治疗肿瘤的方法和组合物的制作方法

专利名称：治疗肿瘤的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过使用来源于一种或者多种微小核糖核酸病毒的分离的核酸序列，包括合成的病毒RNA和互补DNA，来治疗动物肿瘤，尤其是治疗人类肿瘤的方法。本发明也涉及来源于一种或者多种微小核糖核酸病毒的分离的核酸的组合物，以及来源于一种或者多种微小核糖核酸病毒的分离的核酸在制造治疗哺乳动物肿瘤的药物中的应用。

背景技术：
溶瘤病毒治疗是一个对于多种人和动物癌症治疗有前途的疗法。例如Shafren等人(2004；“Systemic Therapy of Malignant HumanMelanoma Tumors by a Common Cold-Producing Enterovirus，Coxsackievirus A21”.Clin Cancer Res.10(1)53-60)通过使用人黑色素瘤NOD-SCID小鼠模型证实了柯萨奇病毒血清型CVA21体内溶瘤能力的有效性。对已形成皮下黑色素瘤异种移植物的免疫缺失小鼠，与磷酸盐缓冲盐水(PBS)治疗对照组相比，CVA21的瘤内(i.t.)用药治疗显示肿瘤负荷显著减少了。CVA 21的腹腔内(i.p.)和静脉内(i.v.)病毒给药途径也已经被证实能有效地减少黑色素瘤异种移植物的负荷。
特定病毒的靶向和溶解易感癌细胞，同时不溶解非恶性、正常细胞的特异性，使这种治疗与传统治疗，例如放疗和化疗相比，显现出许多优势。与细胞恶性转化有关的细胞表面受体表达的特性改变以及细胞信号转导通路的改变，被溶瘤病毒用来从正常细胞中识别癌细胞。PCT/AU2003/001688(公开为WO/2004/054613标题是“通过直接的微小核糖核酸病毒介导的瘤细胞溶解治疗受试者的恶性肿瘤的方法”)，例如，描述了使用埃可病毒(echoviruses)，例如埃可病毒血清型EV1、EV7、EV8和EV22，来破坏多种类型癌细胞，例如乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、卵巢癌以及黑素瘤细胞。细胞识别对于，例如能识别细胞受体α2β1以感染细胞的埃可病毒血清型EV1和EV8，和识别补体调控蛋白衰变加速因子(DAF)以感染细胞的EV7或EV22是有利的。同样，能识别至少一种细胞粘附分子，例如细胞间粘附分子-1(ICAM-1)，以及补体调控蛋白，例如DAF的微小核糖核酸病毒也显示能定向破坏癌细胞，例如黑色素瘤、乳腺癌以及前列腺癌细胞。正如在PCT/AU00/01461(公开为WO01/37866标题是“治疗受试者恶性肿瘤的方法以及在其中使用的药物组合物”)中所证实的那样，这种微小核糖核酸病毒包括柯萨奇病毒(Coxsackievirus)例如柯萨奇病毒血清型CVA13、CVA15、CVA18和CVA21。
感染后，溶瘤病毒能够通过直接的溶解感染、诱导调亡或者通过激发对病毒抗原的免疫反应而杀死肿瘤细胞。因而溶瘤病毒不限于单剂输入，它可以进行多周期感染，从而产生大量的子代病毒。这些子代病毒既可以局部扩散到附近的肿瘤细胞，又可以全身性扩散到远处转移部位。溶瘤治疗的这一特性对治疗难以达到的肿瘤或者未确诊的微小转移灶尤其有吸引力。
恶性黑色素瘤 恶性黑色素瘤是来源于活化的或者遗传改变的表皮黑色素细胞的一种肿瘤。在皮肤(表皮基底层)、眼睛、头发和粘膜内的少量的黑色素细胞群通常通过生成并向角质形成细胞分布黑色素而发挥对皮肤/头发着色的作用。在遗传因子和环境因素之间的一批复杂的反应被认为诱导了黑色素细胞的恶性转化，包括遗传倾向和暴露于紫外线照射环境。
恶性黑色素瘤通过许多特定的阶段而进展。起初，局部病变(痣)通常显示出径向生长相(RGP)，局限于表皮。从这里开始，黑色素瘤进展到垂直成长相(VGP)进入真皮，并发展成为具有转移能力的膨胀性肿瘤结节。黑色素瘤进展至这种转移性结节对患者生存具有明显的负面影响。
恶性黑色素瘤目前的治疗包括手术切除、放疗、化疗和生物治疗，所有这些疗法成功率均相对较低(约1/14)(Russell-Jones，R.和K.Acland，Sentinel node biopsy in the management of malignant melanoma.Clin ExpDermatol，2001.26(6)463-468；Slominski A等人，Malignant MelanomaAn Update.Achives of Pathology and Laboratory Medicine，2001.125(10)1295-1306.)。如果在转移发生之前得到诊断，那么手术切除通常能够产生有效的、长期的疗效。但是，细胞转移以后，病变变为恶性，目前的治疗方法，尤其是化疗提供的治疗益处很少的甚至没有(Atkins，M.B.，The treatment of metastatic melanoma with chemotherapyand biologics.Curr Opin Oncol，1997.9(2)p.205-13)。
随着世界范围内黑色素瘤的发病率的增加，对有效的特效疗法的需求越发明显。澳大利亚是黑色素瘤发病率最高的国家之一，2000年确诊的新发病例超过8500例(Cancer in Australia 2000，in AIHW(CancerSeries no.23)，Australian Institute of Health and Welfare(AIHW) &Australasian Association of Cancer Registries(AACR)2003Canberrap.AIHW cat.no.CAN 18)。仅在新南威尔士州，在2002年报道有超过3000例新发病例和425例死亡，每100000的发病率仅次于昆士兰州和Western Australia而排在世界第三位(Tracey EA等人，Cancer in NewSouth WalesIncidence and Mortality 2002.2004，The Cancer CouncilNSW，New South Wales Department of HealthSydney)。由于这些原因，提出了大量治疗黑色素瘤的新方法。
恶性黑色素瘤细胞表达高水平的补体调控蛋白——衰变加速因子(DAF)，以及细胞粘附分子——细胞间粘附分子-1(ICAM-1)。这些分子表达的增加使肿瘤细胞获得了许多有利于其长期生存的特性。DAF表达的增加使癌细胞能够逃避补体介导的降解作用(Cheung，N.K.等人，Decay-accelerating factor protects human tumor cells fromcomplement-mediatedcytotoxicity in vitro.J Clin Invest，1988.81(4)1122-8)，推测ICAM-1表达上调通过促进与侵入的淋巴细胞的反应而增加了肿瘤的转移潜能(Johnson，J.P.等人，Denovo Expression ofIntercellular-Adhesion Molecule 1 in Melanoma Correlates with IncreasedRisk of Metastasis.Proc Natl Acad Sci USA，1989.86(2)641-644)。肿瘤厚度(VGP)的增加与ICAM-1表达的增加相关，并且厚度越厚，转移能力越强。表面表达高水平ICAM-1的转移细胞特征性地向循环系统分泌高水平的可溶性ICAM-1(sICAM-1)，其水平用作恶性黑色素瘤进展程度的诊断因子(Vuoristo，M.-S.等人，Serum adhesion molecules andinterleukin-2 receptor as markers of tumour load and prognosis inadvanced cutaneous melanoma.European Journal of Cancer，2001.37(13)1629-1643)。
ICAM-1和DAF两者都上调通常使黑色素瘤细胞进行不受控制的增殖和转移，但是，这一特性最近被开发用于肿瘤细胞的体内或者体外靶向瘤细胞溶解。CAV21，微小核糖核酸病毒家族的一员，近来显示可以特异性地靶向和溶解ICAM-1和DAF两者都显示上调的黑色素瘤细胞(Shafren等人2004；ibid)。
微小核糖核酸病毒 微小核糖核酸病毒是一个最大的病毒家族之一，用希腊语“pico”(非常小)，以及“RNA”在其核糖核酸基因组之后而命名。该家族包括许多临床上重要的人和动物的病原体，包括脊髓灰质炎病毒、鼻病毒属和甲型肝炎。微小核糖核酸病毒根据病毒粒自然属性、RNA序列相似性以及病毒RNA基因组的结构组成分为9类(表1.2)(Stanway，G.等人，Molecular and Biological Basis of Picornavirus Taxonomy，inMolecular Biology of Picornaviruses，in B.Semler and E.Wimmer，Editors.2002，ASM PressWashington DC.p.17-24)。
表1.微小核糖核酸病毒属。RNA病毒的微小核糖核酸病毒家族的9个种属显示如下。同时列出每一种属的代表种类。
总之，上述发现表明CAV21和其他微小核糖核酸病毒是控制恶性黑色素瘤和其他癌症的潜在的病毒治疗制剂。基于活病毒的制备和给药的治疗可能会引起公众的关注，例如与感染病毒的生产、分布以及给药等相关的生物安全性问题。使用溶瘤病毒疗法治疗恶性黑色素瘤和其他肿瘤的替代疗法可以打消这些顾虑。


发明内容
本发明的第一个方面提供了一种治疗需要所述治疗的哺乳动物的肿瘤的方法，所述方法包括在引起病毒介导的一种或者多种肿瘤细胞的瘤细胞溶解的条件下给予哺乳动物有效量的核酸分子，所述核酸分子包括来源于微小核糖核酸病毒的分离的病毒多核苷酸序列。
在一个实施方式中，肿瘤选自前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、淋巴癌、白血病、脑癌、肺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、肾癌、肾上腺癌、肝癌、胃癌、小肠癌和黑色素瘤。
在一个实施方式中，核酸分子可以选自包括来源于微小核糖核酸病毒的序列的单链RNA或者互补DNA(cDNA)。
在一个实施方式中，序列可包括当给予细胞后能够诱发溶解感染的整个病毒基因组或者其一部分。
在一个实施方式中，核酸分子是合成的病毒RNA。
在一个实施方式中，核酸分子来源于微小核糖核酸病毒，它能够识别免疫球蛋白超家族的细胞粘附分子和用于感染细胞的补体调控蛋白中的至少一种。
在一个实施方式中，核酸分子来源于微小核糖核酸病毒，它能够识别α2β1以感染细胞。
在一个实施方式中，核酸分子来源于微小核糖核酸病毒，它能够识别ICAM-1和DAF中的至少一种以感染细胞。
在一个实施方式中，核酸分子来源于能够在基本缺少ICAM-1的细胞内溶解感染或者诱发调亡的微小核糖核酸病毒。
在一个实施方式中，核酸分子来源于能够通过细胞上的DAF在细胞内溶解感染或者诱发调亡的微小核糖核酸病毒。
在一个实施方式中，核酸分子来源于选自CVA13、CVA15、CVA18和CVA21的柯萨奇病毒。
在一个实施方式中，核酸分子来源于选自EV1、EV7、EV8和EV22的埃可病毒。
在一个实施方式中，多核苷酸序列包括与野生型相比在一个或者多个衣壳蛋白中的改变，其中该改变增强了细胞的选择性和/或包括该改变的病毒的肿瘤靶向作用。
在一个实施方式中，多核苷酸序列包括具有一个或者多个外壳蛋白突变的柯萨奇病毒核酸序列。
在一个实施方式中，外壳蛋白突变包括选自VP3 R96H、VP3E101A、VP3 A239S、VP2 S164L和VP2 V209或其相应的保守变异体的一个或者多个突变。
在一个实施方式中，核酸分子是以制剂的形式给药，所述制剂包括vRNA和例如阳离子脂质的脂质。
在一个实施方式中，该制剂进一步包括能识别并且与肿瘤特异性标记物反应的配体。
在一个实施方式中，该制剂进一步包括能识别肿瘤抗原的抗体，例如识别DAF、ICAM-1、α2β1或者MAGE的单克隆抗体。
在一个实施方式中，核酸分子通过直接注射到肿瘤内给药。
在一个实施方式中，核酸分子以口服或者全身给药。
在一个实施方式中，该方法进一步包括给予哺乳动物一种或者多种免疫抑制剂。
在一个实施方式中，该哺乳动物是人类。
本发明的第二个方面提供了一种治疗需要所述的治疗的人的黑色素瘤的方法，该方法包括在引起病毒介导的一种或者多种黑色素瘤细胞的瘤细胞溶解的条件下给予人有效量的vRNA:脂质制剂，其中vRNA包括从选自CVA13、CVA15、CVA18、CVA21、EV1、EV7、EV8和EV22变异体CVA21#272101、CVA21#275238和CVA21#272598，以及CVA21-DAFv的一种或者多种病毒分离的RNA。
在一个实施方式中，给药是将该制剂直接注射到人的一个或者多个黑色素瘤内。
在一个实施方式中，该制剂进一步包括能识别并且与肿瘤特异性标记物反应的配体。
在一个实施方式中，该制剂进一步包括能识别肿瘤抗原的抗体，例如识别DAF、ICAM-1、α2β1或者MAGE的单克隆抗体。
本发明的第三个方面提供了一种核酸分子在制备治疗哺乳动物肿瘤的药物中的应用，所述核酸分子包括来源于微小核糖核酸病毒的分离的病毒核酸序列。
本发明的第四个方面提供了一种药物组合物，其包括具有来源于微小核糖核酸病毒的分离的病毒多核苷酸序列的核酸分子，以及制药学可接受的赋形剂、稀释剂或者载体，其中该药物组合物给予肿瘤会引起病毒介导的一种或者多种肿瘤细胞的瘤细胞溶解。
在一个实施方式中，核酸分子来源于选自CVA13、CVA15、CVA18、CVA21、EV1、EV7、EV8和EV22变异体CVA21#272101、CVA21#275238和CVA21#272598，以及CVA21-DAFv的一种或者多种病毒。
在一个实施方式中，组合物包括一种或者多种脂质，例如阳离子脂质。
在一个实施方式中，组合物包括vRNA:脂质复合体，例如CVA21:脂质复合体。
在一个实施方式中，组合物包括能识别并且与肿瘤特异性标记物反应的配体。
在一个实施方式中，该制剂进一步包括能识别肿瘤抗原的抗体，例如识别DAF、ICAM-1、α2β1或者MAGE的单克隆抗体。
缩写 CD 分化群 cDNA 互补DNA ℃ 摄氏温度 CHO中国仓鼠卵巢 CPE细胞病变效应 CSPD 3-(4-甲氧基螺旋{1，2-二氧环丁烷-3，2’-(5-氯)三环 [3.3.1.13，7]癸烷}-4-基)苯基磷酸二钠 CAV21 柯萨奇病毒A21 DAF衰变加速因子 DIG地高辛配基化-11-2’-脱氧-尿嘧啶-5’-三磷酸 DMEM Dulbecco′s modified Eagle′s Medium培养基 DNA脱氧核糖核酸 FCS胎牛血清 GPI 糖基磷脂酰肌醇 ICAM-1细胞间粘附分子-1 Ig免疫球蛋白 IgSF 免疫球蛋白超家族 i.p. 腹腔内注射 IRES 内核糖体进入位点 i.t. 瘤内注射 i.v. 静脉内注射 kDa 千道尔顿 LFA-1 白细胞功能相关抗原-1 MAb 单克隆抗体 Mac-1 巨噬细胞-1抗原 mRNA 信使RNA NOD-SCID 非肥胖型重型糖尿病合并免疫缺陷 PBS 磷酸缓冲液 PI感染后 RD横纹肌肉瘤 RGP 径向生长相 RNA 核糖核酸 RT室温 s.c. 皮下注射 SCR 短同源重复序列 TCID5050％组织培养感染剂量 UTR 非翻译区 VGP 垂直成长相 vRNA 病毒RNA vRNA:lipid病毒RNA/脂质复合体 VP病毒蛋白 VPg 基因组连接的病毒蛋白 定义 下面是一些可能有助于理解本发明的描述的定义。这些定义遵循通用的定义，而不以任何方式将本发明的范围仅限制于那些术语，且是为了更好的理解下面的描述而提出的。
在本发明书的上下文中，术语“治疗”指以任意方式来治疗疾病状态或症状、防止疾病产生、或防止、阻碍、延迟或逆转疾病或其它不希望的症状的进展的任何和所有应用方法。
除非上下文需要以别的方式或者特别地说明以相反的含义，本发明的多个整数、步骤或组分在此被引用为单数形式的整数、步骤或者组分，显然也包括这些引用的整数、步骤或者组分的单数和复数形式。
在整个说明书中，除非上下文需要，单词“包括(comprise)”，或词形变化，例如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”应被理解为包括所述步骤或者组分或者整数，或者一组步骤或者组分或者整数。因此，在本发明书的上下文中，术语“包括(comprising)”的含义是“主要包括，但不必是仅仅包括”。
在此现有技术文件的任何描述，或来自或基于这些文件的陈述并不意味着承认这些文件或者衍生的陈述属于澳大利亚或者其他地方的现有技术的公知常识的一部分。
本领域技术人员要理解的是，此处所描述的发明除了这些特别描述之外，还易于进行改变和修改。要理解的是，本发明包括所有这些改变和修改。本发明也包括本说明书中个别或者集中提到或指出的所有步骤、特性、组合物和化合物，以及所述步骤或者特性的任意和全部组合或者任意两个或者多个的组合。



图1.SK-Mel-28、RD和CHO细胞上的ICAM-1和DAF表面表达的流式细胞检测分析。黑色柱形图显示了仅有结合物的结合；兰色柱形图代表抗-ICAM-1单克隆抗体(MAb)的结合；红色柱形图代表抗-DAF MAb的结合。
图2.CVA21 RNA的变性琼脂糖凝胶电泳和Northern印迹。A.CVA21 RNA的420-核酸3’区与DIG-11-UTP标记的DNA探针序列互补。B.两个标本的CVA21 RNA(5μl和10μl)以及0.3-6.9kb RNA标志物(M)在变性的1％琼脂糖凝胶上被分离。C.经Northern印迹毛细管转移技术转移，RNA条带被转移并固定到尼龙膜上，与标记的DNA探针进行杂交，用抗-DIG-碱性磷酸酶和CSPD检测并最后曝光在X射线胶片上。
图3.SK-Mel-28、RD和CHO细胞上的Lipofectamine 2000TM的细胞毒性。将单层SK-Mel-28、RD和CHO细胞与不同浓度的Lipofectamine 2000TM孵育在24孔板内24小时，然后显微镜下检测细胞的死亡。高浓度的Lipofectamine 2000TM 10μl/孔(A)和5μl/孔(B)对SK-Mel-28细胞具有高度毒性，而2μl/孔的Lipofectamine 2000TM是所有三个细胞系所能耐受的最高浓度SK-Mel-28(C)、RD(D)和CHO(E)。
图4.SK-Mel-28细胞用CVA21病毒RNA脂质介导转染后的病毒细胞病变效应的进展情况。24孔板内的单层SK-Mel-28细胞用结合了Lipofectamine 2000TM的CVA21 RNA(vRNA:脂质复合体)转染。对照孔包括2μl/孔的仅Lipofectamine 2000TM(仅脂质)、1μl/孔的仅病毒RNA(仅病毒RNA)以及1.6×104 TCID50/孔活CVA21病毒粒(CVA21活病毒)。转染后监测细胞的病毒细胞病变效应(CPE)征象48小时。显微照片显示12、24和48小时后每孔的代表性部分。所观察到的大约的CPE值从没有CPE(-)、25％细胞显示CPE(+)、50％CPE(++)、75％CPE(+++)到100％CPE(++++)。在SK-Mel-28细胞的单层培养物中用溶解细胞感染性检测测定的孔内上清液的每毫升50％组织培养感染剂量(TCID50/ml)显示在每张图片的左下角。
图5.CVA21 vRNA:脂质复合体转染后的细胞上清液的感染性测定。在每个所关心的时间点，来自所有四种治疗方法CVA21 vRNA:脂质复合体(vRNA:脂质)、仅CVA21 vRNA(仅vRNA)、仅脂质和CVA21活病毒粒(CVA21活病毒)的96孔板SK-Mel-28细胞单层与10倍稀释的转染上清液孵育。在本实施例中显示的转染后12小时时取得的标本。单层在37℃5％CO2中孵育72小时，显微镜下观察CVA21诱导的CPE，并用结晶紫溶液染色。CPE阳性孔记为(+)。使用Reed和Muench的方法(A simple method for estimating fifty percent endpoints.Am.J.Hyg.，1938.27p.493-497)，采用每个稀释度的CPE阳性CPE阴性孔的比率用来计算50％组织培养感染剂量(TCID50)。
图6.RD和CHO细胞用CVA21 vRNA转染后的CVA21诱导的细胞病变效应和子代病毒产生的进展情况。24孔板内RD(A)和CHO(B)细胞的单层用结合有Lipofectamine 2000TM的vRNA(vRNA:脂质复合体)转染。对照孔接种以初始剂量为2μl/孔的Lipofectamine 2000TM。显微照片显示12、24和48小时后每孔的代表性部分。显示了所观察到的大概的CPE值；没有CPE(-)、25％细胞显示CPE(+)、50％CPE(++)、75％CPE(+++)以及100％CPE(++++)。在SK-Mel-28细胞的单层培养物中用溶解细胞感染性检测测定的孔内上清液的每毫升50％组织培养感染剂量(TCID50/ml)显示在每个图片的左下角。
图7.vRNA:脂质转染上清液传代后的RD和CHO细胞中CVA21诱导的细胞病变效应的发生情况。RD和CHO细胞后转染48小时收集到的上清液传代到24孔板内RD和CHO细胞单层上，来检测子代感染性CVA21对这些细胞的感染性。在37℃5％CO2中孵育48小时后所有细胞类型中都没有观察到CPE。
图8.从用vRNA:脂质复合体或者CVA21活病毒注射的已形成皮下黑色素瘤异种移植物的NOD-SCID小鼠血清中提取的CVA21病毒RNA进行实时RT-PCR。对从血清标本中提取的RNA筛选CVA21vRNA。当荧光(logΔRn)相对于周期数的对数改变进行作图时，阈值水平(红线)设定在扩增的指数相的线形区域之内。荧光超过这个阈值的标本则为CVA21 vRNA阳性，通过将这些未知滴度的阈值周期(CT)与已知滴度(STD 103-107TCID50/ml)的标准CVA21制品的CT值相比较来计算病毒滴度。通过笼号(C1-4)和耳标签号(左侧一个1L，右侧一个1R，左侧一个和右侧一个LR，右侧两个2R，没有孔NH)来识别每个小鼠的标本。
图9.用CVA21 vRNA:脂质复合体或者CVA21活病毒治疗的已形成人黑色素瘤异种移植物的NOD-SCID小鼠的肿瘤体积的缩小情况。A.用四种治疗方法之一在第0天和第8天向四组荷皮下SK-Mel-28人黑色素瘤的NOD-SCID小鼠进行瘤内注射；CVA21 vRNA:脂质复合体(vRNA:脂质，n＝5)、仅vRNA(n＝4)、仅脂质(n＝4)或者CVA21活病毒(n＝4)。由于实时RT-PCR筛选报告此组血清中有高滴度的CVA21，CVA21活病毒治疗小鼠在第8天没有进行注射。B.用球形体的体积计算公式，通过每个肿瘤的两个交点测量值来计算肿瘤体积(mm3)。显示从第0天(初始治疗的那天)到第35天的每组的平均值，除此之外，由于伦理上的原因处死了一些小鼠限制了各组平均值的统计学关联性。误差棒表示标准差(SD/√n)。
*与仅脂质治疗组相比统计学有显著差异(p＜0.05)。
图10.用仅脂质、仅CVA21vRNA、vRNA:脂质复合体或者CVA21活病毒治疗的已形成皮下黑色素瘤异种移植物的NOD-SCID小鼠的死后肿瘤负荷检测。用下述方法向已形成皮下SK-Mel-28人黑色素瘤异种移植物的小鼠瘤内注射治疗A.仅脂质或者B.CVA21 vRNA(仅vRNA)，在两个时刻，第0天和第8天。初始治疗44天后，处死小鼠，从每只小鼠的背部去除皮毛和皮肤显露肿瘤。在两个时刻(第0天和第8天)用C.CVA21 vRNA:脂质复合体(vRNA:脂质)治疗小鼠或者在第0天用D.CVA21活病毒治疗一次。死后去除毛和皮肤显露肿瘤。通过实时RT-PCR(PCR)以及细胞感染性检测(Infect.Assay)测试病毒血清载量，报告为50％终点滴度(TCID50/ml)。用(+)代表CVA21病毒血症阳性，(-)代表病毒血症阴性。每个肿瘤块被切下、匀浆，并通过匀浆上清液的细胞感染性检测测定肿瘤病毒载量(TCID50/μg)。两个肿瘤检测时没有检测到(未检测到)，所以显示没有肿瘤病毒载量。

具体实施例方式 尽管已知一些天然的和改良的微小核糖核酸病毒，例如柯萨奇病毒和艾柯病毒，适用于治疗癌症，但是本发明人已经认识到了有治疗癌症的其它方法的需求，例如，提供对活病毒给药的替代或辅助的方法。
本发明来源于本发明人在此所观察和证实到的发现，即将分离的微小核糖核酸病毒核酸给予异常细胞，如黑素瘤所证明的那样，能够诱发细胞中发生生产性病毒感染，从而引起细胞破坏。
因此，本发明提供了一种治疗需要该治疗的哺乳动物的肿瘤的方法，该方法包括在引起病毒介导的一个或多个肿瘤细胞的瘤细胞溶解的条件下给予哺乳动物有效量的核酸分子，所述核酸分子包括来源于微小核糖核酸病毒的分离的病毒多核苷酸序列。
核酸分子可以作为分离的核酸给予细胞。可以理解，术语“分离的”包括来源于微小核糖核酸病毒的多核苷酸序列，该多核苷酸序列包括例如编码病毒基因组的核酸序列或其足以在细胞中产生病毒或能够诱发细胞中溶解感染的核酸序列。因此，核酸分子可包括单个病毒RNA或DNA分子，例如互补的DNA分子，或多个编码不同病毒序列的该类分子。
如本文所用的术语“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸碱基或已知的类似物或天然核苷酸、或其混合物的单链或双链聚合物。
要理解的是在本说明书的上下文中，术语“来源于”的含义包括序列可以是直接从微小核糖核酸病毒分离的病毒RNA、合成的RNA、与分离的序列对应的cDNA。术语还包括合成的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与野生型序列相比，在序列中具有一个或多个突变，该突变包括例如在外壳蛋白上的突变。
肿瘤细胞可以被从纯化病毒粒提取的病毒RNA，或例如利用噬菌体T7RNA聚合酶，从cDNA模板在体外产生的RNA转录产物(如Ansardi，D.C.等人，2001所述)转染。同样，可以给予单个质粒或RNA分子用于表达病毒蛋白质和产生病毒，或给予多个编码不同的病毒蛋白质的质粒或RNA分子用于转染细胞和产生病毒。
可以使用任意合适方法来分离病毒RNA，包括基于使用苯酚/氯仿提取的方法，例如以市售的试剂盒形式分离病毒RNA，例如TrizolLS试剂(GIBCO BRL，Life Technologies Grand Island，NY，USA)，基于使用磁珠分离的分离方法，例如Ambion MagMaxTM病毒RNA分离试剂盒。用于分离病毒RNA的方法通常描述在，例如Ausubel，F.等人，主编，Current Protocols in Molecular Biology.1992，Green PublishingAssociates and Wiley-Interscience，John Wiley and SonsNew York.以及在Sambrook等人，(1989)，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Ed.，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York中。
要理解的是，该方法不需要病毒RNA，不论其是否直接从病毒分离、合成、呈现为质粒分子或例如利用噬菌体T7 RNA聚合酶从cDNA在体外产生，要没有污染物质，例如细胞碎片，要在本发明的上下文中被认为是“分离的”。因此，在本说明书的上下文中，当来自来源物质，例如细胞蛋白质的非-RNA成分被部分或完全地从RNA去除时，RNA将被认为是分离的。例如，当超过50％的非-RNA成分被去除时，RNA被认为“分离的”。优选超过60％的非-RNA成分被去除，更优选超过70％、80％或90％的非-RNA成分被去除。一般，RNA含有不到10％的污染物质，更典型地含有不到5％的污染物质。因此，对于病毒RNA优选RNA超过95％的纯度，甚至更优选超过97％纯度或超过99％纯度。
除了给予病毒RNA本身，可以将合并了用于产生病毒的核酸的病毒或其它质粒或表达载体注射入肿瘤(瘤)内被肿瘤细胞摄取并在细胞内产生完整的病毒使细胞死亡。合适的表达载体包括能够表达编码产生病毒所必需的病毒蛋白质的DNA(例如，染色体组DNA或cDNA)插入片段的质粒。表达载体一般包括与插入序列可操作地连接的转录调控序列。“可操作地连接”指核酸插入片段与转录调控序列连接，使得插入序列在插入片段的可读框架中不发生移位的情况下进行转录。该转录调控序列包括有助于RNA聚合酶结合以引发转录的启动子，和用于结合核糖体以转录mRNA的表达控制元件。
更具体地说，如此处所使用的术语“调控序列”被用于包含参与驱动转录和控制(即，调节)指定DNA序列的转录水平的任意DNA。例如，5’调控序列是位于编码序列的上游的DNA序列，其可包括启动子和5’未翻译的前导序列。3’调控序列是位于编码序列的下游的DNA序列，其可包括适当的转录终止(和/或)调节信号，包括一种或多种多腺苷酸化信号。如本文所用，术语“启动子”包含在启动转录过程中被依赖DNA的RNA聚合酶识别和结合(直接或间接)的任意DNA序列。启动子包括转录起始位点，和用于转录起始因子和RNA聚合酶的连接位点，并可包括多种可与基因表达调节蛋白质连接的其它位点和序列(例如，增强子)。
在本领域中已知有大量的用于转染哺乳动物细胞的表达载体。适合转染哺乳动物细胞的表达载体包括pSV2neo、pEF-PGk.puro、pTk2和加入了多腺苷酸位点的非复制性腺病毒穿梭载体和延伸因子1-x启动子和最优选加入了巨细胞病毒(CMV)启动子的基于pAdEasy的表达载体(例如，参见He等人，1998)。还可以使用利用多肽延伸因子-α2作为启动子的质粒pEFBOS。
编码产生病毒所必需的病毒蛋白质的cDNA可以通过逆转录病毒RNA基因组或其片段来制备并使用本领域公知的重组技术加入至适合的载体中，如下所述Sambrook等人，(1989)，Molecular CloningALaboratory Manual，Second Ed.，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York，和Ausubel等人，(1994)Current Protocols in MolecularBiology，USA，Vol.1 and 2。
在缺乏有助于细胞转染的运载工具或不能与该工具组合的情况下，质粒或RNA可通过局部或通过注射被肿瘤细胞摄取来对肿瘤直接给药。
合适的运载工具包括脂质体，在本领域中其一般以水包油乳液的形式提供。合成的脂质囊泡(脂质体)有助于各种分子的运输，包括核酸分子穿过细胞膜。脂质体在体外和体内被用于运输核酸、细胞毒药物、甚至化妆品至细胞。近来的脂质体技术的进展进一步提高了其核酸运输效率。显示完全正电荷的阳离子脂质体是最广泛使用的类型。这些脂质体通过包封或与负电荷的核酸结合，使其能够克服它和细胞膜(也是负电荷)间的静电排斥力而发挥作用。如果被包封，脂质则作为合成膜，将核酸分子包围。如果成为复合体，则脂质将核酸携带在其外表面。随后，靶细胞通过细胞膜的融合和脂质体内容物的排出，或通过将整个复合体内吞，摄取被携带的分子。已经证明有多种市售的阳离子脂质体在体外和体内真核细胞的转染中都是成功的(Audouy S，H.D.，Cationic Lipid-mediated Transfection in vitro and in vivo(Review)。Molecular Membrane Biology，2001.18129-143；Dalby，B.，S.等人，Advanced transfection with Liposfectamine 2000 reagentprimary neurons，siRNA，and high-throughput applications.Methods，2004.33(2)95-103；Egilmez，N.K.等人，Evaluation and Optimization of Different CationicLiposome Formulations for in Vivo Gene Transfer.Biochemical andBiophysical Research Communications，1996.221(1)169-173；Reynier P等人，In Vitro and In Vivo transfection of Melanoma Cells B16-F10mediated by Cholesterol-based Cationic Liposomes.J Drug Targeting，2002.10(7)557-566)。
脂质体通常包括脂质，尤其是磷脂，例如相变温度很高的磷脂通常和一种或多种类固醇或类固醇前体例如胆固醇的组合以便为脂质体提供膜稳定性。对于制备脂质体有用的脂质的实例包括磷脂酰化合物，例如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、神经鞘脂、磷脂酰乙醇胺、脑苷脂和神经节苷脂。二酰基磷脂酰甘油是特别适合的，其脂质部分含有14至18个碳原子，更优选16至18碳原子，并且是饱和的。可获得市售的适用于本发明的脂质体，包括例如Lipofectamine2000(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad CA，USA)。脂质体和脂质体:核酸的适当的和最佳的浓度由专业技术人员使用本领域所公知的方法和本文所描述的方法来确定，对于市售的脂质体，采用制造商推荐的方法来确定。
脂质体和靶细胞的相互作用可以是被动的，也可以是主动的。主动靶向涉及通过在脂质体膜上加入与靶细胞表达的相应配体相结合或相作用的特异配体而对脂质体进行改良。这种配体包括例如单克隆抗体或其结合片段(例如，Fab或F(ab’)2)片段、糖或糖脂部分、或病毒蛋白质，特别优选对α2β1、ICAM-1或DAF特异的病毒蛋白质或单克隆抗体，如对黑色素瘤抗原编码(MAGE)基因产物(例如如Chen Z等人，人肝细胞癌中A、G和B黑素瘤抗原基因的表达，Hepatobiliary PancreatDis Int.2002 Nov；1(4)570-3)特异的单克隆抗体或其它配体。当核酸分子经口服或全身给药时，优选使用该靶向配体。
上述核酸序列可来源于天然产生的微小核糖核酸病毒，或改良的微小核糖核酸病毒，例如通过有意或无意的生物选择或重组方法来制备。
在本说明书的上下文中，术语“天然产生的”的微小核糖核酸病毒可以理解成为从天然来源分离的微小核糖核酸病毒，没有经过人类在实验室中进行有意的改良。
核酸的微小核糖核酸病毒来源可以是通过如本领域公知和例如Ausubel等人和Sambrook等人描述的重组方式改良的微小核糖核酸病毒。作为可选方案另外的方案，微小核糖核酸病毒可以通过如Johansson等人所描的生物选择进行改良(2004；J.Virol.78(22)12603-12612)。
在一个实施方式中，微小核糖核酸病毒选自柯萨奇病毒、埃可病毒或其改良形式。
如PCT/AU00/01461，公开号为WO 01/37866，标题为“一种治疗受试者恶性肿瘤的方法及在其中使用的药物组合物”中所述，可以识别至少一种细胞粘附分子(例如ICAM-1)，和补体调节蛋白质(例如DAF)的微小核糖核酸病毒家族的病毒能够杀死异常细胞，例如癌细胞。PCT/AU00/01461的内容在此作为相互参照引入本文。
因此，要理解的是，本发明的微小核糖核酸病毒核酸分子可以是识别至少一种细胞粘附分子(如ICAM-1)和补体粘附分子(例如DAF)的用于感染细胞的微小核糖核酸病毒核酸分子。例如，该微小核糖核酸病毒核酸分子可以是柯萨奇病毒，例如柯萨奇A族病毒，例如柯萨奇A族病毒血清型CAV1至CAV21的一种或多种。
在一个实施方式中，柯萨奇A族病毒选自CAV13、CAV15、CAV18和CAV21。
如共同未决申请PCT/AU2003/001688(公开号为WO/2004/054613，标题为“通过直接的微小核糖核酸病毒介导的瘤细胞溶解治疗受试者恶性肿瘤的方法”)中所述，识别α2β1以感染细胞的柯萨奇病毒能够诱导细胞溶解，并可以用于治疗异常细胞，例如哺乳动物中的癌细胞。因此，要理解的是，本发明的微小核糖核酸病毒核酸可以是识别α2β1以感染细胞的埃可病毒核酸。例如，该埃可病毒可以是选自埃可病毒EV1和EV8的埃可病毒。还要理解的是，本发明的微小核糖核酸病毒核酸可以是识别DAF以感染细胞的埃可病毒核酸，如EV7或EV22。PCT/AU2003/001688的内容在此作为相互参照引入本文。
如上所述，微小核糖核酸病毒可以是经过例如重组方法或生物选择方法生产的改良微小核糖核酸病毒。例如，在2005年1月17日提交的共同未决申请PCT/AU2005/000048，公开号为WO/2005/087931，标题为“改良的溶瘤细胞病毒”中特别描述了用于制备能够溶解感染或诱发肿瘤凋亡的分离的被选择的微小核糖核酸病毒的方法。PCT/AU2005/000048还描述了用于能够在基本上缺乏细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的情况下，生物选择溶解感染细胞的微小核糖核酸病毒的方法。PCT/AU2005/000048的内容在此作为相互参照引入本文。
PCT/AU2005/000048包括生物选择的微小核糖核酸病毒的具体实例，该生物选择的微小核糖核酸病毒与野生型病毒相比，在一种或多种外壳蛋白上已经有所改变，例如包括一种或多种突变VP3 R96H、VP3 E101A、VP3 A239S、VP2 S164L和VP2 V209的柯萨奇病毒。如PCT/AU2005/000048所述，本文所描述的病毒样品遵照布达佩斯条约保藏在澳大利亚政府分析实验室(National Measurement Institute，1Suakin Street(PO Box 385)Pymble NSW 2073 Australia)。分离株CVA21#272101(保藏登记号NM05/43993)、CVA21#275238(保藏登记号NM05/43991)、和CVA21#272598(保藏登记号NM05/43992)，于2005年1月14日进行保藏。CVA21-DFv于2005年1月17日进行保藏，保藏登记号NM05/43996。
用于制备和选择能够溶解各种癌细胞的改良的微小核糖核酸病毒的方法在Newcombe，N.G.等人，Enterovirus Capsid Interactions withDecay-Accelerating Factor Mediate Lytic Cell Infection.J.Virol.，2004.78(3)1431-1439中有所描述。
因此，要理解的是在本发明的上下文中的微小核糖核酸病毒可以是改良的微小核糖核酸病毒，如在PCT/AU2005/000048和Newcombe等人(2004)所述。
在一个实施方式中，与野生型病毒相比，微小核糖核酸病毒是一种或多种外壳蛋白被改良的微小核糖核酸病毒，如包括一种或多种突变VP3 R96H、VP3 E101A、VP3 A239S、VP2 S164L和VP2 V209的柯萨奇病毒。
肿瘤可以是实体肿瘤，例如肉瘤或癌，或者是影响造血系统的癌性生长，例如淋巴癌、淋巴瘤或白血病。肿瘤是组织的异常生长，通常通过比普通组织生长更快的细胞增殖而形成明显的团块。肿瘤显示部分或完全缺乏正常组织的组织结构和功能。在本发明的上下文中，“肿瘤”也指包括造血系统肿瘤以及实体肿瘤的肿瘤。至少一些肿瘤细胞表达DAF和/或ICAM-1。如本文所证明的那样，一种特别适用于本发明的方法的肿瘤是黑色素瘤。可以用本发明的方法来治疗的其它肿瘤包括乳腺癌、脑癌例如恶性胶质瘤、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、肾癌、肾上腺癌、肝癌、白血病、卵巢癌、胃癌和小肠癌等。
该核酸一般以生理学可接受的载体或媒介物给予哺乳动物，例如生理学可接受的盐水。将核酸给予哺乳动物显示核酸是按照核酸与一个或多个肿瘤细胞相接触的方式给药。给药途径，以及剂型、载体或媒介物，取决于肿瘤的类型、位置和所给予的核酸的形式。可以采用多种给药途径。例如，对于易接近的实体肿瘤，给药途径可以是直接注射。对于造血系统肿瘤，核酸可以通过静脉内或血管内给药。对于在体内不容易接近的肿瘤，如转移灶和脑瘤，核酸可以经过要治疗的哺乳动物的身体给药，例如通过鞘内、静脉内或肌肉内给药，使得核酸通过身体经全身转运至肿瘤。可选择的是，核酸可以直接给予单个实体肿瘤。核酸还可以经皮下、腹膜内、局部(例如治疗黑色素瘤)、口腔(例如治疗口腔或食管肿瘤)、直肠(例如治疗结肠直肠肿瘤)、阴道(例如治疗子宫颈或阴道肿瘤)、鼻腔给药或通过雾化吸入(例如治疗肺部或咽喉肿瘤)给药。
通常，用于给药的合适组合物根据本领域的普通技术人员所公知的方法制备，因此可包括制药学可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。
包括核酸的组合物可通过标准途径给药。通常，该组合物可通过胃肠外(静脉内、脊柱内、皮下或肌肉内)、经口或局部途径给药。更优选通过胃肠外途径进行给药。
载体、稀释剂和佐剂必须是“可接受的”，能够与组合物的其它成分相容，不会对其接受者有害。
制药学可接受的载体或稀释剂的实例是去除矿物质水或蒸馏水；盐溶液；植物油，例如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷类，例如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲苯基聚硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油，如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、或羟丙甲基纤维素；低级烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳醇；低级聚烷撑二醇或低级烷撑二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯类，例如棕榈酸异丙酯、豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；角叉菜胶；黄蓍胶或阿拉伯树胶，以及凡士林。通常，一种载体或多种载体占组合物的10wt％至99.9wt％。
本发明的组合物可以是适合注射给药的形式，可以是适合口服摄取的剂型形式(如胶囊、片剂、小胶囊、酏剂)，可以是适合局部给药的软膏、霜剂或洗剂，可以是适合作为滴眼液给药的形式，可以是适合吸入给药的气溶胶形式，例如通过经鼻吸入或经口吸入，还可以是适合胃肠外给药的形式，即皮下、肌肉内或静脉内注射。
对于作为可射溶液或混悬液的给药，无毒的胃肠外可接受的稀释剂或载体包括，林格氏液、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1，2-丙二醇。
用于口服的合适的载体、稀释剂、赋形剂和佐剂的一些实例包括花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、海藻酸钠、阿拉伯树胶、黄蓍胶、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖醇、明胶和卵磷脂。另外，这些口服制剂可以含有合适的调味剂和着色剂。当以胶囊形式使用时，胶囊可涂布有延缓崩解的化合物，例如单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯。
佐剂一般包括润肤剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和缓冲剂。
要理解的是，根据本发明治疗哺乳动物可以作为单一疗法治疗哺乳动物的肿瘤，或与其它治疗肿瘤的方法联合使用。因此，例如，该方法与传统的治疗，例如化疗和放疗一起使用，在可以应用时，还可以与手术方法联合使用。该方法还可以与给予哺乳动物活病毒的病毒疗法(virotherapy)联合使用。在进行该联合治疗时，要理解治疗的不同方面可采取任何具体的顺序，由治疗医生决定。例如，在一个治疗方案中，在外科治疗之前给予核酸；之后进行或不进行化疗和放疗。因此，治疗方案的具体步骤可采用任意顺序，由医生来决定。
哺乳动物的治疗可包括核酸的单次给药或包括多次给药，如两次、三次、四次或更多次给药。当该方法包括核酸的多次给药时，可以一定的间隔来给药，由医生来决定。多次给药之间间隔的实例可以是大约一天、大约两天、大约五天、大约八天、大约一周、大约两周、大约三周、或大约一、二或三个月。优选给药可达到病毒血症的水平为大约106至大约107TCID50/ml。
本发明的方法可以与免疫抑制剂联合使用。因此，例如，根据本发明的核酸的给药可以在被治疗的哺乳动物建立了免疫抑制治疗(如使用已知的免疫抑制剂例如环孢菌素或其变体)之前或之后进行。这样，被治疗个体的免疫应答至少被调节至能增加转染的效率和随后的溶解作用。
在本说明书的上下文中，“细胞溶解”指细胞的细胞膜的破裂，随后释放细胞的所有或部分内容物或通过凋亡诱导细胞死亡。
哺乳动物可以是需要根据本发明治疗的哺乳动物，包括人类和具有社会、经济或研究价值的任何种属的个体，包括但不限于绵羊属、牛属、马属、猪属、猫属、犬属、灵长类和啮齿类的成员。
在本发明书的上下文中，“治疗有效量”在其含义内是指包括无毒但其量足够能提供所希望的治疗效果的本发明的化合物或组合物的用量。药物的准确的治疗有效量根据以下因素而改变，例如动物的疾病类型、年龄、性别、动物的体重、给药方式。可调整用药方案以提供最佳的治疗效果。例如，可以每天分成几次用药或根据治疗情况的紧急事件为指征按比例减少用药量。
在本发明书的上下文中，术语“治疗”指以任意方式来治疗疾病状态或症状、防止疾病产生、或防止、阻碍、延迟或逆转疾病或其它不希望的症状的进展的任意和所有方法。
实施例 现在参考具体实施例来进一步详细描述本发明，这些具体实施例不以任何方式限制本发明的范围。
材料和方法 细胞和病毒 人黑色素瘤细胞系、SK-Mel-28从S.J.Ralph(Department ofBiochemistry and Molecular Biology，Monash University，Victoria，Australia)获得。异倍体人胚胎横纹肌肉瘤(RD)细胞从MargeryKennett(Entero-Respiratory Laboratory，Fairfield Hospital，MelbourneVictoria，Australia)获得。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞从BruceLoveland(Austin Research Insitutue，Heidelberg，Victoria，Australia)获得。
柯萨奇病毒A21(CAV21)原型株，Kuykendall，从Dr MargeryKennett(Entero-Respiratory Laboratory)获得，并在SK-Mel-28细胞中扩增。
抗体 对ICAM-1的N-末端功能域特异的抗-ICAM-1单克隆抗体(Mab)WEHI(Body，A.W.等人，Intercellular adhesion molecule1(ICAM-1)has a central role in cell-cell contact-mediated immunemechanisms.Proc Natl Acad Sci USA，1988.85(9)3095-9)从AndrewBoyd(Queensland Institute for Medical Research，Queensland，Australia)获得。能够识别DAF的第三短同源重复序列(SCR 3)的抗-DAF MabIH4(Coyne，K.E.等人，Mapping of epitopes，glycosylation sites，andcomplement regulatory domains in human decay acceleration factor.JImmunol，1992.149(9)2906-13)从Bruce Loveland(Austin ResearchInsitutue，Heidelberg，Victoria，Australia)获得。
细胞培养 SK-Mel-28和RD细胞培养在Dulbecco′s modified Eagle′s培养基中(DMEM，GIBCO，Invitrogen Corporation，Auckland，NZ)，CHO细胞培养在RPMI1640(GIBCO)中，两者都添加有2％v/v胎牛血清(FCS，GIBCO)；100μg/ml青霉素/链霉素(Thermo Trace，Melbourne，Australia)以及2％v/v HEPES缓冲液(GIBCO)。细胞在37℃5％二氧化碳(CO2)环境下单层细胞培养生长。
为了进行细胞传代，汇合的单层细胞用10ml磷酸缓冲液(PBS，Thermo Trace)洗涤两次，然后用10ml胰蛋白酶EDTA溶液(GIBCO)孵育30秒。去除胰蛋白酶并将细胞在37℃下孵育1分钟，或者直到细胞从培养瓶表面升起。将细胞重新悬浮于约10ml的生长培养基中，将适当体积的细胞悬液转移到一个新的含有30-50ml的生长培养基的培养瓶中(或者75cm2，或者175cm2)。然后孵育培养瓶直到形成汇合的单层细胞。
为了在96孔组织培养板内制备单层细胞，在100μl2％生长培养基中接种1×104细胞/孔。用于转染的24孔板在500μl不含抗生素的2％生长培养基中每孔接种4×104细胞。所有板在37℃5％CO2环境下孵育过夜达90-95％汇合。
流式细胞计量术 通过流式细胞仪分析本研究使用的细胞系上DAF和ICAM-1的表面表达。通过用10ml依地酸溶液(GIBCO)在37℃孵育10分钟收集细胞单层，细胞悬液在4℃以2000rpm离心5分钟。散开的细胞(106细胞在PBS中)与合适的MAb(5μg/ml稀释于PBS中)在冰上孵育20分钟。用PBS洗涤细胞并以1000×g离心5分钟成为细胞团，再悬浮于100μl1∶100羊抗鼠免疫球蛋白(DAKO A/S，Copenhagen，Denmark)R-藻红蛋白-结合F(ab’)2片段的稀释液中，并在冰上孵育20分钟。洗涤细胞，离心成团并重新悬浮于PBS中，用FACStar Analyer(Becton Dickenson，Sydney，Australia)获得ICAM-1和DAF的表达水平。数据用Weasel2.1版软件进行分析(www.biotechcentre.net.au/cytometry)。
柯萨奇病毒A21病毒RNA的制备 病毒的生长和分离 CAV21病毒母株在培养在175mm2的组织培养瓶中的SK-Mel-28细胞的汇合单层中生长。感染的细胞在37℃下孵育24小时或者直到观察到100％病毒细胞病变效应(CPE)。培养瓶在-80℃下冷冻1小时，然后在37℃下复温。病毒悬浮液转移到50ml Falcon管，涡旋30秒，然后在4℃2000rpm下离心5分钟以去除细胞碎片。上清液转移到Beckman超速离心管中，在Beckman XL-90超速离心机(SW41TiRotor)上在4℃36000rpm下旋转2.5小时。病毒团再悬浮于200μl的上清液中并转移到1.5ml微量离心(microfuge)管用于RNA抽提。
病毒RNA的抽提 将TrizolLS试剂(GIBCO BRL，Life Technologies Grand Island，NY，USA)和氯仿加入到再悬浮的病毒中，并在室温下(RT)下孵育3分钟。将混合物在4℃不超过12000×g的速度下旋转15分钟，将RT异丙醇加入到上层水相，室温下孵育10分钟。将RNA在4℃不超过12000×g的速度下离心成丸10分钟，用75％的乙醇洗涤，在4℃下以2500rpm离心5分钟(Eppendorf Centrifuge 5417R，Hamburg，Germany)，空气干燥，再悬浮于不含RNase的蒸馏水(dH2O)中并在-80℃下储存。
病毒RNA浓度的估算 使用紫外(UV)分光光度法估计抽提标本中的病毒RNA(vRNA)的浓度。标本稀释于不含RNase的蒸馏水中，用Bio-Spec-mini(SHIMADZU Corporation，Japan)读取260nm吸光度(A260)。用下列公式计算RNA浓度 RNA浓度(μg/ml)＝A260×40×稀释系数(Ausubel等人，ibid) 变性琼脂糖凝胶电泳 用变性琼脂糖凝胶电泳可显现vRNA的存在。通过在15μl变性剂(22.5％v/v 12.3 M甲醛，0.1％v/v溴乙锭(EtBr，10mg/ml母液)，64.4％甲酰胺，13％10×MOPS缓冲液)中65℃下加热5分钟使RNA(5μl和10μl)和0.3-6.9kb的RNA标记物(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN USA)变性。将样品在含有10.4％v/v 10×MOPS缓冲液、18.8％v/v12.3 M甲醛的1％琼脂糖凝胶上，在1×MOPS缓冲液中100伏电压下离析1-1.5小时。凝胶在UV灯下成像，在不含RNase的蒸馏水中洗涤10分钟，然后进一步进行Northern印迹杂交分析(参见下述)。
Northern印迹杂交和CAV21 3’RNA探针杂交 通过Northern印迹杂交毛细管转移技术将琼脂糖凝胶上的RNA条带转移到尼龙膜上。洗涤凝胶3次(在不含RNase的蒸馏水中10分钟，在0.05M氢氧化钠(NaOH)中15分钟，在10×SSC缓冲液中10分钟)，然后转移到尼龙膜上(Zeta-ProbeBIORAD Laboratories，Hercules，CA，USA)在20×SSC缓冲液中过夜(大约16小时)。将膜浸泡在10×SSC缓冲液中10分钟，空气干燥并在80℃下烘干2小时以固定RNA。
固定的膜用DIG-11-dUTP(地高辛配基化-11-2’-脱氧-尿嘧啶-5’-三磷酸)标记的对CAV21的420核酸、3’区域特异的DNA探针探查CAV21RNA。该探针由Miss Erin Haley(Department of Immunology andMicrobiology，University of Newcastle，Australia)惠赠并结合使用DIG-dUTP PCR来进行制备。膜孵育在一个含有10到15ml的杂交缓冲液(0.25M Na2HPO4，pH7.2，1mM EDTA，20％SDS，0.5×Block(封闭试剂(Roche，Indianapolis，USA)稀释于马来酸缓冲液中；100mM马来酸，150mM NaCl pH7.5))的密闭塑料袋内，68℃水浴并同时搅动1小时。在将4ul的新鲜杂交缓冲液加入到袋内之前，探针在99℃下变性10分钟，放置在冰上2分钟，然后将袋子重新密封并在68℃下孵育过夜(大约16小时)。该膜用预热(65℃)的洗涤缓冲液(20mM Na2HPO4，1mMEDTA，1％SDS)洗涤2次，在65℃下20分钟，然后用缓冲液A(0.1mM马来酸，0.3％Tween 20，pH8.0，3M NaCl)在室温下漂洗5分钟。去除缓冲液A并将膜用1×封闭缓冲液(具有0.5×Block的缓冲液A)室温下封闭1小时，同时搅动。探针在15ml 1×封闭缓冲液中的抗-DIG-碱性磷酸酶1/5000稀释液中孵育30分钟而进行测定，未结合的抗体在室温下缓冲液A中洗涤4×10分钟而去除。膜用底物缓冲液(0.1M Tris，0.1MNaCl，50mM MgCl2，pH9.5)在室温下平衡5分钟，然后在15ml CSPD底物(CSPD(3-(4-甲氧基螺旋{1，2-二氧环丁烷-3，2’-(5-氯)三环[3.3.1.13，7]癸烷}-4-基)苯基磷酸二钠)在底物缓冲液中的1∶100稀释液，Roche)中室温下孵育5分钟，然后空气干燥。CSPD是碱性磷酸酶的化学发光底物，当它被脱磷酸化时，能发射出X光膜可以检测到的光。将膜暴露于HyperfilmTM(Amersham Pharmacia Biotech UK，Buckinghamshire，England)30分钟，用DuPont QC1-RT处理器(Sterling DiagnosticImaging，Hertfordshire England)显影。
体外脂质体介导的CAV21病毒RNA转染 转染优化 通过在含有Lipofectamine 2000(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad CA，USA)培养基中孵育这些细胞直到48小时，检测每孔0.5到10μl的不同浓度Lipofectamine 2000对SK-Mel-28、RD和CHO细胞的细胞毒性。然后将适合三种细胞系的Lipofectamine 2000的最佳浓度(2μl/孔)用于所有接下来的转染。
SK-Mel-28、RD和CHO细胞转染 SK-Mel-28、RD和CHO细胞的转染是在如此处所述接种在24孔组织培养板上进行的。
病毒RNALipofectamine 2000复合体的制备 对于每个转染标本，根据生产厂商的说明书制备vRNA:Lipofectamine 2000复合体(vRNA:lipid)。简言之，不同量的vRNA和2μlLipofectamine 2000被分别稀释于50μl无血清和无抗生素的培养基中并轻轻混合。Lipofectamine 2000稀释后5分钟，将相应的vRNA和脂质溶液合并并轻轻混合。为了形成vRNA:脂质复合体，将该混合物室温下孵育45分钟。
向准备的含有细胞和培养基的24孔板的每个孔内加入100微升的转染复合体并通过轻摇混合。对照孔仅含有vRNA、仅含有脂质和CAV21活病毒，同样也在无血清和无抗生素的培养基中稀释到100μl。所有板在37℃5％CO2环境下孵育。6小时后，向每孔加入600μl的不含抗生素的2％FCS DMEM，孵育48小时。
细胞病变效应的评价 通过在不同时间点显微镜下评价病毒细胞病变效应进行病毒产量的定性检测。检查每孔的特征性的细胞变圆、核凝聚以及细胞从培养板表面脱离。记录CPE的百分率，其水平从0、25、50、75到100％。
转染上清液的收集和储存 在转染后0、12、24和48小时收集每个孔的上清液和细胞进行病毒滴度分析。用向上翻转的移液管尖从每个培养板的表面刮下所有附着的细胞，孔的全部内容物转移到1.5ml的微量离心管中。细胞和上清液涡旋30秒，-80℃下冷冻，复温释放所有细胞内的病毒粒子。细胞碎片在4℃2000rpm下离心5分钟成丸(Eppendorf Centrifuge 5417R)，上清液在-80℃下储存。
CHO和RD细胞上清液的传代 来自CHO和RD细胞转染的每个上清液标本传代到新的分别有CHO或者RD细胞的培养板上。培养板如前所述制备，200μl每种转染上清液加入到适当的孔内。检测孔的CPE48小时。
病毒感染性检测 用100μl的10倍连续稀释的转染上清液一式三份感染96孔组织培养板内的SK-Mel-28汇合单层细胞，并在37℃5％CO2环境中孵育72小时。如在此所述在显微镜下评价每孔的CPE，然后固定并用结晶紫溶液(0.1％的结晶紫，20％的甲醇、20％的福尔马林、60％PBS)染色。只要出现CPE，该孔即记为阳性(+)，而不管其观察到的百分比是多少。用下列公式计算表示为50％组织培养感染剂量(TCID50/ml)的病毒滴度 Log TCID50＝101+d(S-0.5)[22] 其中；d＝稀释度的对数(＝1到10倍稀释液) S＝每三排的CPE阳性孔∶CPE阴性孔的比例的总和 (Dougherty，R.M.，Animal virus titration techniques，in Techniques inexperimental Virologe.，R.J.C.Harris，Editor.1964，Academic Press，NewYork.Pp.169-223) 体内形成皮下人黑色素瘤异种移植物的模型 实验动物 4到6周龄的雌性NOD-SCID小鼠，从University of NewcastleAnimal Facility获得并在无病原体条件下圈养在大学的动物处理设施内。每笼4-5只小鼠，在室内控制明暗各12小时的周期，随意地进食食物和饮水。所有的动物处理均在University of Newcastle AnimalFacility动物关怀和伦理委员会制定的指导原则下进行。
细胞制备和注射方案 SK-Mel-28细胞生长在10％FCS DMEM中，用胰蛋白酶消化收集并在2％FCS DMEM中洗涤1次和在无菌的PBS中洗涤2次。用台盼蓝染色评价细胞的活力，只有含有＞95％活细胞的细胞部分才用于注射。最后，细胞再悬浮于无菌的PBS中至浓度为3×107/ml。
在注射前，动物用100-150μl甲苯噻嗪(Bayer，NSW，Austrialia)和氯胺酮(Parnell Laboratory，NSW，Austrialia)的1/10PBS稀释液腹腔注射(i.p.)麻醉。在每只小鼠的肩胛骨之间，皮下注射SK-Mel-28细胞(100μl PBS中3×106)。选择这个区域的既是为了使小鼠所受到的不适减到最小，又可防止小鼠干扰肿瘤。
肿瘤体积的评价 每天监测肿瘤的体积并用电子数字卡尺(Dick Smith Electronics，Australia)以毫米增加值达到一个小数位做周期性测量。在测量之前，肿瘤区域用75％乙醇浸透以消除与皮毛厚度相关的误差。每个肿瘤做两个交点测量(长和宽)，并通过下面的球形体积公式计算其体积(V) V(mm3)＝π/6a.b2 其中，a＝长度(mm)，b＝宽度(mm)，a＞b。
每组肿瘤体积的标准差(SE)用下面的公式计算 SE＝SD/√n 体内瘤内给予CAV21病毒RNA 在注射治疗前一天，测量所有肿瘤的体积，根据肿瘤大小将小鼠随机分为4组。每组小鼠接受四种治疗中的一种vRNA:脂质复合体(n＝5)、仅vRNA(n＝4)、仅脂质(n＝4)或者CVA21活病毒(n＝4)。
治疗制剂和注射方案 病毒RNALipofectamine 2000复合体如在此所述进行制备，维持已确定的最佳vRNA:脂质复合体(μg∶μl)比率。随同50μl稀释的仅2μgvRNA和4μl Lipofectamine 2000对照治疗制剂一起，制备50μl含有2μgvRNA和4μl Lipofectamine 2000的转染复合体，它们都在无血清和无抗生素的DMEM中。注射前三种治疗制剂在室温下孵育45分钟。另外，在注射前将50μl剂量的CVA21活病毒(109TCID50)母液保持在冰上备用。
为了进行注射治疗动物用4％异氟醚(isofluorane)(ISOFLOTM，Abbott Australasia，NSW，Australia)吸入麻醉。每种治疗均是通过用30.5号规格的胰岛素注射器向瘤内单次注射(i.p.)50μl注射液。
所有四种治疗都在第0天给药，第8天时vRNA:脂质复合体、仅vRNA和仅脂质的治疗组再注射一次。
经大隐静脉取血收集血清 在不同的时间点经大隐静脉收集血标本(约75μl)。血液用未肝素化的毛细管(Hirschmann Laborgerate，Germany)收集并转移到0.5ml的微量离心管中。标本在4℃下凝结10-20分钟，4℃12000rpm下离心5分钟分离血清(Eppendorf Centrifuge 5417R)。收集10-40μl之间的血清标本并在-80℃下储存。
过量异氟醚处死小鼠 所有小鼠吸入过量的4％异氟醚(Abbott Australasia)而被处死。通过心脏穿刺收集最终的血标本，分离血清并在-80℃下储存。
从血清中抽提病毒RNA 用QLAamp病毒RNA Mini Kit Mini-spin Protocol(QIAGEN PtyLtd，Victoria，Australia)抽提小鼠血清标本中感染性病毒粒子的病毒RNA。简言之，10μl血清加入到60μl不含RNase的dH2O和280μl含有“载体RNA”(试剂盒提供的)的AVL缓冲液中，将混合物涡旋并在室温下孵育10分钟以溶解完整的病毒和灭活RNase。加入280μl的乙醇(98-100％)，涡旋混合并将整个体积加到QLAampMini Spin柱硅胶膜上，然后在22℃8000rpm下离心1分钟(Eppendorf Centrifuge 5417R)。该膜用500μl试剂盒提供的的洗涤缓冲液(AW1和AW2)洗涤2次，8000rpm离心1分钟，在两次洗涤之间去除任何污染物。纯RNA在40μlAVE洗脱缓冲液中通过8000rpm旋转1分钟洗脱，收集并在-80℃下储存。
为了为定量实时RT-PCR生成一套标准品，一系列标准vRNA标本以与上述同样的方式从已知浓度的CAV21中抽提出来。在不含RNase的dH2O中制备已知滴度的CAV21母液的10倍连续稀释液，从此系列(101-107TCID50/ml)内的标本中抽提病毒RNA并以等分试样储存在-80℃下。对于每次vRNA抽提，也同时抽提阴性对照dH2O。
通过实时RT-PCR进行血清病毒载量的定量测定 用实时逆转录酶聚合酶链式反应(qRT-PCR)进行血清标本内病毒载量(TCID50/ml)的定量。对含有5’-报告染料(reporter dye)6-羧基荧光素(carboxyfluorcein)(FAM)和3’-遮蔽染料(quencher dye)6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)的CAV21 Kuykendall株(KKVP3，Applied Biosystems，CA，USA)在VP3区域内的序列特异的双标记荧光探针用于定量标本内vRNA的量。使用PlatinumQuantitative RT-OCR ThermoScriptTMOne-Step System(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad CA，USA)分析血清和标准RNA标本。KKVP3探针、正向引物和反向引物(两者都来自GeneWorks Pty Ltd，Hindmarsh，SA，Australia)的序列列于表2。
表2 用于CAV21Kuykendall株VP3区域实时RT-PCR的引物和探针序列 每25μl的反应物含有5μl洗脱的vRNA、2μl不含RNase的dH2O、12.5μl2×ThermoScriptTM Reaction Mix(含0.4mM每种dNTP，6mMMgSO4)、0.5μl ROX参考染料(Reference Dye)、0.5μl ThermoScriptTMPlus/PlatinumTaq Mix(含逆转录酶和耐热性DNA聚合酶的混合物)、每种10μM引物(正向和方向引物)1μl以及2.5μl KKVP3探针(2.5μM)。每个循环中连同不含RNase的dH2O、无模板对照一起也同时分析阴性对照水抽提液。PCR标本在60℃下孵育30分钟用于cDNA合成并在95℃下5分钟灭活逆转录酶、使RNA/cDNA杂交物变性以及活化PlatinumTaq DNA聚合酶。然后标本使用ABI PRISM 7000SequenceDetection System(Applied Biosystems，Victoria，Australia)在95℃下(变性)15秒和60℃下1分钟(退火和延伸)共循环40次。在退火-延伸步骤中收集荧光数据，并用1.1版ABI Prism SDS软件(Applied Biosystems)进行分析。相对于参考染料(ROX)测定报告染料(FAM)信号来标准化孔-孔之间非PCR相关的波动。计算6次和15次循环之间的平均基线发射水平，阈值水平设定在指数扩增的线性区域内。
血清的病毒感染性检测 如上所述，用血清的10倍系列稀释液滴定96孔板的SK-Mel-28细胞评价在小鼠血清内出现的病毒感染作为“病毒感染性检测”。但在此例中，用4.5μl血清以10-2开始每个稀释系列。如前所述，计算50％组织培养感染剂量(参见上面的“病毒感染性检测”)。
肿瘤分析 处死每只动物后肉眼评价肿瘤的特征。去除每只小鼠背部的毛和皮，对下面的肿瘤块进行照相。分离出肿瘤块用于进一步分析并在PBS中洗涤3次。将肿瘤块称重并放置在含有陶瓷匀浆珠的Lysing matrix D管(BIO 101 Systems，Qbiogene，CA，USA)中，向每个标本加入600μlPBS并放置在冰上。将标本匀浆45秒(FastPrepTM FP 120 BIO 101ThermoSavant，Integrated Sciences，Willoughby，NSW，Australia)并返回到冰上5分钟。细胞碎片在4℃8000rpm下10分钟(Eppendorf Centrifuge5417R)成丸，收集上清液并在-80℃下储存。如上所述的“病毒感染性检测”将肿瘤溶解产物上清液进行病毒感染性检测。
统计分析 先用单因素方差分析(ANOVA)，随后进行Newman-Keul′s后续检验来检验每个不同治疗组的肿瘤体积之间的差异。所有检验的显著性水平均设定在P＜0.05。所有统计检验用GraphPad Prism version 4的Macintosh版统计学软件进行分析。
实施例1 SK-Mel-28、RD和CHO细胞上的ICAM-1和DAF的细胞表面表达 通过流式细胞仪分析在本研究使用的细胞的表面上柯萨奇病毒A21细胞受体、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和衰变加速因子(DAF)的表达。在用荧光结合物孵育和随后的激光扫描之前，每个细胞系用抗-ICAM-1单克隆抗体(WEHI)后者抗-DAF单克隆抗体(IH4)孵育。在人黑色素瘤细胞系SK-Mel-28上检测到高水平的ICAM-1表达，但在人胚胎横纹肌肉瘤(RD)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞上不表达ICAM-1。高水平的表面DAF表达仅限于SK-Mel-28和RD细胞(图1)。
实施例2 从CVA21病毒粒抽提的病毒RNA的特性 使用变性琼脂糖凝胶电泳确定Trizol抽提的完整的全长CVA21vRNA的存在。在紫外光检测下，在凝胶上可见三条明显的RNA条带，两条核糖体RNA(rRNA)条带(在～4.2kb处的28S rRNA，在～2.2kb处的18S rRNA)和一条在～7kb处的病毒RNA条带(图2B)。通过Northern印迹杂交毛细管转移技术将RNA条带转移到尼龙上，并与对CVA21 RNA的420核酸3’区特异的DIG-11-UTP标记的DNA探针进行杂交(图2A)。杂交和化学发光检测后，可见一条致密的CVA21 RNA条带(图2C)。见到的条带与琼脂糖凝胶上观察到的vRNA条带相一致，证实存在全长的CVA21 vRNA。
实施例3 体外CVA21病毒RNA转染 3.1.转染优化 测试用于细胞转染的不同浓度的Lipofectamine 2000TM、阳离子脂质对SK-Mel-28、RD和CHO细胞的细胞毒性。体积从0.5到10μl的脂质稀释在100μl的生长培养基中，加入到24孔板中单层培养细胞中(4×104个细胞/孔)。在37℃5％CO2环境下孵育24小时后，显微镜下检测单层细胞的细胞毒性征象。尽管生产商推荐使用，但高浓度的脂质(5-10μl/孔)具有细胞毒性并在24小时内在SK-Mel-28(图3A和B)、RD和CHO细胞(数据未显示)上几乎诱导全部细胞死亡，而较低浓度的脂质(0.5-3μl/孔)对SK-Mel-28没有细胞毒性。发现每孔2微升时所有三个细胞系(SK-Mel-28(图3C)、RD(图3D)、CHO细胞(图3E))都能耐受Lipofectamine 2000TM的最高浓度(图3C)，并被用于所有接下来的转染以最大化地递送RNA。
3.2.用CVA21病毒RNA转染SK-Mel-28细胞 3.2.1检测SK-Mel-28的单层培养细胞中发生的细胞病变效应 在用1μg CAV21 RNA(vRNA)和2μl Lipofectamine 2000TM复合体(vRNA:脂质)转染SK-Mel-28细胞后，显微镜下监测CAV21诱发CPE进展的情况。感染后12小时(PI)，同时观察CAV21活病毒对照孔和vRNA:脂质复合体处理孔的细胞变圆、核凝聚以及肠道病毒溶解感染[23]的细胞溶解特征。在仅vRNA处理和仅脂质处理对照孔内没有观察到病毒感染的征象。用完整的活CAV21病毒粒(1.6×104TCID50/孔)处理的单层细胞在感染(PI)后24小时显示出完全的CPE，而vRNA:脂质复合体处理的单层细胞在观察到全部细胞溶解之前需要24到48小时孵育(图4)。尽管达到完全CPE需要更长的时间，vRNA:脂质处理的细胞显示出病毒感染细胞与死亡细胞具有相同的形态。
3.2.2.用CVA21 vRNA转染SK-Mel-28单层培养细胞后CVA21子代病毒的产生水平 通过溶解细胞感染性检测测定在用CVA21 vRNA转染后SK-Mel-28单层培养细胞上感染性CVA21的产生水平。用转染后12、24和48小时收集的细胞上清液的10倍连续稀释液的感染在96孔板内的SK-Mel-28单层细胞。单层细胞被固定并用结晶紫溶液染色，孵育72小时后在显微镜下评价CPE(图5)。如2.6.3章节所述使用Reed和Muench61的方法计算每种上清液标本的50％组织培养感染滴度(TCID50/ml)。在仅脂质、没有脂质的vRNA或者细胞对照制剂的初始接种物中没有检测到感染病毒。相反，感染后12小时，在vRNA:脂质复合体(3.2×102TCID50/ml)和CAV21活病毒(从初始接种物的1.6×104到3.2×107TCID50/ml)处理的细胞上清液中都观察到感染病毒。在感染后24小时，vRNA:脂质复合体处理的上清液的滴度增加到3.2×104TCID50/ml，48小时后增加到3.1×105TCID50/ml。在CAV21活病毒处理的上清液中，感染后12和24小时之间没有检测到病毒水平的增加，因为在这些时间点之间发生了完全CPE。由于缺少活细胞基质，在感染后48小时，活病毒处理的上清液滴度已降至6.8×106TCID50/ml(图4)。在整个检测间期(0-48小时)的任何时刻，细胞对照组或者vRNA处理的细胞的上清液中都没有检测到感染病毒。
3.3.用CVA21病毒RNA转染RD和CHO细胞 用CVA21病毒RNA转染RD和CHO细胞并监测CPE和感染性CVA21子代病毒的产生情况，从而评价CVA21 vRNA在缺乏CVA21细胞受体ICAM-1和DAF的细胞中的复制能力。另外，在这些正常的抗性细胞之内的溶解感染的发生将证实vRNA:脂质制剂不含完整的感染性CVA21病毒粒，而实际上感染性vRNA的复制是在SK-Mel-28细胞转染中所观察到的子代病毒的来源。
3.3.1.检测RD和CHO单层培养细胞中细胞病变效应的发生情况 用CVA21 vRNA脂质介导转染后在24孔板中的RD和CHO细胞(4×104/孔)单层培养细胞中，用显微镜监测CAV21诱导的CPE的进展情况。转染后12小时，RD细胞显示出肠道病毒溶解感染的细胞溶解特征，包括细胞变圆和细胞溶解，在孵育48小时后，观察到完全的溶解(图6A)。在CHO细胞上直到转染后24小时才观察到的CPE的发生，在孵育48小时后，显示CPE的细胞增加到75％(图3.6B)。用初始剂量为3×104TCID50/孔的完整CAV21病毒粒处理的RD和CHO单层细胞在48小时后没有显示出任何明显的CPE。这些结果与这些细胞系都不表达ICAM-1或者DAF(这些细胞表面受体是天然的溶解性CAV21感染所必需的(见上述))的发现是一致的。
3.2.2.用CVA21 vRNA转染后RD和CHO单层培养细胞中CVA21子代病毒的产生水平 在96孔板内的SK-Mel-28单层细胞上(见上述)，通过转染上清液的溶解细胞感染性检测来测定CVA21 vRNA转染后的RD和CHO单层培养细胞中感染性CVA21的产生水平。用CVA21 vRNA:脂质复合体转染的RD和CHO单层培养细胞中子代病毒的50％组织培养感染滴度(TCID50/ml)都增加(图6)。用完整CVA21病毒粒感染的RD或者CHO细胞中均没有观察到病毒滴度的增加，在上清液中仅检测到残留的接种病毒。
3.3.3.检测在含有感染性CVA21的转染上清液传代后RD和CHO单层培养细胞中细胞病变效应的发生情况 从用CVA21vRNA转染的RD和CHO细胞中产生的含有CVA21的细胞上清液传代到新的RD和CHO单层培养细胞上，来评价该子代CVA21的选择性感染性。由于缺乏表面ICAM-1的表达(见图1)RD和CHO细胞正常情况下不易于受CVA21的溶解性感染。用细胞上清液感染后48小时，在显微镜下RD和CHO细胞中都没有观察到CPE。
实施例4 通过CAV21 vRNA:脂质复合体瘤内给药体内产生感染性CVA21 四组已形成皮下SK-Mel-28人黑色素瘤异种移植物的NOD-SCID小鼠瘤内注射四种治疗中的一种(i)CVA2 1 vRNA:脂质复合体(2μgRNA；4μl脂质)，(ii)仅2μg vRNA，(iii)仅4μl脂质，(iv)CVA21活病毒(每个部位5×106 TCID50)，都在无菌DMEM中稀释至50μl。初始治疗是在第0天给药，随后在第8天给予vRNA:脂质复合体、仅vRNA和仅脂质。
4.1.通过RT-PCR进行CVA21病毒载量的定量 在不同的时间点收集血液标本。从血清中抽提病毒RNA并通过实时RT-PCR筛选CVA21 vRNA。为了绘制标准曲线，从CVA21母液制剂抽提的vRNA的连续稀释液被平行扩增。阈值水平设定在指数扩增的线性区域之内，只有达到这个阈值的标本被视为是CVA21 vRNA阳性的(图8)。通过将达到阈值(阈值周期或CT值)的样品的周期与已知滴度(STD 103-107TCID50/ml)的CVA21母液制剂中抽提的标准样品的CT值相比较而计算未知样品的病毒滴度。
仅在用活CVA21注射小鼠的2小时(第0天)、注射后2天和5天收集的血液标本中检测到CVA21 vRNA。在第8天给予合适的小鼠以vRNA:脂质、仅vRNA和仅脂质进行第二次治疗。注射后第16天，在vRNA:脂质复合体组中，4/5小鼠的血清标本中检测到CVA21 vRNA(平均2.6×105TCID50/ml)，在CVA21活病毒组中，2/2小鼠检测到CVA21vRNA(平均3.5×106TCID50/ml)，在仅vRNA组中，2/2小鼠检测到CVA21 vRNA(平均2.6×105TCID50/ml)。在随后筛选的日子(第23、30、37和44天)里，在vRNA:脂质复合体组中同样有4只小鼠被检测到CVA21 vRNA阳性，组增加的平均水平从第23天的5.6×105TCID50/ml到第44天的1.6×106TCID50/ml。vRNA:脂质复合体组的一只小鼠在整个检测期间均无未检测到CVA21 vRNA阳性。在仅用CVA21 vRNA治疗的小鼠的血清中检测到的CVA21 vRNA水平也仅从第23天的4.1×105TCID50/ml增加到第44天的1.3×106TCID50/ml。CVA21活病毒治疗组的所有小鼠在检测的每一天都显示CVA21 vRNA阳性，第37天的平均水平为2.0×107TCID50/ml。仅脂质治疗组的所有小鼠在实验期间CVA21 vRNA检测都是阴性的(表3)。

表3.用CVA21 vRNA:脂质复合体、仅vRNA、仅脂质或者CVA21活病毒注射已形成皮下人黑色素瘤异种移植物的NOD-SCID小鼠中的血清病毒载量表。从小鼠血清中抽提的RNA用实时RT-PCE筛选CVA21 vRNA的存在，以血清的TCID50/ml表示。用CVA21 vRNA:脂质复合体(vRNA:脂质复合体)、仅vRNA、仅脂质或者完整的CVA21活病毒(CVA21活病毒)注射四组小鼠。在几个时间点(注射后的某天)取血液标本，浅灰色的阴影区表示在那天没有从那只小鼠采集标本。黑色阴影区表示由于伦理原因小鼠从本研究中被剔除。通过耳朵标签鉴别小鼠NH＝没有孔，1L＝左耳有1孔，1R＝右耳有1孔，LR＝左右耳各有1孔，2R＝右耳有2孔。显示了每天每组的平均值(AVG)。*在第42天获得的值；◇在第22天获得的值；在第33天获得的值。通过将这些未知血清标本的CT(阈值周期值)与来自已知滴度的母液的标准CVA21标本的CT值相比较而计算病毒滴度。
4.2通过溶解细胞感染性检测进行CVA21病毒负荷的定量 为了评价实时RT-PCR阳性结果是否与血清中存在感染性CVA21相关，对死后的血液标本进行溶解细胞感染性检测。用10倍稀释的血清接种在96孔板内的SK-Mel-28单层细胞中。在37℃5％CO2环境中孵育72小时后，在显微镜下检查各孔的CPE，固定并用结晶紫溶液染色(见上述)。所有通过实时RT-PCR检测CVA21vRNA阳性的血清标本，包括仅用vRNA治疗的小鼠，被发现都含有感染性CVA21。标本的感染滴度与那些通过实时RT-PCR测定的相似(表4)。
表4.通过对SK-Mel-28细胞的溶解细胞感染性检测测定用CVA21vRNA:脂质复合体瘤内注射治疗荷皮下黑色素瘤异种移植物的小鼠的感染性CVA21的血清病毒载量。通过溶解细胞检测，检测用CVA21vRNA:脂质复合体、仅vRNA、仅脂质或者CVA21活病毒治疗44天后的4组小鼠死后血清标本中感染性CVA21的存在情况。用10倍稀释的血清接种在单层细胞中并在37℃下孵育72小时，然后在显微镜下检查CPE，并用结晶紫溶液染色。使用Reed和Muench ibid的方法计算终点感染滴度(TCID50/ml)。
实施例5 CVA21在人黑色素瘤异种移植物中的溶瘤作用 5.1.在NOD-SCID小鼠中通过CVA21介导的溶瘤作用黑色素瘤异种移植物的肿瘤体积减小 在整个观察期间，NOD-SCID小鼠的皮下人黑色素瘤的两个交点测量用数字卡尺进行从外部进行估计，并通过球形体积公式计算其体积。仅用脂质治疗的小鼠发生了很大的结节状肿瘤。与之相反，在试验期间，血清中感染性CVA21为阳性(病毒血症)的所有用CVA21 vRNA:脂质复合体治疗的小鼠显示出肿瘤体积急剧减小。同样，所有用CVA21活病毒治疗的小鼠的肿瘤体积也明显减小(图9)。仅用vRNA治疗的小鼠的平均肿瘤体积没有下降，但是，个别CVA21病毒血症小鼠的肿瘤体积则减小了(见上述)。
通过死后解剖每个小鼠背部的皮毛肉眼检查肿瘤的特征。仅脂质治疗组的小鼠显示出膨胀的、结节状和高度血管化的肿瘤(图10A)。在仅vRNA治疗的小鼠中，那些有病毒血症的小鼠与无病毒血症的小鼠相比显示肿瘤相当小且血管更少(图10B)。同样，CVA21 vRNA:脂质复合体治疗的有病毒血症的小鼠的肿瘤负荷与该组中无病毒血症的小鼠和仅有脂质的对照小鼠相比急剧减小(图10C)。在所有用CVA21活病毒治疗的小鼠的肿瘤也显著减小，一些肿瘤在解剖时没有检测到(图10D)。
5.2.在黑色素瘤异种移植物的溶解产物中感染性CVA21的水平 通过对SK-Mel-28细胞进行溶解细胞感染性检测，将从每个治疗组选择的小鼠死后分离的肿瘤块匀浆检测感染性CVA21的水平。用10倍稀释的匀浆上清液接种在96孔板内的单层细胞，并在37℃5％CO2环境中孵育72小时后，在显微镜下检查CPE。使用Reed和Muench(ibid)的方法计算肿瘤病毒载量(TCID50/μg)。所有有病毒血症的小鼠的肿瘤匀浆在肿瘤组织内(直至8×103TCID50/μg肿瘤)显示出很高水平的感染性病毒。被检测的无病毒血症的小鼠的所有肿瘤块均不含有感染性CVA21(图10)。
讨论 综述 通过提供诸如与感染性病毒的大规模生产、储存、分布以及给药等相关的生物安全性和成本等问题的解决方法，有可能改善病毒溶瘤治疗的临床应用。如此处所证实的那样，给予病毒RNA代替活病毒提供了一种活病毒给药的替代方法。病毒RNA转录产物的体外大规模生产和/或溶瘤病毒的感染性cDNA克隆的潜在使用代表了病毒溶瘤治疗商品化的一个重要的新方向。就储存、分布和给药而言，使用溶瘤病毒的病毒RNA或者cDNA克隆能够明显提高病毒溶瘤治疗的安全性，因为这个底物只有在它从细胞表面进入到胞质中时才有感染性。
如果没有早期诊断，目前对于恶性黑色素瘤的治疗是有限的，由于大多数传统的放疗和化疗很难控制转移性扩散，所以需要更有效的、选择性的疗法。已经证实CAV21是一个对体外人黑色素瘤细胞和在免疫缺失小鼠体内形成的黑色素瘤异种移植物的有效溶瘤制剂(Shafren等人(2004；ibid)。
在此呈现的结果综合起来支持和证明向细胞胞质内导入脂质CAV21病毒RNA复合体能产生感染性子代病毒。另外，在此证实这种子代病毒可引起体内人黑色素瘤肿瘤体积的减小。
体外感染性子代CAV21的产生 用阳离子脂质体(CVA21 vRNA:脂质复合体)递送CAV21病毒RNA能在体外产生感染性子代病毒和黑色素瘤细胞的溶解感染。由于缺少CAV21细胞表面受体的表达，子代病毒也可以在正常情况下不易受到自然CAV21感染的细胞内产生。但是，这种感染限于一轮复制，因为子代病毒在传代时不能感染同一类型的细胞。这一结果表明通过递送CVA21 vRNA:脂质复合体产生的子代病毒CAV21保留了其对表达高水平的ICAM-1和DAF细胞的特异性。与之相反，仅递送没有脂质载体的裸CVA21 vRNA无法介导体外子代病毒的生产，但其在某些动物中与肿瘤体积的减少有关，从而证明了裸病毒RNA具有潜在的应用价值。
与CVA21活病毒的感染相比，vRNA:脂质复合体转染需要更长的时间来诱导相似水平的镜下CPE(完全CPE需要较长时间，大约12小时)。但细胞死亡的形态学与活CVA21的感染是相同的。在CPE进展方面的延迟最大可能是由于脂质复合体随机与细胞发生联系所需的时间引起的，在这种情况下是基于电荷而不是特异性受体的相互作用。理论上，一旦vRNA转位到细胞胞质中，病毒复制就会以与在用活CVA21病毒粒自然感染中相同的速率发生。
体内感染性CAV21的产生 将CVA21 vRNA:脂质复合体瘤内递送到NOD-SCID小鼠中的人黑色素瘤异种移植物会使感染性CVA21子代在血清和肿瘤组织中(4/5治疗小鼠)都产生。vRNA:脂质复合体、仅vRNA和仅脂质在第0天和第8天时给予两次独立的注射，但是，在初始治疗的第0、2、5或9天没有检测到病毒血症，在第16天第一次检测到CVA21 vRNA。病毒血症的这种延迟可能是由于脂质体转染效率的不足，因为已经报道血清蛋白和其他因子的相互作用可以干扰体内脂质体的功能(Tandia，B.M.等人，Identification of human plasma proteins that bind to cationic lipid/DNAcomplex and analysis of their effects on transfection efficiencyimplications for intravenous gene transfer.Molecular Therapy，2003.8(202640-273)。坏死的肿瘤环境，通常含有大量的血清蛋白，所以脂质体复合物的形成受到严重的破坏。其他可能延迟病毒血症的因子包括不利的核酸:脂质体电荷比率、注射体积和注射准确性。在初始注射当天(第0天)，肿瘤相对较小，直接瘤内注射的功效会受到影响。但是在第8天，肿瘤体积已经增大，更易于直接注射。在9-16天的时间点上额外检测的数据显示反应更快，但额外的血清标本尚未得到伦理上的批准。与之相反，注射CVA21活病毒的小鼠早在注射后2小时在血清中的vRNA水平就可检测到，表明从肿瘤向全身扩散。
与体外的结果相反，在体内裸vRNA的瘤内递送使3/4治疗小鼠中产生了感染性子代CVA21。这种子代病毒的产生直到第16天才在血清中检测到，其发生水平与通过注射vRNA:脂质复合体(4/5小鼠)的小鼠产生的病毒相同。仅注射vRNA的小鼠也同样在死后的肿瘤组织中可以检测到子代病毒，这一结果是有点令人意外，因为当与同样的vRNA接种时，在体外没有检测到病毒复制。这一发现可能是由于肿瘤内环境和自由流动的细胞培养基之间的差异所造成的。可以合理的认为在体外环境下，培养基内的核糖核酸酶和其他细胞因子可以使裸vRNA降解，而且，没有任何机制来克服在vRNA和膜之间的静电力以进入细胞。体内环境可能更有主动一些，少量(50μl)快速推注到肿瘤组织内使肿瘤细胞和vRNA之间具有更大的相互作用，可能加速了肿瘤细胞对vRNA的摄取。
体内感染性子代CVA21的溶瘤作用 在递送CVA21 vRNA:脂质复合体之后，子代CVA21的溶瘤作用使荷皮下人黑色素瘤异种移植物的免疫缺失小鼠中的肿瘤负荷减少。在第28和35天，与仅脂质的治疗组相比，vRNA:脂质复合体治疗小鼠的组平均肿瘤体积明显减小(p＜0.05)。同样，与仅脂质的治疗组相比，用活CVA21病毒治疗的小鼠在第28和35天也显示肿瘤体积明显减小(p＜0.05)。尽管仅vRNA的治疗小鼠3/4有病毒血症，但是与仅脂质的治疗组相比，在这组中平均肿瘤体积没有统计学意义上的明显减小。
死后检测肿瘤证实了感染性血清CVA21引起人黑色素瘤异种移植物的肿瘤负荷的减少的假设。所有有病毒血症的小鼠，不管它们接受何种治疗，都显示了肿瘤体积的实质性的减小。相反，那些依然无病毒血症的小鼠，不管何种治疗，都能支持大的结节状的肿瘤的生长。这些数据综合起来支持了下面的发现，即在NOD-SCID小鼠中存在CAV21病毒血症使已形成的皮下人黑色素瘤异种移植物的肿瘤负荷急剧减少。
结论 恶性黑色素瘤是澳大利亚最常发生的癌症之一，如果没有早期诊断和早期手术切除，就很少有或者没有有效的治疗手段可用。使用CVA21的病毒溶瘤治疗对全身治疗和控制恶性黑色素瘤的进展提供了一种新的治疗途径。如果生物安全性和成本问题限制CVA21病毒溶瘤治疗的广泛使用，那么相对于使用完整活病毒，感染性病毒RNA的给药证明是有优势的。
本研究研究了脂质体介导的递送CVA21病毒RNA以在体外产生感染性子代CVA21的效率以及子代病毒溶解人黑色素瘤细胞和在体内减少已形成的黑色素瘤异种移植物肿瘤负荷的能力。脂质体结合的CVA21病毒RNA的递送在体外和体内都能引起感染性子代病毒的产生。另外，体内仅给予病毒RNA也引起感染性病毒的产生。不管给予何种治疗方法，感染性子代病毒都能感染和减少免疫缺失小鼠的人黑色素瘤异种移植物的肿瘤负荷。
权利要求
1.一种治疗需要所述治疗的哺乳动物的肿瘤的方法，其中所述方法包括在能引起病毒介导的一种或者多种肿瘤的瘤细胞溶解的条件下给予哺乳动物有效量的核酸分子，所述核酸分子包括来源于微小核糖核酸病毒的分离的病毒多核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤选自前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、淋巴癌、白血病、脑癌、肺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、肾癌、肾上腺癌、肝癌、胃癌、小肠癌和黑色素瘤。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子选自包括来源于微小核糖核酸病毒的序列的单链RNA或者互补DNA(cDNA)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子包括当给予细胞时能够诱发溶解感染的病毒基因组或者其一部分。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子是合成的病毒RNA。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子来源于微小核糖核酸病毒，所述微小核糖核酸病毒能识别免疫球蛋白超家族的细胞粘附分子和用于感染细胞的补体调控蛋白中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子来源于微小核糖核酸病毒，所述微小核糖核酸病毒能识别α2β1以感染细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子来源于微小核糖核酸病毒，所述微小核糖核酸病毒能识别ICAM-1和DAF中的至少一种以感染细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子来源于微小核糖核酸病毒，所述微小核糖核酸病毒能够在基本缺乏ICAM-1的细胞内溶解感染或者诱发调亡。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子来源于微小核糖核酸病毒，所述微小核糖核酸病毒能够通过细胞上的DAF在细胞内溶解感染或者诱发调亡。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子来源于选自CVA13、CVA15、CVA18和CVA21的柯萨奇病毒。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子来源于选自EV1、EV7、EV8和EV22的埃可病毒。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸序列包括与野生型相比在一个或者多个衣壳蛋白中的改变，其中所述改变增强了细胞的选择性和/或包括所述改变的病毒的肿瘤靶向作用。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸序列包括具有一个或者多个外壳蛋白突变的柯萨奇病毒核酸序列。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述外壳蛋白突变包括选自VP3 R96H、VP3 E101A、VP3 A239S、VP2 S164L和VP2 V209或其相应的保守变异体的一个或者多个突变。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子是以制剂的形式给药，所述制剂包括vRNA和如阳离子脂质的脂质。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述制剂进一步包括能识别并且与肿瘤特异性标记物反应的配体。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述制剂进一步包括识别肿瘤抗原的抗体，如识别DAF、ICAM-1、α2β1或者MAGE的单克隆抗体。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子通过选自肿瘤内直接注射、口服或者全身给药的一种或多种方法给药。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括给予哺乳动物一种或者多种免疫抑制剂。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
22.一种治疗需要所述治疗的人的黑色素瘤的方法，所述方法包括在引起病毒介导的一种或者多种黑色素瘤细胞瘤细胞溶解的条件下给予人有效量的包括vRNA和脂质的制剂，其中vRNA包括从选自CVA13、CVA15、CVA18、CVA21、EV1、EV7、EV8和EV22，和变异体CVA21#272101、CVA21#275238和CVA21#272598，以及CVA21-DAFv的一种或者多种病毒分离的RNA。
23.根据权利要求22所述的方法，其中给药是将所述制剂直接注射到人的一个或者多个黑色素瘤内。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述制剂进一步包括能识别并且与肿瘤特异性标记物反应的配体。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述制剂进一步包括识别肿瘤抗原的抗体，如识别DAF、ICAM-1、α2β1或者MAGE的单克隆抗体。
26.一种包括来源于微小核糖核酸病毒的分离的病毒核酸序列的核酸分子在制备治疗哺乳动物肿瘤的药物中的应用。
27.一种药物组合物，其中所述药物组合物包括具有来源于微小核糖核酸病毒的分离的病毒多核苷酸序列的核酸分子，以及制药学可接受的赋形剂、稀释剂或者载体，其中将该药物组合物给予肿瘤能引起病毒介导的一种或者多种肿瘤细胞的瘤细胞溶解。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述核酸分子来源于选自CVA13、CVA15、CVA18、CVA21、EV1、EV7、EV8和EV22，和变异体CVA21#272101、CVA21#275238和CVA21#272598，以及CVA21-DAFv的一种或者多种病毒。
29.根据权利要求27所述的组合物，其中进一步包括一种或者多种脂质，如阳离子脂质。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述组合物包括vRNA脂质复合体。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述组合物包括CVA21脂质复合体。
32.根据权利要求27所述的组合物，其中进一步包括识别并且与肿瘤特异性标记物反应的配体。
33.根据权利要求27所述的组合物，其中进一步包括识别肿瘤抗原的抗体。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述抗体是识别DAF、ICAM-1、α2β1或者MAGE的单克隆抗体。
全文摘要
本发明涉及通过使用来源于一种或者多种微小核糖核酸病毒的分离的核酸序列，包括合成的病毒RNA和互补DNA，来治疗动物肿瘤，尤其是治疗人类肿瘤的方法。本发明也涉及来源于一种或者多种微小核糖核酸病毒的分离的核酸序列的组合物，以及来源于一种或者多种微小核糖核酸病毒的分离的核酸序列的组合物在制造用于治疗哺乳动物肿瘤的药物中的应用。
文档编号A61P35/00GK101132798SQ200680006483
公开日2008年2月27日 申请日期2006年1月17日 优先权日2005年1月17日
发明者R·D·雪弗伦 申请人:溶瘤病毒有限公司