专利名称：微泡超声造影剂及其与抗体、靶向基团、基因连接的方法
技术领域：
本发明属于医学成像技术领域，涉及应用于超声诊断与治疗的可携带药物的微泡超声造影剂，尤其涉及一类可有效连接抗体、靶向基团、基因等药物的微泡超声造影剂，本发明还涉及该微泡超声造影剂与抗体、靶向基团、基因进行连接的方法。
背景技术：
超声造影剂是一类能够显著增强医学超声检测信号的诊断药剂，在人体微小血管和组织灌注检测与成像方面，使用超声造影剂进行超声检测具有成像效果好、实时、操作简便、无离子辐射、无损性、适用面广等优点，因此在医学临床检测中得到了越来越多的应用。由于超声成像是基于回波信号的反射强度，而微泡具有较强的回波反射性能，因此被认为是目前最好的人体微管内的造影材料，以微泡制成的超声造影剂称为微泡型超声造影剂。超声造影剂的出现，开创了无创伤超声医学的一个崭新的领域，除了作为超声诊断药剂之外，近年来还发现微泡超声造影剂具有分子成像、促进血栓溶解、促进基因转染及药物体内运输定点释放等作用。
利用靶向分子导向一直是非常活跃的一个研究领域，但由于目前对生物体本身各类生化作用的特异性还远缺乏了解，这对该方法的应用产生了一个目前仍然无法克服的瓶颈效应。采用在微米微泡及亚微米或纳米载药微球膜上分别引入能发生相互作用的分子或基团，然后将微泡与微球载药体按一定比例连接，静脉注入体内后，在特定组织部位通过超声引爆微米微泡，利用微泡崩溃时产生的能量将周围连接的微球击碎，从而达到药物及微泡的靶向运输与控制释放的目的，这一过程可以同时实现造影与释药，即同时实现诊断与治疗的目的。由于不涉及体内的生化反应，而微泡与微球的连接易通过一些化学方法实现，此外由于体外超声引爆微米微泡的无损性、安全性和可控性在微泡超声造影剂的应用中已得到广泛证实，因此认为这一方案可能会成为今后较短时期内靶向给药及控制释放的突破点。除了可以在微泡表面接入载药微球之外，也可在微泡制备时将药物包裹在微泡中，形成同时包裹药物和气体的载药载气的微泡体，如果在内部包裹药物的表面接入靶向分子，则可以实现微泡定向引爆和靶向分子导向的双重靶向作用。
微泡超声造影剂与抗体、靶向基团、基因等热敏性药物或非热敏性药物的高效连接尚未见有实质性方法报道，一般直接将微泡与药物混合，一方面药物直接与微泡连接的效率极差，另一方面容易造成空间位阻，降低药效。
发明内容
本发明的目的在于提供一类可高效连接抗体、靶向基团、基因的超声微泡造影剂，解决了微泡与抗体、靶向基团、基因等药物连接时的效率问题，和容易造成空间位阻的问题。
本发明的另一目的在于提供上述超声微泡造影剂与抗体、靶向基团、基因进行连接的方法。
本发明所采用的技术方案是，可有效连接抗体、靶向基团、基因的超声微泡造影剂，由微泡膜和膜内填充的气体组成，膜内气体为氮气、空气、二氧化碳、氧气、惰性气体、六氟化硫、氟里昂类或全氟化碳，其特点是，微泡膜按重量百分比，其组成为，
连接作用的聚合物1％～50％其它成膜材料1％～90％膜稳定剂1％～50％乳化剂 1％～15％连接作用的聚合物为低熔点长直链生物相容性聚合物或带有小侧链基团的生物相容性聚合物，其它成膜材料选自糖类物质、酯类物质、磷脂类物质、聚合物、改性蛋白质、表面活性剂、高级脂肪醇类或高级脂肪酸类的一种或一种以上的组合。
本发明所采用的另一技术方案是，利用上述超声微泡造影剂与抗体、靶向基团、基因进行有效连接的方法，具体包括以下步骤a.按重量百分比，选取微泡膜材料，其组成为，连接作用的聚合物1％～50％，其它成膜材料1％～90％，膜稳定剂1％～50％，乳化剂1％～15％，连接作用的聚合物为低熔点长直链生物相容性聚合物或带有小侧链基团的生物相容性聚合物，其它成膜材料选自糖类物质、酯类物质、磷脂类物质、聚合物、改性蛋白质、表面活性剂、高级脂肪醇类或高级脂肪酸类的一种或一种以上的组合，膜稳定剂包括碳原子数十二以下的低级脂肪醇类和具有较高黏度的多元醇类、碳原子数十二以下的低级脂肪酸类、纤维素类、糖类物质、油脂类、呈液体形式存在的聚合度小于200的聚合物；b.将上述选取的微泡膜材料制备成微泡超声造影剂；c.使抗体、靶向基团、基因不失活的状态下，将上述制得的微泡超声造影剂与抗体、靶向基团、基因混合均匀，即完成了超声微泡造影剂与抗体、靶向基团、基因的连接。
本发明采用在微泡膜材料中加入低熔点的长直链生物相容性聚合物或不造成空间位阻的带有小侧链基团的生物相容性聚合物，而生成一类新的微泡超声造影剂，使加入的低熔点长直链生物相容性聚合物或不造成空间位阻的带有小侧链基团的生物相容性聚合物作为与微泡的粘合连接臂，微泡通过该连接臂与药物连接，从而解决了空间位阻问题，实现了造影剂微泡与抗体、靶向基团、基因等药物的高效连接。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
本发明的超声微泡造影剂的膜材料，按重量百分比，其组成为连接作用的聚合物1％～50％，其它成膜材料1％～90％，膜稳定剂1％～50％，乳化剂1％～15％。微泡制备时，首先要将膜材料配成膜溶液，膜溶液中需加入缓冲剂。
其它成膜材料即为现在常用的糖类物质、酯类物质、聚合物、改性蛋白质或表面活性剂的一种或一种以上的组合，还包括高级脂肪醇类、高级脂肪酸类等物质的一种或与其它膜材料一种以上的组合。膜稳定剂包括碳原子数十二以下的低级脂肪醇类和具有较高黏度的多元醇类、碳原子数十二以下的低级脂肪酸类、纤维素类、糖类物质、油脂类等、呈液体形式存在的聚合物类如聚合度200的聚乙二醇。膜内气体可以是现在常用的氮气、空气、二氧化碳、氧气、惰性气体、六氟化硫、氟里昂类或全氟化碳，本发明的特点是在现有的超声微泡造影剂的膜材料中引入低熔点的长直链生物相容性聚合物，或不造成空间位阻的其它带有小侧链基团的生物相容性聚合物，即连接作用的聚合物，使之成为微泡的粘合连接臂，使药物不直接与微泡连接，从而解决了空间位阻问题。
连接作用的聚合物为低熔点长直链生物相容性聚合物或带有小侧链基团的生物相容性聚合物，低熔点聚合物可以是聚合度相同的一种聚合物，也可以是熔点较低的不同聚合物的混合体，可以是低聚合度液态形式存在的聚合物与同类或不同类高聚合度固态形式存在的聚合物的混合体。可选自聚乙二醇、聚乙烯醇、聚氨基酸类、氨基酸-非氨基酸共聚物类、聚丙烯酸、聚乳酸、聚乙醇酸、聚丙烯酸钠、聚酯类或聚醚类其中的一种或一种以上的组合。
微泡连接抗体基因等药物时，根据采用温度的不同，选取在该温度下具有粘滞性的聚合物，粘滞性的聚合物指的是该聚合物在该温度下具有粘滞性，其性质介于固态与液态之间或附近，如聚合度800左右的聚乙二醇。
将选取的微泡膜材料采用声空化方法、喷雾干燥法、冷冻干燥法、乳液聚合等常规方法制备得到微泡超声造影剂，使抗体、靶向基团、基因不失活并稍高于体温下、常温下或低温情况下，将含有在该温度下具有粘滞性的聚合物的微泡与抗体、基因等热敏性药物或非热敏性药物混合均匀，即可实现微泡与抗体、靶向基团或基因等热敏性药物或非热敏性药物的简单、高效结合。
实施例1带有聚乙二醇粘合连接臂的微泡膜溶液配方聚乙二醇800 (连接作用的聚合物)12.5g(50％)聚乙二醇3000 (膜材料) 0.25g(1％)Tween80 (乳化剂) 0.25g(1％)
蔗糖(膜稳定剂)12g(48％)生理盐水(缓冲剂) 余量实施例2带有聚乙二醇连接臂的微泡膜溶液配方聚乙二醇800 (连接作用的聚合物)0.5g(1％)聚乙二醇3000 (膜材料) 17g(34％)Tween80 (乳化剂) 7.5g(15％)月桂酸 (膜稳定剂)25g(50％)pH7.0的磷酸盐缓冲溶液(缓冲剂) 余量实施例3带有聚乙二醇连接臂的微泡膜溶液配方聚乙二醇600 (连接作用的聚合物) 0.4g(1％)聚乙二醇800 (连接作用的聚合物) 1.6g(4％)聚乙二醇1500 (膜材料)24g(60％)span60 (膜材料)12g(30％)Tween80 (乳化剂)1.6g(4％)葡萄糖 (膜稳定剂) 0.4g(1％)pH7.01的磷酸盐缓冲溶液(缓冲剂) 余量实施例4带有聚乙二醇连接臂的微泡膜溶液配方其中，连接作用的聚合物24％，其它成膜材料24％，膜稳定剂38％，乳化剂14％，聚乙二醇600 (连接作用的聚合物) 3g
聚乙二醇800 (连接作用的聚合物) 3g聚乙二醇3000 (膜材料) 3g聚乙二醇4000 (膜材料) 2g聚乙二醇6000 (膜材料) 1gOP-10 (乳化剂) 3.5g葡萄糖(膜稳定剂) 5.5g甘油 (膜稳定剂) 4gpH7.0的磷酸盐缓冲溶液(缓冲剂)余量实施例5带有聚乙二醇和聚乙烯醇连接臂的微泡膜溶液配方其中，连接作用的聚合物10％，其它成膜材料70％，膜稳定剂10％，乳化剂10％，聚乙二醇600(连接作用的聚合物)1g聚乙二醇800(连接作用的聚合物)1g聚乙二醇3000 (膜材料) 4g聚乙二醇4000 (膜材料) 4g聚乙烯醇1500 (膜材料) 6gOP-10 (乳化剂) 2g葡萄糖 (膜稳定剂)1g枸杞多糖 (膜稳定剂)1g生理盐水 (缓冲剂) 余量实施例6带有聚乙烯醇连接臂的微泡膜溶液配方
其中，连接作用的聚合物30％，其它成膜材料20％，膜稳定剂40％，乳化剂10％，聚乙烯醇600(连接作用的聚合物)5.1g聚乙烯醇1500 (膜材料) 3.4gOP-10 (乳化剂) 1.7g羟乙基纤维素 (膜稳定剂)1.8g葡萄糖 (膜稳定剂)5gpH7.0的磷酸盐缓冲溶液(缓冲剂)余量实施例7带有聚乙烯醇连接臂的微泡膜溶液配方其中，连接作用的聚合物24％，其它成膜材料20％，膜稳定剂41％，乳化剂15％，聚乙烯醇600(连接作用的聚合物)4.8g聚乙烯醇1500 (膜材料) 2gSpan60 (膜材料) 2OP-10 (乳化剂) 3g月桂醇 (膜稳定剂)8.2gpH7.0的磷酸盐缓冲溶液(缓冲剂)余量实施例8微泡膜溶液配方其中，连接作用的聚合物18％，其它成膜材料32％，膜稳定剂48％，乳化剂2％，
聚乙烯醇600(连接作用的聚合物)4g人血清白蛋白 (膜材料) 5g聚乙烯醇1500 (膜材料) 2g甘油 (膜稳定剂)2g可溶性淀粉 (膜稳定剂)0.6g葡萄糖 (膜稳定剂)2g蔗糖 (膜稳定剂)6gTween80(乳化剂) 0.4g生理盐水 (缓冲剂) 余量实施例9微泡膜溶液配方，其中，连接作用的聚合物29％，其它成膜材料30％，膜稳定剂40％，乳化剂1％，聚乙二醇800(连接作用的聚合物)10g人血清白蛋白 (膜材料) 6g聚乙二醇1500 (膜材料) 4.5gtween80(乳化剂) 0.35g甘油 (膜稳定剂)4g葡萄糖 (膜稳定剂)10g生理盐水 (缓冲剂) 余量实施例10采用实施例1配方进行微泡制备方法采用声空化方法，将上述实施例1的膜溶液在超声功率500瓦声处理3分钟，过程中给膜溶液中通入六氟化硫气体，制备后的微泡液体于分液漏斗中静置20分钟以上，取下层呈微粉悬浮的微泡作为制备出的微泡超声造影剂。该微泡平均直径2.8微米，微泡浓度1.87×109。
实施例11采用实施例2进行微泡制备方法采用声空化方法，将上述实施例2的膜溶液在超声功率400瓦声处理5分钟，过程中给膜溶液中通入全氟丙烷气体，制备后的微泡液体于分液漏斗中静置20分钟以上，取下层呈微粉悬浮的微泡作为制备出的微泡超声造影剂。该微泡平均直径3.17微米，微泡浓度2.34×109。
实施例12采用实施例8配方进行微泡制备方法将上述实施例8含蛋白膜材料在20KHZ、800W时进行超声波空化处理，过程中通入全氟丙烷，制备出的微泡直径分布小于10个微米，微泡浓度1.12×109。
实施例13将上述实施例8含蛋白膜溶液混合均匀后，在1万转高速乳化机下滴入含有3％span60的大豆油中，滴完后将乳化机转速调制到1.5万转均质5分钟，此后将大豆油温度升高到100度以上，并持续乳化5分钟，冷却，将固体部分过滤收集，石油醚洗涤除油后于80摄氏度真空干燥10小时。制备出的微泡前体白色粉末直径分布可从几十个到几百个纳米，使用时在该前体粉末中加入生理盐水等即可形成直径分布在几十个到几百个纳米的微泡。
实施例14微泡与抗球蛋白抗体结合实例常温下将制备出的微泡与抗体混合均匀，静置1分钟后即可实现微泡与抗球蛋白抗体的结合，结合率大于95％。采用免疫荧光法可观测到抗体紧密结合在微泡表面。
实施例15微泡与其它蛋白质类物质的结合4℃下将制备出的微泡与蛋白质类物质如人血清白蛋白混合均匀，静置1分钟后即可实现微泡与人血清白蛋白的良好结合，结合率大于95％。
实施例16微泡与小分子肽类物质的结合实例如靶向血栓，在常温下将制备出的微泡与对血栓具有亲和力的Dipalmitoyl-Lys-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln.NH.2混合均匀，静置1分钟后即可实现微泡与该小分子肽类物质的结合，结合后的微泡具有靶向血栓的能力。
实施例17微泡与基因物质的结合实例4℃下将制备出的微泡与基因类物质混合均匀，静置1分钟后即可实现微泡与基因类物质的良好结合，结合率大于95％。
实施例18实施例13所得微泡超声造影剂与抗体、小分子肽、基因等的连接方法将所得白色粉末分散到含有抗体、或小分子肽或基因等的溶液中，200转/分搅拌1分钟后即获得带有抗体、或小分子肽或基因的微泡。
权利要求
1.一种可有效连接抗体、靶向基团、基因的超声微泡造影剂，由微泡膜和膜内填充的气体组成，膜内气体为氮气、空气、二氧化碳、氧气、惰性气体、六氟化硫、氟里昂类或全氟化碳，其特征在于，所述的微泡膜按重量百分比，其组成为，连接作用的聚合物1％～50％其它成膜材料1％～90％膜稳定剂1％～50％乳化剂 1％～15％所述连接作用的聚合物为低熔点长直链生物相容性聚合物或带有小侧链基团的生物相容性聚合物，所述其它成膜材料选自糖类物质、酯类物质、磷脂类物质、聚合物、改性蛋白质、表面活性剂、高级脂肪醇类或高级脂肪酸类的一种或一种以上的组合。
2.按照权利要求1所述的超声微泡造影剂，其特征在于，所述低熔点长直链生物相容性聚合物为聚合度相同的一种聚合物或聚合度不同的一种以上聚合物的混合体。
3.按照权利要求1或2所述的超声微泡造影剂，其特征在于，所述连接作用的聚合物选自聚乙二醇、聚乙烯醇、聚氨基酸类、氨基酸-非氨基酸共聚物类、聚丙烯酸、聚乳酸、聚乙醇酸、聚丙烯酸钠、聚酯类或聚醚类其中的一种或一种以上的组合。
4.一种利用权利要求1所述的超声微泡造影剂与抗体、靶向基团、基因进行有效连接的方法，其特征在于，具体包括以下步骤a.按重量百分比，选取微泡膜材料，其组成为，连接作用的聚合物1％～50％，其它成膜材料1％～90％，膜稳定剂1％～50％，乳化剂1％～15％，所述连接作用的聚合物为低熔点长直链生物相容性聚合物或带有小侧链基团的生物相容性聚合物，所述其它成膜材料选自糖类物质、酯类物质、磷脂类物质、聚合物、改性蛋白质、表面活性剂、高级脂肪醇类或高级脂肪酸类的一种或一种以上的组合，b.将上述选取的微泡膜材料制备成微泡超声造影剂；c.使抗体、靶向基团、基因不失活的状态下，将上述制得的微泡超声造影剂与抗体、靶向基团、基因混合均匀，即完成了超声微泡造影剂与抗体、靶向基团、基因的连接。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述低熔点长直链生物相容性聚合物为聚合度相同的一种聚合物或聚合度不同的一种以上聚合物的混合体。
6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述连接作用的聚合物选自聚乙二醇、聚乙烯醇、聚氨基酸类、氨基酸-非氨基酸共聚物类、聚丙烯酸、聚乳酸、聚乙醇酸、聚丙烯酸钠、聚酯类或聚醚类其中的一种或一种以上的组合。
7.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述膜稳定剂包括碳原子数十二以下的低级脂肪醇类和具有较高黏度的多元醇类、碳原子数十二以下的低级脂肪酸类、纤维素类、糖类物质、油脂类、呈液体形式存在的聚合度小于200的聚合物。
全文摘要
本发明公开的微泡超声造影剂，按重量百分比组成为，连接作用的聚合物1％～50％，其它成膜材料1％～90％，膜稳定剂1％～50％和乳化剂1％～15％。该微泡造影剂与抗体、靶向基团、基因的连接方法是以具有低熔点的长直链生物相容性聚合物作为微泡膜的组分之一，或采用不造成空间位阻的其它带有小侧链基团的生物相容性低熔点聚合物作为微泡膜的组分之一，在使抗体、靶向基团、基因等不失活并稍高于体温下、常温下或低温等情况下，将制得的微泡与抗体或基因等热敏性药物或非热敏性药物混合均匀，即实现微泡与抗体或基因等药物的简单、高效结合。本发明解决了抗体、靶向基团、基因等药物与造影剂微泡连接的问题，并消除了药物直接微泡而造成的空间位阻问题，具有简单、实用的特征。
文档编号A61K49/22GK1985996SQ20061010519
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月19日 优先权日2006年12月19日
发明者杜永峰, 姚秉华, 高彩霞 申请人:西安理工大学