu Pro385 390 395 400Tyr Thr Leu Trp Val Ile Thr Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Thr Gly Tyr405 410 415Cys Leu Thr Asp Lys Ile Phe Gly Asn Ser Ser Glu Tyr Tyr Lys Val420 425 430Ala Glu Cys Leu Glu Ser Ile Asn Ser Asn Gly Leu Phe Leu Phe Leu435 440 445Leu Ala Asn Val Ser Thr Gly Leu Val Asn Met Ser Met Val Thr Ile450 455 460Asp Ser Ser Pro Leu Lys Ser Phe Leu Val Leu Leu Ala Tyr Cys Ser465 470 475 480Phe Ile Ala Val Ile Ser Val Phe Leu Tyr Arg Lys Arg Ile Phe Ile485 490 495Lys Leu<210>3<211>1458<212>DNA<213>白色假丝酵母(Candida albicans)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1455)<400>3atg tca tcg tct tta aaa caa ttg aaa gaa caa ttt gtc tca gat ttg48Met Ser Ser Ser Leu Lys Gln Leu Lys Glu Gln Phe Val Ser Asp Leu1 5 10 15act ggt ggc aca att gaa gaa att tat gct gta acc agt ata gca tta96Thr Gly Gly Thr Ile Glu Glu Ile Tyr Ala Val Thr Ser Ile Ala Leu20 25 30tca tct tat ttg tcc ttt aga ttg ttg aaa aag tct ctt ggt gat tta144Ser Ser Tyr Leu Ser Phe Arg Leu Leu Lys Lys Ser Leu Gly Asp Leu35 40 45gct ttg att tac gac tac att ctt aat gtg ttg aca att cta gca tcc192Ala Leu Ile Tyr Asp Tyr Ile Leu Asn Val Leu Thr Ile Leu Ala Ser50 55 60att act gtt tat agc aac agc cct tct tat ttg cat tat ttt att gtt240Ile Thr Val Tyr Ser Asn Ser Pro Ser Tyr Leu His Tyr Phe Ile Val
65 70 75 80att cca tca tta gtt ata tat cta gtg aat tac cat gtt gag aaa cca288Ile Pro Ser Leu Val Ile Tyr Leu Val Asn Tyr His Val Glu Lys Pro85 90 95tct tca ccc cat aga caa aat gat aca aaa gaa gat aaa tcg gac gaa336Ser Ser Pro His Arg Gln Asn Asp Thr Lys Glu Asp Lys Ser Asp Glu100 105 110cta ttg ccg aga aaa caa ttt ata aca gcc tat cgt tct caa atg ttg384Leu Leu Pro Arg Lys Gln Phe Ile Thr Ala Tyr Arg Ser Gln Met Leu115 120 125ata att act aat cta gct ata tta gct gtt gat ttt cct att ttc cca432Ile Ile Thr Asn Leu Ala Ile Leu Ala Val Asp Phe Pro Ile Phe Pro130 135 140aga aga ttt gcc aaa gtg gaa aca tgg ggc acg tca atg atg gat tta480Arg Arg Phe Ala Lys Val Glu Thr Trp Gly Thr Ser Met Met Asp Leu145 150 155 160gga gtt ggg tcg ttt gtg ttc tcc atg ggg ttg gct aat tct cga caa528Gly Val Gly Ser Phe Val Phe Ser Met Gly Leu Ala Asn Ser Arg Gln165 170 175ttg atc aag aac cac acc gac aac tac aaa ttt agt tgg aag agt tat576Leu Ile Lys Asn His Thr Asp Asn Tyr Lys Phe Ser Trp Lys Ser Tyr180 185 190ttg aaa aca atc aag cag aac ttt atc aag tca gtg cct ata ctt gtt624Leu Lys Thr Ile Lys Gln Asn Phe Ile Lys Ser Val Pro Ile Leu Val195 200 205tta gga gct att cgt ttt gtt agt gtt aag caa ttg gac tat cag gaa672Leu Gly Ala Ile Arg Phe Val Ser Val Lys Gln Leu Asp Tyr Gln Glu210 215 220cac gaa aca gag tat gga atc cat tgg aat ttt ttc ttc aca tta ggg720His Glu Thr Glu Tyr Gly Ile His Trp Asn Phe Phe Phe Thr Leu Gly225 230 235 240ttc ttg cca att gta ttg gga ata tta gac ccg gtg ttg aat ttg gtt768Phe Leu Pro Ile Val Leu Gly Ile Leu Asp Pro Val Leu Asn Leu Val245 250 255cca cgc ttc ata ata gga att ggt atc tca att gct tat gag gta gcg816Pro Arg Phe Ile Ile Gly Ile Gly Ile Ser Ile Ala Tyr Glu Val Ala260 265 270ttg aat aag act ggt ttg ttg aag ttc att ttg agc agc gaa aac aga864Leu Asn Lys Thr Gly Leu Leu Lys Phe Ile Leu Ser Ser Glu Asn Arg275 280 285ctt gaa tct ctc atc acc atg aat aaa gaa ggt att ttt tcg ttt att912Leu Glu Ser Leu Ile Thr Met Asn Lys Glu Gly Ile Phe Ser Phe Ile290 295 300gga tat ctt tgt att ttt ata att ggt cag tct ttt ggg tca ttt gtt960
Gly Tyr Leu Cys Ile Phe Ile Ile Gly Gln Ser Phe Gly Ser Phe Val305 310 315 320tta aca ggc tac aaa aca aag aac aac tta ata acc att agc aaa att 1008Leu Thr Gly Tyr Lys Thr Lys Asn Asn Leu Ile Thr Ile Ser Lys Ile325 330 335cgt att tca aaa aaa caa cac aag aaa gag ctg ctg ctg ttt ttc tca 1056Arg Ile Ser Lys Lys Gln His Lys Lys Glu Leu Leu Leu Phe Phe Ser340 345 350gtc gcc act act cag gga tta tat ttg gca tgt atc ttc tat cac tta 1104Val Ala Thr Thr Gln Gly Leu Tyr Leu Ala Cys Ile Phe Tyr His Leu355 360 365gct ttc agt ttg ttc atc agc aac tta tca ttc ttg caa cca att tca 1152Ala Phe Ser Leu Phe Ile Ser Asn Leu Ser Phe Leu Gln Pro Ile Ser370 375 380aga cga ttg gcc aat ttc ccc tac gtc atg tgg gtc gtt tcg tac aat 1200Arg Arg Leu Ala Asn Phe Pro Tyr Val Met Trp Val Val Ser Tyr Asn385 390 395 400gct acg ttt tta tta tgt tat gac tta att gaa aaa ttt atc ccg ggg 1248Ala Thr Phe Leu Leu Cys Tyr Asp Leu Ile Glu Lys Phe Ile Pro Gly405 410 415aac ctt act tct act gta ttg gac tct att aat aac aat ggt tta ttt 1296Asn Leu Thr Ser Thr Val Leu Asp Ser Ile Asn Asn Asn Gly Leu Phe420 425 430atc ttc ttg gtc agc aat tta tta aca ggg ttt att aac atg tcc atc 1344Ile Phe Leu Val Ser Asn Leu Leu Thr Gly Phe Ile Asn Met Ser Ile435 440 445aac act ttg gaa act agc aat aaa atg gca gtg att atc ttg att ggc 1392Asn Thr Leu Glu Thr Ser Asn Lys Met Ala Val Ile Ile Leu Ile Gly450 455 460tat agt ctt act tgg aca ttg ctc gcc tta tat ttg gat aag agg aag 1440Tyr Ser Leu Thr Trp Thr Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Asp Lys Arg Lys465 470 475 480atc tac atc aag ctt tag 1458Ile Tyr Ile Lys Leu485<210>4<211>485<212>PRT<213>白色假丝酵母(Candida albicans)<400>4Met Ser Ser Ser Leu Lys Gln Leu Lys Glu Gln Phe Val Ser Asp Leu
1 5 10 15Thr Gly Gly Thr Ile Glu Glu Ile Tyr Ala Val Thr Ser Ile Ala Leu20 25 30Ser Ser Tyr Leu Ser Phe Arg Leu Leu Lys Lys Ser Leu Gly Asp Leu35 40 45Ala Leu Ile Tyr Asp Tyr Ile Leu Asn Val Leu Thr Ile Leu Ala Ser50 55 60Ile Thr Val Tyr Ser Asn Ser Pro Ser Tyr Leu His Tyr Phe Ile Val65 70 75 80Ile Pro Ser Leu Val Ile Tyr Leu Val Asn Tyr His Val Glu Lys Pro85 90 95Ser Ser Pro His Arg Gln Asn Asp Thr Lys Glu Asp Lys Ser Asp Glu100 105 110Leu Leu Pro Arg Lys Gln Phe Ile Thr Ala Tyr Arg Ser Gln Met Leu115 120 125Ile Ile Thr Asn Leu Ala Ile Leu Ala Val Asp Phe Pro Ile Phe Pro130 135 140Arg Arg Phe Ala Lys Val Glu Thr Trp Gly Thr Ser Met Met Asp Leu145 150 155 160Gly Val Gly Ser Phe Val Phe Ser Met Gly Leu Ala Asn Ser Arg Gln165 170 175Leu Ile Lys Asn His Thr Asp Asn Tyr Lys Phe Ser Trp Lys Ser Tyr180 185 190Leu Lys Thr Ile Lys Gln Asn Phe Ile Lys Ser Val Pro Ile Leu Val195 200 205Leu Gly Ala Ile Arg Phe Val Ser Val Lys Gln Leu Asp Tyr Gln Glu210 215 220His Glu Thr Glu Tyr Gly Ile His Trp Asn Phe Phe Phe Thr Leu Gly225 230 235 240Phe Leu Pro Ile Val Leu Gly Ile Leu Asp Pro Val Leu Asn Leu Val245 250 255Pro Arg Phe Ile Ile Gly Ile Gly Ile Ser Ile Ala Tyr Glu Val Ala260 265 270Leu Asn Lys Thr Gly Leu Leu Lys Phe Ile Leu Ser Ser Glu Asn Arg275 280 285Leu Glu Ser Leu Ile Thr Met Asn Lys Glu Gly Ile Phe Ser Phe Ile290 295 300Gly Tyr Leu Cys Ile Phe Ile Ile Gly Gln Ser Phe Gly Ser Phe Val305 310 315 320Leu Thr Gly Tyr Lys Thr Lys Asn Asn Leu Ile Thr Ile Ser Lys Ile325 330 335Arg Ile Ser Lys Lys Gln His Lys Lys Glu Leu Leu Leu Phe Phe Ser340 345 350Val Ala Thr Thr Gln Gly Leu Tyr Leu Ala Cys Ile Phe Tyr His Leu
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<221>CDS<222>(1)..(1455)<400>5atg tca tcg tct tta aaa caa ttg aaa gaa caa ttt gtc tca gat ttg48Met Ser Ser Ser Leu Lys Gln Leu Lys Glu Gln Phe Val Ser Asp Leu1 5 10 15act ggt ggc aca att gaa gaa att tat gct gta acc agt ata gca tta96Thr Gly Gly Thr Ile Glu Glu Ile Tyr Ala Val Thr Ser Ile Ala Leu20 25 30tca tct tat ttg tcc ttt aga ttg ttg aaa aag tct ctt ggt gat tta144Ser Ser Tyr Leu Ser Phe Arg Leu Leu Lys Lys Ser Leu Gly Asp Leu35 40 45gct ttg att tac gac tac att ctt aat gtg ttg aca att cta gca tcc192Ala Leu Ile Tyr Asp Tyr Ile Leu Asn Val Leu Thr Ile Leu Ala Ser50 55 60att act gtt tat agc aac agc cct tct tat ttg cat tat ttt att gtt240Ile Thr Val Tyr Ser Asn Ser Pro Ser Tyr Leu His Tyr Phe Ile Val65 70 75 80
att cca tca tta gtt ata tat cta gtg aat tac cat gtt gag aaa cca288Ile Pro Ser Leu Val Ile Tyr Leu Val Asn Tyr His Val Glu Lys Pro85 90 95tct tca ccc cat aga caa aat gat aca aaa gaa gat aaa tcg gac gaa336Ser Ser Pro His Arg Gln Asn Asp Thr Lys Glu Asp Lys Ser Asp Glu100 105 110cta ttg ccg aga aaa caa ttt ata aca gcc tat cgt tct caa atg ttg384Leu Leu Pro Arg Lys Gln Phe Ile Thr Ala Tyr Arg Ser Gln Met Leu1l5 120 125ata att act aat cta gct ata tta gct gtt gat ttt cct att ttc cca432Ile Ile Thr Asn Leu Ala Ile Leu Ala Val Asp Phe Pro Ile Phe Pro130 135 140aga aga ttt gcc aaa gtg gaa aca tgg ggc acg tca atg atg gat tta480Arg Arg Phe Ala Lys Val Glu Thr Trp Gly Thr Ser Met Met Asp Leu145 150 155 160gga gtt ggg tcg ttt gtg ttc tcc atg ggg ttg gct aat tct cga caa528Gly Val Gly Ser Phe Val Phe Ser Met Gly Leu Ala Asn Ser Arg Gln165 170 175ttg atc aag aac cac acc gac aat tac aaa ttt agt tgg aag agt tat576Leu Ile Lys Asn His Thr Asp Asn Tyr Lys Phe Ser Trp Lys Ser Tyr180 185 190ttg aaa aca atc aag cag aac ttt atc aag tca gtg cct ata ctt gtt624Leu Lys Thr Ile Lys Gln Asn Phe Ile Lys Ser Val Pro Ile Leu Val195 200 205tta gga gct att cgt ttt gtt agt gtt aag caa ttg gac tat cag gaa672Leu Gly Ala Ile Arg Phe Val Ser Val Lys Gln Leu Asp Tyr Gln Glu210 215 220cac gaa aca gag tat gga atc cat tgg aat ttt ttc ttc aca tta ggg720His Glu Thr Glu Tyr Gly Ile His Trp Asn Phe Phe Phe Thr Leu Gly225 230 235 240ttc ttg cca att gta ttg gga ata tta gac ccg gtg ttg aat ttg gtt768Phe Leu Pro Ile Val Leu Gly Ile Leu Asp Pro Val Leu Asn Leu Val245 250 255cca cgc ttc ata ata gga att ggt atc tca att ggt tat gag gta gcg816Pro Arg Phe Ile Ile Gly Ile Gly Ile Ser Ile Gly Tyr Glu Val Ala260 265 270ttg aat aag act ggt ttg ttg aag ttc att ttg agc agc gaa aac aga864Leu Asn Lys Thr Gly Leu Leu Lys Phe Ile Leu Ser Ser Glu Asn Arg275 280 285ctt gaa tct ctc atc gcc atg aat aaa gaa ggt att ttt tcg ttt att912Leu Glu Ser Leu Ile Ala Met Asn Lys Glu Gly Ile Phe Ser Phe Ile290 295 300gga tat ctt tgt att ttt ata att ggt cag tct ttt ggg tca ttt gtt960Gly Tyr Leu Cys Ile Phe Ile Ile Gly Gln Ser Phe Gly Ser Phe Val
305 310 315 320tta aca ggc tac aaa aca aag aac aac tta ata acc att agc aaa att 1008Leu Thr Gly Tyr Lys Thr Lys Asn Asn Leu Ile Thr Ile Ser Lys Ile325 330 335cgt att tca aaa aaa caa cac aag aaa gag ctg ctg ctg ttt ttc tca 1056Arg Ile Ser Lys Lys Gln His Lys Lys Glu Leu Leu Leu Phe Phe Ser340 345 350gtc gcc act act cag gga tta tat ttg gca tgt atc ttc tat cac tta 1104Val Ala Thr Thr Gln Gly Leu Tyr Leu Ala Cys Ile Phe Tyr His Leu355 360 365gct ttc agt ttg ttc atc agc aac tta tca ttc ttg caa cca att tca 1152Ala Phe Ser Leu Phe Ile Ser Asn Leu Ser Phe Leu Gln Pro Ile Ser370 375 380aga cga ttg gcc aat ttc ccc tac gtc atg tgg gtc gtt tcg tac aat 1200Arg Arg Leu Ala Asn Phe Pro Tyr Val Met Trp Val Val Ser Tyr Asn385 390 395 400gct acg ttt tta tta tgt tat gac tta att gaa aaa ttt atc ccg ggg 1248Ala Thr Phe Leu Leu Cys Tyr Asp Leu Ile Glu Lys Phe Ile Pro Gly405 410 415aac ctt act tct act gta ttg gac tct att aat aac aat ggt tta ttt 1296Asn Leu Thr Ser Thr Val Leu Asp Ser Ile Asn Asn Asn Gly Leu Phe420 425 430atc ttc ttg gtc agc aat tta tta aca ggg ttt att aac atg tcc atc 1344Ile Phe Leu Val Ser Asn Leu Leu Thr Gly Phe Ile Asn Met Ser Ile435 440 445aac act ttg gaa act agc aat aaa atg gca gtg att atc ttg att ggc 1392Asn Thr Leu Glu Thr Ser Asn Lys Met Ala Val Ile Ile Leu Ile Gly450 455 460tat agt ctt act tgg aca ttg ctc gcc tta tat ttg gat aag agg aag 1440Tyr Ser Leu Thr Trp Thr Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Asp Lys Arg Lys465 470 475 480atc tac atc aag ctt tag 1458Ile Tyr Ile Lys Leu485<210>6<211>485<212>PRT<213>白色假丝酵母(Candida albicans)<400>6Met Ser Ser Ser Leu Lys Gln Leu Lys Glu Gln Phe Val Ser Asp Leu1 5 10 15
Thr Gly Gly Thr Ile Glu Glu Ile Tyr Ala Val Thr Ser Ile Ala Leu20 25 30Ser Ser Tyr Leu Ser Phe Arg Leu Leu Lys Lys Ser Leu Gly Asp Leu35 40 45Ala Leu Ile Tyr Asp Tyr Ile Leu Asn Val Leu Thr Ile Leu Ala Ser50 55 60Ile Thr Val Tyr Ser Asn Ser Pro Ser Tyr Leu His Tyr Phe Ile Val65 70 75 80Ile Pro Ser Leu Val Ile Tyr Leu Val Asn Tyr His Val Glu Lys Pro85 90 95Ser Ser Pro His Arg Gln Asn Asp Thr Lys Glu Asp Lys Ser Asp Glu100 105 110Leu Leu Pro Arg Lys Gln Phe Ile Thr Ala Tyr Arg Ser Gln Met Leu115 120 125Ile Ile Thr Asn Leu Ala Ile Leu Ala Val Asp Phe Pro Ile Phe Pro130 135 140Arg Arg Phe Ala Lys Val Glu Thr Trp Gly Thr Ser Met Met Asp Leu145 150 155 160Gly Val Gly Ser Phe Val Phe Ser Met Gly Leu Ala Asn Ser Arg Gln165 170 175Leu Ile Lys Asn His Thr Asp Asn Tyr Lys Phe Ser Trp Lys Ser Tyr180 185 190Leu Lys Thr Ile Lys Gln Asn Phe Ile Lys Ser Val Pro Ile Leu Val195 200 205Leu Gly Ala Ile Arg Phe Val Ser Val Lys Gln Leu Asp Tyr Gln Glu210 215 220His Glu Thr Glu Tyr Gly Ile His Trp Asn Phe Phe Phe Thr Leu Gly225 230 235 240Phe Leu Pro Ile Val Leu Gly Ile Leu Asp Pro Val Leu Asn Leu Val245 250 255Pro Arg Phe Ile Ile Gly Ile Gly Ile Ser Ile Gly Tyr Glu Val Ala260 265 270Leu Asn Lys Thr Gly Leu Leu Lys Phe Ile Leu Ser Ser Glu Asn Arg275 280 285Leu Glu Ser Leu Ile Ala Met Asn Lys Glu Gly Ile Phe Ser Phe Ile290 295 300Gly Tyr Leu Cys Ile Phe Ile Ile Gly Gln Ser Phe Gly Ser Phe Val305 310 315 320Leu Thr Gly Tyr Lys Thr Lys Asn Asn Leu Ile Thr Ile Ser Lys Ile325 330 335Arg Ile Ser Lys Lys Gln His Lys Lys Glu Leu Leu Leu Phe Phe Ser340 345 350Val Ala Thr Thr Gln Gly Leu Tyr Leu Ala Cys Ile Phe Tyr His Leu355 360 365
Ala Phe Ser Leu Phe Ile Ser Asn Leu Ser Phe Leu Gln Pro Ile Ser370 375 380Arg Arg Leu Ala Asn Phe Pro Tyr Val Met Trp Val Val Ser Tyr Asn385 390 395 400Ala Thr Phe Leu Leu Cys Tyr Asp Leu Ile Glu Lys Phe Ile Pro Gly405 410 415Asn Leu Thr Ser Thr Val Leu Asp Ser Ile Asn Asn Asn Gly Leu Phe420 425 430Ile Phe Leu Val Ser Asn Leu Leu Thr Gly Phe Ile Asn Met Ser Ile435 440 445Asn Thr Leu Glu Thr Ser Asn Lys Met Ala Val Ile Ile Leu Ile Gly450 455 460Tyr Ser Leu Thr Trp Thr Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Asp Lys Arg Lys465 470 475 480Ile Tyr Ile Lys Leu485<210>7<211>1458<212>DNA<213>白色假丝酵母(Candida albicans)<400>7atgtcatcgt ctttaaaaca attgaaagaa caatttgtct cagatttgac tggtggcaca 60attgaagaaa tttatgctgt aaccagtata gcattatcat cttatttgtc ctttagattg 120ttgaaaaagt ctcttggtga tttagctttg atttacgact acattcttaa tgtgttgaca 180attctagcat ccattactgt ttatagcaac agcccttctt atttgcatta ttttattgtt 240attccatcat tagttatata tctagtgaat taccatgttg agaaaccatc ttcaccccat 300agacaaaatg atacaaaaga agataaatcg gacgaactat tgccgagaaa acaatttata 360acagcctatc gttctcaaat gttgataatt actaatctag ctatattagc tgttgatttt 420cctattttcc caagaagatt tgccaaagtg gaaacatggg gcacgtcaat gatggattta 480ggggttgggt cgtttgtgtt ctccatgggg ttggctaatt ctcgacaatt gatcaagaac 540cacaccgaca actacaaatt tagttggaag agttatttga aaacaatcaa gcagaacttt 600atcaagtcag tgcctatact tgttttagga gctattcgtt ttgttagtgt taagcaattg 660gactatcagg aacacgaaac agagtatgga atccattgga attttttctt cacattaggg 720ttcttgccaa ttgtattggg aatattagac ccggtgttga atttggttcc acgcttcata 780ataggaattg gtatctcaat tggttatgag gtagcgttga ataagactgg tttgttgaag 840ttcattttga gcagcgaaaa cagacttgaa tctctcatcg ccatgaataa agaaggtatt 900ttttcgttta ttggatatct ttgtattttt ataattggtc agtcttttgg gtcatttgtt 960ttaacaggct acaaaacaaa gaacaactta ataaccatta gcaaaattcg tatttcaaaa1020aaacaacaca agaaagagct gctgctgttt ttctcagtcg ccactactca gggattatat1080ttggcatgta tcttctatca cttagctttc agtttgttca tcagcaactt atcattcttg1140caaccaattt caagacgatt ggccaatttc ccctacgtca tgtgggtcgt ttcgtacaat1200
gctacgtttt tattatgtta tgacttaatt gaaaaattta tcccggggaa ccttacttct 1260actgtattgg attctattaa taacaatggt ttatttatct tcttggtcag caatttatta 1320acagggttta ttaacatgtc catcaacact ttggaaacta gcaataaaat ggcagtgatt 1380atcttgattg gctatagtct tacttggaca ttgctcgcct tatatttgga taagaggaag 1440atctacatca agctttag 1458<210>8<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>8gcagtcgact cgatgaggtc tttgctaatc ttg 33<210>9<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>13cccggtacca aattaaagcc ttcgagcctc cca 33<210>14<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列
<400>14cccggatcct gtttgcagca tgagacttgc ata 33<210>15<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>CDS<222>(1)..(1380)<400>27atg tca tac aaa ttg gaa aaa gaa gca ttt gtc tca aac ctg acg ggt48Met Ser Tyr Lys Leu Glu Lys Glu Ala Phe Val Ser Asn Leu Thr Gly1 5 10 15tca agt tcc att gag aca tgt ggc ttg tta tta ata gga att gct tgc96Ser Ser Ser Ile Glu Thr Cys Gly Leu Leu Leu Ile Gly Ile Ala Cys20 25 30aac gtt ttg tgg gta aac atg act gcg aga aac atc tta ccc aaa ggg144Asn Val Leu Trp Val Asn Met Thr Ala Arg Asn Ile Leu Pro Lys Gly35 40 45aat ctt ggg ttt ctt gtt gag ttt ttc atc ttt tgc tta att cca tta192Asn Leu Gly Phe Leu Val Glu Phe Phe Ile Phe Cys Leu Ile Pro Leu50 55 60ttt gtc att tac gtt tca tcg aaa gtt ggc gtt ttc act ctt tgc ata240Phe Val Ile Tyr Val Ser Ser Lys Val Gly Val Phe Thr Leu Cys Ile65 70 75 80gcc tct ttt ttg cct tcc ttc gtc ctt cat gtt ata agt cca att aat288Ala Ser Phe Leu Pro Ser Phe Val Leu His Val Ile Ser Pro Ile Asn85 90 95tgg gat gtg ctg aga aga aaa cct ggt tgt tgt ctt act aaa aaa aat336Trp Asp Val Leu Arg Arg Lys Pro Gly Cys Cys Leu Thr Lys Lys Asn100 105 110gaa aat act ttt gat cga cga att gct gga gtc aca ttt tat cgt tct384Glu Asn Thr Phe Asp Arg Arg Ile Ala Gly Val Thr Phe Tyr Arg Ser115 120 125caa atg atg ttg gtt act gtc act tgc atc ctg gcc gtt gac ttt acc432Gln Met Met Leu Val Thr Val Thr Cys Ile Leu Ala Val Asp Phe Thr130 135 140ctt ttc ccg agg aga tat gcc aaa gtt gaa acc tgg gga aca tca ctg480Leu Phe Pro Arg Arg Tyr Ala Lys Val Glu Thr Trp Gly Thr Ser Leu145 150 155 160atg gat ctt ggt gtt gga tct ttc atg ttt tct tca ggt act gtg gct528Met Asp Leu Gly Val Gly Ser Phe Met Phe Ser Ser Gly Thr Val Ala165 170 175
gga cgg aaa aat gac att aaa aaa cca aat gcg ttt aaa aat gta ttg576Gly Arg Lys Asn Asp Ile Lys Lys Pro Asn Ala Phe Lys Asn Val Leu180 185 190tgg aat tct ttc atc ctt ttg att tta gga ttt gcg cgc atg ttt tta624Trp Asn Ser Phe Ile Leu Leu Ile Leu Gly Phe Ala Arg Met Phe Leu195 200 205acg aaa agc atc aat tac caa gaa cat gta agc gaa tat ggc atg cat672Thr Lys Ser Ile Asn Tyr Gln Glu His Val Ser Glu Tyr Gly Met His210 215 220tgg aac ttt ttt ttc acc cta ggt ttc atg gct ctt ggc gta ttt ttt720Trp Asn Phe Phe Phe Thr Leu Gly Phe Met Ala Leu Gly Val Phe Phe225 230 235 240ttt cgt cgt tct tta aaa aaa gtc tcc tat ttt aat tta gca acc ttc768Phe Arg Arg Ser Leu Lys Lys Val Ser Tyr Phe Asn Leu Ala Thr Phe245 250 255att act ctt ctt cat cat tgt ttg ctt gtt tta acc cct ttc caa aaa816Ile Thr Leu Leu His His Cys Leu Leu Val Leu Thr Pro Phe Gln Lys260 265 270tgg gca cta tcc gcc ccc aga aca aat att ttg gct cag aat aga gag864Trp Ala Leu Ser Ala Pro Arg Thr Asn Ile Leu Ala Gln Asn Arg Glu275 280 285ggt att gct tct ctt ccc gga tac att gct att tac ttt tat gga atg912Gly Ile Ala Ser Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Ile Tyr Phe Tyr Gly Met290 295 300tat acc ggt agt gta gtt ttg gct gat cga cct cta atg tat act aga960Tyr Thr Gly Ser Val Val Leu Ala Asp Arg Pro Leu Met Tyr Thr Arg305 310 315 320gct gag tcg tgg aag cgc ttt caa cgt cta tta ttc ccg cta tgc att1008Ala Glu Ser Trp Lys Arg Phe Gln Arg Leu Leu Phe Pro Leu Cys Ile325 330 335ttg tta gtg ttg tat ctt gtg tct aac ttt ttg tca gtt ggt gtt tct1056Leu Leu Val Leu Tyr Leu Val Ser Asn Phe Leu Ser Val Gly Val Ser340 345 350cgc cga ctt gct aat acg cct tat gtt gcg aat gtt gcc ttt atc aat1104Arg Arg Leu Ala Asn Thr Pro Tyr Val Ala Asn Val Ala Phe Ile Asn355 360 365atg ttt ttt ctt act ata tac ata ctt att gat gcc tat tta ttc cca1152Met Phe Phe Leu Thr Ile Tyr Ile Leu Ile Asp Ala Tyr Leu Phe Pro370 375 380tct tct gtg cca tat gga agt cgc gtc ccc aaa ctg ctt gaa gat gcc1200Ser Ser Val Pro Tyr Gly Ser Arg Val Pro Lys Leu Leu Glu Asp Ala385 390 395 400aat aat aat ggc ttg ttg gtg ttt ttg att gct aac gtt tta aca gga1248Asn Asn Asn Gly Leu Leu Val Phe Leu Ile Ala Asn Val Leu Thr Gly
405 410 415gta gtt aat tta tcg ttc gac acc ctt cat tct agc aat gca aaa ggc 1296Val Val Asn Leu Ser Phe Asp Thr Leu His Ser Ser Asn Ala Lys Gly420 425 430ttg aca atc atg act atg tat ctt ttt att att tgc tat atg gca cat 1344Leu Thr Ile Met Thr Met Tyr Leu Phe Ile Ile Cys Tyr Met Ala His435 440 445tgg ctt gct caa cac gga att cgt ttt cgc ctt tag 1380Trp Leu Ala Gln His Gly Ile Arg Phe Arg Leu450 455 460<210>28<211>459<212>PRT<213>粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)<400>28Met Ser Tyr Lys Leu Glu Lys Glu Ala Phe Val Ser Asn Leu Thr Gly1 5 10 15Ser Ser Ser Ile Glu Thr Cys Gly Leu Leu Leu Ile Gly Ile Ala Cys20 25 30Asn Val Leu Trp Val Asn Met Thr Ala Arg Asn Ile Leu Pro Lys Gly35 40 45Asn Leu Gly Phe Leu Val Glu Phe Phe Ile Phe Cys Leu Ile Pro Leu50 55 60Phe Val Ile Tyr Val Ser Ser Lys Val Gly Val Phe Thr Leu Cys Ile65 70 75 80Ala Ser Phe Leu Pro Ser Phe Val Leu His Val Ile Ser Pro Ile Asn85 90 95Trp Asp Val Leu Arg Arg Lys Pro Gly Cys Cys Leu Thr Lys Lys Asn100 105 110Glu Asn Thr Phe Asp Arg Arg Ile Ala Gly Val Thr Phe Tyr Arg Ser115 120 125Gln Met Met Leu Val Thr Val Thr Cys Ile Leu Ala Val Asp Phe Thr130 135 140Leu Phe Pro Arg Arg Tyr Ala Lys Val Glu Thr Trp Gly Thr Ser Leu145 150 155 160Met Asp Leu Gly Val Gly Ser Phe Met Phe Ser Ser Gly Thr Val Ala165 170 175Gly Arg Lys Asn Asp Ile Lys Lys Pro Asn Ala Phe Lys Asn Val Leu180 185 190Trp Asn Ser Phe Ile Leu Leu Ile Leu Gly Phe Ala Arg Met Phe Leu195 200 205
Thr Lys Ser Ile Asn Tyr Gln Glu His Val Ser Glu Tyr Gly Met His210 215 220Trp Asn Phe Phe Phe Thr Leu Gly Phe Met Ala Leu Gly Val Phe Phe225 230 235 240Phe Arg Arg Ser Leu Lys Lys Val Ser Tyr Phe Asn Leu Ala Thr Phe245 250 255Ile Thr Leu Leu His His Cys Leu Leu Val Leu Thr Pro Phe Gln Lys260 265 270Trp Ala Leu Ser Ala Pro Arg Thr Asn Ile Leu Ala Gln Asn Arg Glu275 280 285Gly Ile Ala Ser Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Ile Tyr Phe Tyr Gly Met290 295 300Tyr Thr Gly Ser Val Val Leu Ala Asp Arg Pro Leu Met Tyr Thr Arg305 310 315 320Ala Glu Ser Trp Lys Arg Phe Gln Arg Leu Leu Phe Pro Leu Cys Ile325 330 335Leu Leu Val Leu Tyr Leu Val Ser Asn Phe Leu Ser Val Gly Val Ser340 345 350Arg Arg Leu Ala Asn Thr Pro Tyr Val Ala Asn Val Ala Phe Ile Asn355 360 365Met Phe Phe Leu Thr Ile Tyr Ile Leu Ile Asp Ala Tyr Leu Phe Pro370 375 380Ser Ser Val Pro Tyr Gly Ser Arg Val Pro Lys Leu Leu Glu Asp Ala385 390 395 400Asn Asn Asn Gly Leu Leu Val Phe Leu Ile Ala Asn Val Leu Thr Gly405 410 415Val Val Asn Leu Ser Phe Asp Thr Leu His Ser Ser Asn Ala Lys Gly420 425 430Leu Thr Ile Met Thr Met Tyr Leu Phe Ile Ile Cys Tyr Met Ala His435 440 445Trp Leu Ala Gln His Gly Ile Arg Phe Arg Leu450 455<210>29<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature
<222>(3)<223>n代表a，g，c或t<220>
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<220>
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gtraaraara arttccartg naynccrtay tc 32<210>32<211>188<212>DNA<213>烟曲霉(Aspergillus fumigatus)<400>32atggatctgg gcgttggatc gtttgtcttt tcgggcggag tagtatccgc tcgctcacta60ctcaagagca ggaccaatgg ctctaaaagg ttgcctcttg ccaagaggtt gattgcgtcg 120acgcgacact ctattcctct gctcgtcctc ggcctgattc ggctatacag cgtcaaaggc 180ttggacta188<210>33<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>33ggagtagtat ccgctcgctc acta 24<210>34<211>25<212>DNA<213>人工的<400>34gtccaagcct ttgacgctgt atagc 25<210>35<211>25<212>DNA<213>人工的<400>35gggatgtgct gcaaggcgat taagt 25
<210>36<211>26<212>DNA<213>人工的<400>36tttatgcttc cggctcgtat gttgtg 26<210>37<211>25<212>DNA<213>人工的<400>37aaaggtgcaa atcccgcggc attga 25<210>38<211>28<212>DNA<213>人工的<400>38agttcactat atatcttcaa cacaccac28<210>39<211>1576<212>DNA<213>烟曲霉(Aspergillus fumigatus)<220>
<221>CDS<222>(31)..(1536)<400>39aaggtgcaaa tcccgcggca ttgagtcaag atg gat cca gat tat aaa gct cgc 54Met Asp Pro Asp Tyr Lys Ala Arg1 5aaa gag gcc ttt gtc tca ggt ctt gca gga gga agc atc ctg gaa atc102Lys Glu Ala Phe Val Ser Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ile Leu Glu Ile10 15 20aac gcc gtc acc ttg gtt gct tcg gta tcc gtt ttt ctg tgg tca att150
Asn Ala Val Thr Leu Val Ala Ser Val Ser Val Phe Leu Trp Ser Ile25 30 35 40cta caa tct cgc cta tcc ttt ttc aca ccc tac agc gcc gct gcc ctt198Leu Gln Ser Arg Leu Ser Phe Phe Thr Pro Tyr Ser Ala Ala Ala Leu45 50 55ctc gtt gat ttc ctg ctc aat gta cta gct atc ttg ttc gca acc act246Leu Val Asp Phe Leu Leu Asn Val Leu Ala Ile Leu Phe Ala Thr Thr60 65 70tta tac tct tcg gcg cct ctt ctt ctc aat ctc ctt cta ata tct ccc294Leu Tyr Ser Ser Ala Pro Leu Leu Leu Asn Leu Leu Leu Ile Ser Pro75 80 85gct ctg ctg ata ctc ctc tct acg aaa cgt cct cgg acc ccc gtc aaa342Ala Leu Leu Ile Leu Leu Ser Thr Lys Arg Pro Arg Thr Pro Val Lys90 95 100gcg aaa cct cct cgc cag tcc gct aga gct ggg aaa gat gac tcg aaa390Ala Lys Pro Pro Arg Gln Ser Ala Arg Ala Gly Lys Asp Asp Ser Lys105 110 115 120cat gcg aca gcc ttg cca gag tct cta ccc att cat cca ttt ctc acg438His Ala Thr Ala Leu Pro Glu Ser Leu Pro Ile His Pro Phe Leu Thr125 130 135aca tat cgc gcc gcc atg atg gtt atc acg tgc atc gct atc ttg gct486Thr Tyr Arg Ala Ala Met Met Val Ile Thr Cys Ile Ala Ile Leu Ala140 145 150gtg gat ttt cgc att ttt cct cgc cga ttc gcc aag gta gaa aac tgg534Val Asp Phe Arg Ile Phe Pro Arg Arg Phe Ala Lys Val Glu Asn Trp155 160 165ggt aca tca ctc atg gat ctg ggc gtt gga tcg ttt gtc ttt tcg ggc582Gly Thr Ser Leu Met Asp Leu Gly Val Gly Ser Phe Val Phe Ser Gly170 175 180gga gta gta tcc gct cgc tca cta ctc aag agc agg acc aat ggc tct630Gly Val Val Ser Ala Arg Ser Leu Leu Lys Ser Arg Thr Asn Gly Ser185 190 195 200aaa agg ttg cct ctt gcc aag agg ttg att gcg tcg acg cga cac tct678Lys Arg Leu Pro Leu Ala Lys Arg Leu Ile Ala Ser Thr Arg His Ser205 210 215att cct ctg ctc gtc ctc ggc ctg att cgg cta tac agc gtc aaa ggc726Ile Pro Leu Leu Val Leu Gly Leu Ile Arg Leu Tyr Ser Val Lys Gly220 225 230ttg gac tat gcg gag cac gtc acc gag tac ggc gta cat tgg aac ttc774Leu Asp Tyr Ala Glu His Val Thr Glu Tyr Gly Val His Trp Asn Phe235 240 245ttc ttt aca ttg ggt ctt ttg cct ccg ttc gtg gag gtc ttc gac gcc822Phe Phe Thr Leu Gly Leu Leu Pro Pro Phe Val Glu Val Phe Asp Ala250 255 260
ttg gct acg atc att ccg tca tac gag gtt ctc tcc gtg ggg atc gcc870Leu Ala Thr Ile Ile Pro Ser Tyr Glu Val Leu Ser Val Gly Ile Ala265 270 275 280gtc ttg tat caa gtt gcc cta gag tca aca gac ttg aaa agc tac atc918Val Leu Tyr Gln Val Ala Leu Glu Ser Thr Asp Leu Lys Ser Tyr Ile285 290 295ctc gtc tcc cct cgt ggg cca agc tta ctg tcc aag aat cgt gaa ggc966Leu Val Ser Pro Arg Gly Pro Ser Leu Leu Ser Lys Asn Arg Glu Gly300 305 310gtc ttc tcc ttc tca ggt tat ctc gcg att ttt ctt gct ggt cgt gcg1014Val Phe Ser Phe Ser Gly Tyr Leu Ala Ile Phe Leu Ala Gly Arg Ala315 320 325atc ggc att cgg ata atc cct cgc gga act tct ttc tca aga agc cca1062Ile Gly Ile Arg Ile Ile Pro Arg Gly Thr Ser Phe Ser Arg Ser Pro330 335 340gaa cag gcc agg aga cgg gtc ctg atc agc ctt ggc gtg caa gcg tta1110Glu Gln Ala Arg Arg Arg Val Leu Ile Ser Leu Gly Val Gln Ala Leu345 350 355 360gtg tgg acc act ctt ttt gtg ttg aac tcc act tat gcg atg gga tac1158Val Trp Thr Thr Leu Phe Val Leu Asn Ser Thr Tyr Ala Met Gly Tyr365 370 375gga gct aat atc cct gtc tcc cgc cgc ctc gct aac atg ccc tat gtc1206Gly Ala Asn Ile Pro Val Ser Arg Arg Leu Ala Asn Met Pro Tyr Val380 385 390ctt tgg gtt tcg gcg ttc aac acc gcg caa ctg ttt gtg ttc tgc ctg1254Leu Trp Val Ser Ala Phe Asn Thr Ala Gln Leu Phe Val Phe Cys Leu395 400 405atc gaa aca ctc tgc ttt cct gca gtt cat cgg aca acg act caa gag1302Ile Glu Thr Leu Cys Phe Pro Ala Val His Arg Thr Thr Thr Gln Glu410 415 420agc gaa tct gag cga gtc gat ttt gct acg agc cga atc atg tcg gcc1350Ser Glu Ser Glu Arg Val Asp Phe Ala Thr Ser Arg Ile Met Ser Ala425 430 435 440ttc aat aag aac agt ctc gcg atc ttt ctt ttg gcc aat ctt ctg act1398Phe Asn Lys Asn Ser Leu Ala Ile Phe Leu Leu Ala Asn Leu Leu Thr445 450 455gga gct gtg aat ctg agc atc tcc aca att gat gct aat aca gcg cag1446Gly Ala Val Asn Leu Ser Ile Ser Thr Ile Asp Ala Asn Thr Ala Gln460 465 470gcc atc gct gtt ctc att gga tat tca tcc att atc aca ggg gtt gct1494Ala Ile Ala Val Leu Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ile Thr Gly Val Ala475 480 485cta gca ttg cat cat gcc aat atc aaa gta ctt cct ttc tag1536Leu Ala Leu His His Ala Asn Ile Lys Val Leu Pro Phe
490 495 500ggtatttacg agcaattggt ggtgtgttga agatatatag1576<210>40<211>501<212>PRT<213>烟曲霉(Aspergillus fumigatus)<400>40Met Asp Pro Asp Tyr Lys Ala Arg Lys Glu Ala Phe Val Ser Gly Leu1 5 10 15Ala Gly Gly Ser Ile Leu Glu Ile Asn Ala Val Thr Leu Val Ala Ser20 25 30Val Ser Val Phe Leu Trp Ser Ile Leu Gln Ser Arg Leu Ser Phe Phe35 40 45Thr Pro Tyr Ser Ala Ala Ala Leu Leu Val Asp Phe Leu Leu Asn Val50 55 60Leu Ala Ile Leu Phe Ala Thr Thr Leu Tyr Ser Ser Ala Pro Leu Leu65 70 75 80Leu Asn Leu Leu Leu Ile Ser Pro Ala Leu Leu Ile Leu Leu Ser Thr85 90 95Lys Arg Pro Arg Thr Pro Val Lys Ala Lys Pro Pro Arg Gln Ser Ala100 105 110Arg Ala Gly Lys Asp Asp Ser Lys His Ala Thr Ala Leu Pro Glu Ser115 120 125Leu Pro Ile His Pro Phe Leu Thr Thr Tyr Arg Ala Ala Met Met Val130 135 140Ile Thr Cys Ile Ala Ile Leu Ala Val Asp Phe Arg Ile Phe Pro Arg145 150 155 160Arg Phe Ala Lys Val Glu Asn Trp Gly Thr Ser Leu Met Asp Leu Gly165 170 175Val Gly Ser Phe Val Phe Ser Gly Gly Val Val Ser Ala Arg Ser Leu180 185 190Leu Lys Ser Arg Thr Asn Gly Ser Lys Arg Leu Pro Leu Ala Lys Arg195 200 205Leu Ile Ala Ser Thr Arg His Ser Ile Pro Leu Leu Val Leu Gly Leu210 215 220Ile Arg Leu Tyr Ser Val Lys Gly Leu Asp Tyr Ala Glu His Val Thr225 230 235 240Glu Tyr Gly Val His Trp Asn Phe Phe Phe Thr Leu Gly Leu Leu Pro245 250 255Pro Phe Val Glu Val Phe Asp Ala Leu Ala Thr Ile Ile Pro Ser Tyr260 265 270
Glu Val Leu Ser Val Gly Ile Ala Val Leu Tyr Gln Val Ala Leu Glu275 280 285Ser Thr Asp Leu Lys Ser Tyr Ile Leu Val Ser Pro Arg Gly Pro Ser290 295 300Leu Leu Ser Lys Asn Arg Glu Gly Val Phe Ser Phe Ser Gly Tyr Leu305 310 315 320Ala Ile Phe Leu Ala Gly Arg Ala Ile Gly Ile Arg Ile Ile Pro Arg325 330 335Gly Thr Ser Phe Ser Arg Ser Pro Glu Gln Ala Arg Arg Arg Val Leu340 345 350Ile Ser Leu Gly Val Gln Ala Leu Val Trp Thr Thr Leu Phe Val Leu355 360 365Asn Ser Thr Tyr Ala Met Gly Tyr Gly Ala Asn Ile Pro Val Ser Arg370 375 380Arg Leu Ala Asn Met Pro Tyr Val Leu Trp Val Ser Ala Phe Asn Thr385 390 395 400Ala Gln Leu Phe Val Phe Cys Leu Ile Glu Thr Leu Cys Phe Pro Ala405 410 415Val His Arg Thr Thr Thr Gln Glu Ser Glu Ser Glu Arg Val Asp Phe420 425 430Ala Thr Ser Arg Ile Met Ser Ala Phe Asn Lys Asn Ser Leu Ala Ile435 440 445Phe Leu Leu Ala Asn Leu Leu Thr Gly Ala Val Asn Leu Ser Ile Ser450 455 460Thr Ile Asp Ala Asn Thr Ala Gln Ala Ile Ala Val Leu Ile Gly Tyr465 470 475 480Ser Ser Ile Ile Thr Gly Val Ala Leu Ala Leu His His Ala Asn Ile485 490 495Lys Val Leu Pro Phe500<210>41<211>1648<212>DNA<213>烟曲霉(Aspergillus fumigatus)<220>
<221>内含子<222>(122)..(198)<220>
<221>CDS<222>(26)..(121)
<220>
<221>CDS<222>(199)..(1608)<400>41gcaaatcccg cggcattgag tcaag atg gat cca gat tat aaa gct cgc aaa52Met Asp Pro Asp Tyr Lys Ala Arg Lys1 5gag gcc ttt gtc tca ggt ctt gca gga gga agc atc ctg gaa atc aac100Glu Ala Phe Val Ser Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ile Leu Glu Ile Asn10 15 20 25gcc gtc acc ttg gtt gct tcg gttcgtgtta ctatcttatt gtggctactt 151Ala Val Thr Leu Val Ala Ser30cgcctacatt gtttctcgac taaccgagtc tctttgcgat caatcag gta tcc gtt207Val Ser Val35ttt ctg tgg tca att cta caa tct cgc cta tcc ttt ttc aca ccc tac255Phe Leu Trp Ser Ile Leu Gln Ser Arg Leu Ser Phe Phe Thr Pro Tyr40 45 50agc gcc gct gcc ctt ctc gtt gat ttc ctg ctc aat gta cta gct atc303Ser Ala Ala Ala Leu Leu Val Asp Phe Leu Leu Asn Val Leu Ala Ile55 60 65ttg ttc gca acc act tta tac tct tcg gcg cct ctt ctt ctc aat ctc351Leu Phe Ala Thr Thr Leu Tyr Ser Ser Ala Pro Leu Leu Leu Asn Leu70 75 80ctt cta ata tct ccc gct ctg ctg ata ctc ctc tct acg aaa cgt cct399Leu Leu Ile Ser Pro Ala Leu Leu Ile Leu Leu Ser Thr Lys Arg Pro85 90 95cgg acc ccc gtc aaa gcg aaa cct cct cgc cag tcc gct aga gct ggg447Arg Thr Pro Val Lys Ala Lys Pro Pro Arg Gln Ser Ala Arg Ala Gly100 105 110 115aaa gat gac tcg aaa cat gcg aca gcc ttg cca gag tct cta ccc att495Lys Asp Asp Ser Lys His Ala Thr Ala Leu Pro Glu Ser Leu Pro Ile
120 125 130cat cca ttt ctc acg aca tat cgc gcc gcc atg atg gtt atc acg tgc543His Pro Phe Leu Thr Thr Tyr Arg Ala Ala Met Met Val Ile Thr Cys135 140 145atc gct atc ttg gct gtg gat ttt cgc att ttt cct cgc cga ttc gcc591Ile Ala Ile Leu Ala Val Asp Phe Arg Ile Phe Pro Arg Arg Phe Ala150 155 160aag gta gaa aac tgg ggt aca tca ctc atg gat ctg ggc gtt gga tcg639Lys Val Glu Asn Trp Gly Thr Ser Leu Met Asp Leu Gly Val Gly Ser165 170 175ttt gtc ttt tcg ggc gga gta gta tcc gct cgc tca cta ctc aag agc687Phe Val Phe Ser Gly Gly Val Val Ser Ala Arg Ser Leu Leu Lys Ser180 185 190 195agg acc aat ggc tct aaa agg ttg cct ctt gcc aag agg ttg att gcg735Arg Thr Asn Gly Ser Lys Arg Leu Pro Leu Ala Lys Arg Leu Ile Ala200 205 210tcg acg cga cac tct att cct ctg ctc gtc ctc ggc ctg att cgg cta783Ser Thr Arg His Ser Ile Pro Leu Leu Val Leu Gly Leu Ile Arg Leu215 220 225tac agc gtc aaa ggc ttg gac tat gcg gag cac gtc acc gag tac ggc831Tyr Ser Val Lys Gly Leu Asp Tyr Ala Glu His Val Thr Glu Tyr Gly230 235 240gta cat tgg aac ttc ttc ttt aca ttg ggt ctt ttg cct ccg ttc gtg879Val His Trp Asn Phe Phe Phe Thr Leu Gly Leu Leu Pro Pro Phe Val245 250 255gag gtc ttc gac gcc ttg gct acg atc att ccg tca tac gag gtt ctc927Glu Val Phe Asp Ala Leu Ala Thr Ile Ile Pro Ser Tyr Glu Val Leu260 265 270 275tcc gtg ggg atc gcc gtc ttg tat caa gtt gcc cta gag tca aca gac975Ser Val Gly Ile Ala Val Leu Tyr Gln Val Ala Leu Glu Ser Thr Asp280 285 290ttg aaa agc tac atc ctc gtc tcc cct cgt ggg cca agc tta ctg tcc1023Leu Lys Ser Tyr Ile Leu Val Ser Pro Arg Gly Pro Ser Leu Leu Ser
295 300 305aag aat cgt gaa ggc gtc ttc tcc ttc tca ggt tat ctc gcg att ttt1071Lys Asn Arg Glu Gly Val Phe Ser Phe Ser Gly Tyr Leu Ala Ile Phe310 315 320ctt gct ggt cgt gcg atc ggc att cgg ata atc cct cgc gga act tct1119Leu Ala Gly Arg Ala Ile Gly Ile Arg Ile Ile Pro Arg Gly Thr Ser325 330 335ttc tca aga agc cca gaa cag gcc agg aga cgg gtc ctg atc agc ctt1167Phe Ser Arg Ser Pro Glu Gln Ala Arg Arg Arg Val Leu Ile Ser Leu340 345 350 355ggc gtg caa gcg tta gtg tgg acc act ctt ttt gtg ttg aac tcc act1215Gly Val Gln Ala Leu Val Trp Thr Thr Leu Phe Val Leu Asn Ser Thr360 365 370tat gcg atg gga tac gga gct aat atc cct gtc tcc cgc cgc ctc gct1263Tyr Ala Met Gly Tyr Gly Ala Asn Ile Pro Val Ser Arg Arg Leu Ala375 380 385aac atg ccc tat gtc ctt tgg gtt tcg gcg ttc aac acc gcg caa ctg1311Asn Met Pro Tyr Val Leu Trp Val Ser Ala Phe Asn Thr Ala Gln Leu390 395 400ttt gtg ttc tgc ctg atc gaa aca ctc tgc ttt cct gca gtt cat cgg1359Phe Val Phe Cys Leu Ile Glu Thr Leu Cys Phe Pro Ala Val His Arg405 410 415aca acg act caa gag agc gaa tct gag cga gtc gat ttt gct acg agc1407Thr Thr Thr Gln Glu Ser Glu Ser Glu Arg Val Asp Phe Ala Thr Ser420 425 430 435cga atc atg tcg gcc ttc aat aag aac agt ctc gcg atc ttt ctt ttg1455Arg Ile Met Ser Ala Phe Asn Lys Asn Ser Leu Ala Ile Phe Leu Leu440 445 450gcc aat ctt ctg act gga gct gtg aat ctg agc atc tcc aca att gat1503Ala Asn Leu Leu Thr Gly Ala Val Asn Leu Ser Ile Ser Thr Ile Asp455 460 465gct aat aca gcg cag gcc atc gct gtt ctc att gga tat tca tcc att1551Ala Asn Thr Ala Gln Ala Ile Ala Val Leu Ile Gly Tyr Ser Ser Ile
470 475 480atc aca ggg gtt gct cta gca ttg cat cat gcc aat atc aaa gta ctt 1599Ile Thr Gly Val Ala Leu Ala Leu His His Ala Asn Ile Lys Val Leu485 490 495cct ttc tag ggtatttacg agcaattggt ggtgtgttga agatatatag 1648Pro Phe500<210>42<211>27<212>DNA<213>人工的<400>42gccataataa gctaccgaat tgcaatg 27<210>43<211>26<212>DNA<213>人工的<400>43cattaacacc cccattgaca accacg 26<210>44<211>1869<212>DNA<213>新型隐球酵母(Cryptocccus neoformans)<400>44ggggattaca agtcggccaa agaggccttt gtctcggata acccaggtgc ttctatctgg 60agtatcaacg ctgtcagcct ggtcgcactg gtatgtagct cgttctccga ggggttctgt 120catttggaga cgcttattaa ttgggatcgc aggcgacata tgctctctgg atcgccttat 180cgccgtacat ccgtcatgga ctcctgaaca actacctgat ctgtgttctt cccctattat 240tcggggtgac catcttctca acttcgcctc tcgtatttac ctcttttttg tccattattt 300ccctcgcttt catcacgaaa tcccaaaaat gcttcaaatc tgtcagttcg cccgaaaagc 360caaaaggcca atggctagac gaatcagact ccgatgagga accagcggaa cctgcttctg 420cagctggatc tgcagcagtc tcaccagtaa agcttctacc ttcccaagtg gcgttcgctt 480cgggatccct attatctccc gatccgacaa catcccccat gtcgccaagt agttcttcag 540
cttcaggaca tgaagaccct ttggggatta tgggcgttaa cagacggagg tcgctattag 600aaggagtttc gcttgatgtt ccgtcacata tcgactccaa ggtcagaata tctcctgttc 660cctacttgag gctcaaaaag tctagggcaa cgaaggcgca atgggtgaaa gaaaagggaa 720gattaccatt tttgacagtg taccgagcgc acatgatgct catgactgtt atctgcatct 780tggcggtaga ttttgaagtg tttcctagat ggcagggcaa gtgcgaagat tttggtacta 840gtctggtaag ctttccttca gccatggtcc agtgctcacc gctctacttg ccgtagatgg 900acgtgggtgt cgggtcattc gtcttttccc tcggtctcgt ctccacaaaa tctctttctc 960ctccacctcc aactcctacg ccctcctcgc ccgctctcaa ctctcacatc attcccctca1020ccccgtcccc gttcacttcc atcctcatct cgctccgaaa atccatcccc atcctcgtcc1080tcggctttat acggttgatt atggtcaagg gatctgatta tcctgagcat gtgacggagt1140acggcgtgca ctggaatttc ttcttcaccc tcgcattggt tcctgtgctc gccgtgggca1200ttcgaccatt gacgcagtgg cttcgctgga gtgtgcttgg ggtaatcatc tctttgctgc1260atcagctgtg gttaacatat tatctccaat ccatcgtctt ctcattcggc cggtcaggta1320tctttctagc aaacaaggaa ggcttctcct ctcttcctgg ttatctttcc atatttttga1380tcggcttgtc tattggagat catgttttaa ggctcagttt accaccaaga agagagaggg1440tcgtgtcaga aacaaatgaa gagcatgagc agagtcattt tgagagaaaa aaattggatt1500tgattatgga gttgattgga tatagcttag gctggtgggc actcttagga ggctggattt1560gggccggcgg ggaggtatcc aggcgtttag taagtggaca tctttggtaa tattgtacct1620atactaatcc ctgcataaag gccaacgctc cttatgtatt ttgggtagcg gcatacaata1680ccacctttct cctcggctac ctcctcctta cccacattat tccatctccc acctcttccc1740aaacatcacc atcgatctta gtgcctccct tgctcgacgc tatgaataaa aacggtctcg1800cgatattttt ggcggccaac ttgcttacag gactggtgaa tgtgagcatg aagacaatgt1860atgcgccgg1869<210>45<211>27<212>DNA<213>人工的<400>45gtaaaggaag gcgctagaaa agatatg 27<210>46<211>26<212>DNA<213>人工的<400>46ctcatcggag tctgattcgt ctagcc 26<210>47
<211>470<212>DNA<213>新型隐球酵母(Cryptocccus neoformans)<400>47gaaggcgcta gaaaagatat ggtcttgtca tagcattaaa tccccgccat aataagctac 60tgaattgcaa tgggggatta caagtcggcc aaagaggcct ttgtctcgga taacccaggt 120gcttctatct ggagtatcaa cgctgtcagc ctggtcgcac tggtatgtag ctcgttctcc 180gaggggttct gtcatttgga gacgcttatt aattgggatc gcaggcgaca tatgctctct 240ggatcgcctt atcgccgtac atccgtcatg gactcctgaa caactacctg atctgtgttc 300ttcccctatt attcggggtg accatcttct caacttcgcc tctcgtattt acctcttttt 360tgtccattat ttccctcgct ttcatcacga aatcccaaaa atgcttcaaa tctgtcagtt 420cgcccgaaaa gccaaaaggc caatggctag acgaatcaga ctccgatgag 470<210>48<211>37<212>DNA<213>人工的<400>48gcccacgcgt cgactagtac tttttttttt ttttttt 37<210>49<211>29<212>DNA<213>人工的<400>49catcttggcg gtagattttg aagtgttcc26<210>50<211>20<212>DNA<213>人工的<400>50ggccacgcgt cgactagtac 20<210>51<211>1136
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<211>2045<212>DNA<213>新型隐球酵母(Cryptocccus neoformans)<220>
<221>内含子<222>(137)..(198)<220>
<221>内含子<222>(892)..(942)<220>
<221>内含子<222>(1636)..(1686)<220>
<221>CDS<222>(44)..(2001)<400>54gtcatagcat taaatccccg ccataataag ctactgaatt gca atg ggg gat tac55Met Gly Asp Tyr1aag tcg gcc aaa gag gcc ttt gtc tcg gat aac cca ggt gct tct atc103Lys Ser Ala Lys Glu Ala Phe Val Ser Asp Asn Pro Gly Ala Ser Ile5 10 15 20tgg agt atc aac gct gtc agc ctg gtc gca ctg gtatgtagct cgttctccga 156Trp Ser Ile Asn Ala Val Ser Leu Val Ala Leu25 30ggggttctgt catttggaga cgcttattaa ttgggatcgc ag gcg aca tat gct 210Ala Thr Tyr Ala35ctc tgg atc gcc tta tcg ccg tac atc cgt cat gga ctc ctg aac aac258Leu Trp Ile Ala Leu Ser Pro Tyr Ile Arg His Gly Leu Leu Asn Asn40 45 50tac ctg atc tgt gtt ctt ccc cta tta ttc ggg gtg acc atc ttc tca306Tyr Leu Ile Cys Val Leu Pro Leu Leu Phe Gly Val Thr Ile Phe Ser55 60 65act tcg cct ctc gta ttt acc tct ttt ttg tcc att att tcc ctc gct354Thr Ser Pro Leu Val Phe Thr Ser Phe Leu Ser Ile Ile Ser Leu Ala70 75 80ttc atc acg aaa tcc caa aaa tgc ttc aaa tct gtc agt tcg ccc gaa402Phe Ile Thr Lys Ser Gln Lys Cys Phe Lys Ser Val Ser Ser Pro Glu
85 90 95aag cca aaa ggc caa tgg cta gac gaa tca gac tcc gat gag gaa cca 450Lys Pro Lys Gly Gln Trp Leu Asp Glu Ser Asp Ser Asp Glu Glu Pro100 105 110 115gcg gaa cct gct tct gca gct gga tct gca gca gtc tca cca gta aag 498Ala Glu Pro Ala Ser Ala Ala Gly Ser Ala Ala Val Ser Pro Val Lys120 125 130ctt cta cct tcc caa gtg gcg ttc gct tcg gga tcc cta tta tct ccc 546Leu Leu Pro Ser Gln Val Ala Phe Ala Ser Gly Ser Leu Leu Ser Pro135 140 145gat ccg aca aca tcc ccc atg tcg cca agt agt tct tca gct tca gga 594Asp Pro Thr Thr Ser Pro Met Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ala Ser Gly150 155 160cat gaa gac cct ttg ggg att atg ggc gtt aac aga cgg agg tcg cta 642His Glu Asp Pro Leu Gly Ile Met Gly Val Asn Arg Arg Arg Ser Leu165 170 175tta gaa gga gtt tcg ctt gat gtt ccg tca cat atc gac tcc aag gtc 690Leu Glu Gly Val Ser Leu Asp Val Pro Ser His Ile Asp Ser Lys Val180 185 190 195aga ata tct cct gtt ccc tac ttg agg ctc aaa aag tct agg gca acg 738Arg Ile Ser Pro Val Pro Tyr Leu Arg Leu Lys Lys Ser Arg Ala Thr200 205 210aag gcg caa tgg gtg aaa gaa aag gga aga tta cca ttt ttg aca gtg 786Lys Ala Gln Trp Val Lys Glu Lys Gly Arg Leu Pro Phe Leu Thr Val215 220 225tac cga gcg cac atg atg ctc atg act gtt atc tgc atc ttg gcg gta 834Tyr Arg Ala His Met Met Leu Met Thr Val Ile Cys Ile Leu Ala Val230 235 240gat ttt gaa gtg ttt cct aga tgg cag ggc aag tgc gaa gat ttt ggt 882Asp Phe Glu Val Phe Pro Arg Trp Gln Gly Lys Cys Glu Asp Phe Gly245 250 255act agt ctg gtaagctttc cttcagccat ggtccagtgc tcaccgctct 931Thr Ser Leu260acttgccgta g atg gac gtg ggt gtc ggg tca ttc gtc ttt tcc ctc ggt981Met Asp Val Gly Val Gly Ser Phe Val Phe Ser Leu Gly265 270 275ctc gtc tcc aca aaa tct ctt tct cct cca cct cca act cct acg ccc1029Leu Val Ser Thr Lys Ser Leu Ser Pro Pro Pro Pro Thr Pro Thr Pro280 285 290tcc tcg ccc gct ctc aac tct cac atc att ccc ctc acc ccg tcc ccg1077Ser Ser Pro Ala Leu Asn Ser His Ile Ile Pro Leu Thr Pro Ser Pro295 300 305ttc act tcc atc ctc atc tcg ctc cga aaa tcc atc ccc atc ctc gtc1125
Phe Thr Ser Ile Leu Ile Ser Leu Arg Lys Ser Ile Pro Ile Leu Val310 315 320ctc ggc ttt ata cgg ttg att atg gtc aag gga tct gat tat cct gag1173Leu Gly Phe Ile Arg Leu Ile Met Val Lys Gly Ser Asp Tyr Pro Glu325 330 335cat gtg acg gag tac ggc gtg cac tgg aat ttc ttc ttc acc ctc gca1221His Val Thr Glu Tyr Gly Val His Trp Asn Phe Phe Phe Thr Leu Ala340 345 350 355ttg gtt cct gtg ctc gcc gtg ggc att cga cca ttg acg cag tgg ctt1269Leu Val Pro Val Leu Ala Val Gly Ile Arg Pro Leu Thr Gln Trp Leu360 365 370cgc tgg agt gtg ctt ggg gta atc atc tct ttg ctg cat cag ctg tgg1317Arg Trp Ser Val Leu Gly Val Ile Ile Ser Leu Leu His Gln Leu Trp375 380 385tta aca tat tat ctc caa tcc atc gtc ttc tca ttc ggc cgg tca ggt1365Leu Thr Tyr Tyr Leu Gln Ser Ile Val Phe Ser Phe Gly Arg Ser Gly390 395 400atc ttt cta gca aac aag gaa ggc ttc tcc tct ctt cct ggt tat ctt1413Ile Phe Leu Ala Asn Lys Glu Gly Phe Ser Ser Leu Pro Gly Tyr Leu405 410 415tcc ata ttt ttg atc ggc ttg tct att gga gat cat gtt tta agg ctc1461Ser Ile Phe Leu Ile Gly Leu Ser Ile Gly Asp His Val Leu Arg Leu420 425 430 435agt tta cca cca aga aga gag agg gtc gtg tca gaa aca aat gaa gag1509Ser Leu Pro Pro Arg Arg Glu Arg Val Val Ser Glu Thr Asn Glu Glu440 445 450cat gag cag agt cat ttt gag aga aaa aaa ttg gat ttg att atg gag1557His Glu Gln Ser His Phe Glu Arg Lys Lys Leu Asp Leu Ile Met Glu455 460 465ttg att gga tat agc tta ggc tgg tgg gca ctc tta gga ggc tgg att1605Leu Ile Gly Tyr Ser Leu Gly Trp Trp Ala Leu Leu Gly Gly Trp Ile470 475 480tgg gcc ggc ggg gag gta tcc agg cgt tta gtaagtggac atctttggta 1655Trp Ala Gly Gly Glu Val Ser Arg Arg Leu485 490atattgtacc tatactaatc cctgcataaa g gcc aac gct cct tat gta ttt 1707Ala Asn Ala Pro Tyr Val Phe495 500tgg gta gcg gca tac aat acc acc ttt ctc ctc ggc tac ctc ctc ctt1755Trp Val Ala Ala Tyr Asn Thr Thr Phe Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Leu505 510 515acc cac att att cca tct ccc acc tct tcc caa aca tca cca tcg atc1803Thr His Ile Ile Pro Ser Pro Thr Ser Ser Gln Thr Ser Pro Ser Ile520 525 530
tta gtg cct ccc ttg ctc gac gct atg aat aaa aac ggt ctc gcg ata 1851Leu Val Pro Pro Leu Leu Asp Ala Met Asn Lys Asn Gly Leu Ala Ile535 540 545ttt ttg gcg gcc aac ttg ctt aca gga ctg gtg aat gtg agc atg aag 1899Phe Leu Ala Ala Asn Leu Leu Thr Gly Leu Val Asn Val Ser Met Lys550 555 560aca atg tat gcg ccg gcg tgg ttg tca atg ggg gtg tta atg ttg tat 1947Thr Met Tyr Ala Pro Ala Trp Leu Ser Met Gly Val Leu Met Leu Tyr565 570 575 580acc ttg aca atc agt tgt gta ggg tgg ata ctg aaa gga cgg agg atc 1995Thr Leu Thr Ile Ser Cys Val Gly Trp Ile Leu Lys Gly Arg Arg Ile585 590 595aag ata tagttaaagt gtttaccatg caggatactg agtatctcgg ttca 2045Lys Ile<210>55<211>23<212>DNA<213>人工的<400>55cagcctggtc gcactggcga cat 23<210>56<211>25<212>DNA<213>人工的<400>56cataaggagc gttggctaaa cgcct 25<210>57<211>1418<212>DNA<213>新型隐球酵母(Cryptocccus neoformans)<400>57cagcctggtc gcactggcga catatgctct ctggatcgcc ttatcgccgt acatccgtca 60tggactcctg aacaactacc tgatctgtgt tcttccccta ttattcgggg tgaccatctt 120ctcaacttcg cctctcgtat ttacctcttt tttgtccatt atttccctcg ctttcatcac 180gaaatcccaa aaatgcttca aatctgtcag ttcgcccgaa aagccaaaag gccaatggct 240
agacgaatca gactccgatg aggaaccagc ggaacctgct tctgcagctg gatctgcagc 300agtctcacca gtaaagcttc taccttccca agtggcgttc gcttcgggat ccctattatc 360tcccgatccg acaacatccc ccatgtcgcc aagtagttct tcagcttcag gacatgaaga 420ccctttgggg attatgggcg ttaacagacg gaggtcgcta ttagaaggag tttcgcttga 480tgttccgtca catatcgact ccaaggtcag aatatctcct gttccctact tgaggctcaa 540aaagtctagg gcaacgaagg cgcaatgggt gaaagaaaag ggaagattac catttttgac 600agtgtaccga gcgcacatga tgctcatgac tgttatctgc atcttggcgg tagattttga 660agtgtttcct agatggcagg gcaagtgcga agattttggt actagtctga tggacgtggg 720tgtcgggtca ttcgtctttt ccctcggtct cgtctccaca aaatctcttt ctcctccacc 780tccaactcct acgccctcct cgcccgctct caactctcac atcattcccc tcaccccgtc 840cccgttcact tccatcctca tctcgctccg aaaatccatc cccatcctcg tcctcggctt 900tatacggttg attatggtca agggatctga ttatcctgag catgtgacgg agtacggcgt 960gcactggaat ttcttcttca ccctcgcatt ggttcctgtg ctcgccgtgg gcattcgacc 1020attgacgcag tggcttcgct ggagtgtgct tggggtaatc atctctttgc tgcatcagct 1080gtggttaaca tattatctcc aatccatcgt cttctcattc ggccggtcag gtatctttct 1140agcaaacaag gaaggcttct cctctcttcc tggttatctt tccatatttt tgatcggctt 1200gtctattgga gatcatgttt taaggctcag tttaccacca agaagagaga gggtcgtgtc 1260agaaacaaat gaagagcatg agcagagtca ttttgagaga aaaaaattgg atttgattat 1320ggagttgatt ggatatagct taggctggtg ggcactctta ggaggctgga tttgggccgg 1380cggggaggta tccaggcgtt tagccaacgc tccttatg 1418<210>58<211>1797<212>DNA<213>新型隐球酵母(Cryptocccus neoformans)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1794)<400>58atg ggg gat tac aag tcg gcc aaa gag gcc ttt gtc tcg gat aac cca 48Met Gly Asp Tyr Lys Ser Ala Lys Glu Ala Phe Val Ser Asp Asn Pro1 5 10 15ggt gct tct atc tgg agt atc aac gct gtc agc ctg gtc gca ctg gcg 96Gly Ala Ser Ile Trp Ser Ile Asn Ala Val Ser Leu Val Ala Leu Ala20 25 30aca tat gct ctc tgg atc gcc tta tcg ccg tac atc cgt cat gga ctc 144Thr Tyr Ala Leu Trp Ile Ala Leu Ser Pro Tyr Ile Arg His Gly Leu35 40 45ctg aac aac tac ctg atc tgt gtt ctt ccc cta tta ttc ggg gtg acc 192Leu Asn Asn Tyr Leu Ile Cys Val Leu Pro Leu Leu Phe Gly Val Thr50 55 60
atc ttc tca act tcg cct ctc gta ttt acc tct ttt ttg tcc att att240Ile Phe Ser Thr Ser Pro Leu Val Phe Thr Ser Phe Leu Ser Ile Ile65 70 75 80tcc ctc gct ttc atc acg aaa tcc caa aaa tgc ttc aaa tct gtc agt288Ser Leu Ala Phe Ile Thr Lys Ser Gln Lys Cys Phe Lys Ser Val Ser85 90 95tcg ccc gaa aag cca aaa ggc caa tgg cta gac gaa tca gac tcc gat336Ser Pro Glu Lys Pro Lys Gly Gln Trp Leu Asp Glu Ser Asp Ser Asp100 105 110gag gaa cca gcg gaa cct gct tct gca gct gga tct gca gca gtc tca384Glu Glu Pro Ala Glu Pro Ala Ser Ala Ala Gly Ser Ala Ala Val Ser115 120 125cca gta aag ctt cta cct tcc caa gtg gcg ttc gct tcg gga tcc cta432Pro Val Lys Leu Leu Pro Ser Gln Val Ala Phe Ala Ser Gly Ser Leu130 135 140tta tct ccc gat ccg aca aca tcc ccc atg tcg cca agt agt tct tca480Leu Ser Pro Asp Pro Thr Thr Ser Pro Met Ser Pro Ser Ser Ser Ser145 150 155 160gct tca gga cat gaa gac cct ttg ggg att atg ggc gtt aac aga cgg528Ala Ser Gly His Glu Asp Pro Leu Gly Ile Met Gly Val Asn Arg Arg165 170 175agg tcg cta tta gaa gga gtt tcg ctt gat gtt ccg tca cat atc gac576Arg Ser Leu Leu Glu Gly Val Ser Leu Asp Val Pro Ser His Ile Asp180 185 190tcc aag gtc aga ata tct cct gtt ccc tac ttg agg ctc aaa aag tct624Ser Lys Val Arg Ile Ser Pro Val Pro Tyr Leu Arg Leu Lys Lys Ser195 200 205agg gca acg aag gcg caa tgg gtg aaa gaa aag gga aga tta cca ttt672Arg Ala Thr Lys Ala Gln Trp Val Lys Glu Lys Gly Arg Leu Pro Phe210 215 220ttg aca gtg tac cga gcg cac atg atg ctc atg act gtt atc tgc atc720Leu Thr Val Tyr Arg Ala His Met Met Leu Met Thr Val Ile Cys Ile225 230 235 240ttg gcg gta gat ttt gaa gtg ttt cct aga tgg cag ggc aag tgc gaa768Leu Ala Val Asp Phe Glu Val Phe Pro Arg Trp Gln Gly Lys Cys Glu245 250 255gat ttt ggt act agt ctg atg gac gtg ggt gtc ggg tca ttc gtc ttt816Asp Phe Gly Thr Ser Leu Met Asp Val Gly Val Gly Ser Phe Val Phe260 265 270tcc ctc ggt ctc gtc tcc aca aaa tct ctt tct cct cca cct cca act864Ser Leu Gly Leu Val Ser Thr Lys Ser Leu Ser Pro Pro Pro Pro Thr275 280 285cct acg ccc tcc tcg ccc gct ctc aac tct cac atc att ccc ctc acc912Pro Thr Pro Ser Ser Pro Ala Leu Asn Ser His Ile Ile Pro Leu Thr
290 295 300ccg tcc ccg ttc act tcc atc ctc atc tcg ctc cga aaa tcc atc ccc960Pro Ser Pro Phe Thr Ser Ile Leu Ile Ser Leu Arg Lys Ser Ile Pro305 310 315 320atc ctc gtc ctc ggc ttt ata cgg ttg att atg gtc aag gga tct gat1008Ile Leu Val Leu Gly Phe Ile Arg Leu Ile Met Val Lys Gly Ser Asp325 330 335tat cct gag cat gtg acg gag tac ggc gtg cac tgg aat ttc ttc ttc1056Tyr Pro Glu His Val Thr Glu Tyr Gly Val His Trp Asn Phe Phe Phe340 345 350acc ctc gca ttg gtt cct gtg ctc gcc gtg ggc att cga cca ttg acg1104Thr Leu Ala Leu Val Pro Val Leu Ala Val Gly Ile Arg Pro Leu Thr355 360 365cag tgg ctt cgc tgg agt gtg ctt ggg gta atc atc tct ttg ctg cat1152Gln Trp Leu Arg Trp Ser Val Leu Gly Val Ile Ile Ser Leu Leu His370 375 380cag ctg tgg tta aca tat tat ctc caa tcc atc gtc ttc tca ttc ggc1200Gln Leu Trp Leu Thr Tyr Tyr Leu Gln Ser Ile Val Phe Ser Phe Gly385 390 395 400cgg tca ggt atc ttt cta gca aac aag gaa ggc ttc tcc tct ctt cct1248Arg Ser Gly Ile Phe Leu Ala Asn Lys Glu Gly Phe Ser Ser Leu Pro405 410 415ggt tat ctt tcc ata ttt ttg atc ggc ttg tct att gga gat cat gtt1296Gly Tyr Leu Ser Ile Phe Leu Ile Gly Leu Ser Ile Gly Asp His Val420 425 430tta agg ctc agt tta cca cca aga aga gag agg gtc gtg tca gaa aca1344Leu Arg Leu Ser Leu Pro Pro Arg Arg Glu Arg Val Val Ser Glu Thr435 440 445aat gaa gag cat gag cag agt cat ttt gag aga aaa aaa ttg gat ttg1392Asn Glu Glu His Glu Gln Ser His Phe Glu Arg Lys Lys Leu Asp Leu450 455 460att atg gag ttg att gga tat agc tta ggc tgg tgg gca ctc tta gga1440Ile Met Glu Leu Ile Gly Tyr Ser Leu Gly Trp Trp Ala Leu Leu Gly465 470 475 480ggc tgg att tgg gcc ggc ggg gag gta tcc agg cgt tta gcc aac gct1488Gly Trp Ile Trp Ala Gly Gly Glu Val Ser Arg Arg Leu Ala Asn Ala485 490 495cct tat gta ttt tgg gta gcg gca tac aat acc acc ttt ctc ctc ggc1536Pro Tyr Val Phe Trp Val Ala Ala Tyr Asn Thr Thr Phe Leu Leu Gly500 505 510tac ctc ctc ctt acc cac att att cca tct ccc acc tct tcc caa aca1584Tyr Leu Leu Leu Thr His Ile Ile Pro Ser Pro Thr Ser Ser Gln Thr515 520 525tca cca tcg atc tta gtg cct ccc ttg ctc gac gct atg aat aaa aac1632
Ser Pro Ser Ile Leu Val Pro Pro Leu Leu Asp Ala Met Asn Lys Asn530 535 540ggt ctc gcg ata ttt ttg gcg gcc aac ttg ctt aca gga ctg gtg aat 1680Gly Leu Ala Ile Phe Leu Ala Ala Asn Leu Leu Thr Gly Leu Val Asn545 550 555 560gtg agc atg aag aca atg tat gcg ccg gcg tgg ttg tca atg ggg gtg 1728Val Ser Met Lys Thr Met Tyr Ala Pro Ala Trp Leu Ser Met Gly Val565 570 575tta atg ttg tat acc ttg aca atc agt tgt gta ggg tgg ata ctg aaa 1776Leu Met Leu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Cys Val Gly Trp Ile Leu Lys580 585 590gga cgg agg atc aag ata tag 1797Gly Arg Arg Ile Lys Ile595<210>59<211>598<212>PRT<213>新型隐球酵母(Cryptocccus neoformans)<400>59Met Gly Asp Tyr Lys Ser Ala Lys Glu Ala Phe Val Ser Asp Asn Pro1 5 10 15Gly Ala Ser Ile Trp Ser Ile Asn Ala Val Ser Leu Val Ala Leu Ala20 25 30Thr Tyr Ala Leu Trp Ile Ala Leu Ser Pro Tyr Ile Arg His Gly Leu35 40 45Leu Asn Asn Tyr Leu Ile Cys Val Leu Pro Leu Leu Phe Gly Val Thr50 55 60Ile Phe Ser Thr Ser Pro Leu Val Phe Thr Ser Phe Leu Ser Ile Ile65 70 75 80Ser Leu Ala Phe Ile Thr Lys Ser Gln Lys Cys Phe Lys Ser Val Ser85 90 95Ser Pro Glu Lys Pro Lys Gly Gln Trp Leu Asp Glu Ser Asp Ser Asp100 105 110Glu Glu Pro Ala Glu Pro Ala Ser Ala Ala Gly Ser Ala Ala Val Ser115 120 125Pro Val Lys Leu Leu Pro Ser Gln Val Ala Phe Ala Ser Gly Ser Leu130 135 140Leu Ser Pro Asp Pro Thr Thr Ser Pro Met Ser Pro Ser Ser Ser Ser145 150 155 160Ala Ser Gly His Glu Asp Pro Leu Gly Ile Met Gly Val Asn Arg Arg165 170 175
Arg Ser Leu Leu Glu Gly Val Ser Leu Asp Val Pro Ser His Ile Asp180 185 190Ser Lys Val Arg Ile Ser Pro Val Pro Tyr Leu Arg Leu Lys Lys Ser195 200 205Arg Ala Thr Lys Ala Gln Trp Val Lys Glu Lys Gly Arg Leu Pro Phe210 215 220Leu Thr Val Tyr Arg Ala His Met Met Leu Met Thr Val Ile Cys Ile225 230 235 240Leu Ala Val Asp Phe Glu Val Phe Pro Arg Trp Gln Gly Lys Cys Glu245 250 255Asp Phe Gly Thr Ser Leu Met Asp Val Gly Val Gly Ser Phe Val Phe260 265 270Ser Leu Gly Leu Val Ser Thr Lys Ser Leu Ser Pro Pro Pro Pro Thr275 280 285Pro Thr Pro Ser Ser Pro Ala Leu Asn Ser His Ile Ile Pro Leu Thr290 295 300Pro Ser Pro Phe Thr Ser Ile Leu Ile Ser Leu Arg Lys Ser Ile Pro305 310 315 320Ile Leu Val Leu Gly Phe Ile Arg Leu Ile Met Val Lys Gly Ser Asp325 330 335Tyr Pro Glu His Val Thr Glu Tyr Gly Val His Trp Asn Phe Phe Phe340 345 350Thr Leu Ala Leu Val Pro Val Leu Ala Val Gly Ile Arg Pro Leu Thr355 360 365Gln Trp Leu Arg Trp Ser Val Leu Gly Val Ile Ile Ser Leu Leu His370 375 380Gln Leu Trp Leu Thr Tyr Tyr Leu Gln Ser Ile Val Phe Ser Phe Gly385 390 395 400Arg Ser Gly Ile Phe Leu Ala Asn Lys Glu Gly Phe Ser Ser Leu Pro405 410 415Gly Tyr Leu Ser Ile Phe Leu Ile Gly Leu Ser Ile Gly Asp His Val420 425 430Leu Arg Leu Ser Leu Pro Pro Arg Arg Glu Arg Val Val Ser Glu Thr435 440 445Asn Glu Glu His Glu Gln Ser His Phe Glu Arg Lys Lys Leu Asp Leu450 455 460Ile Met Glu Leu Ile Gly Tyr Ser Leu Gly Trp Trp Ala Leu Leu Gly465 470 475 480Gly Trp Ile Trp Ala Gly Gly Glu Val Ser Arg Arg Leu Ala Asn Ala485 490 495Pro Tyr Val Phe Trp Val Ala Ala Tyr Asn Thr Thr Phe Leu Leu Gly500 505 510Tyr Leu Leu Leu Thr His Ile Ile Pro Ser Pro Thr Ser Ser Gln Thr515 520 525
Ser Pro Ser Ile Leu Val Pro Pro Leu Leu Asp Ala Met Asn Lys Asn530 535 540Gly Leu Ala Ile Phe Leu Ala Ala Asn Leu Leu Thr Gly Leu Val Asn545 550 555 560Val Ser Met Lys Thr Met Tyr Ala Pro Ala Trp Leu Ser Met Gly Val565 570 575Leu Met Leu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Cys Val Gly Trp Ile Leu Lys580 585 590Gly Arg Arg Ile Lys Ile595<210>60<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>60aaagaattca tggcaacagt acatcagaag30<210>61<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>61gggcactgtt gaaaaaccta 20<210>62<211>1428<212>DNA<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>启动子<222>(1)..(1428)<400>62
gttgttcaaa atgggggtaa aattgagacg tcttacttga gcggcattta cgatcattct60tattacatca ttccaagtaa taaagctctt gactccttca atgatttacc tgagattata 120gatgataatg atggtatagt tacagaattt ttcattgaac gctgcttgta ttatcaaaaa 180ttactacacc caatagattt atggtcaaaa cccttcctca gcacaataga gtttcaagtt 240tcgtcttctt caaagttatt gcatcatgaa ttttcttctt ccccttttct gaatgttact 300atcactggat tctctggcgt agagctgtta catctgacta aagtattaaa tcttctaaaa 360ccaatgggca tcaattatgt agaatacctc aataaatcca ctgacattct gctaatcaac 420ttagcagctt tacccagtat cccgaaaacc catccgttat ggtcgaatga atttagcgat 480ctttttactc agttttgcat taataacaat aatgatgatc ctggtgataa taacagaaaa 540gattttcaaa ataattcaat cttgagaaat tcgatgaaaa ggaaaattga atatatcaag 600aaattccact ccataccggt agttactcca gcatttattt ttaaattatt gtccgctgca 660tctggagaaa ataatgaaat ctttttaaac aatatcaagt ggtgtattat ctgcccaaga 720ggacacaagg acgattttaa atgtaagata aaaaaaccat actataccag cattagttca 780gaaaaaaagt accaaaacaa tgatccaaaa atcgacaaaa ctattctttt gaaaagaaac 840aattcctcat tatcggagca ctctatgaaa gataccaaaa acgaattatt gcagaaaatt 900agagaaactg attctggaag aaaaaagcgt agtgtctcat cgagtatcat ggatgtttct 960tcagagagac aaatgccgga tacgaaaagg atcaagttgg agtcactgcc aaaaaatttc 1020gttcctaaac aaattaaacg aaccacgagt tggggcacaa taatgtcaga aaatgtgcct 1080acagagcagc cgactgcaat ttctaatcca gaagagatcc caagaactga ggaagtttca 1140catactcaag ttacctatgg ctccattcaa gataagaaac gtactgcctc tttagaaaaa 1200cctatgagac gacagacaag aaatcagaca aaggaattag attcttgaaa tgtagtccgt 1260aattttataa gatattcatt tacatacgcc atctacagca ttattcaaat ctactcatct 1320atatgtatta ccgttttgta tgataatact ttccatgaca tgctcgcgtg aaaaaacagc 1380atgagaaaaa gaggatcgca ataagaagac acgtaaatat ctaaataa 1428<210>63<211>133<212>DNA<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>终止子<222>(1)..(133)<400>63taacacacca tccacatttc catgtagttc gtatacaaac cctaccagta aaataaaatt 60aactcctatg tgctttaaat aaaaattata aaccgcctcc aatagttgac gtagtcaggc 120atgaaagtgc tac 13权利要求
1.一种编码蛋白质的DNA，当该DNA过量表达在真菌中时，所述蛋白质具有赋予真菌耐受式(Ia)所示化合物的活性，其中该DNA选自(a)编码包含SEQ ID NO40的氨基酸序列的蛋白质的DNA，(b)包含SEQ ID NO39或41的核苷酸序列的DNA，(c)在严谨条件下与包含SEQ ID NO39或41的核苷酸序列的DNA杂交的DNA，(d)编码蛋白质的DNA，其中所述蛋白包含SEQ ID NO40的氨基酸序列且增加、缺失、取代和/或插入一个或多个氨基酸，及
2.一种编码蛋白质的DNA，该蛋白质具有降低真菌细胞壁中GPI-锚定蛋白质的量的活性，其中所述活性是由于该DNA功能缺陷，并且其中该DNA选自(a)编码包含SEQ ID NO40的氨基酸序列的蛋白质的DNA，(b)包含SEQ ID NO39或41的核苷酸序列的DNA，(c)在严谨条件下与包含SEQ ID NO39或41的核苷酸序列的DNA杂交的DNA，(d)编码蛋白质的DNA，所述蛋白质包含SEQ ID NO40的氨基酸序列且其中增加、缺失、取代和/或插入一个或多个氨基酸。
3.通过权利要求1或2的DNA编码的蛋白质。
4.其中插入了权利要求1或2的DNA的载体。
5.包含权利要求1或2的DNA或者权利要求4的载体的转化体。
6.权利要求5的转化体，其为过量表达权利要求3的蛋白质的真菌。
7.一种真菌，其中权利要求3的蛋白质的功能有缺陷。
8.一种制备权利要求3的蛋白质的方法，该方法包括培养权利要求5的转化体，并由该转化体或其培养上清液收集所表达的蛋白质的步骤。
9.一种与权利要求3的蛋白质结合的抗体。
10.一种筛选具有抗真菌作用的化合物的方法，其中该方法包括以下步骤(a)使试样与权利要求3的蛋白质接触；(b)检测该蛋白质与试样之间的结合活性；及(c)选取具有与该蛋白质结合活性的化合物。
11.一种筛选具有抗真菌作用的化合物的方法，其中该方法包括以下步骤(a)使试样与过量表达权利要求3的蛋白质的真菌接触；(b)检测GPI-锚定蛋白质转运到真菌细胞壁上的量；及(c)选取使步骤(b)中所检测的GPI-锚定蛋白质转动到真菌细胞壁上的量比试样与未过量表达权利要求3的蛋白质的真菌接触时所检测到的转运量减少的化合物。
12.一种具有抗真菌作用的化合物，其是通过权利要求10或11的筛选方法分离的。
13.一种抗真菌剂，其包含权利要求9的抗体或者权利要求12的化合物作为活性成分。
14.一种治疗真菌感染的方法，包括将治疗有效量的权利要求13的抗真菌剂给药于哺乳动物。
全文摘要
构建一种反映将GPI－锚定蛋白质转运到细胞壁的过程的报告系统，并且公开了抑制该转运过程的化合物。此外，确定赋予上述化合物以耐受性的基因，并且揭示筛选化合物的方法，该化合物抑制由该基因编码的蛋白质的活性。因此，该新化合物提供了依据新机制的抗真菌剂，所述机制中，GPI－锚定蛋白质转运到细胞壁的过程受到抑制。
文档编号A61K39/395GK1873003SQ20061009411
公开日2006年12月6日 申请日期2001年7月6日 优先权日2000年7月7日
发明者塚原克平, 畑桂, 相根康司, 中本和孝, 土谷满美子, 渡边直彰, 大场史记, 塚田格, 上田教博, 田中圭悟, 甲斐纯子 申请人:卫材株式会社