专利名称：：一种抗幽门螺杆菌的药物组合物的制作方法一种抗幽门嫘杆菌的药物组合物
技术领域：
：本发明属于医药领域，具体地说涉及从栊牛儿苗科植物中提取得到的一种提取物以及该提取物的提取方法和在制备抗幽门螺杆菌感染以及治疗或预防幽门螺杆菌感染导致的消化道疾病药物中的应用和在制备治疗肝炎药物中的应用。—、宵豕狡不1983年澳大利亚学者沃伦(Warren)和马歇尔(Marshall)首次从胃粘膜中分离出幽门螺杆菌(/fe//co6ac^/^/on),简称///7。幽门螺杆菌(股//0)6^^^/巾'，/^)是一种革兰氏阴性螺旋状细菌。资料显示，全世界约有50%以上的人口感染幽门螺杆菌，发展中国家的感染尤为严重，其中成年人感染率达到6080%，幽门螺杆菌是急、慢性胃炎以及胃、十二指肠溃疡的主要致病原因，并与胃癌和胃粘膜相关性淋巴样组织(MALT)恶性淋巴瘤发病密切相关。最近，世界卫生组织将/^归为I类致癌物，它在胃癌发展中起主导作用。目前流行的治疗/7/7感染的方案是同时服用质子泵抑制剂(PPI)加两种抗生素(克拉霉素，阿莫西林、四环素、甲硝唑等选二种)的三联疗法。影响三联疗法的最主要因素被认为是///7对抗菌剂的耐药性；另一严重问题是质子泵抑制剂会诱发消化不良，大量抗菌剂则导致消化道内菌群的严重毁灭。因此，寻找高效、安全的具有抗HP活性的药物成为一个重要和迫切的任务。三、
发明内容本发明的目的是提供一种新的药物组合物，该药物组合物为从栊牛儿苗科植物中经过提取得到的提取物，特征是该提取物中化合物1,2，3,6-四-0-没食子酰-;S-Z)-葡萄糖(l，2，3，6-Tetra-0-galloyl-fZ)-glucose)占提取物总质量的百分比为1%—20%;优选为该提取物中化合物1,2,3,6-四-0-没食子酰^-D-葡萄糖(1，2，3，6-Tetra-0-galloyl-yS-D-glucose)占提取物总质量的百分比为2%—15%;最优选为该提取物中化合物1，2,3，6-四-没食子酰-/"D-葡萄糖(l，2，3，6-Tetra-Ogalloyl-々-￡>-glucose)占提取物总质量的百分比为3%—10%。本发明另一个目的是提供上述提取物的制备方法。本发明所述提取物的制备方法为选自栊牛儿苗科的植物经粉碎后采用乙醇冷浸或回流提取，浓縮到无醇味，加水稀释后上大孔树脂，用水、浓度为10-90%的酒精洗脱液洗脱分离，收集合并酒精部分洗脱液浓縮至干而得。大孔树脂可以选自型号为HPD100、HPD400、HPD600优选为HPD100。提取过程中冷浸或回流的乙醇浓度为40-80%，优选浓度为50-70%，最优选为60%。洗脱液浓度为10%-90%的酒精，优选为40-60%的酒精，最优选为50%的酒精洗脱液。优选制备方法为取上述药材地上部分或全草粉碎后经60%酒精冷浸或回流提取三次，将提取液合并浓縮至无醇味，加水稀释，上HPD100大孔树脂，用水、10-90%任意浓度酒精分别洗脱，经紫外吸收检验，收集10-90%酒精洗脱液，合并浓縮至干得固形物即为提取物。通过上述方法得到的提取物中化合物1，2,3,6-四-0-没食子酰-AD-葡萄糖(1,2，3,6-Tetra-0-galloyl-^D-glucose)占总提取物质量百分比为1%-20%。本方法中所述紫外吸收验证目的是收集波长275nm处有紫外吸收的洗脱液。经紫外吸收验证10-90。/。酒精洗脱液在275nm处均有紫外吸收，50%酒精的洗脱液在275nm处紫外吸收最强。提取方法中冷浸或回流提取采用本领域常规提取时间提取，乙醇提取液浓度优选为50-70%，最优选为60%。本发明提取物中成分主要为多酚类和黄酮类成分。提取物中化合物1,2,3，6-四-0-没食子酰-AD-葡萄糖(1,2，3，6-Tetra-Ogalloyl-AD"glucose)的含量采用HPLC方法测定，具体测定条件如下色谱柱十八烷基硅胶键合相检测波长275nm流动相乙腈-2%冰醋酸水溶液(14:86)进样量20ul流速1.0ml/min本发明的另一目的是提供上述提取物在制备抗幽门螺杆菌感染以及治疗或预防幽门螺杆菌感染导致的消化道疾病的药物中的应用。本发明还有一个目的是提供上述提取物在制备治疗肝炎药物中的应用。特别有益的是在所述应用中该提取物可以与药学可接受的辅料通过药学常规制备方法制备成药学常规剂型。药学可接受辅料包括药学常规的填充剂、湿润剂、粘合剂、崩解剂、赋形剂、抗氧剂、调味剂等。药学常规剂型包括片剂、胶囊剂、滴丸剂、微丸剂、散剂、颗粒剂等其中优选片剂、胶囊剂。本发明人通过大量药理学试验，证实了所述提取物在体内外能有效抑制幽门螺杆菌的生长，并通过整体动物试验证实该提取物能有效抑制幽门螺杆菌诱发的胃部溃疡的发生。一般认为幽门螺杆菌在胃粘膜定植后，经数周或数月可以引发慢性、浅表性胃炎，数年或数十年后可能发展成为十二指肠溃疡、胃溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤、慢性萎縮性胃炎等，而这些均是导致胃癌前病变或胃癌发生的最危险因素。因此可以相信，本发明所述提取物在有效抑制幽门螺杆菌，治疗由幽门螺杆菌诱发的胃溃疡的同时能有效预防胃部肿瘤和胃部癌前病变的发生。本发明所述的肝炎包括乙型肝炎、丙型肝炎等病毒性肝炎，也包括因摄入化学物质或服用药物不当导致的化学性的肝损伤，包括药物性肝损伤、酒精性肝损伤等。发明人通过药理学试验证实，该提取物能降低肝损伤导致的转氨酶升高，对肝脏有保护作用。值得注意的是本提取物在优选范围内降酶保肝作用最佳，表明提取物功效成分之间存在相互协同作用。上述具体有益效果通过实施例5、6、7、8详细说明。本发明所述的維牛儿苗科植物为主要选自娥牛儿苗科植物中的粗根老鹳草(Gera"/娜d。/m"'c鹏)、野老鹳草(Geram,訓c/Mzm/附)、毛蕴老鹳草(Geraw/w/wen'o对ewo")、绒背老鹳草((？e/^r"/wmv/owon'a"w附)、青岛老鹳草(Geraw/w加加'wgtowen5e)、大根老鹳草(Geraw/wwwac/wr/z/zww)中的一禾中或两种以上的植物。本发明所述化合物1，2，3，6-四没食子酰-AZ)-葡萄糖(l,2，3，6-Tetra-0-galloyl-y^ZXglucose)其结构式如下OHOHl，2，3,6-Tetra-0-galloyl-/"D-glucose本发明所述的胃部癌前病变是指胃癌前阶段病变包括慢性浅表性胃炎、肠上皮化生和异型增生等。本发明所述的消化道疾病主要指幽门螺杆菌导致的急、慢性胃炎、浅表性胃炎以及胃、十二指肠溃疡和胃部肿瘤以及胃部的癌前病变。具体实施方式下列实施例用来进一步解释说明本发明的内容，但不意味着对本发明的任何限制。实施例l取粗根老鹳草(Geraw'MW^/iw"/cww)100g，粉碎，加8倍量40%的乙醇，回流提取三次，每次2小时。滤去药渣合并3次提取液，浓縮至l/6体积，至无醇味，加水稀释到两倍药材体积，过滤，滤液上HPD100大孔树脂，用水、10。/。、50%、90%酒精分别洗脱，经紫外吸收验证，收集合并10%、50%、90%酒精洗脱液，浓縮至干得固形物2.13g即为本提取物。其中化合物1，2，3，6-四-0-没食子酰-y^Z^葡萄糖(1，2，3，6-Tetra-0-galloyl-AZ)-glucose)占提取物总质量的2.2%。实施例2取野老鹳草(Gera"/w/wcara//w/zmmi)lkg，粉碎，加8倍量60%的乙醇室温冷浸提取三次，每次浸泡24小时。滤去药渣合并3次提取液，浓縮至l/7体积，挥发去酒精，上HPD100大孔树脂，用水、30%、50%、90%酒精分别洗脱，经紫外吸收验证，收集合并30%、50%、90%洗脱液，浓縮至千得固形物22.7g为本提取物。其中化合物1,2,3,6-四-O-没食子酰葡萄糖(l，2,3，6-Tetra-0-galloyl-/W)-glucose)占提取物总质量的4.6%。实施例3取青岛老鹳草(Gmw/M/w加'"gto/e"se)200g,粉碎，加8倍量80%的乙醇回流提取三次，每次2小时。滤去药渣合并3次提取液，浓縮至l/6体积，至无醇味，加水稀释到两倍药材体积，过滤，滤液上HPD100大孔树脂，用水、20%、50%、70%酒精分别洗脱，经紫外吸收验证，收集20%、50%、70%酒精洗脱液，浓縮至干得固形物4.18g为本提取物。其中化合物1，2，3,6-四-0-没食子酰-;^)-葡萄糖(1,2,3，6-Tetra力-gaUoy卜^Z)-glucose)占提取物总质量的11.4%。实施例4取大根老鹳草(GerawM/nwacAwrWzww)100g,粉碎，力[]8倍量60%的乙醇室温冷浸提取三次，每次浸泡24小时。滤去药渣合并3次提取液，浓縮至1/7体积，挥发去酒精，上HPD100大孔树脂，用水、50%、90%酒精分别洗脱，经紫外吸收验证，收集合并50%、90%酒精洗脱液，浓缩至干得固形物2.58g为本提取物。其中化合物1，2，3，6-四-(9-没食子酰-^D-葡萄糖(1,2,3，6-Tetra-0-galloyl-AD"glucose)占提取物总质量的5.7%。实施例5本发明所述提取物抗幽门螺杆菌体外实验1.实验材料提取物采用实施例4的方法制备，化合物1，2,3,6-四-6>-没食子酰}/>葡萄糖(1,2,3,6-Tetra-O-galloyl-AD-glucose)占提取物总质量的5.7%。实验菌株幽门螺杆菌(/fe/Zco6acter/^/oa7'，/f/)标准菌株ATCC43504、ATCC49503来自美国菌种保存中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)，//pSSl菌株来自澳大利亚新南威尔士大学微生物学院，其余幽门螺杆菌临床菌株来自上海消化病研究所，经快速尿素酶、涂片革兰氏染色、氧化酶和触酶鉴定为阳性后，传代纯培养，所得菌株作为实验菌株。2.实验方法1)菌株培养方法采用微需氧袋(购自复旦大学)进行/^的菌株培养。2)生物活性测定方法采用琼脂稀释法来测定供试样品的最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)。琼脂稀释法測定MC:(A)药物平板的制备首先将测试的提取物与阳性对照药用二甲基亚砜(DMSO)溶液配制成3.2mg/ml的母液，过滤除菌后，再用无菌水倍比稀释到320，160，80，40,20，10，5，2.5，1.25,0.6和0.3(ig/ml的浓度系列，DMSO在介质中的浓度小于1%。将1ml配制好的测试药物溶液与保温于50。C的9ml哥伦比亚培养基充分混匀，浇制冷却即成，培养基为Mueller-Hinton琼脂(DifcoCo.)。(B)转接实验菌(涂菌)用微量取样器吸取稀释好的10SCFU/ml/^的菌悬液0.1ml均匀地涂抹在培养皿表面，倒置于37镔烘干箱中15min后取出，目的使琼脂表面干燥，备用。(C)确定MC将待测培养皿在微需氧袋(含85%N2，10%(302和5%02)中，保温37°C培养72小时，观察饰生长情况，以完全没有菌生长的样品最低浓度为最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)值。阳性对照药物为氨苄西林(AmpicilUn)。所有试验重复三次。3.实验结果表l.本发明提取物对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度实验菌株3201608040201052.51.250.60.343504+++++++-一-—//./^/or/49503++++++++-—-++++++-一—-//.pyfor/006+++++++++--+++++++--—-++++++++—-—+++++++++--一"'036++++++++_-H一"'037+++++++—--—//040++++++++---+:能完全抑制菌的生长-:不能完全抑制菌的生长表2.氨苄西林^g/mi)对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度实验菌株320160804020102.51.250,60.3//43504++++++++---//:/3y/w749503++++++++---+++++++//—r/006++++++++---++++++++--一"*010++++++++---++++++++---///^fo/v'036++++++++---++++++++---H./yfoh040+++++++---+:能完全抑制菌的生长；-:不能完全抑制菌的生长。4.结果讨论体外实验表明本发明所述提取物具有很强的抗幽门螺杆菌活性，作用强度接近于阳性药物氨苄西林。本发明所述提取物浓度为5pg/ml时能抑制所有的生长，尤其是对//:py/or/006、//.;^y/o"018的生长抑制最为明显，最小抑菌浓度(MIC)达为1.25pg/ml。结果见表l、表2。实施例6本发明提取物的体内抗幽门螺杆菌实验本实验分两个阶段进行，第一阶段建立/^感染的小鼠模型，第二阶段进行药效学试验。1、幽门螺杆菌(冲)感染的小鼠模型的建立1)//p菌株的培养///7SS1菌株来自澳大利亚新南威尔士大学微生物学院。将一7(TC冻存的菌种在含5%马血的Columbia琼脂平板上复苏，转种于添加了15%马血清和抗生素的心脑浸液中。在微需氧条件下培养扩增，经尿素酶、触酶、氧化酶试验及涂片革兰染色鉴定后分装，置一8(TC保存。接种前将细菌在Skkrow选择性培养基上培养2448小时，经鉴定和观察细菌活力后，将细菌于PBS液中离心、洗涤，最后以改良布氏肉汤配制成lxl(^CFU/ml的细菌悬液，立即接种实验动物。2)//p菌株在小鼠体内的接种实验动物为无特殊病原菌级(SPF)C57BL/6小鼠，鼠龄6~8周，体重18-20g。委托中科院上海实验动物中心饲养。灌胃给予每只小鼠0.5ml(含5xl0SCFU)的Z/pSSl菌液，隔日1次，共3次。造模后2周随机抽样造模动物，处死小鼠后，取胃分别作快速尿素酶试验、涂片革兰氏染色、病理切片及细菌培养检测，以确保每只小鼠的感染率。2、本发明提取物的药效学实验1)实验分组将制备好的幽门螺杆菌感染雄性小鼠随机分为5组，每组10只。2)给药模型组灌胃给予生理盐水(NS)0.4ml/只。阳性组CBS6.15mg/kg，四环素50mg/kg，甲硝唑22.5mg/kg;(CBS:胶体次枸橼酸铋)。小剂量组75mg提取物/kg;中剂量组150mg提取物/kg;大剂量组450mg提取物/kg;本试验中提取物采用实施例4所述方法提取得到，化合物1,2,3,6-四-0-没食子酰-户1>葡萄糖(1,2,3，6-Tetra-0-galloy卜AD-glucose)占提取物总质量的5.7%。各组动物每天灌胃给药一次，共14天。3)疗效检测最后一次给药4周后处死所有小鼠。解剖取胃，沿胃大弯纵向切成4份，分别作快速尿素酶试验、革兰氏染色、病理切片及细菌培养检测/尔。4种检测方法结果均阴性者定为邵阴性，1种或1种以上检测方法结果阳性者定为冲感染。3.实验结果表3.本发明提取物的体内抗幽门螺杆菌活性分组例数Oi)模型组10阳性对照组10小剂量组10中剂量组10大剂量组10药物及剂量NS0.4ml/只CBS6.15mg/Kg+四环素50mg/Kg+甲硝唑22.5mg/Kg50mg/Kg150mg/Kg450mg/Kg感染数(n)清除率100%370%**7300/0#550%*460%**:与模型组比较；#:与阳性对照组比。*p<0.05;**p<0.01。4.讨论我们用目前临床上最为常用的标准三联疗法作为体内药效的阳性对照，结果显示接受三联疗法的阳性对照组幽门螺杆菌感染的清除率为70%，与模型组比有显著差异；本发明提取物在大、中剂量时清除率分别为60%和50%，与模型组比有显著差异，同时与阳性对照组比没有显著差异。表明本发明所述化合物在剂量为450mg/Kg、150mg/Kg时能有效清除小鼠幽门螺杆菌的感染，作用强度与目前常用的三联疗法接近。实施例7本发明提取物抗幽门螺杆菌导致的实验动物胃溃疡的研究1材料和方法1.1实验材料沙土鼠(MowgoZ/a"ge咖？MGS/Sea(SPF级)6周龄，^，体重50g55g。/fpSSl菌株来自澳大利亚新南威尔士大学微生物学院。将一7(TC冻存的菌种在含5%马血的Columbia琼脂平板上复苏，转种于添加了15%马血清和抗生素的心脑浸液中。在微需氧条件下培养扩增，经尿素酶、触酶、氧化酶试验及涂片革兰染色鉴定后分装，置一8(TC保存。接种前将细菌在Skirrow选择性培养基上培养24-48小时，经鉴定和观察细菌活力后，将细菌于PBS液中离心、洗涤，最后以改良布氏肉汤配制成30"CFU/ml的细菌悬液，备用。1.2方法1.2.1动物模型沙土鼠禁食24h，接种前30min灌胃给予400mL/L酒精0.5mL，将上述细菌悬液0.5mL在30min内灌胃给于实验动物，然后再禁食4h,接种连续3d。造模后3个月随机取样部分动物，处死，取胃作快速尿素酶试验、涂片革兰氏染色、病理切片及细菌培养检测，确保造模成功。1.2.2#;7接种3个月后，以本发明所述提取物大、中、小剂量作为测试组，三联疗法(CBS6.15mg/kg，四环素50mg/kg，甲硝唑22.5mg/kg)作为阳性对照组；每天灌胃给药连续2周。2周后停止给药饲养1个月后处死所有动物，取胃，放大镜下测量胃内壁溃疡面长度和宽度，以其乘积(mm2)作为溃疡指数。本试验中提取物采用实施例4所述方法提取得到，化合物1，2,3，6-四-^没食子酰-,f葡萄糖(1,2,3,6-Tetra-^galloyl-^fglucose)占提取物总质量的5.7%，剂量与实施例6中所述老鹳草大、中、小剂量相同。按下式计算溃疡抑制率溃疡抑制率(％)-{1-(实验组溃疡指数均值/对照组溃疡指数均数)}00%;数据以X盥表示，组间差异的比较采用t检验、方差(F值)分析进行统计学处理。表4.本发明提取物对^感染的胃溃疡的影响(x土S)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注*P<0.05(与对照比较)；**P<0.Ol(与对照比较)试验结果显示，本发明化合物大、中剂量组均能有效减小造模动物胃内溃疡面积。大、中剂量组的作用强度与阳性组相当。表明本发明提取物能有效治疗因幽门螺杆菌引起的消化道溃疡。实施例8、提取物对CCl4所致肝损伤的影响18—20g昆明种小鼠60只，雌雄各半，按体重随机分为六组正常对照组、模型对照组、本提取物A、B、C剂量组、联苯双酯对照组(提取物A、B、C组分别是根据实施例1、3、4制备，其中化合物的含量分别为2.2%、11.4%、5.7%)。灌胃给药连续7天(药物剂量为150mg/Kg)，末次给药后2h,除正常对照组外其余各组ip0.25。/。CCl4一敵榄油10ml/kg，24h后眶静脉取血，2500rpm离心15min，取血清测定ALT，结果进行t检验，见表5。表5、提取物对CCU所致肝损伤小鼠的影响(X土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>A组10150mg/Kg283.18±42.40###**141.13±8.61絲#**B组10150mg/Kg271.29±56.61#絲**138.73±13.42絲#***C组10150mg/Kg252.86±55.26###***121.40±9.02絲#***联苯双酯组105.85mg/kg272.37±43.04###**120.50±8.39##弁***注与正常对照组比#P<0.05，#絲P〈0.001;与模型对照组比*P<0.05，**p<0.01，***P<0.001;由表5结果可见，小鼠ip给予CCU后血清ALT、AST含量显著升高。给予本提取物A、B、C组后可使小鼠升高的血清ALT、AST显著降低，尤其是C组提取物作用强度与阳性药联苯双酯相当并且优于A、B组。试验结果表明本提取物对于CCU肝脏损伤有明显治疗保护作用。权利要求1.一种牻牛儿苗科植物中提取得到的提取物，特征是该提取物中化合物1，2，3，6-四-O-没食子酰-β-D-葡萄糖(1，2，3，6-Tetra-O-galloyl-β-D-glucose)占提取物总质量的百分比为1％？0％。2、权利要求1所述的提取物，其中1，2，3,6-四-0-没食子酰-^Z)"葡萄糖(l，2，3，6-Tetra-<9-galloyl+ZXglucose)占提取物总质量的百分比为2%-15%。3、权利要求1所述的提取物，其中1,2，3,6-四-0-没食子酰---/)-葡萄糖(1，2,3,6-Tetra-0-galloyl弄D-glucose)占提取物总质量的百分比为3%-10%。4、权利要求1-3所述的提取物的制备方法，特征是选自栊牛儿苗科的植物经粉碎后采用乙醇冷浸或回流提取三次，将提取液合并浓縮至无醇味，加水稀释后上大孔树脂，用水、10-90%任一浓度酒精洗脱液洗脱分离，收集10-90%酒精洗脱液浓缩至干而得；大孔树脂可以选自型号为HPD100、HPD400、HPD600;提取过程中冷浸或回流的乙醇浓度为40-80%。5、权利要求4所述的制备方法，其中大孔树脂型号为HPD100。6、权利要求4所述的制备方法，特征是使用40-60%酒精作为洗脱液。7、权利要求4所述的制备方法，特征是使用50%酒精作为洗脱液。8、权利要求1-3所述的提取物，特征是其中的栊牛儿苗科植物为选自粗根老鹳草(Geraiw'廳da/賠'c腦)、野老鹳草(Geram'謹cwoZ/w/z"謂)、毛蕴老鹳草(Geraw/'MWer/oWe附ow)、绒背老鹳草(Gerafw/w附v/owon'"www)、青岛老鹳草(Gera"/w加加'"gtowerae)、大根老鹳草((7era"/w附附ac7wr/^ww)中的一禾中或两种以上的植物。9、权利要求1-3所述的提取物在制备抗幽门螺旋杆菌感染以及治疗或预防幽门螺旋杆菌感染导致的消化道疾病的药物中的应用。10、权利要求9所述的应用，其中消化道疾病包括幽门螺旋杆菌导致的急、慢性胃炎、浅表性胃炎以及胃、十二指肠溃疡和胃部肿瘤以及胃部的癌前病变。11、权利要求1-3所述的提取物在制备治疗肝炎药物中的应用。全文摘要本发明提供了一种从牻牛儿苗科植物中提取得到的一种提取物以及该提取物的提取方法和在制备抗幽门螺杆菌感染以及治疗或预防幽门螺杆菌感染导致的消化道疾病药物中的应用以及该组合物在制备治疗肝炎药物中的应用。文档编号A61K36/185GK101209271SQ200610161639公开日2008年7月2日申请日期2006年12月29日优先权日2006年12月29日发明者张喜全,洋李,李新祝申请人:江苏正大天晴药业股份有限公司