专利名称：：基于5SrRNA间隔序列的草药鉴定方法
技术领域：
：本发明涉及通过分析DNA序列鉴定草药或植物的方法。特别地，本发明涉及基于5SrRNA间隔区域基因组DNA序列的草药鉴定方法。
背景技术：
：天然资源，例如植物产品(草药)、动物产品和矿物质，在世界上的很多地方都已经被长时间用于健康和医疗用途、治疗或预防疾病。现在，尽管现代药物有很大的发展，但在很多国家那些传统药材的市场仍很繁荣。例如在许多亚洲国家里，一些人把它们用作主要治疗方法，而另一些人把它们用作辅助治疗方法。在传统药材中，植物产品(或草药)是主要成分。草药通常是各种植物的经过加工的部分，例如根、茎、叶、花、果实、种子等等。从最初开始，对于将草药用于医疗目的的人们来说草药鉴定就是一个巨大的挑战。当使用了错误的草药时，它们可能会是无效的，并因此耽误疾病的治疗，或者它们可能使病情恶化，甚至导致死亡。草药的错误鉴别可以是无意的(加工后的植物部分通常难以区分)或者是有意的(受到利益驱使的商家有时用看上去相似的较便宜的草药替换昂贵的草药)。传统上，人们通过观其外表、嗅其气味和/或品其味道鉴定草药，并且这些方法中的一些仍旧在被应用。后来，草药通过在显微镜下观察而鉴定，在这里各种植物细胞的形状和内容物被检测和分析。这些基于器官感觉标志或解剖学特征的方法有时是不确定的。分析色谱例如薄层色谱、高效液相色谱、或液相色谱/质谱被用于草药鉴定。然而，化学表征(chemicalprofile)是多变的，并且可以被真实性(authenticity)之外的其它因素所影响。最近以来，利用现代生物技术，将在某些区域内的基因组DNA片段通过聚合酶链反应(PCR)扩增并进行限制酶消化，从而产生限制性消化模式，这接下来被用于基于与标准模式(已知样品)对比而确认某些特定草药的真实性(见美国专利号5，876，977、6，309，840和6,803,215)。然而，即使是这些现代鉴定技术也不能被广泛用于所有草药物种。仍需要开发基于各个独立物种的可靠的鉴定方法。发明概述本发明提供了新的技术以鉴定百部属(^mo加)的草药或植物。这—属的三个物种蔓生百部(&ewo"ay'^o"/ca)、直立百部(S.1sew//z/o//a)和对叶百部CS.rt^era^)在中国被官方认定为草药百部(i^fcc^emo"fle)的来源(所述植物干燥块根(roottuber))。本发明的鉴定方法是基于对5SrRNA间隔区域的DNA序列的分析。使用这些区域作为分子标记，本发明的技术提供了一种用于鉴定百部的可靠的方法，没有本方法，这将是一件很有挑战性的任务，因为不同百部属物种的干燥块根和掺杂物在外表上非常相似，而它们的化学表征是变化相当大的。本发明的一方面提供了用于鉴定百部的可重复的及客观的方法。所述方法简单并且可在任何标准分子生物学实验室中实施。在本发明一个特定的实施方案中，代表6个百部属物种的17个样品以及一种天门冬属C4^arag^)物种被用于本发明的鉴定方法。概括说来，所述鉴定过程包括下面的步骤的一些或全部(a)从植物材料样品(新鲜的或干燥的植物)中提取DNA;(b)通过PCR(聚合酶链反应)扩增DNA提取物；(c)将PCR产物插入到载体中，然后将其转化进感受态细胞，培养各个感受态细胞克隆并提取所述质粒DNA;(d)将各个克隆的经扩增的质粒DNA测序；(e)将不同样品的序列和/或得自标准序列的序列进行比较和排列对比；(f)计算在样品自身间的相似性百分比或与所述标准序列的相似性百分比。关于真实性的结论可以基于对每一个样品所获得的相似性百分比得到，或基于通过各种DNA序列分析生成的系统发生树或简约树(parsimonioustree)得到。根据本发明的一个目的，本发明提供了多个新的DNA序列用作实施本发明的鉴定方法的标准序列。下面的DNA序列是用于实施本发明的标准物。每一个列出的序列都可以以其全长用作进行对比的标准序列。或者一条列出的序列的一部分，从10%到100%(即等同于全长序列)，都可以用作实施本发明的标准序列。在下面描述的特殊实施方案中，所述列出的序列的100%部分被用作标准序列。本领域技术人员可以容易地使用所提供的标准序列的较小部分，并且可以针对特定的鉴定任务确定所述部分的最佳大小。当然，本发明还包括如下内容，即包含所列出的一种序列的更大的DNA序列也可用作所述标准序列以通过使用不同的引物实施本发明。附图简述图1示出了百部属物种和羊齿天门冬(J^arag^刀/z'd""力的5SrRNA间隔序列的序列排列对比。图2示出了通过UPGMA树构建方法基于5SrRNA间隔序列产生的系统发生树。图3示出了通过邻位相连分析基于5SrRNA间隔序列产生的系统发生树。图4示出了基于5SrRNA间隔序列产生的严格共有简约树。发明详述歸糊收集代表六种百部物种的n个样品和一种天门冬物种。所述n个样品或者是新鲜植物，或者是干燥的植物材料。在此提供的所述样品及其来源只是作为示例(表i)，并且作为鉴定方法，样品的来源并不重要，只要有可用的已知被鉴定的标准样品就可以了。表1代表六种百部物种的17个样品和一种天门冬物种的来源和名称<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在DNA提取前，处理植物材料以避免真菌污染。将清洗过的植物材料在液氮中用杵和研钵研磨成粉末。将所述粉末保持在一80'C直至使用。通过Kang等(1998)的方法从植物样品(草药)中提取基因组DNA样品。所述磨成粉末的样品与400/ilSDS提取缓冲液(200mMTris-HCl(pH8.0)，200mMNaCl，25mMEDTA,0.5%SDS)和50/ig蛋白酶K混和。将所得混和物在37'C温育1小时。然后加入400/xl2%CTAB溶液(100mMTris-HCl(pH8.0)，1.4MNaCl,20mMEDTA(pH8.0)，2%(w/v)CTAB，1%PVP(聚乙烯吡咯烷酮)Mr40000)并充分混和。接下来将所得混和物与含有5%苯酚的氯仿:异戊醇(24:1)混和并在12000rpm离心10分钟。将上清与2/3体积的异丙醇混和并在室温温育10分钟。最后将所得混和物在12000rpm离心5分钟。将沉淀用70%乙醇洗涤后重悬于50/xl高温灭菌的双蒸水中。覆合蘑舰应潛》用PCR扩增感兴趣的DNA区域。使用引物S-l(5'-GGATCCGTGCTTGGGCGAGAGTAGTA-3，或SEQIDNO:l)和AS-1(5，-GGATCCTTAGTGCTGGTATGATCGCA-3'或SEQIDN0:2)扩增5SrRNA间隔序列。如果用S-l和AS-1未能成功进行PCR，则使用另一对引物5S2F(5，-GTGCTTGGGCGAGAGTAGTA-3'或SEQIDN0:3)和5S2R(5，-TTAGTGCTGGTATGATCGCA-3'或SEQIDN0:4)进行PCR。该两对引物在基因组相同的区域退火，但是5S2F和5S2R比S-l和AS-1短6bp。此处提供的特异引物是为了示例，而不是进行限制。当然，也可以选择其它引物扩增所希望的DNA区域并得到令人满意的结果。PCR在含有15.3/xl高温灭菌的双蒸水、2.5/xlIOXPCR缓冲液(IOOmMTris-HCl(pH8.8)，500mMKC1)、2pd2.5mMdNTP、2/xl25mMMgCl2、luTaq聚合酶、1/d(10mM)两种引物以及1/d模板DNA的混和物中进行。热循环在MJ-PTC100热循环仪中进行，条件如下95。C5min，1个循环；95°C20sec，56°C30sec，72°C1.5min，20个循环；以及最终延伸72"C5min。百部属物种的5SrRNA间隔序列的大小是大约500bp长。羊齿天门冬的5SrRNA间隔序列的大小是大约600bp。遂接力转众纯化所得到的PCR产物并通过连接插入到载体中。PCR产物的连接使用pGEM-TEasyVectorSystemI(Promega)进行。将所得重组质粒转化进大肠杆菌DH5a感受态细胞。从一80'C取出100/il大肠杆菌感受态细胞并保持在冰上使得所述细胞融化。当所述细胞刚刚融化时，加入全部5/xl重组质粒。将感受态细胞在冰上留置30min后在42'C热激2min。热激后，将所述感受态细胞在冰上进一步保持2min。然后向细胞中加入200/il37°CLB培养基并将所得混和物在37'C温育50min。在温育后，向细胞中加入5(^12%X-gal和0.4MIPTG。将所得培养物涂布在Luria-Bertani(LB)琼脂平板上并在37"C过夜温育。在温育后，在所述平板上形成蓝色及白色菌落。对于每一块平板，选择几个白色菌落。每一个单一白色菌落接种至含有50Mg/ml氨苄青霉素的5mlLuria-Bertani培养基中。所得培养物在37。C持续摇动温育过夜。从所得培养物中使用Mini-MTMPlasmidDNAExtractionSystem(Viogene，cat.GF1002)分离质粒DNA。使用'BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit(AppliedBiosystems,PN4337455)进行质粒DNA的循环测序。纯化所述循环测序的产物并重悬于HiDiFormamide(AppliedBiosystems,PN4311320)。然后使用ABIPRISM3100GeneticAnalyzer进行样品电泳。^"蕭i^ffcc汾e附o廳虛房J鉴定比较柯氏百部、蔓生百部、克氏百部、细花百部、直立百部、对叶百部和羊齿天门冬的DNA序列。对所述序列进行排列并示于图1。计算样品之间的相似性百分比并将结果列于表2。构建系统发生树以显示它们之间的关系。使用分子进化遗传学分析(MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis,MEGA)软件2.1版(Kumar等，2001)生成非加权配对组算数平均(UnweightedPairGroupMethodw他ArithmeticMean,UPGMA)树、邻位相连(NeighborJoining)树以及最大简约(MaximumParsimony)树。对于邻位相连树和UPGMA树，距离使用Kimura2-parameter算法计算。对于简约分析，使用紧密相邻互换(close-neighbor-interchange，CNI)方法检索简约树。对于500次重复进行跋靴测试。在5SrRNA基因之间的间隔序列是变化的。这个变化可以足够大以从其掺杂物中区分百部以及在不同的百部属物种之间进行区分。羊齿天门冬的5SrRNA间隔序列与百部属物种的差别非常大。根据5SrRNA间隔序列的大小的差别、低相似性百分比以及其在系统发生树中的位置可以很容易地从百部属物种中区分出羊齿天门冬。得自羊齿天门冬的PCR产物的大小是600bp，而得自百部属的PCR产物的大小仅有500bp。百部属和天门冬的5SrRNA间隔序列差别太大以至于无法进行排列对比。羊齿天门冬和百部属物种的相似性百分比是平均大约16%。在构建的UPGMA树(示于图2)、邻位相连树(示于图3)以及最大简约树(示于图4)中，羊齿天门冬和百部属物种不属于同一组。百部属物种的5SrRNA间隔序列还可以彼此区分不同的百部属物种。序列排列对比的结果显示所述间隔序列的300bp-400bp区域是变化最大的区域(见图1)。在这个变化区域中，每一个物种都具有独特的插入和缺失部分或独特的序列。所述间隔序列的序列在同一物种中是非常保守的，而在物种间的变化则是非常大的。如表2中所述，种内相似性百分比大约是90-100%。在不同百部属物种之间的种间相似性百分比大约是70-80%。因此，5SrRNA间隔序列对于鉴定百部是非常有用的分子标记。在基于5SrRNA间隔序列构建的所有系统发生树中，6种百部属物种形成了不同于羊齿天门冬的进化枝。百部属的进化枝进一步分枝出四个表示四种百部属物种的小进化枝。这些进化枝在跋靴测试中的跋靴值为100，这意味着这些进化枝得到了充分支持。表2:6种百部属物种间5SrRNA间隔序列的相似性百分比<table><table>如前面的实施方案中所实现的，本发明利用DNA技术及5SrRNA间隔序列的遗传学特征提供了在鉴定这一属的药用材料(草药)和/或植物中有用的方法。作为一个实例，百部可以容易地以及客观地从掺杂物中被鉴定。通过分析5SrRNA间隔序列，还可以将对草药材料的鉴别具体至物种水平。预期可以通过对其它应用实施前述基于5SrRNA间隔序列的鉴定方法获得令人满意的结果。由于已经通过将其应用于优选的实施方案而描述并指出了本发明的基本的具有新颖性的特征，应理解在所示范的过程和方法的形式及具体内容上的各种省略和取代和改变可以由本领域技术人员在未背离本发明精神的前提下完成。例如，应特别指出表现基本相同的功能，以基本相同的途径得到相同结果的本发明的方法步骤的各种要素的所有组合都包括在本发明的范围内。本发明不受限于上面描述的具体实施方案，它们仅仅代表了本发明的实例，可以在所附的权利要求所限定的保护范围内通过各种方法对其进行修改。序列表<110>香港赛马会中药研究院有限公司<120>基于5SrRNA间隔序列的草药鉴定方法<130>HKWIIi0585<160>47<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>26<212>DNA<213>Artificial<220><223>Primer'S1<400>1ggatccgtgcttgggcgagagtagta26<210>2<211>26<212>DNA<213>Artificial<220><223>PrimerAS1<400>2ggatccttagtgctggtatgatcgca26<210>3<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>Primer5S2F<400>3gtgcttgggcgagagtagta20<210>4<211>19<212>DNA<213>Artificial<220><223>Primer5S2R<400>4ttagtgctggtatgatcgc19<210>5<211>655<212>DNA<213>Asparagusfilicimis<220><223>5SrDNASpacerclonea<400>5gtgcttgggcgsgsgtsgtsctaggatgggtgscctcctgggaagtcctcgtgttgcacc60cctcctttttgcccggcgcgcaasttgcgactgagagcacgttt33ttttattttattat120tttccgccaatcggcggctcctttttttscCCCCtC3tttcctcccgccgtcsgcgcgga180cgtctgggsatgaga3g3tgagaagcacgtcgggcttctcgtttcgggga240gggggctg3ccgtcgggcascttagccccctccggatcgg3agttgcgggtcggggaggt300cacgcggaagcccgtccggcggasttggagtgtttccccgcgctcggggcascgtcaggg360ggtccgggccagcgtttcccttgtgsgc33ctttatccctggcsggtaca420aaaacgcagat3tCCCtC333ccgt33gggatttggcgaacgsacgaacc480cttcgggttcgttcggttggctccgtctcgccgagataagcgattttcatat3taattcg540tccaattccgscttacggcttgasagttscgccct3ttctccgstctatgttcagsacct600cgcctsagggcggctagtggatgggtgcga七C3t3CC3gC655<210>6<211>658<212>DNA<213>Asparagusfilicinus<220><223>5SrDNASpacercloneb<400>6gtgcttgggcgagagtagtactsggstgggtgacctcctgggssgtcctcgtgttgcacc60cctcctttttgctcggcgcgctgagsgcccgtttastttt3tttcsttat120tttccgccs3tcggcggctcCttttttt3CCCCCtC3tttcttcccgccgtcagggcgga180cgcctgggaacgsgssgatgagsagcacgtcgggcttctcgttgascaaggtttcgcgga240gggggccgaccgtcgggcsactscgtccccccccccggatcggaagttgcgggtcgggga300ggtcscgcggaagcccgtccggcgga3ttggagtgtttccccgcgctcggggc33cggct360gggggtccgggccagcgtttccctcgtaiggtgcctttatccctagcagag420ggstatccctgggatttggcgaaacggaggaagcgascga■acccttcgggttsgttcggttggctccgtctcgtcgagataagcgattttcgtatataat540tcgtccs3ttccgscttscggtttgasagttacgccctattcttcgatctatgttcggag600cctcgcct33ggggggsaggagacggcgagtggatgggtgcgatcatacc3gC3Ct33658<210>7<211>464<212>DNA<213>Stemona.collinsae(SpecimenG57)<220><223>5SrDNASpacer<400>7gtgcttgggcgagagteigtactsgg3tgggtgscctcctgggasgtcctcgtgttgcacc60CCttt33Cttttgcsgcgcccgcccgtcscgtctcgcagaasactcggggtcgatttgtg120tccctcgattctgscttgttsgggtgtgsstttggagaattcgacaccgc180cgscggcctgcggctgtcggccgcgccgttgctctcag33tcagctttccgtggscsggt240ssttcgtccgccgtagctcccgcsccgtcgattccagccg3gtcgcgcaa300ttcggctcc3aaatacggcagc3C3cgccg3tCCC3CCCttgttcctcgtaattttagcc360tcgggsgcccctcgcgcgtcgtgscsgccttggtgggtgcaggtgcgcgaggttaaaacg420gssatgcgtcgcacgtgtgtqgggtgcgstC3tatccsgc3464<210>8<211>465<212>DNA<213>Stemonacollinsae(SpecimenG57)<220><223>5SrDNASpacercloneb<400>8gtgcttgggcgagsgt3gtsctaggstgggtgscctcctgggasgtcctcgtgttgcacc60CCttt33Cttttgcsgcgcccgcgcgtgscgttttgcagagtcgsttcgc120gggaaaggaaatccctcgsttctgaicttgttsgggtttgsstttggagaattcgscsccg180ccgacggcctgcggctgtcggccgcgccgt3gctctcsg3atcagctttccgtggscagg240tssttcgtccgaaacggacacccgtsgctcccgcsccgtcg3ttCC33CCgagtcgcgca300attcggctccgaastscggc3gcsctctccC3tCCC3CCCttgttcctcgtwtttt3tc360ctcgggsgcccctcgcgcgtcgtg3asgccttggtgggggcgggtgcgcgaggttaaaac420ggaaatgcgtcgcacgtgtgtcgggtgcg3tcataccagc465<210>915<211>465<212>DNA<213>Stemonacollinsae(SpecimenG57)<220><223>5SrDNASpacerclonec<400>9gtgcttgggcgagagtagtactaggatgggtgacctcctgggaagtcctcgtgttgcacc60cctttsacttttgcsgcgcccgcgcgtgacgttttgcsgaaa3Ct3gggtgtcgstttgc120gggaagggaaatccctcgsttctgacgtgttsgggtgggsatttggsgsattcgscaccg180ccgscggcctgcggcggtcggccgcgtcgtggctctcagaatcsgctttccgtggscsgg240tai5Lttcgtcccccgtagctcccgcaccgttgattccsgccgagtcgcgca300sttcgtctccgaascscggc3gc3ctcggcgstcccsccctttttcctcgtwttttagc360cccgagcgcccctcgcgcgtcgtggssgcgttcgtgggcgcgggtgcgcgaggttgaaac420gg333tgcgscgcacctgtgtcgggtgcgatcataccagc465<210>10<211>477<212>DMA<213>Stemonajaponica(SpecimenHu&But23971)<220><223>5SrDNASpacerclon63<400>10gtgcttgggcgagsgtsgt3ctaggatgggtgacctcctgggasgtcctcgtgttgcacc60ccttttcctttttgsgcscggttttgcagsassatggagagcggctgccg120tccgtcgtcgttccggscgggtt5Lgaiga_tgggsitccgsggt33tcctcgc180ctccggccgcctgcggtcgaagtccaagtcgtaggtctctggstgggccttccgtcggga240ggtgattcgtcagccst3gctcccgcggcgccgsttttsgtggcgctagt300ttt3tt3tt3gtatactatttttstttttstttttgttttt3tttttttttggggggggg360ggatttatggcctctcccsgccactcgagcgtcgttcatggaatcgggattgcgaatgga420csgggtt3sgsgggss3cgcggtaga3333tgtcgggtgcg3tC3t3CC3gcactas477<210>11<211>465<212>DNA<213>Stemonajaponica(SpecimenHu&But23971)<220><223>5SrDNASpacercloneb<400>11gtgcttgggcgsgagtsgt3ctaggatgggtgscctcctgggasgtcctcgtgttgc3cc60ccttttcctttttgatcaagggcatatt33gttttgcsg3aaastggagagcggttgtcg120tccgtcgtcgttccggscaggttagagatgggatttgaggtsstcctcgc180ctccggccgcctgcggtcg3agtccacgttgtaggtctctggstgggctttccgtcggga240ggtgattcgtccgaagcggscsgccgtagctcccgcggcgccg3tttt3gtggcgccagt300ttt3ttsttsgtatactat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tttttttttttatgggatttatggc360ccscttcggccsctcgagcgtcgctgscggastcgggsgtgcgggscagcgggtttatga420agtaaaagcggtcgggtgcgatcataccag权利要求1.一种用于鉴定百部属内的草药或植物的方法，包括下述步骤(a)从所述包括5SrRNA的草药或植物中获得基因组DNA样品；(b)分析所述5SrRNA的DNA序列；以及(c)将所述DNA序列与标准DNA序列、所述标准DNA序列的一部分、或者包含所述标准DNA序列或所述标准DNA序列的一部分的DNA序列进行比较，所述标准DNA序列选自由SEQIDNO5、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17、SEQIDNO18、SEQIDNO19、SEQIDNO20、SEQIDNO21、SEQIDNO22、SEQIDNO23、SEQIDNO24、SEQIDNO25、SEQIDNO26、SEQIDNO27、SEQIDNO28、SEQIDNO29、SEQIDNO30、SEQIDNO31、SEQIDNO32、SEQIDNO33、SEQIDNO34、SEQIDNO35、SEQIDNO36、SEQIDNO37、SEQIDNO38、SEQIDNO39、SEQIDNO40、SEQIDNO41、SEQIDNO42、SEQIDNO43、SEQIDNO44、SEQIDNO45、SEQIDNO46、和SEQIDNO47组成的一组。2.如权利要求1的方法，其中在步骤(b)中分析所述5SrRNA的DNA序列之前，扩增所述基因组DNA的所述5SrRNA的间隔区域。3.如权利要求1的方法，其中使用所述标准DNA序列的一部分，并且所述部分占所述标准DNA序列长度的10%-100%，所述长度用DNA碱基对数目表示。4.如权利要求1的方法，其中所述草药或植物据称是蔓生百部、直立百部或对叶百部。5.如权利要求2的方法，其中所述基因组DNA的所述5SrRNA间隔序列区域通过进行PCR反应而被扩增。6.如权利要求5的方法，其中所述PCR反应使用两对DNA引物，分别是SEQIDNO:l和SEQIDNO:2，或SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。7.如权利要求1的方法，其中步骤(c)通过计算所述DNA序列与所述标准物的DNA序列的相似性百分比进行。8.如权利要求1的方法，其中步骤(c)通过构建系统发生树进行。9.如权利要求8的方法，其中所述系统发生树通过邻位相连分析或通过非加权配对组算数平均法构建。10.如权利要求1的方法，其中步骤(c)通过简约分析进行，所述简约分析通过使用紧密相邻互换方法检索简约树进行。全文摘要本发明提供了基于trnL和/或5SrRNA编码区的序列鉴定草药或植物的方法。利用此方法，基于相似性百分比计算比较得自样品的待测定的序列和得自已知身份的草药或植物的样品的序列。所述鉴定还可以基于系统发生树或简约树进行，所述系统发生树或简约树基于DNA序列分析生成。文档编号A61K36/904GK101104868SQ20061010193公开日2008年1月16日申请日期2006年7月11日优先权日2005年7月11日发明者毕培曦,江仁望,邵鹏柱,陈耀文申请人:香港赛马会中药研究院有限公司