专利名称：酰化的glp-1化合物的制作方法
酰化的GLP-l化合物发明领域本发明涉及治疗性肽领域，即涉及新的长效GLP-1化合物。 发明背景一系列不同方法已经用于修饰胰高血糖素样肽l (GLP-1 )化合物 的结构以便提供体内更长的作用持续时间。W0 96/29342公开了其中亲本肽激素已经通过在C-端氨基酸残基 或在N-端氨基酸残基引入亲脂性取代物而修饰的肽激素衍生物。W0 98/08871公开了其中亲本肽的至少一个氨基酸残基连接有亲 脂性取代物的GLP- l衍生物。WO 99/43708公开了具有连接至C-端氨基酸残基的亲脂性取代物 的GLP-1 (7-35)和GLP-1 (7-36)衍生物。WO 00/34331^S开了酰化的GLP-1类似物。WO 00/69911公开了用于注射进患者中的活化的促胰岛素肽，据 认为在患者中它们与血液成分反应形成缀合物，从而据说提供体内更 长的作用持续时间。WO 02/46227公开了融合至人血清白蛋白以便延长体内半衰期的 GLP-l和毒蜥外泌肽-4类似物。许多糖尿病患者尤其是2型糖尿病患者患有所谓的"针-恐怖症"， 即十分恐惧他们自己注射。在2型糖尿病患者中，多数患者使用口服 降血糖药治疗，并且自从期望GLP-1化合物是这些患者将施用的首选注 射产品，对注射的恐惧可能会成为广泛使用这种临床上非常有希望的 GLP-1化合物的严重障碍。因此，需要开发能够每天施用少于一次， 例如每两天或每三天一次优选为每周一次，同时保持可接受的临床特 性的新的GLP-l化合物。发明概述本发明提供了相对于序列GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1 )在位置 7和/或8具有至少一个非-蛋白质源性(non-proteogenic )氨基酸残基 修饰的GLP-1类似物，其在位置26的赖氨酸残基处用一个部分酰化，并 且其中所述的部分包含至少两个酸性基团，其中一个酸性基团在末端 连接。本发明还提供了包含根据本发明化合物的药物组合物，以及提供 了根据本发明的化合物用于制备治疗疾病的药物的用途。本发明提供了用于增加GLP-1类似物在患者中的作用时间的方 法，其特征在于在所述GLP-1类似物的位置26的赖氨酸残基上，用如在 任意先前的权利要求中公开的B-U，部分酰化所述的GLP-1类似物。发明描述在本说明书中，下列术语具有指定的含义 如此处使用的，术语"多肽"和"肽"表示由至少5个通过肽 键连接的组成氨基酸组成的化合物。组成氨基酸可以来自由遗传密码 编码的氨基酸并且它们可以是不通过遗传密码编码的天然氨基酸，以 及合成的氨基酸。不通过遗传密码编码的天然氨基酸是例如Y _羧基 谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成氨基酸 包括通过化学合成产生的氨基酸，即由遗传密码编码的氨基酸的D-异 构体，例如D-丙氨酸和D-亮氡酸、Aib ( cc-氨基异丁酸)、Abu ( a- 氨基丁酸)、Tie (叔丁基甘氨酸)、P-丙氨酸、3-氨曱基苯曱酸、 邻氨基苯曱酸。22种蛋白质源性氨基酸是丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷 氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、 赖氨酸、曱硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、 酪氨酸、缬氨酸。因此，非蛋白质源性氨基酸是可以通过肽键整合进肽的部分，但 不是蛋白质源性氨基酸。实例是Y-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨 酸、D-氨基酸例如D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成的非蛋白质源性氨基 酸包括通过化学合成产生的氨基酸，即通过遗传密码编码的氨基酸的 D-异构体例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib( a-氨基异丁酸)、Abu( a -氨基丁酸)、Tie (叔丁基甘氨酸)、3-氨甲基苯甲酸、邻氨基苯甲 酸、脱氨基-组氨酸、氨基酸的P类似物例如p-丙氨酸等、D-组氨酸、 脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、p-幾基-组氨酸、高组氨酸 (homohistidine) 、 N"-乙酰基-组氨酸、oc-氟甲基-组氨酸、a-甲基 -组氨酸、3-吡啶丙氨酸、2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸、(l-氨基环 丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(l-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸或(1-氨基环辛基)羧酸；如此处使用的，涉及多肽的术语"类似物，，表示经修饰的肽，其 中所述肽的一个或多个氨基酸残基已经由其它氨基酸残基取代和/或 其中一个或多个氨基酸残基已经从肽中删减和/或其中一个或多个氨 基酸残基已经从肽中删减和或其中一个或多个氨基酸残基已经加入至 肽中。这种氨基酸残基的加入或缺失可以在肽的N-端和/或肽的C-端发生。通常用 一 个简单的系统来描述类似物 例如 [Arg"]GLP-l(7-37)Lys指其中在位置34天然存在的赖氨酸已经由精 氨酸取代并且其中一个赖氨酸已经加入至末端氨基酸残基，即加至 Gly"的GLP-1 (7-37)类似物。旋光异构体未说明的所有氨基酸应 该理解为表示L-异构体。在本发明的实施方案中，最多17个氨基酸
已经受到修饰。在本发明的实施方案中，最多15个氨基酸已经受到修饰。在本发明的实施方案中，最多io个氨基酸已经受到修饰。在本发明的实施方案中，最多8个氨基酸已经受到修饰。在本发明的实 施方案中，最多7个氨基酸已经受到修饰。在本发明的实施方案中， 最多6个氨基酸已经受到修饰。在本发明的实施方案中，最多5个氨 基酸已经受到修饰。在本发明的实施方案中，最多4个氨基酸已经受 到修饰。在本发明的实施方案中，最多3个氨基酸已经受到修饰。在 本发明的实施方案中，最多2个氨基酸已经受到修饰。在本发明的实 施方案中，l个氨基酸受到修饰。如此处使用的，有关肽的术语"衍生物，，表示经化学修饰的肽或 其类似物，其中至少一个取代基不存在于未经修饰的肽或其类似物中， 即表示已经经共价修饰的肽。典型的修饰是酰胺、糖类、烷基、酰基、 酯等。GLP-1(7-37)衍生物的实例是Ns"- ( (4S) -4-(十六烷酰基 氨基)-羧基-丁酰基)[Arg"， Lys"]GLP-1-(7-37)。如此处使用的，术语"GLP-1肽，，表示GLP-1(7-37) (SEQ ID No 1)、 GLP-1(7-37)类似物、GLP-1 (7-37)衍生物或GLP-1 (7-37)类似 物的衍生物。在一个实施方案中，GLP-1肽是促胰岛素剂。如此处使用的，术语"促胰岛素剂，，表示是人GLP-1受体激动剂 的化合物，即刺激cAMP在含有人GLP-1受体的合适培养基(在下文中 公开一种这样的培养基)中形成的化合物。促胰岛素剂的效力通过从 如下面描述的剂量-反应曲线计算ECs。值测定。将表达克隆的人GLP-1受体的幼仓鼠肾(BHK)细胞(BHK-467-12A)在加入IOO IU/mL青霉素、100 jug/mL链霉素、5 %胎牛血 清、0. 5 mg/mL遗传霉素G-418 (Life Technologies)的DMEM培养基 中生长。在磷酸盐緩沖液中洗涤细胞两次并用Versene收获。在緩 沖液1 ( 20 raM HEPES-Na， lOmMEDTA， pH7. 4)中通过用Ultraturrax 均化从细胞制备质膜。在4 。C下以48，00Q x g离心勾浆15分钟。 通过均化使沉淀物悬浮于緩冲液2 (20 mM HEPES-Na， 0.1 mM EDTA， pH 7.4)中，随后在4 。C下以48, 000 x g离心15分钟。再次重复洗 涤步骤。将最终的沉淀物悬浮于緩冲液2中并直接用于检测或在-80 'C下储存。功能性受体测定法通过测量作为对促胰岛素剂刺激的反应的环 磷腺苷(cAMP)来完成。形成的cAMP通过AlphaScreenTM cAMP Kit(Perkin Elmer Life Sciences)定量。孵育在半区(half-area) 96-孔微量滴定板中在50 juL总体积的緩沖液3 ( 50mMTris-HCl， 5 mM HEPES， 10 mM MgCl" pH 7.4)中完成并加入1 mM ATP、 1 jaM GTP、 0. 5 mM 3-异丁基-l-甲基黄噪呤(IBMX ) 、 0. 01 %吐温20、 0. 1 % BSA、 6 pg膜制备物、15 iagAnL受体微珠、用6 nM生物素基-cAMP预孵育 的20 ^g/mL供体微珠。将要检测激动剂活性的化合物溶解并稀释于 緩沖液3中。对每个试验新鲜制备GTP。将平板在室温下于黑暗中緩 慢搅动孵育3小时，随后将其在FusionTM仪(Perkin Elmer Life Sciences)中计数。使用Prism v. 4. 0用4参数logistic模型(GraphPad, Carlsbad, CA )绘制每种化合物的浓度-反应曲线并估计 ECs。值。如此处使用的，涉及多肽的术语"DPP-IV保护"指这样一种多 肽，该多肽已经经化学修饰以便使所述化合物能够抗血浆肽酶二肽氨 基肽酶-4 (DPP-IV)。 已知血浆中的DPP-IV酶参与多种肽激素如 GLP-1、 GLP-2、毒蜥外泌肽-4等的降解。因此，正在做出相当大的努 力来开发易受DPP-IV介导的水解作用影响的多肽的类似物和衍生物 以便减小DPP-IV降解速率。在一个实施方案中，DPP-IV保护的肽比 GLP-1 (7-37)或毒蜥外泌肽-4 (1-39)更能抗DPP-IV。肽对二肽氨基肽酶IV降解的抗性可通过下面的降解测定法测定 在37 。C下于100 nL、 0. 1 M pH 7. 4的三乙胺-HCl緩沖液中，将 肽的等分样品(5 nmol)用相当于5 mU酶活性的l jnL纯化的二肽氨基 肽酶IV孵育10-180分钟。通过加入5 pLlO %的三氟乙酸终止酶促反 应，并使用HPLC分析法分离和定量肽降解产物。用于实施该分析的一 种方法是 根据Siegel等Regul.Pept. 1999 ; 79: 93-102和 Mentlein等.Eur. J. Biochem. 1993; 214: 829-35,将混合物上样
至Vydac C18 widepore (30 nm小孑L， 5拜微粒)250 x 4. 6 mm柱并 使用O. 1 %三氟乙酸中的乙腈线性阶式梯度(0 %的乙腈3分钟，0-24 % 的乙腈17分钟，24-48 %的乙腈1分钟)以l ml/分钟的流速将其洗脱。 肽和它们的降解产物可通过它们在220 nm (肽键)或280 nm (芳香族 氨基酸)处的吸光度监控，并通过它们相对于标准品的峰面积积分来 定量。在引起少于IO %的肽受到水解的孵育时间下估计二肽氨基肽酶 IV水解肽的速率。如此处使用的术语"Cw-烷基"指具有1-6个碳原子的饱和的、 分支的、直链或环烃基团。代表性实例包括，但不限于甲基、乙基、 正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、 新戊基、叔戊基、正己基、异己基、环己烷等。如此处使用的，术语"可药用"指适合于正常的药学应用，即在 患者中未产生有害事件等。如此处使用的，术语"赋形剂"指通常加入至药物组合物的化合 物，例如緩冲剂、张度剂(tonicity agent)、防腐剂等。如此处使用的，术语"有效量"指与不治疗相比对患者的治疗足 够有效的剂量。如此处使用的，术语"药物组合物"指包含活性化合物或其盐加 之药物赋形剂(如緩冲剂、防腐剂和任选张度调节剂和/或稳定剂)的 产品。因而，药物组合物在本领域也称为药物制剂。如此处使用的，术语"疾病的治疗"指治疗和看护已经患有疾病、 病症或障碍的患者。治疗目的是对抗疾病、病症或障碍。治疗包括 施用活性化合物以消除或控制疾病、病症或障碍以及减轻与疾病、病 症或障碍相关的症状或并发症。在另一方面，本发明涉及同时结合白蛋白和GLP-1受体的酰化的 GLP-1类似物。
在另一方面，本发明涉及酰化的GLP-1类似物，当存在非常低的 浓度(例如0. 005 %至0.2 %)的人白蛋白时的亲和力与存在2 %的人 白蛋白时的亲和力比较时，所述GLP-1类似物对GLP-1受体的亲和力 只是部分地减小。在这些条件下亲和力的改变小于50倍，优选小于 30倍并更优选小于10倍。如此处使用的，术语"白蛋白结合部分"表示非共价结合人血清 白蛋白的残基。连接至治疗性多肽的白蛋白结合残基通常具有对人血 清白蛋白低于10 ^M的亲和力并且优选低于1 pM。 在末端具有酸性 基团的含有4-40个碳原子的直链和支链亲脂性部分中已知了一系列 的白蛋白结合残基。如此处使用的，术语"亲水性连接物"表示分开肽和白蛋白结合 残基的间隔物，所述的间隔物具有包含至少5个非氢原子且其中3 0-5 0 %的这些非氢原子是N或0的化学部分。如此处使用的，术语"酸性基团"表示在生理pH下完全或部分带 负电荷的有机化学基团。这种基团的pKa值小于7，优选小于5。这 包括但不限于羧酸、磺酸、磷酸或在生理学pH时完全或部分带负电荷 的杂环体系。在下面的结构式II中，U部分是可以以两种不同方式连接末端基团B和肽中的赖氨酸的氨基的双基(di-radical )。在本发明的实施方案中，式II中的U与烷基链一端的基团B和另一端的肽连接。在下面的式中，连接基团的端键应该认为是连接键并且不以亚甲基结尾，除非另外说明。在下面的式中、c CH3表示01^-1类似物的11^-^8-人^- N-端。 在一个实施方案中，本发明提供了用含有至少两个游离的酸性化
学基团的亲脂性白蛋白结合部分酰化的GLP-1类似物，所述的白蛋白结 合部分通过非天然的氨基酸连接物连接至位置26的赖氨酸残基。在一个实施方案中，术语"游离的酸性化学基团"将理解为具有 与此处使用的"酸性基团"相同的含义。在一个实施方案中，本发明提供了酰化的GLP-l类似物，其中所 述的GLP-1类似物通过修饰相对于序列GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1)的 位置7和8中的至少一个氨基酸残基而对DPP-IV是稳定的，并且其中所 述的酰化指任选通过非天然氨基酸亲水性连接物连接至位置26的赖氨 酸残基上的二酸。在本发明的一个实施方案中，GLP-1类似物在相对于序列GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1)的位置7和/或8上具有至少一个非蛋白源性 氨基酸残基的修饰，其在位置26的赖氨酸残基处用一个部分酰化，并 且其中所述的部分包含至少两个酸性基团，其中一个酸性基团在末端 连接。一个实施方案提供了根据上述实施方案的GLP-1类似物，其中在 位置26处连接的部分含有亲水性连接物。一个实施方案提供了根据上述实施方案的GLP-1类似物，其中亲 水性连接物包含至少5个非氢原子，其中30-50 。/。的这些非氬原子是N 或0。一个实施方案提供了根据上述任意实施方案的GLP-1类似物，其 中在位置26处连接的部分含有通过亲水性连接物与肽隔开的白蛋白 结合部分。一个实施方案提供了根据上述实施方案的GLP-1类似物，其中白蛋 白结合部分是具有末端酸性基团的含有4-40个;f友原子的直链或支链亲 脂性部分。一个实施方案提供了根据上述任意实施方案的GLP-1类似物，其中 酰化部分是B-U，，其中U，选自<formula>formula see original document page 23</formula>m是0、1、 2、 3、 4、 5 & 6，n是1、2或3s是0、1、 2或3，t是0、1、 2、 3或4P是1、2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、18、19、20、 21、 22或23;12、 13、 14、 15、 16.并且其中B是选自下列的酸性基团<formula>formula see original document page 23</formula>
其中1是12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20; 一个实施方案提供了根据上述任意实施方案的GLP-1类似物，其 是式I化合物(SEQ ID No. 2):Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-
o
H 11
Xaa^-Ala-Xaa^N^lJ~O(aa27-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37
式i
其中
Xaa 是L-组氨酸、咪喳并丙酰基(imidazopropionyl ) 、 a-鞋基-组
氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、p-羟基-组氨酸、
高组氨酸、Na-乙酰基-组氨酸、fT-甲酰基-组氨酸、ot-氟曱基-组氨
酸、a-甲基-组氨酸、3-吡啶丙氨酸、2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸；
Xaas是Ala、 Gly、 Val、 Leu、 Ile、 Thr、 Ser、 Lys、 Aib、 (l一氨基环
丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(l-氨基环戊基)羧酸、(l-氨
基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸或(1-氨基环辛基)羧酸；
Xaai6是Val或Leu;
Xaai8是Ser、 Lys或Arg;
Xaai9是Tyr或Glir,
Xaa20是Leu或Met;
Xaa"是Gly、 Glu或Aib;
Xaa23是Gln、 Glu、 Lys或Arg;
Xaa"是Ala或Val;
Xaa27是Leu或Gluj
Xaa3o是Ala、 Glu或Arg;
Xaa33是Val或Lys;
Xaa"是Lys、 Glu、 Asn或Arg;
Xaa"是Gly或Aibj
Xaa〗6是Arg、 Gly或Lys， 或缺失；
Xaa"是Gly、 Ala、 Glu、 Pro、 Lys，或缺失；
并且B和U， 一起是酰化部分，其中U，选自O、N' H、MoM 、NT H、0一O0、vOH、NT H 0o-N0。 C)、。^VoOH1、 2、 3、 4、 5或6， 2或3 1、 2或3，1、 2、 3或42、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、m是0、 n是1、 s是0、 t是0、 P是1、17、 18、 19、 20、 21、 22或23;12、 13、 14、 15、 16.并且其中B是选自下列的酸性基团其中1是12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20;在一个实施方案中，本发明提供了是式II化合物(SEQ IDNo. 3) 的化合物<formula>formula see original document page 26</formula>式ii式II与如上面实施方案中说明的式I 一样，其中B-U部分代替了 B-U，。 不同的只是，相对于U, U，整合有羧基，而U没有连接的羧 基。在式II中，每个Xaa，具有下列含义 Xaa,是L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、P-羟 基-组氨酸、高组氨酸、Na-乙酰基-组氨酸、a-氟甲基-组氨酸、ot-甲基-组氨酸、3-吡啶丙氨酸、2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸； Xaas是Ala、 Gly、 Val、 Leu、 Ile、 Lys、 Aib、 (l-氨基环丙基)羧酸、 (l-氨基环丁基)羧酸、(l-氨基环戊基)羧酸、(l-氨基环己基)羧 酸、(l-氨基环庚基)羧酸或(l-氨基环辛基)羧酸； Xaai6是Val或Leu; Xaa)8是Ser、 Lys或Argj Xaa"是Tyr或Gln; Xaa20是Leu或Met; Xaau是Gly、 Glu或Aib; Xaa23是Gln、 Glu、 Lys或Arg; Xaa25是Ala或Val; Xaa27是Leu或Glu'， Xaa3。是Ala、 Glu或Arg; Xaa"是Val或Lysj Xaa34是Lys、 Glu、 Asn或Arg;Xaa35是Gly或Aib; Xaa〗6是Arg、 Gly或Lys，或缺失； Xaa"是Gly、 Ala、 Glu、 Pro、 Lys，或缺失； XaaM是Lys、 Ser、酰胺或缺失； 并且其中U是间隔物，其选自<formula>formula see original document page 27</formula>其中n是12、 13、 14、 15、 16、 17或18 1是12、 13、 14、 15、 16、 17或18， m是0、 1、 2、 3、 4、 5或6， s是0、 1、 2或3，p是3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 18、 19、 20、 21、 22或23;并且其中B是选自下列的酸性基团<formula>formula see original document page 27</formula> 和 <formula>formula see original document page 27</formula>在下面的实施方案中，当涉及式I中的U，时，也应该理解为也 指式II和U，唯一的不同是羧基。一个实施方案提供了根据上述实施方案的GLP-1类似物，其中U，<formula>formula see original document page 27</formula><formula>formula see original document page 28</formula>m是2、 3、 4或5，n是1或2;s是0、 1或2，t是0、 1、 2或3p是1、 2、 3、 4、 7、 11或23一个实施方案提供了根据上迷实施方案的GLP-l类似物，其中 B-U，-是其中1是14、 15、 16、 17、 18、 19或20; p是1、 2、 3、 4、 7、 8、 9、 10、 11或12。 s是0、 1或2， t是0或1;根据上述的实施方案，其中 其中1是14、 15、 16、 17或18 p是1、 2、 3、 4或11; s是0、 1或2; t是0或1;一个实施方案提供了根据上述实施方案的GLP-1类似物 B-U，是其中<formula>formula see original document page 29</formula><formula>formula see original document page 30</formula>h o其中1是14、 15、 16、 p是1、 2、 3或4。 s是0、 1或2, n是0、 1或2<formula>formula see original document page 30</formula>
根据上述任意实施方案的实施方案是其中B是<formula>formula see original document page 30</formula>并且1是14、 16、 18或20;一个实施方案提供了根据上述任意实施方案的GLP-l类似物，其 中B是并且1是14、 15或16。
一个实施方案提供了根据上述任意实施方案的GLP-1类似物，其 中s是l。一个实施方案提供了根据上述任意实施方案的GLP-1类似物，其 中n是1。一个实施方案提供了根据上述任意实施方案的GLP-1类似物，其 中1是14、 15或16;在实施方案中，1是17、 18、 19或20。在实施 方案中，1是15、 16或17。在实施方案中，1是18、 19或20。在实 施方案中1是14。在实施方案中1是16。在实施方案中1是18。在 实施方案中1是20。一个实施方案提供了根据上述任意实施方案的GLP-1类似物，其 中P是l。一个实施方案提供了根据上述任意实施方案的GLP-1类似物，其 中P是2。一个实施方案提供了根据上述任意实施方案的GLP-1类似物，其 中P是3。一个实施方案提供了根据上述任意实施方案的GLP-1类似物，其 中P是4。一个实施方案提供了根据上述任意实施方案的GLP-1类似物，其 中B-U， 是<formula>formula see original document page 31</formula>
一个实施方案提供了根据上述任意实施方案的GLP-1类似物，其 中B-U' 是一个实施方案提供了根据上述任意实施方案的GLP-1类似物，其 中B-U' 是一个实施方案提供了根据上述式I的GLP-1类似物，其中 Xaa7是His或脱氨基-组氨酸； Xaa^是Ala、 Gly、 Val、 Leu、 Ile、 Lys或Aibj Xaai6是Val; Xaau是Ser; Xaai9是Tyrj Xaa2o是Leu;Xaa22是Gly、 Glu或Aib;Xaa23是Gln或Glu;Xaa25是AlajXaa27是Glu5Xaa3。是Ala或Glu;Xaa33是Val;Xaa"是Lys或Arg;Xaa"是Gly或Aib5:化! Xaa36是Arg或Lys5 Xaaw是Gly、酰胺或缺失；一个实施方案提供了根据上述式I的GLP-1类似物，其中Xaa7是HisXaas是Gly或Aib;Xaa6是Val;Xaa"是Ser;Xaai9是TyrjXaa20是Leu;Xaa22是Glu或Aib'，Xaa23是Gln;Xaa25是Ala5Xaa27是Glu;Xaa3。是Ala;Xaa33是Val;Xaa34是Lys或Arg;Xaa"是Gly或Aib;Xaa^是ArgXaa〗7是Gly一个实施方案提供了根据上述实施方案任意之一的GLP-1类似 物，其中GLP-l类似物在GLP-1(7-37)序列位置7的N-端L-组氨酸包含 修饰。一个实施方案提供了根据上述实施方案的GLP-1类似物，其中所 述的GLP-1类似物包括咪唑并丙酰基7、 a-羟基-组氨酸'或N-曱基-组氨 酸7、 D-组氨酸7、脱氨基-组氨酸7、 2-氨基-组氨酸7、 p-羟基-组氨酸 -组氨酸7、 ot-氟甲基-组氨酸7、 a-甲基-组 氨酸7、 3-吡啶丙氨酸7、 2-吡啶丙氨酸7或4_吡啶丙氨酸7。一个实施方案提供了根据上迷实施方案任意之一的GLP-1类似 物，其中所述的GLP-1类似物包含用另 一个氨基酸残基对GLP-1 (7-37) 序列位置8的L-丙氨酸的取代。一个实施方案提供了根据上述实施方案的GLP-1类似物，其中所 述的GLP-l类似物包含Aib8、 Gly8、 Val8、 Ile8、 Leu8、 Ser8、 Thr8、 (1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(l-氨基环戊基)羧酸、(l-氨基环己基)羧酸、(l-氨基环庚基)羧酸或(l-氨基环辛基)羧酸。一个实施方案提供了根据上述任意实施方案的GLP-l类似物，其 中所述的GLP-l类似物包含Ait)8;在本发明的一个实施方案中，所述的GLP-1类似物是 Aib8， Arg34-GLP-1 (7-37)或Aib8,22, Arg"-GLP-1 (7-37)。一个实施方案提供了根据上述任意实施方案的GLP-1类似物，其 中所述的GLP-1类似物与GLP-1 (7-37) (SEQ ID No. l)比较包含不超 过15个已被交换、加入或缺失的氨基酸残基。一个实施方案提供了根据上述实施方案的GLP-1类似物，其中与 GLP-1 (7-37) (SEQ ID No. l)比较有不超过10个已被交换、加入或 缺失的氨基酸残基。一个实施方案提供了根据上述实施方案的GLP-1类似物，其中所 述的GLP-1类似物与GLP-1 (7-37) (SEQ ID No. 1)比较包含不超过6 个已被交换、加入或缺失的氨基酸残基。
一个实施方案提供了根据上述任意实施方案的GLP-1类似物，其 中所述的GLP-1类似物包含不超过3个不是由遗传密码编码的氨基酸 残基。一个实施方案提供了根据上述任意实施方案的GLP-l类似物，其 中所述的GLP-l类似物仅包含一个赖氨酸残基。一个实施方案提供了根据上述任意实施方案的GLP-l类似物，其为Aib8， Arg34-GLP-1 (7-37) Aib8'22, Arg34-GLP-1 (7-37)。 Arg34-GLP-1 (7-37)。[3- (4-咪唑基)丙酰基7， Arg34] GLP-l- (7-37)肽Gly8, Arg34-GLP-1 (7-37)Aib8，Arg34，Pro37-GLP-l(7-37)Aib8'22'27'3°'35， Arg34， Pro"-GLP-l(7-37)酰胺，它们都在位置26由B-U，取代。一个实施方案提供了根据上述实施方案任意之一的GLP-1类似 物，其选自N-s26- (17-羧基十七烷酰基)-[Aib8， Arg34] GLP-l- (7-37)-肽,N-s26- (19-羧基十九烷酰基)-[Aib8， Arg34] GLP-l- (7-37) -肽，,-HAEGTFTSDVSSYLEGQAA——^EF I AA/LVRGRG-c画
N-s26- (4- {[N- (2-羧乙基)-N- (15-羧基十五烷酰基)氨基]甲基}苯 曱酰)[Arg34]GLP—1-(7-37)，—车h3c ch3， 。义N-s26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰基氨基)-4 (S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰 基][Aib8， Arg34]GLP-1-(7-37)肽，<formula>formula see original document page 36</formula>H O-H A EGTFTSDVSSYLEGQA A-N^~E FIAWLVRG R G-圃O Q 0NHSDVSSYLEGQA A—N、HOO O 'O一个实施方案提供了用于增加GLP-1类似物在患者中的作用时间 的方法，其特征在于在所述GLP-1类似物的位置26处的赖氨酸残基上， 用如在上述任意实施方案中公开的B-U部分酰化所述的GLP-l类似物。 一个实施方案提供了用于增加GLP-1类似物在患者中的作用时间 达到多于约40个小时的方法，其特征在于修饰GLP-1 (7-37)肽或其类似 物位置7和8处的至少一个氨基酸残基，并且在所述GLP-l类似物位置26 处的赖氨酸残基上，用如上述任意实施方案中公开的B-U，-部分酰化 所述GLP-1类似物。一个实施方案提供了药物组合物，所述的药物组合物包含根据上 述实施方案任意之一的化合物和可药用赋形剂。一个实施方案提供了根据上述实施方案的药物组合物，其适合肠 胃外施用。一个实施方案提供了根据上述实施方案任意之一的化合物的用 途，用于制备药物。一个实施方案提供了根据上述实施方案任意之一的化合物用于制 备药物的用途，所述的药物用于治疗或预防高血糖症、2型糖尿病、 葡萄糖耐量降低、l型糖尿病、肥胖症、高血压、X综合征、血脂障碍 (dyslipidemia)、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和 其它心血管疾病、中风、炎性肠综合征(inflammatory bowel syndrome)、消化不良和胃溃疡。一个实施方案提供了根据上述实施方案任意之一的化合物的用 途，用于制备用于延緩或预防2型糖尿病的疾病发展的药物。一个实施方案提供了根据上述实施方案任意之一的化合物的用 途，用于制备用于降低食物摄取、降低P-细胞凋亡、增加p-细胞功 能和P _细胞量和/或恢复P -细胞的葡萄糖敏感性的药物。 在一个实施方案中，本发明提供了根据上述实施方案的化合物，其中所述的GLP-1类似物是连接至连接物B-U ， 的 Aib8， Arg"-GLP-1 (7-37)或Aib822， Arg"-GLP-1 (7-37);在式II的一个实施方案中，B-U表示<formula>formula see original document page 39</formula>或在实施方案中，本发明提供了根据上述实施方案任意之一的化合 物，其中所述的二酸包括二羧酸。在实施方案中，本发明提供了根据上述实施方案任意之一的化合物，其中酰化基团包括直链或支链的烷烃a， (o-二羧酸。在实施方案中，本发明提供了根据上述实施方案的化合物，其中 酰化基团包含结构H00C-(CH丄C0-,其中n是12-20。在实施方案中，本发明提供了根据上述实施方案的化合物，其 中酰化基团包含选自H00C-(CH2) 14C0- 、 HOOC-(CH2)15CO-、 H00C- (CH2) 16C0-、 H00C- (CH2) 17C0-和HOOC- (CH2) 1800-的结构。 在实施方案中，本发明提供了根据上述实施方案的化合物，其中酰化基团包含结构H00C- (CH2) 16C0-。本发明的另 一 目标是提供含有根据本发明的化合物的药物制剂， 所述的化合物以0. 1 mg/ml至25 mg/ml的浓度存在，并且其中所述的 制剂具有3. O至9. 0的pH。该制剂可进一步包含緩沖系统、防腐剂、 张度剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中， 药物制剂是含水制剂，即包含水的制剂。这种制剂通常是溶液或悬液。 在本发明的进一步实施方案中，该药物制剂是含水溶液。术语"含水 制剂"定义为含有至少5 0 % w/w水的制剂。同样，术语"含水溶液" 定义为含有至少50。/。w/w水的溶液，并且术语"含水悬液，，定义为含 有至少50 % w/w水的悬液。在另一个实施方案中，药物制剂是一种冻千制剂，在使用前医师 或患者加入溶剂和/或稀释液至其中。在另一个实施方案中，药物制剂是不需任何预先溶解的即用型干 燥制剂(例如冰冷干燥或喷雾千燥)。在另 一方面，本发明涉及含有根据本发明的化合物的含水溶液以 及緩冲剂的药物制剂，其中所述的化合物以0.1 mg/ml或0.1 mg/ml 以上的浓度存在，并且其中所述的制剂pH为约3. 0至约9. 0。在本发明的另一个实施方案中，制剂的pH为约7. O至约9.5。在 本发明的另一个实施方案中，制剂的pH为约3. 0至约7. 0。 在本发 明的另一个实施方案中，制剂的pH为约5. 0至约7. 5。 在本发明的 另一个实施方案中，制剂的pH为约7. 5至约9. 0。 在本发明的另一 个实施方案中，制剂的pH为约7. 5至约8. 5。 在本发明的另一个实 施方案中，制剂的pH为约6. 0至约7. 5。 在本发明的另一个实施方 案中，制剂的pH为约6. 0至约7. 0。 在另一个实施方案中，药物制 剂为8. 0至8. 5。在本发明的进一步实施方案中，緩冲剂选自乙酸钠、碳酸钠、柠 檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)-氨基曱烷、N-二(羟乙基) 甘氨酸、N-(羟曱基)甲基甘氨酸、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富 马酸、酒石酸、天门冬氨酸或其混合物。这些特定緩冲剂的每一种构 成本发明的一个备选实施方案。在本发明的进一步实施方案中，制剂进一步包含可药用防腐剂。 在本发明的进一步实施方案中，防腐剂选自苯酚、邻曱酚、间甲酚、 对甲酚、对幾基苯甲酸甲酯、对羟基苯曱酸丙酯、2-苯氧乙醇、对羟 基苯曱酸丁酯、2-苯基乙醇、千醇、氯丁醇和硫柳汞(thiomerosal )、 溴硝丙二醇、苯曱酸、咪脲、氯己啶、脱氢醋酸钠、氯曱酚、对羟苯 曱酸乙酯、千索氯铵、氯苯甘醚(3对-氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)或 其混合物。在一个实施方案中，防腐剂是苯酚或间曱酚。在本发明 的进一步实施方案中，防腐剂以O. 1 mg/ml至20 mg/ml的浓度存在。 在本发明的进一步实施方案中，防腐剂以O. 1 mg/ral至5 mg/ml的浓 度存在。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂以5 mg/ml至10 mg/ml 的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂以10 mg/ml至 20 mg/ml的浓度存在。这些特定防腐剂的每一种构成了本发明的一 个备选实施方案。防腐剂在药物组合物中的使用是技术人员熟知的。 为方便起见，可参考 Remington: r力e 5We/zce a/7d户rac〃ce 19th edition, 1995。在本发明的进一步实施方案中，制剂进一步包含等渗剂。在本发 明的进一步实施方案中，等渗剂选自盐(如氯化钠)、糖或糖醇、氨 基酸(如L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天门冬 氨酸、色氨酸、苏氨酸)、糖醇(如丙三醇(甘油)、1，2-丙二醇(丙 二醇)、1，3-丙二醇、1,3-丁二醇)聚乙二醇(如PEG400 )或其混合 物。在一个实施方案中，等渗剂是丙二醇。可以使用任何糖例如单糖、 二糖或多糖，或者水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、 山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、支链淀粉、 糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧曱基纤维素钠。在一个实施方案中，糖添加剂是蔗糖。糖醇定义为具有至少一个-OH基团的 C4-C8碳氢化合物并包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫 矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一个实施方案中，糖醇添加剂是甘露 醇。上面提及的糖或糖醇可以独立地或组合使用。使用剂量无限制， 只要糖或糖醇可溶解于液体制剂并且对使用本发明方法达到的稳定效 应无不利影响。在一个实施方案中，糖或糖醇的浓度在约1 mg/ml 和约150 mg/ml之间。在本发明的进一步实施方案中，等渗剂以1 mg/ml至50 mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，等 渗剂以1 mg/ml至7 mg/ml的浓度存在。在本发明的实施方案中，等 渗剂以5mg/ml至7mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案 中，等渗剂以8 mg/ml至24 mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步 实施方案中，等渗剂以25mg/ml至50rag/ml的浓度存在。这些特定 等渗剂的每一种构成了本发明的一个备选实施方案。等渗剂在药物组 合物中的使用是技术人员熟知的。为了方便起见，可参考Remington: 7T e 5We"ce尸rac〃ce o尸尸力ar则c7， 19th edition, 1995。在本发明的进一步实施方案中，制剂进一步包含螯合剂。在本 发明的进一步实施方案中，螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬 酸和天门冬氨酸的盐及其混合物。在本发明的进一步实施方案中，螯 合剂以0. lmg/ml至5 mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方 案中，螯合剂以0. lmg/ml至2 mg/ml的浓度存在。在本发明的进一 步实施方案中，螯合剂以2mg/ral至5mg/ml的浓度存在。这些特定 的螯合剂的每一种构成了本发明的一个备选实施方案。螯合剂在药物 组合物中的使用是技术人员熟知的。为了方便起见，可参考 Remington: r力e 5We/7ce a/2f/ /Va"/ce o尸户力sr/z/ac/， 19th edition, 1995。
在本发明的进一步实施方案中，制剂进一步包含稳定剂。稳定剂 在药物组合物中的使用是技术人员熟知的。为了方便起见，可参考Remington: r力e 5We/zce a/2^Z户rac〃ce o/户力ar则cy， 19th edition, 1995。更特别地，本发明组合物是稳定的液体药物组合物，该液体药物 组合物的治疗活性成分包括在液体药物制剂存储过程中可能会显示出 聚集体形成的多肽。"聚集体形成，，旨在指导致寡聚物形成的多肽分 子之间的物理相互作用，所述的寡聚物可保持可溶，或者是从溶液中 沉淀出的大的可见聚集体。"在存储过程中"意指已经制备的、未立 即施用给受试者的液体药物组合物或制剂。而且，在制备后，将其以 液体形式、冰冻状态或干燥形式包装存储用于随后将其重构为适合施 用于受试者的液体形式或其它形式。"干燥形式"意指液体药物组合 物或制剂通过冷冻干燥(即，冻干法；见例如Williams和Polli( 1984 ) J. Parenteral Sci. Technol. 38: 48-59 )、喷雾干燥(见Masters (1991) Spray-Drying Handbook ( 5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K. ) , pp. 491-676; Broadhead等(1992 ) Drug Devel. Ind. Pharra. 18: 1169-1206;和M画nthaler等(1994 ) Pharm. Res. 11: 12-20)或风干(Carpenter和Crowe ( 1988 ) Cryobiology 25: 459-470;和Roser (1991年)Biopharm. 4: 47-53 ) 而干燥。在液体药物组合物存储过程中多肽的聚集体形成可能会不利 地影响所述多肽的生物活性，导致药物组合物的治疗效果丧失。而且， 当釆用输注系统施用含有多肽的药物组合物时，聚集体形成可引起其 它问题例如输液管、膜或泵阻塞。本发明的药物组合物可以进一步包含足够用来减少在组合物存储 过程中多肽聚集体形成的量的氨基酸碱。"氨基酸碱"意指氨基酸或 氨基酸组合，其中任何给定氨基酸是以其游离碱形式或其盐形式存在。 如果使用氨基酸的组合，所有的氨基酸可以以它们的游离碱形式存在， 全部可以以它们的盐形式存在，或者一些可以以它们的游离碱形式存 在而其它以它们的盐形式存在。在一个实施方案中，制备本发明组合 物中使用的氨基酸是那些具有携带电荷的侧链的氨基酸，例如精氨酸、 赖氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸。特定氨基酸(如曱硫氨酸、组氨酸、 咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸及其混合物)的任何立体异构体(即L、 D或其混合物)或这些立体异构体 的组合可存在于本发明的药物组合物中，只要该特定氨基酸以其游离 碱形式或其盐形式存在。在一个实施方案中，使用L-立体异构体。本 发明组合物也可以使用这些氨基酸的类似物制备。 "氨基酸类似物" 意指天然存在的氨基酸的衍生物，所述的氨基酸衍生物引起减少在本 发明液体药物组合物存储过程中的多肽聚集体形成的期望效果。合适 的精氨酸类似物包括，例如氨基胍、鸟氨酸和N-单乙基L-精氨酸，合 适的甲硫氨酸类似物包括乙硫氨酸和丁硫氨酸(buthionine),以及 合适的半胱氨酸类似物包括S-甲基-L半胱氨酸。如同其它氨基酸一 样，氨基酸类似物以它们的游离碱形式或它们的盐形式整合进组合物。 在本发明的进一步实施方案中，氨基酸或氨基酸类似物以足以防止或 延迟蛋白质聚集的浓度使用。在本发明的进一步实施方案中，当作为治疗剂的多肽包含至少一 种易于氧化的曱硫氨酸残基时，可以加入曱硫氨酸(或其它含硫的氨制"意指随着时间的过去曱硫氨酸氧化种类的最小限度的积聚。抑制 甲硫氨酸氧化导致多肽更多地保持以其正常的分子形式存在。可以使 用甲硫氨酸的任何立体异构体(L或D)或其组合。加入的量应该是 足以抑制曱硫氨酸残基氧化的量，这样甲硫氨酸亚砜的量对管理机构 是可接受的。通常，这意味着该组合物包含不多于约10 %-约30 % 的曱硫氨酸亚砜。通常，这可以通过加入甲石克氨酸而使得加入的曱硫 氨酸与甲硫氨酸残基的比率为约1: 1-约1000: 1,例如10: 1-约100: 1来实现。在本发明的进一步实施方案中，所述的制剂进一步包含选自高分 子量聚合物或低分子量化合物的稳定剂。在本发明的进一步实施方案 中，稳定剂选自聚乙二醇(如PEG 3350 )、聚乙烯醇(PVA)、聚乙
烯吡咯烷酮、羧基-/羟基纤维素或其衍生物(如HPC、 HPC-SL、 HPC-L 和HPMC)、环糊精、含硫的物质如单硫代甘油(monothioglycerol )、 巯基乙酸和2-曱疏基乙醇以及不同的盐(例如氯化钠)。这些特定 稳定剂的每一种构成了本发明的一个备选实施方案。药物组合物还可以包含额外的稳定剂，该稳定剂进一步增强其中 的治疗活性多肽的稳定性。本发明特别重要的稳定剂包括(但不限于) 使多肽免于曱硫氨酸氧化的曱硫氨酸和EDTA，以及使多肽免于与冻融 或机械剪切力相关的聚集的非离子型表面活性剂。在本发明的进一步实施方案中，制剂进一步包含表面活性剂。在 本发明的另一个实施方案中，所述的药物组合物包含两种不同的表面 活性剂。如此处使用的，术语"表面活性剂"指由水溶性(亲水性) 部分(头部)和脂溶性(亲脂性)部分组成的任何分子或离子。表面 活性剂优选在界面处积聚，其亲水性部分朝向水(亲水相)而亲脂部 分朝向油-或疏水相(即玻璃、空气、油等)。表面活性剂开始形成 胶束时的浓度称为临界胶束浓度或CMC。 此外，表面活性剂降低了液 体的表面张力。表面活性剂也称为两亲化合物。术语"去垢剂"通 常是表面活性剂的同义词。阴离子表面活性剂可以选自鵝去氧胆酸、鵝去氧胆酸钠盐、胆 酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、脱氧胆酸甲酯、洋地黄皂甙、毛地黄毒苷 配基、N， N-二曱基十二烷胺N-氧化物、多库酯钠、甘氨鵝去氧胆酸 钠、甘氨胆酸水合物、甘氨脱氧胆酸一水合物、甘氨脱氧胆酸钠盐、 甘氨脱氧胆酸钠盐、葡糖石胆酸3-硫酸二钠盐、葡糖石胆酸乙酯、N-十二烷酰肌氨酸钠盐、N-十二烷酰肌氨酸钠盐、N-十二烷酰肌氨酸、 N-十二烷酰肌氨酸、十二烷基硫酸锂、Lugol、 1-辛烷磺酸钠盐、1-辛烷磺酸钠盐、1-丁烷磺酸钠、1-癸烷磺酸钠、1-十二烷磺酸钠、l-庚烷磺酸钠、1-庚烷磺酸钠、1-壬烷磺酸钠、1-丙烷磺酸钠一水合物、 2-溴乙烷磺酸钠、胆酸钠水合物、牛或羊胆汁、胆酸钠水合物、络胆 酸钠盐、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、己烷磺酸 钠、辛基硫酸钠、戊烷磺酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺鵝去氧胆酸钠盐、牛磺脱氧胆酸钠盐一水合物、牛磺石胆酸3-硫酸二钠盐、牛熊脱氧胆 酸钠盐、Trizma 十二烷基硫酸盐、DSS (多库酯钠，CAS注册号 [577-11-7])、多库酯钩，CAS注册号[128-49-4])、多库酯钾，CAS 注册号[7491-09-0] ) 、 SDS (十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠)、十 二烷基磷酸胆碱(F0S-胆碱-12)、癸基礴酸胆碱(F0S-胆碱-lO)、 壬基磷酸胆碱(F0S-胆碱-9 ) 、 二棕榈酰基磷脂酸、辛酸钠和/或熊果 脱氧胆酸。阳离子表面活性剂可以选自烷基三甲基溴化铵、苯扎氯铵、苯 扎氯铵、千基二甲基十六烷基氯化铵、千基二甲基十四烷基氯化铵、 千基三甲基四氯碘酸铵、二曱基双十八烷基溴化铵、十二烷基乙基二 甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、乙基 十六烷基二曱基溴化铵、十六烷基三曱基溴化铵、十六烷基三曱基溴 化铵、聚氧乙烯(10)-N-牛油-1， 3-二氨基丙烷、通佐溴胺和/或三曱基 (十四烷基)溴化铵。非离子表面活性剂可以选自BigCHAP、双(聚乙二醇双[咪唑基羰 基])、嵌段共聚物如聚氧化乙烯/聚氧化丙烯嵌段共聚物例如泊洛沙 姆、泊洛沙姆-188和泊洛沙姆-407、 Brij 35、 Brij 56、 Brij 72、 Brij 76、 Brij 92V、 Brij 97、 Brij 58P、 Cremophor EL、十乙 二醇单十二烷基醚、N-癸酰-N-甲基葡糖胺、n-十二烷酰-N-曱基葡糖 胺、烷基-多聚葡萄糖苷、乙氧化蓖麻油、七乙二醇单癸基醚、七乙二 醇单十二烷基醚、七乙二醇单十四烷基醚、六乙二醇单十二烷基醚、 六乙二醇单十六烷基醚、六乙二醇单十八烷基醚、六乙二醇单十四烷 基醚、Igepal CA-630、 Igepal CA-630、甲基-6-0-(N-庚基氨基曱酰)-P-D-吡喃葡萄糖苷、九乙二醇单十二垸基醚、N-壬酰-N-甲基葡糖胺、 N-壬酰-N-曱基葡糖胺、八乙二醇单癸基醚、八乙二醇单十二烷基醚、 八乙二醇单十六烷基醚、八乙二醇单十八烷基醚、八乙二醇单十四烷 基醚、辛基-p-D-吡喃葡萄糖苷、五乙二醇单癸基醚、五乙二醇单十 二烷基醚、五乙二醇单十六烷基醚、五乙二醇单己基醚、五乙二醇单
十八烷基醚、五乙二醇单辛基醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇醚W-l、聚氧乙烯IO十三烷基醚、聚氧乙烯100硬脂酸酯、聚氧乙 烯20异十六烷基醚、聚氧乙烯20 油基醚、聚氧乙烯40硬脂酸 酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯双(咪 唑基羰基)、聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸酯、来自Quillaja bark的 Saponin 、 Span⑧20、 SpanMO、 Span⑧60、 SpanK65、 Span①80、 Span8 85、 Tergitol ( 15—S-12型)、Tergitol ( 15—S—30型)、Tergitol (15—S-5型)、Tergitol ( 15+7型)、Tergitol ( 15-S-9型)、 Tergitol ( NP-10型)、Tergitol ( NP-4型)、Tergitol ( NP-40型)、 Tergitol ( NP-7型)、Tergitol ( NP-9型)、十四烷基-p-D-麦芽苷、 四乙二醇单癸基醚、四乙二醇单十二烷基醚、四乙二醇单十四烷基醚、 三乙二醇单癸基醚、三乙二醇单十二烷基醚、三乙二醇单十六烷基醚、 三乙二醇单辛基醚、三乙二醇单十四烷基醚、Triton CF-H、 Triton CF_32、 TritonDF-12、 TritonDF-16、 TritonGR-5M、 TritonQS-15、 Triton QS-44、 Triton X-100、 Triton X-102、 Triton X-15、 Triton X-151、 TritonX-200、 Triton X-207、 Triton X-100、 Triton X-114、 Triton X-165溶液、Triton X-305溶液、Triton X-405、 Triton X-45、 Triton X-705-70、 TWEEN 20、 TWEEN 40、 TWEEN 60、 TWEEN 6、 TWEEN 65、 TWEEN 80、 TWEEN 81、 TWEEN 85、四丁酚醛、鞘磷 脂(神经鞘磷脂)和鞘糖脂类(神经酰胺、神经节苷酯)、磷脂和/或正十 一烷基|3-D-吡喃葡萄糖苷。两性离子表面活性剂可以选自CHAPS、 CHAPSO、 3-(癸基二甲基 铵)丙磺酸内盐、3-(十二烷基二曱基铵)丙磺酸内盐、3-(十二烷基二 曱基铵)丙磺酸内盐、3-(N， N-二甲基十四烷基铵)丙磺酸盐、3-(N， N-二甲基十八烷基铵)丙磺酸盐、3-(N， N-二曱基辛基铵)丙磺酸内盐、 3-(N， N-二曱基十六烷基铵)丙磺酸盐、N-烷基-N, N-二甲基铵-l-丙 磺酸盐、3-胆酰胺-l-丙基二甲基铵-l-丙磺酸盐、十二烷基磷酸胆碱、 肉豆蔻酰溶血磷脂酰胆碱、Zwittergent 3-12 (^十二烷基-#， A^二 曱基-3-铵基-l-丙磺酸盐)、Zwittergent 3-10 (3-(癸基二曱基铵)
丙磺酸内盐)、Zwittergent 3-08 (3-(辛基二曱基铵)丙磺酸盐)、甘 油磷脂类(卵磷脂、脑磷酯、磷脂酰丝氨酸)、甘油糖脂类(吡喃半乳糖 苷)、溶血磷脂酰胆碱和磷脂酰胆碱的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧 基(烷基醚)-衍生物，例如溶血磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱 的月桂酰和肉豆蔻酰衍生物，以及极性头基团的修饰物，即胆碱、乙 醇胺、磷脂酸、丝氨酸、苏氨酸、甘油、肌醇、溶血磷脂酰丝氨酸和 溶血磷脂酰苏氨酸)、酰基肉毒碱及其衍生物、赖氨酸、精氨酸或组 氨酸的N^-酰化的衍生物，或者赖氨酸或精氨酸的侧链酰化的衍生 物，包含赖氨酸、精氨酸或组氨酸和中性或酸性氨基酸任意组合的二 肽的W-酰化的衍生物，包含中性氨基酸和两个带电荷氨基酸的任意 组合的三肽的W-酰化的衍生物，或者表面活性剂可选自咪唑啉衍生 物、长链脂肪酸及其盐C6-C12 (例如油酸和辛酸)、N-十六烷基-N， N-二曱基-3-铵-1-丙磺酸盐、阴离子型(烷基-芳基-磺酸酯)单价表面活 性剂、棕榈酰溶血磷脂-L-丝氨酸、溶血磷脂(例如乙醇胺、胆碱、丝 氨酸或苏氨酸的l-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯)或其混合物。如此处使用的，术语"烷基-多聚葡萄糖苷"涉及由一个或多个糖 苷部分(例如麦芽糖苷、糖类等)取代的直链或支链的Cw。-烷基、-链烯基或-炔基链。这些烷基-多聚葡萄糖苷的实施方案包括CH8-烷基-多聚葡萄糖苷。这些烷基-多聚葡萄糖苷的特定实施方案包括偶数 碳链例如Ce, Cs、 d。、 C12、 C14、 C16、"和C2。烷基链。糖苷部分的特定 实施方案包括吡喃糖苷、吡喃葡萄糖苷、麦芽糖苷、麦芽三糖苷和蔗 糖。在本发明的一个实施方案中，少于6个的糖苷部分连接至烷基基 团。在本发明的一个实施方案中，少于5个的糖苷部分连接至烷基基 团。在本发明的一个实施方案中，少于4个的糖苷部分连接至垸基基 团。在本发明的一个实施方案中，少于3个的糖苷部分连接至烷基基 团。在本发明的一个实施方案中，少于2个的糖苷部分连接至烷基基 团。烷基-多聚葡萄糖苷的特定实施方案是烷基葡萄糖苷如正癸基 P-D-吡喃葡萄糖苷、癸基(3-D-吡喃麦芽糖苷、十二烷基(3-D-吡喃葡萄 糖苷、正十二烷基p-D-麦芽糖苷、正十二烷基p-D-麦芽糖苷、正十二
烷基|3-D-麦芽糖苷、十四烷基p-D-吡喃葡萄糖苷、癸基|3-D-麦芽糖苷、 十六烷基P-D-麦芽糖苷、癸基p-D-麦芽三糖苷、十二烷基p-D-麦芽三 糖苷、十四烷基P-D-麦芽三糖苷、十六烷基(3-D-麦芽三糖苷、正十二 烷基-蔗糖、正癸基-蔗糖、蔗糖单癸酸酯、蔗糖单月桂酸酯、蔗糖单 十四酸酯，以及蔗糖单棕桐酸酯。表面活性剂在药物组合物中的使用是技术人员熟知的。为了方便 起见，可参考Remington: T力e Sc/e/7ce a/7tf尸rac〃ce o/ /^ar/z7ac/， 19th edition, 1995。在本发明的进一步实施方案中，所述的制剂还包括蛋白酶抑制剂 例如EDTA (乙二胺四乙酸)和节脒HC1，但也可以使用其它可商业获 得的蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的使用在含有蛋白酶酶原的药物组 合物中是特别有用的，以便抑制自身催化。其它成分可以存在于本发明的肽药物制剂中。这些额外的成分可 以包括湿润剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张力调节剂、螯合剂、 金属离子、油质载体、蛋白质(例如人血清白蛋白、明胶或蛋白质) 以及两性离子(例如，氨基酸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、 赖氨酸和组氨酸)。当然，这些额外成分不应该不利地影响本发明药 物制剂的整体稳定性。含有根据本发明化合物的药物组合物可以在多个位点施用给需要 这种治疗的患者，例如在局部位点(如皮肤和粘膜位点)、在不经过 吸收的位点(如在动脉、静脉、心脏施用)、以及在涉及吸收的位点 (如在皮肤、皮下、肌肉或腹部施用)。根据本发明的药物组合物的施用可以通过多种给药途径施用给需 要这种治疗的患者，例如舌、舌下、口颊、口中、经口、在胃和肠内、 鼻、肺(如通过细支气管和肺泡或它们的组合)、表皮、真皮、经皮 肤、阴道、直肠、目艮(例如通过结膜)、输尿管和肠胃外施用。本发明组合物 乳剂、微乳剂、复合型乳剂、泡沫剂、油青剂、糊剂、硬骨剂、软青 剂、片剂、包衣片剂、沖洗剂、胶嚢剂(例如硬明胶胶嚢剂和软明胶 胶嚢剂)、栓剂、直肠用胶囊剂、滴剂、凝胶剂、喷雾剂、粉剂、气 溶胶、吸入剂、滴眼剂、眼膏剂、眼用沖洗剂、阴道栓剂、阴道环、 阴道软膏剂、注射溶液、原位转化溶液(例如原位凝胶化、原位固定、 原位沉淀、原位结晶)、输注液和埋植剂施用。本发明组合物可以进一步例如通过共价、疏水性和静电相互作用 混合进或连接至药物载体、药物递送系统和高级药物递送系统以便进 一步增强本发明化合物的稳定性、提高生物利用率、增强溶解性、降 低不利效应、达到本领域那些技术人员熟知的定时治疗(chronotherapy )，以及增强患者顺应性或它们的任意组合。载体、 药物递送系统和高级药物递送系统的实例包括(但不限于)聚合物(如 纤维素及其衍生物)、多糖(如葡聚糖及其衍生物、淀粉及其衍生物)、 聚(乙烯醇)、丙烯酸酯和甲基丙烯酸聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及 它们的嵌段共聚体、聚乙二醇、载体蛋白(如白蛋白)、凝胶如热凝 股系纟充(thermogelling system) ， i口本4页^戈秀卩些才支术人员熟^p的嵌 段共聚体系统、胶束、脂质体、微球体、纳米微粒、液晶及其分散体(dispersion) 、 L2相及其分散体，月旨-水系统的相行为领域中的那 些技术人员熟知的高分子胶束、复合型乳剂、自乳化、自微乳化、环 糊精和其衍生物，以及树状分子。固体、粉末和溶液，所述的肺部施用是使用例如定量吸入器、干粉吸 入器和喷雾器来进行，所有这些装置是本领域那些技术人员熟知的。 本发明组合物特别可用于制备控制释放、持续释放、延长释放、 阻释和緩释药物递送系统。更特别地，但不作为限制，组合物可用于 制备本领域那些技术人员熟知的肠胃外控制释放系统和持续释放系统(这两个系统都导致施用量减少许多倍)。甚至更特别地是，组合物 可用于制备经皮下施用的可控制释放系统和持续释放系统。无意于限 制本发明领域，有用的控制释放系统和组合物的实例是水凝胶、油性 凝胶、液晶、高分子微团、微球、纳米微粒。生产可用于本发明组合物的控制释放系统的方法包括(但不限于) 结晶、浓缩、共结晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高压匀化、胶嚢 化、喷雾干燥、微胶嚢化、凝聚、相分离、溶剂蒸发产生微球、挤出(extrusion )和超临界;危体过禾呈(supercritical fluid process )。 一般参考Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D丄，ed. Marcel Dekker ， New York, 2000 )和Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99 : Protein Formulation and Delivery (MacNally， E. J. , ed. Marcel Dekker， New York, 2000 )。 肠胃外施用可以用注射器，任选笔式注射器通过皮下、肌内、腹 膜内或静脉内注射来实施。备选地，肠胃外施用可以通过输注泵实施。 进一步的选择是，可以以鼻或肺液体或粉末喷雾形式施用本发明化合 物的溶液或混悬剂或粉剂的组合物。作为更进一步的选择，含有本发 明化合物的药物组合物也能够适合例如通过无针注射或通过药贴，任 选离子导入药贴(iontophoretic patch)经皮肤施用，或者经粘膜(如 口腔)施用。本发明化合物可以使用适合肺部药物递送的任何已知类型的装 置，在载体中作为溶液、混悬剂或干粉剂通过肺部途径施用。这些装 置的实例包括(但不限于)用于肺部药物递送的三种通用型气溶胶发 生器，并且可以包括喷射雾化器或超声波雾化器、定量吸入器或干粉 吸入器(参见YuJ， Chien YW. Pulmonary drug del ivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14 (4) (1997) 395-453)。基于标准化的测试方法学，将粒子的气体动力学直径(da)定义 为单位密度Ug/cm3)的参考标准球形粒子的几何等效直径。在最简 单的情形中，对于球形微粒，da作为相对密度的平方根函数与基准直 径(d)相关，如Modifications to this relationship occur for non-spherical particles中描述(参见Edwards DA， Ben-Jebria A， Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, . J Appl Physiol 84 (2) (1998) 379-385 )。术语"MMAD"和"MMEAD"是本领域已充分描述和已知的(参见 Edwards DA， Ben-Jebria A， Langer R and represents a measure of the median value of an aerodynamic particle size distribution. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385)。质 量中值直径(MMAD)和质量中值有效直径(MMEAD)可以交换使用，是 统计参数，并且经验地描述气溶胶粒子大小(该大小与它们在肺中沉 积的潜力相关)，不依赖于实际形状、大小或密度(参见Edwards DA， Ben-Jebria A， Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84 (2) (1998) 379-385 ) 。 MMAD通常用碰撞器(测量粒子在气体中的 惯性行为的装置)测量计算。在进一步的实施方案中，制剂可以通过任何已知的烟雾化技术(例 如喷雾技术)而烟雾化，以达到气溶胶粒子的画AD小于10pm，更优 选1-5 pm，并且最优选1-3 pm。优选的粒子大小是基于递送药物进 肺深部(在那里蛋白质得以最佳吸收)的最有效大小(参见Edwards DA， Ben-Jebria A， Langer A， Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84 (2) (1998) 379-385 )。技术的改变形式进一步优化，所述的吸入技术的改变形式是例如(但 不限于)緩慢吸入气流(例如30L/分钟)、屏气和定时释放(breath holding and timing of actuation)。术语"稳定制剂，，指具有增加的物理稳定性、增加的化学稳定 性或增加的物理和化学稳定性的制剂。
如此处使用的术语蛋白制剂的"物理稳定性"指该蛋白由于其暴 露于热-机械应力下和/或与失稳的界面和表面(如疏水表面和界面) 相互作用而形成生物学上失活的和/或不可溶的蛋白聚集物的倾向性。 含水的蛋白质制剂的物理稳定性可通过在不同的温度下将置于合适容 器(如药筒或小瓶)中的制剂暴露于机械/物理应力(如搅动)下多个 时间段后通过视觉检查和/或浊度测量来评估。制剂的视觉检查在具有 黑色背景的强聚焦光下进行。制剂的浊度通过视觉打分评定混浊程度等级来表征，如以0-3的等级来表征(未显示混浊的制剂对应视觉打 分O,而在日光下显示可见的混浊的制剂对应视觉打分3)。当制剂在 日光下显示可见的混浊度时，将蛋白分类为关于蛋白聚集是物理不稳 定的。备选地，制剂的浊度可通过技术人员熟知的简单浊度测量法评 估。含水蛋白质制剂的物理学稳定性也可以通过使用光谱剂 (spectroscopic agent )或蛋白质构象状态的揮:4f来评估。该探针 优选为优先结合蛋白质的非天然构象异构体的小分子。蛋白质结构的 小分子光谱探针(spectroscopic probe)的一个实例是硫磺素T。硫 磺素T是已经广泛用于检测淀粉样蛋白原纤维的荧光染料。在有原纤 维，或许也有其它蛋白质构象的情况下，硫磺素T在结合原纤维蛋白 质形式时在约450認处产生新的激发极大值并且在约482 nm处发射 增强。未结合的疏磺素T在这些波长下基本上是无荧光的。其它小分子可以用作蛋白质结构改变(从天然到非天然状态)的 探针。例如，优选结合蛋白质的暴露的疏水片(hydrophobic patch) 的"疏水片"探针。疏水片通常是包埋于天然态蛋白的三级结构中， 但当蛋白开始去折叠或变性时其变为暴露在外。这些小分子、光语探 针的实例是芳香的、疏水染料如antrhacene、吖啶、二氮杂菲等。其 它光镨探针是金属-氨基酸络合物例如疏水氨基酸如苯丙氨酸、亮氨 酸、异亮氨酸、曱硫氨酸和缬氨酸等的钴金属络合物。如此处使用的术语，蛋白质制剂的"化学稳定性"指蛋白结构中 的化学共价变化，其中所述的这种变化导致具有较于天然蛋白结构潜 在较小的生物学效力和/或潜在增加的免疫原特性的化学降解产物的 形成。可以形成多种化学降解产物，这取决于天然蛋白质的类型和性质 以及该蛋白质暴露的环境。化学降解的消除几乎不可能完全实现并且 在存储和使用蛋白质制剂过程中通常可见化学降解产物的量增加，这 是本领域技术人员熟知的。多数蛋白质易于脱酰胺作用，即谷氨酰胺 或天冬酰胺残基中的侧链酰胺基水解形成游离的羧酸的过程。其它降 解途径包括高分子量的转化产物的形成，其中两个或多个蛋白分子通 过转酰胺基作用和/或二硫化物相互作用共价地彼此结合导致形成共价结合二聚体、寡聚体和多聚体降解产物(Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M. C. ， Plenum Press, New York 1992 )。氧化(例如甲硫氨酸残基的氧化)可认为是化学降 解的另一种变体。蛋白制剂的化学稳定性可通过在其暴露于不同的环 境条件(降解产物的形成通常可通过例如增加温度来加速)下后，在 多个时间点测量化学降解产物的量来评估。每种单独的降解产物的量 通常可根据分子大小和/或电荷，使用多种色i普技术(如SEC-HPLC和/ 或RP-HPLC)而分离降解产物测定。因此，按上面描述，"经稳定的制剂"指具有增强的物理学稳定 性、增强的化学稳定性或增强的物理和化学稳定性的制剂。通常，制 剂在使用和存储过程中(根据建议的使用和存储条件)必须是稳定的， 直到达到有效期满。在本发明的一个实施方案中，含有本发明化合物的药物制剂在6 周以上的使用和3年以上的存储中是稳定的。在本发明的另一个实施方案中，含有本发明化合物的药物制剂在 4周以上的使用和3年以上的存储中是稳定的。在本发明进一步的实施方案中，含有本发明化合物的药物制剂在 4周以上的使用和2年以上的存储中是稳定的。在本发明进一步的实施方案中，含有本发明化合物的药物制剂在 2周以上的使用和2年以上的存储中是稳定的。在另 一方面，本发明涉及根据本发明的化合物用于制备药物的用途。在一个实施方案中，根据本发明的化合物用于制备治疗或预防高 血糖、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、l型糖尿病、肥胖症、高血压、 X综合征、血脂障碍、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、中风、 冠心病和其它心血管疾病、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡的药物。在另一个实施方案中，根据本发明的化合物用于制备延緩或预防 2型糖尿病的疾病发展的药物。在另一个实施方案中，根据本发明的化合物用于制备减少食物摄 取、减少p-细胞凋亡、增加P-细胞功能和p-细胞量和/或恢复P-细胞的葡萄糖敏感性的药物。使用根据本发明化合物的治疗也可以与另 一种或多种药理活性物 质组合，所述的药理活性物质例如选自抗糖尿病药、减肥药、食欲调 节剂、抗高血压药、用于治疗和/或预防由糖尿病引发或与其相关的并 发症的制剂以及用于治疗和/或预防由肥胖症引发或与其相关的并发 症和障碍的制剂。这些药理活性物质的实例是胰岛素、磺脲类、双 胍、氯茴苯酸类、葡萄糖苷酶抑制剂、胰高血糖素拮抗剂、DPP-IV(二 肽基肽酶-IV)抑制剂、涉及刺激糖异生和/或糖原分解的肝脏酶的抑 制剂、葡萄糖摄取调节剂、调节脂类代谢的化合物如抗高血脂药剂如 HMGCoA抑制剂(他汀类药物)、胃抑制性多肽(GIP类似物)、降低 食物摄取的化合物、RXR激动剂和作用于P细胞的ATP依赖性钾通道的 制剂；考来烯胺、考来替泊、安妥明、吉非贝齐、洛伐他汀、普伐他 汀、辛伐他汀、普罗布考、右甲状腺素、neteglinide、瑞格列奈；|3 阻滞剂如烯丙心安、氨酰心安、噻吗心安、吲哚心安、萘心安和甲氧 乙心安、ACE (血管紧张素转化酶)抑制剂如贝那普利、卡托普利、恩 纳普利、福森普利、赖诺普利、alatriopril、喹那普利和雷米普利、 钙通道阻滞剂如硝苯吡啶、二氯苯吡啶、硝苯千吡啶、依拉地平、尼 莫地平、地尔硫卓和维拉帕米，以及a阻滞剂如多沙唑溱、哌胺甲尿 啶、哌唑溱和特拉唑溱；CART (可卡因安非他明调节的转录物)激动 剂、NPY (神经肽Y)拮抗剂、PYY激动剂、PYY2激动剂、PYY4激动 剂、混合的PPY2/PYY4激动剂、MC4 (黑皮质素4)激动剂、阿立新拮 抗剂、TNF (肿瘤坏死因子)激动剂、CRF (促皮质素释放因子)激动 剂、CRF BP (促皮质素释放因子结合蛋白)拮抗剂、urocortin激动 剂、激动剂、MSH (黑素细胞-刺激激素)激动剂、MCH (黑素细胞 收缩激素)拮抗剂、CCK (胆嚢收缩素)激动剂、血清素重吸收抑制剂、 血清素和去甲肾上腺素重吸收抑制剂、经混合的血清素和去甲肾上腺 素化合物、5HT(血清素)激动剂、蛙皮素激动剂、神经节肽拮抗剂、 生长激素、生长激素释放化合物、TRH(促甲状腺激素释放激素)激动 剂、UCP 2或3 (解偶联蛋白2或3 )调节剂、瘦素激动剂、DA激动剂 (溴隐停、doprexin)、脂肪酶/淀粉酶抑制剂、RXR(视黄醇类X受 体)调节剂、TR (3激动剂；组胺H3拮抗剂、胃抑制性多肽激动剂或 拮抗剂(GIP类似物)、胃泌素和胃泌素类似物。使用根据本发明化合物的治疗还可以与外科手术(即影响葡萄糖 水平和/或脂质体内平衡的外科手术)例如胃嚢带术或胃旁路术联合。应该理解的是，根据本发明的化合物与一种或多种上面提及的化 合物，以及任选一种或多种其它药理活性物质的任何合适的组合可以 认为是在本发明范围内。本发明通过下面的实施例来进一步阐述，然而，所述的实施例不 应理解为限制本专利保护的范围。在前面描述和下列实施例中公开的 特征(个别地和它们的任何组合)可以是用于以其不同形式实现本发 明的材料。实施例
使用的缩写 r. t:室温DIPEA: 二异丙基乙胺 H20:水 CH3CN:乙腈DMF: N， N-二甲基曱酰胺HBTU: 2-(lH-苯并三唑-l-基-)-l， 1， 3， 3-四甲基脲六氟磷酸Fmoc: 9 H-芴-9-基甲氧基羰基Boc: ^又丁氧羰基0tBu: *又丁酯tBu:叔丁基Trt:三苯曱基Pmc: 2， 2， 5， 7， 8-五甲基-苯并二氢吡喃-6-磺酰基Dde: 1-(4， 4-二曱基-2， 6-二氧环亚己基)乙基ivDde: 1- (4， 4-二甲基-2， 6-二氧环亚己基)-3-甲基丁基Mtt: 4-曱基三苯曱基Mmt: 4-曱氧基三苯甲基DCM: 二氯曱烷TIS:三异丙基硅烷)TFA:三氟乙酸Et20: 乙醚NMP: l-甲基-吡咯烷-2-酮 DIPEA: 二异丙基乙胺 H0At: l-羟基-7-氮杂苯并三唑 H0Bt: 1-羟基苯并三唑 DIC: 二异丙基碳二亚胺使用制造商提供的FastMocUV方法，在Applied Biosystems 433 肽合成仪上根据Fmoc策略合成0. 25 mmol或1. 0 mmol量级的经保护 的肽酰树脂，所述的FastMoc UV方法采用在NMP (N-甲基吡咯烷酮) 中的HBTU ( 2- ( lH-苯并三唑-l-基-)-1, 1， 3， 3-四甲基脲六氟磷 酸)或HATU(0-(7-氮杂苯并三唑-l-基)-l， 1， 3， 3-四甲基脲六氟磷酸) 介导的偶联，并且UV监控Fmoc保护基团的去保护。用于合成GLP-1 肽酰胺的起始树脂是Rink-Amide树脂并且Wang或氯三苯甲基树脂用 于具有羧基C端的GLP-1肽。除了非天然的氨基酸例如Fmoc-Aib-0H (Fmoc-氨基异丁酸)以外，使用的经保护的氨基酸衍生物是在适合用 于ABI433A合成仪的预称量筒中提供的标准Fmoc-氨基酸(由例如 Anaspec或Novabiochem提供)。N端氨基酸在a氨基处用Boc保护(例 如将Boc-His (Boc)0H用于N端具有His的肽)。位置26的赖氨酸的 s氨基用Mtt、 Mmt、 Dde、 ivDde或Boc保护，这取决于连接白蛋白结 合部分和间隔物的方式。肽的合成在一些情况中可以通过利用在二肽酰胺键上用酸性条件下能够切割的基团保护的二肽来改善，所述的基 团例如是但不限于2-Fmoc-氧-4-甲氧节基或2， 4, 6-三甲氧基苄基。在肽中存在丝氨酸或苏氨酸的情况中，可以使用假脯氨酸 (pseudoproline) 二肽(见例如NovoMochem 2002/2003或更新版 本的目录，或W.R. Sampson (1999)， J. Pep. Sci. 5， 403 )。除去ivDde或Dde—呆护的方法。将树脂(0.25 mmol)置于一个手动振荡器/过滤装置中并用N-曱 基吡咯烷酮中的2%肼(20ml， 2xl2分钟)处理以除去Dde或ivDde 基团并用N-甲基吡咯烷酮(4x20 ml)洗涤。除去Mtt或Mmt-保护的方法。将树脂(0.25 mmol)置于手动振荡器/过滤装置中并用DCM中的 2 % TFA和2-3 % TIS处理(20 ml， 5-10分钟，重复6-12次)以除
去Mtt或Mmt基团，并用DCM (2 x 20 ml) 、 DCM中的10 °/。 MeOH和5 % DIPEA ( 2 x 20ml )和N-曱基吡咯烷酮(4x20 ml )洗涤。将侧链连接至赖氨酸残基的方法.白蛋白结合残基(式I的B-U-侧链)可以通过使用标准酰化剂(例 如但不限于DIC、 H0Bt/DIC、 H0At/DIC或HBTU)酰化至结合树脂的肽 上或在溶液中酰化至未受保护的肽上而连接至GLP-1。连接至结合树脂的肽上 路径I将活化的(活化酯或对称酸酐)白蛋白结合残基(式I的B-U-侧 链)例如十八烷二酸单-(2， 5-二氧-吡咯烷-l-基)酯(Ebashi爭， EP511600,相对于结合树脂的肽4摩尔当量)溶解于NMP( 25 mL)中， 在室温下加入至树脂并摇动过夜。过滤反应混合物并用NMP、 二氯曱 烷、2-丙醇、甲醇和乙醚仔细洗涤树脂。路径II将白蛋白结合残基(式I的B-U-侧链)溶解于N-甲基吡咯烷酮/ 二氯甲烷(l:l， 10ml)中。加入活化试剂例如羟基苯并三唑(H0Bt)(相对于树脂4摩尔当量)和二异丙基碳二亚胺(相对于树脂4摩尔 当量)并搅拌溶液15分钟。将该溶液加入至树脂中并加入二异丙基乙 胺(相对于树脂4摩尔当量)。将树脂在室温下摇动2_24小时。用 N-甲基吡咯烷酮(2x2Qml) 、 N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1: 1 ) (2x 20ml )和二氯甲烷(2x20 ml )洗涤树脂。路径III将活化的(活化酯或对称酸酐)白蛋白结合残基(式I的B-U-侧 链)例如十八烷二酸单-(2，5-二氧-吡咯烷-l-基)酯(Ebashi爭， EP511600,相对于GLP-1肽1-1. 5摩尔当量)溶解于有机溶剂例如乙 腈、THF、 DMF、 DMSO或水/有机溶剂的混合物(1-2 ml)中，并与10 摩尔当量的DIPEA—起加入至水中的肽溶液(10-20 ml)中。在保护 基团位于白蛋白结合残基例如叔丁基的情形中，0/N冻干反应混合物 并然后将分离的肽粗产物去保护-在叔丁基的情形中，将肽溶解于三氟 乙酸、水和三异丙基甲硅烷的混合物(90:5:5)中。30分钟后，在真 空中蒸发该混合物并且使用制备级HPLC纯化肽终产物。除去Fmoc-保护的方法将树脂(0. 25 mraol )置于手动振荡器的 滤瓶中并用N-曱基吡咯烷酮/二氯曱烷(1: 1 ) ( 2 x 20ml )和N-甲基 吡咯烷酮(1 x 20 ml )、 N-曱基吡咯烷酮中的20 %旅咬溶液(3 x 20 ml ， 每次IO分钟)处理。用N-甲基吡咯烷酮(2x20 ml) 、 N-甲基吡咯 烷酮/二氯甲烷(1: 1 ) ( 2 x 20 ml )和二氯甲烷(2x20 ml )洗涤树 脂。用于将肽从树脂裂解的方法通过用三氟乙酸、水和三异丙基硅烷(95: 2.5: 2. 5至92: 4: 4 ) 的混合物在室温下搅拌180分钟将肽从树脂裂解。过滤裂解混合物并 通过氮气流将滤出液浓缩为油状产物。用45 ml乙醚从油状产物中沉 淀出肽粗产物并用45 ml乙醚洗涤1至3次。纯化将肽粗产物在装填有5 n或7 ja C-18珪石的20mmx 250 mm柱上通过半制备HPLC纯化。根据肽使用一个或两个纯化系统。TFA:千燥后，将肽粗产物溶解于5 ml 50 %乙酸H20中并用H20 将其稀释成20 ml并注入柱中，随后在40 °C下50分钟内将该柱用0. 1 % TFA中的40-60 %的CH3CN梯度以10 ml/分钟洗脱。收集含有肽的 级分。用水稀释洗脱物后冻干纯化的肽。硫酸铵用经浓H2S04调节至pH 2. 5的0.05M (NH4) 2S04中的40 % CH3CN平衡柱子。干燥后，将肽粗产物溶解于5mlH20中50%的乙酸中 并用}120稀释至20 ml并注入柱中，随后在40 。C下50分钟内将该柱
用0. 05M (N仏)2S04中的40-60 %的CH3CN梯度以10 ml/分钟洗脱。收 集含有肽的级分并用3倍体积的H20稀释，并且使其通过已经用0.1% TFA平衡了的Sep-Pak C18筒(Waters part. #: 51910)。随后用 含有0. 1 % TFA的70 % CH3CN将其洗脱并在用水稀释洗脱物后通过冻 干来分离纯化的肽。荻得的终产物通过分析型RP-HPLC (保留时间)和LCMS鉴定。 RP-HPLC分析用214 nm下的UV检测和在42 。C下以1 ml/分钟洗 脱的Vydac 218TP54 4. 6 ram x 250 mm 5pC-18硅柱(The Separations Group, Hesperia， USA)进行。使用两种不同的洗脱条件Al:在由用浓112304调节至pH 2. 5的0.1 M (NH4) 2S04组成的緩沖 液中平衡该柱，并用相同緩冲液中的0 %-60 °/。的CH3CN梯度洗脱50 分钟。Bl:用0. 1 % TFA/H20平衡该柱并用0 % CH3CN/0. 1 % TFA/H20至 60 % CH3CN/0. 1 % TFA/H20的梯度洗脱50分钟。B6:用0.1 % TFA/H20平衡该柱并用0 % CH3CN/0. 1 % TFA/H20至 90 % CH3CN/0. 1 % TFA/H20的梯度洗脱50分钟。备选地，RP-HPLC分析用214 nm下的UV检测和在"。C下以1 ml/ 分钟洗脱的Symmetry300， 3. 6 mm x 150 mm, 3. 5pC-18珪柱(Waters) 进行。B4:用0.05 % TFA/H20平衡该柱并用5 % CH3CN/0. 05 % TFA/H20 至95 % CH3CN/0. 05 % TFA/H20的梯度洗脱15分钟。使用了下列仪器LCMS在由Sciex API 100 Single quadropole质语仪、Perkin Elmer系列200 Quard泵、Perkin Elmer系列200自动采样器、Applied Biosystems 785A UV检测器、Sedex 75蒸发光散射检测器组成的装 置上进行4义器控制和数据采集由在Windows 2000计算机上运行的SciexSample控制软件完成。HPLC泵连接至两个洗脱液Ji&液器，贮液器含有 A:水中0. 05 %的三氟乙酸 B:乙腈中0. 05 %的三氟乙酸在室温下，通过注射适宜量样品(优选为20 pl)至经乙腈梯度 洗脱的柱上进行分析。使用的HPLC条件、检测器设置和质谱仪设置在下表中给出。柱Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5拜梯度 在7. 5分钟内以1. 5 ml/分钟进行的5 %-90 %的乙腈线性梯度检测210 nm (从DAD模拟输出) ELS (从ELS模拟输出)，40 。C MS离子化模式API-ES备选地，LCMS在由Hewlett Packard系列1100 G1312A Bin Pump、 Hewlett Packard系列1100柱室、Hewlett Packard系列1100 G1315A DAD 二极管阵列检测器、Hewlett Packard系列1100 MSD和由HP Chemstation软件控制的Sedere 75蒸发光散射检测器组成的装置中 进行。HPLC泵连接至两个洗脱液贮液器，所述的贮液器含有A: 水中的10 mM NH40HB: 90 %乙腈中的10 mM NH40H分析在23。C下，通过注射适宜量样品(优选为20 Ml)至柱上， 用A和B梯度洗脱该柱来进行。使用的HPLC条件、检测器设置和质谱仪设置在下表中给出。 柱Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5 ju m
梯度在6.5分钟内以L5 ml/分钟进行的5 %-100 %的乙腈线 性梯度检测 210 nm (从DAD模拟输出) ELS (从ELS模拟输出)MS离子化模式API-ES。扫描100-1000 amu 步长为0. 1 amu结合表达人GLP-1受体的质膜的放射性配体结合测定法用含有人GLP-1受体的经纯化的质膜进行。含有受体 的质膜从稳定表达的BHK tk-ts 13细胞纯化。将膜在检测緩沖液(50 mM HEPES、 5 mM EGTA、 5 mM MgCl2、 0.005 %吐温20， pH=7. 4 )中 稀释至终浓度为0. 2 mg/ml的蛋白质并将其分配至用0. 3 % PEI预包 被的96孔微量滴定板中。膜与0.05 nM [mI]GLP-l、浓度渐增的未 标记配体和不同HSA浓度(0. 005 %、 0. 05 %和2 %)在30匸下孵育 2小时。孵育后，通过多头抽真空装置过滤使未结合的配体与结合的 配体分离，随后用2 x 100 jil冰冷的测定緩沖液洗涤。将滤出液在RT 下过夜千燥，取出(punch out)并在Y-计数器中定量。实施例1<formula>formula see original document page 63</formula>N-s26- (17-羧基十七烷酰)-[Aib8, Arg34] GLP-l- (7-37)-肽 根据制造商的说明书，在ABI433A机器上用树脂(Fmoc-Gly-NovaSyn TGT， 0.22 mmol/g Novabiochem 0.25 mmole)产生一级序列。除在 位置26处使用的残基(FmocLys (ivDde) -OH, Novabiochem)夕卜，所 有的保护基团都是酸不稳定性，使得该赖氨酸特定地去保护而不是任 何其它赖氨酸。 方法将树脂(0.09 mmol)置于手动振荡器/过滤装置中并用N-甲基吡 咯烷酮中的4 %肼(4xl0分钟，4x4 ml)处理以除去ivDde基团。用 N-甲基吡咯烷酮(3x4ml)洗涤树脂。将十八烷二酸单-(2, 5-二氧-吡咯烷酮-l-基)酯)(相对于树脂4 mol当量)溶解于DMF (4 ml)中。 将该溶液加入至树脂并加入二异丙基乙胺(相对于树脂8 mol当量)。 在室温下摇动树脂24小时。用N-甲基吡咯烷酮(4x4 ral)和DCM(4 x4 ml)洗涤树脂。在室温下，通过用三氟乙酸、水及三异丙基硅烷 的混合物(92.5:5.0:2.5 4 ml )搅拌180分钟将肽从树脂裂解。过滤 裂解混合物并用40 ml乙醚沉淀出肽粗产物并用45 ml乙醚将其洗涤3 次。在装填有7ia C-18硅石的20mmx 250腿柱上通过制备级HPLC纯化 该肽粗产物。将肽粗产物溶解于5 ml水中50 °/。乙酸中，用仏0稀释至20 ml并将其注射至柱上，随后将该柱在RT下用25-65 %的梯度(在含有O. 1 % TFA的水中的CH3CN)以20 ml/分钟洗脱40分钟。收集含有肽的级分。 用水稀释洗脱物后冻干纯化的肽。 HPLC (方法B4) : RT-9. 94分钟(91 %) LCMS: m/z = 1232 (MH33+)计算值(MH +) - 1232N-s26- (19-羧基十九烷酰)-[Aib8， Arg34] GLP-1- (7-37) -肽如实施例l并依照"合成法"制备。HPLC(方法B4): RT-10. 42分钟(91 % )LCMS: m/z = 1242 (MH33+)计算值(MH +) = 1242实施例3实施例2 N-e26- (4- {[N- (2-羧乙基)-N- (15-羧基十五烷酰)氨基]甲基}苯甲 酰)[Arg34]GLP-l-(7-37)-肽加入DIPEA (7 pl)和O-(l-琥珀酰亚胺基)-N，N，r ，r-四曱基 脲六氟磷酸(TSTU， 17 mg， 56 pl)至THF (1 ml )中的4-(N-(2-(叔 丁氧基羰基)乙基)-N- (15-(叔丁氧基羰基)十五烷酰)氨甲基)苯曱酸 (36 mg， 60 ;imol)溶液中。在室温下搅拌1小时后，用THF ( 1 ml ) 稀释该混合物，并且加入1 ml得到的溶液至水(5 ml )中的 [Arg34]GLP-l-(7-37)肽(约100mg)和DIPEA (103 jil)溶液中。在 0.5 h后，加入更多的THF-酰化剂溶液(0. 4 ml)。在室温下搅拌总 共1.5 h后，过滤反应混合物并应用于制备级HPLC ( 35-55 % MeCN/55-35 °/。水/含有1 % TFA的10 %水的梯度洗脱)。合并含有期 望产物的级分并冻干。然后在室温下用25 ml TFA和水的混合物(95/5 vol)处理产物15分钟，将其浓缩，并通过HPLC再次纯化。得到了 15.4 mg标题化合物。HPLC (方法B4 ) : RT= 9. 41分钟(99 % )LCMS: m/z=1287 ( MH33+)。计算值(MH33+) :1 2 8 7实施例4N-s26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰氨基)-4 (S)-羧 基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰 基][Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37)肽。 通过标准的Fmoc-固相肽合成制备[Aib8, Arg34] GLP-l-(7-37)-肽并通过制备级HPLC纯化。将[Aib8， Arg34]GLP-l-(7-37)-肽溶解 于水(15 ml )中并加入DIPEA ( 50 ul )。将17-((S)-l-叔丁氧基羰 基-3- {2- [2- ({2- [2- (2， 5-二氧吡咯烷-l-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰)曱氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰)丙基氨基甲酰)十七烷 酸#又丁酯(21mg)溶解于2:1的乙腈/水(1. 5 ml )中并且分批加入。 通过HPLC监控该反应。当不再发现有[Aib8， Arg34]GLP-l-(7-37)-肽时，将反应混合物0/N冻干。将10 ml 90 % TFA/5 % TIS/5 %水加 入至分离的化合物中并保持反应混合物2小时，将其在真空中蒸发， 并与庚烷共蒸发。将剩余的油状产物溶解于含有1 % NH3-aq的15 ml 水中并通过制备级HPLC纯化以产生标题化合物。 HPLC(方法B4): RT=9. 60分钟(100 % ) LCMS: m/z=1372 (MH33+)。计算值(MH33+) :1 37 2N-s26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (19-羧基十九烷酰氨基)-4 (S) -羧 基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰 基][Aib8， Arg34]GLP-l-(7-37)肽。根据下列方法制备肽A.将在Fmoc-Gly-Wang树脂(0. 66 mmol/g Novabiochem)上合成的0. 25 mMol量的结合树脂的肽用于根据制造商 的说明书在ABI433A机器上产生一级序列。除在位置26处使用残基 (FmocLys (Mtt) -OH, Novabiochem)对酸超级敏感外，所有的保护 基团都是对酸敏感的，使得该赖氨酸而不是任何其它赖氨酸能特定地 去保护。
除去Mtt-保护的方法。将树脂(0. 25mmol)置于手动振荡器/过 滤装置中并用DCM中的2 % TFA、 3 % TIS (20 ml， 5-10分钟，重复 6-12次)处理以除去MU基团并用DMF洗涤。继续用方法合成将侧链 连接至赖氨酸残基上，按照路径II,使用适当方法除去Fmoc-保护。 根据该方法进行最终的去保护、HPLC-纯化和HPLC及LC-MS分析。 HPLC (方法B6 ) : RT=34. 56分钟(100 % ) LCMS: m/z-1381.8 ( MH33+)。计算值(M+H+) : 4142.7实施例6<formula>formula see original document page 67</formula>N-s26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰氨基)-4 (S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][3-(4-咪唑基)丙酰基7， Arg34]GLP-1-(7-37)肽如实施例5并依照"合成法"制备。HPLC (方法B6 ) : RT-32. 89分钟(100 % )LCMS: m/z=1362. 3 ( MH33+)。计算值(M+H+) : 4085.6实施例7<formula>formula see original document page 67</formula>N-e26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰氨基)-(羧甲基-氨 基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰 基][Aib8， Arg34]GLP-1-(7-37)肽
如实施例5并依照"合成法"制备。HPLC (方法B6 ) : RT-32. 67分钟(100 % )LCMS: m/z=1367. 3 ( MH33+)。计算值(M+H+) : 4100.6实施例8N-s"- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰氨基)-3 (S)-磺丙酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Aib8，Arg34]GLP-l-(7-37)肽如实施例5并依照"合成法，，制备。HPLC(方法B6): RT=32. 04分钟(100 % )LCMS: m/z=1379.8 ( MH33+)。计算值(M+H+) : 4136.7实施例9N-s26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰氨基)-4 (S)-羧基丁 酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰 基][Gly8， Arg34]GLP-1-(7-37)肽。使用购自Advanced Cheratech的Apex396,通过Fmoc-固相肽合 成从150 mg 2-氯三苯甲基氯树脂(1.4 mmol/g)开始制备[Gly8， Arg34]GLP-l (7-37)肽。将位置26的Lys残基保护为Lys (ivDde), 同时其它氨基酸的官能侧链用标准的对酸敏感的保护基保护。在NMP 中使用3 %肼/3 %哌啶将Lys残基去保护1小时。然后，使用DIC/H0At 将2单位的8-氨基-3, 6-二氧辛酸、y-谷氨酸和十八烷二酸偶联至
连接树脂的肽上。最后用TFA/TIS/H2O/苯曱硫醚(90/5/3/2)使肽去保 护并从树脂裂解。通过LC-MS分离肽。HPLC:在46 %乙腈处洗脱MALDI: 4087 (MH+)实施例10N-s26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰基氨基)-4 (S) -羧基 丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Aib8， Arg34]GLP-l-(7-37)酰胺使用购自Advanced Chemtech的Apex396，通过Fmoc-固相肽合 成从200 mg Tentagel RAM S树脂(0.26 mmol/g )开始制备 [Aib8， 34] GLP-1(7-37) 酰胺。将位置26的Lys残基保护为 Lys(ivDde)，同时其它氨基酸的官能侧链用标准的对酸敏感的保护基 保护。在NMP中使用3 %肼/3 %哌啶将Lys残基去保护1小时。然 后，使用DIC/H0At将2单位的8-氨基-3， 6-二氧辛酸、y-谷氨酸、 十八烷二酸偶联至连接树脂的肽上。最后使用TFA/TIS/H20/苯甲硫醚 (90/5/3/2)将肽去保护并从树脂裂解。通过LC-MS分离肽。HPLC:在49 %乙腈处洗脱MALDI: 4114 (MH+)实施例11N-s26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰基氨基)-4 (S)-羧基 丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰
基][Aib8， Arg34， Pro37] GLP-1-(7-37)酰胺肽在Rink酰胺树脂(0.70 mmol/g Novabiochem)上制备，或如实施 例5并依照"合成法"制备。HPLC(方法B6): RT=32. 13分钟(100 %)(方法A1): RT=44. 33 分钟(98. 4 %)LCMS: m/z=1385.3 ( MH33+)。计算值(M+H+) : 4153.8实施例12Aib8， Lys26 (N-s26- (2- (2- (2- (2- [2- (2- (4-(十五烷酰氨基)-4-羧基丁 酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}), Arg")GLP-l H (7-37)-OHHPLC (方法B6) : RT-30. 41分钟LCMS: m/z = 1362.9 (MH33+)计算值(M+) = 4085.61N-s26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- {[N- (2-羧乙基)-N- (17-羧基十七烷酰) 氨基]甲基}苯甲酰)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基) 乙酰基〗[Aib8， Arg34〗GLP-1(7-37)使用购自Advanced Chemtech的Apex396，通过Fmoc-固相肽合 成从150 mg 2-氯三苯甲基氯树脂(1.4 mmol/g)开始制备[Aib8, Arg34]GLP-1 (7-37)肽。将位置26的Lys残基保护为Lys (ivDde)， 同时其它氨基酸的官能侧链用标准的对酸敏感的保护基保护。在NMP 中使用3 %肼/3 %哌啶将Lys残基去保护1小时。使用DIC/H0At将 2单位的8-氨基-3， 6-二氧辛酸和4 {[ (2-叔丁氧基羰基-乙基)-(17-叔 丁氧基羰基-十七烷酰)-氨基]-曱基}-苯甲酸偶联至连接树脂的肽上。 最后使用TFA/TIS/H20/苯曱硫醚(90/5/3/2)将肽去保护并从树脂裂 解。通过制备级LC-MS分离肽。HPLC:在52 %乙腈处洗脱MALDI: 4191細+)实施例14N- a 7-甲酰基，N- e 26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰氨 基)-4 (S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧 基)乙酰基][Arg"]GLP-l-(7-37)-肽HPLC (方法B6) : RT-32. 6分钟LCMS: m/z = 1377.3 (MH33+)计算值(M+) = 4128.0实施例15N- e 2626- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰氨基)-4 (S) -羧 基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰 基][Aib8， Glu22, Arg34]GLP-1-(7-37)肽。使用购自Advanced Chemtech的Apex396，通过Fmoc-固相肽合 成从150 mg Fmoc-Gly-Wang树脂(0.66 mmol/g)开始制备[Aib8, Glu22, Arg34]GLP-l(7-37)肽。将位置26的Lys残基保护为 Lys(Mtt),同时其它氨基酸的官能侧链用标准的对酸敏感的保护基保 护。在DCM中使用2 % TFA/2 % TIS将Lys残基去保护4 x 5分钟。使 用DIC/H0At将2单位的8-氨基-3， 6-二氧辛酸、y-谷氨酸和十八烷 酸叔丁酯偶联至连接树脂的肽上。最后使用TFA/TIS/H20/苯曱硫醚 (90/5/3/2)将肽去保护并从树脂裂解。通过LC-MS分离肽。HPLC:在50 %乙腈处洗脱MALDI: 4187 (MH+)实施例16N- s 26 {3- [2- (2- {2- [2- (2- {2- [2- (2- [4- (15- (N- ((S) -l ， 3-二羧基 丙基)氨基甲酰)十五烷酰氨基)-(S)-4-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧 基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基} [Aib8, Arg34]GLP-l-(7-37)-肽 方法和分析如实施例3并依照"合成法，，制备。HPLC(方法B4): RT-10. 29分钟(92 % )LCMS: m/z=1450 ( MH33+)。计算值(匪33+) :1 4 5 0实施例17N- s 26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- {[N- (2-羧乙基)-N- (17-羧基十七烷 酰)氨基]甲基}苯甲酰)氨基](4 (S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基] 乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Aib8， Arg34]GLP-l (7-37)使用购自Advanced Chemtech的Apex396，通过Fmoc-固相肽合 成从150 mg Fmoc-Gly-Wang树脂(0.66 mmol/g)开始制备[Aib8，
Arg34]GLP-l(7-37)肽。将位置26的Lys残基保护为Lys (Mtt)，同 时其它氨基酸的官能侧链用标准的对酸敏感的保护基保护。在DCM中 用2 % TFA/2 % TIS将Lys残基保护4 x 5分钟。用DIC/HOU将2单 位的8-氨基-3， 6-二氧辛酸、Y-谷氨酸和4{[(2-叔丁氧基羰基-乙 基)-(17-叔丁氧基羰基-十七烷酰)-氨基]-甲基}-苯甲酸偶联至连接 树脂的肽上。最后使用TFA/TIS/H2O/苯甲硫醚(90/5/3/2)将肽去保护 并从树脂裂解。通过制备级HPLC分离肽。HPLC:在51 %乙腈处洗脱MALDI: 4 320 (MH+)实施例18N- s 26- {(S) -4-羧基-4- ((S) -4-羧基-4- ((S) -4-羧基-4- ((S) -4-羧基 -4- (19-羧基十九烷酰氨基)丁酰基氨基)丁酰基氨基)丁酰基氨基)丁 酰基氨基} [Aib8， Arg34]GLP-l-(7-37)在Liberty Microwave肽合成仪(CEM公司)上用Fmoc化学合成 该肽。该合成在载荷为0. 66 mmol/g的Gly-Wang树月旨(Novabiochem) 上进行，使用4倍过量的氨基酸和DIC/H0At用于偶联。N-端组氨酸是 Boc-保护的并且要修饰的赖氨酸是Mt t-保护的。在合成肽的主链后， 在DCM中用3 %的TFA除去Mtt基团并用标准肽合成方法在Liberty 上构建侧链。在最后的步骤中，将脂肪二酸作为单叔丁酯加入。在用TFA/TIS/水(95: 2. 5: 2. 5)裂解后，通过加入DIPEA将肽溶解 于50 %乙腈中并且在室温下通过7. 8 x 300 mra X-Terra Prep MS C18 10 ^m柱将其在Waters LC-MS系统上纯化。在30 % CH3CN、 0.08 % TFA 下5分钟后(4 ml/分钟)，用30至70 °/。的CH3CN线性梯度洗脱该柱 40分钟。收集含有期望化合物的级分并通过测量280 nm下的UV吸 光度来测定洗脱液中肽的浓度(假定酪氨酸和色氨酸的摩尔消光系数分别为1280和3690 )。通过MALDI确定性质和纯度。在浓度测定后， 将洗脱液以等份分配进可容纳期望量的管形瓶中并通过真空离心干 燥。HPLC:在52 %乙腈处洗脱 MALDI: 4239 (MH+)实施例19N-s 26-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(S)-羧基丁酰基-[Aib8， Arg34]GLP-l-(7-37)-肽方法和分析如实施例4并依照"合成法"制备。HPLC (方法B4) : RT-9. 64分钟(97 %)LCMS: m/z: = 1276 (MH,)，计算值(MH33+)为1276实施例20 。 。N- e 26- {3- [2- (2- {2- [2- (2- {2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰氨 基)-4 (S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙氧基)乙氧基] 乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基} [Aib8， Arg34]GLP-l-(7-37)-肽。 LCMS*: m/z: = 1417 (MH33+)，计算值(MH33+)为1417 *HPLC (在42 。C下使用5——>80%乙腈、85——>10%水和10 %的l.O %三氟乙酸溶液的线性梯度以0. 5 mL/分钟洗脱50分钟。UV检测在 Symmetry300, 5um， 3.9 mm x 150 mm C-18桂柱上于214 nm下进行) 方法B4) : Rt = 32.09分钟(95 %)实施例21^ w —H3CCH3 0 H《H3C CH3N- s 26- {2- (2- (2- (2- [2- (2- (4- (17-羧基十七烷酰氨基)-4-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰 基)}-[Aib8,22,27,3。,35， Arg34， Pro37, Lys26] GLP-1 (7-37)酰胺HPLC (方法B6) : RT=35. 0分钟LCMS: m/z = 1394.0 (MH33+)计算值(M+) = 4180.0实施例22-H-K H3C-R》N- s 26- [2- (2- [2- [4- (21-羧基uneicosanoy 1氨基)-4 (S)-羧基丁 酰基氨基]乙氧基]乙氧基)乙酰基][Aib8, Arg34]GLP-l-(7-37) 使用与实施例19中相同的方法制备。HPLC:在5 3. 4 °/。乙腈处洗脱 MALDI: 4025 (MH+)本发明的其它化合物包括:<formula>formula see original document page 76</formula>N- s 26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (21-羧基uneicosanoyl氨基)-4 (S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰 基][Aib8， Arg34]GLP-l-(7-37)肽。<formula>formula see original document page 76</formula>N-al-曱酰基-N- e 26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (19-羧基十九烷酰氨 基)-4 (S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧 基)乙酰基][Arg34]GLP-1-(7-37)-肽。<formula>formula see original document page 76</formula>
<formula>formula see original document page 77</formula>使用db/db小鼠的药效研究在本发明的一个方面，GLP-1激动剂在以30nmol/kg剂量施用给 db/db小鼠后具有至少24小时的作用持续时间。 效力和作用持续时间在db/db小鼠中测量。8-10周大的雄性db/db小鼠购自丹麦的Taconic。 从到达开始， 在标准条件但是在24 。C下圏养小鼠。每个笼子放置IO只小鼠直到用 于试验，所述的小鼠在正常时日光循环(在上午6时开始光照)下 能够自由摄取标准食物(Altromin, Brogaarden APS，丹麦)和自来 水。每周将小鼠用于l次试验，进行3周。之后，让小鼠安乐死。在1周的适应期后，通过从小鼠的尾部顶端毛细血管取样来测量 血糖。简而言之，将5 jil血液取样于肝素化的玻璃毛细管中并立即 混悬于1.5 ml Eppendorf管中的250 jul EBIO緩冲液(Eppendorf, 德国)中。血糖浓度在EBIO Plus自动分析仪(Eppendorf,德国)上 通过葡萄糖氧化酶法测量。血糖的截断值是10 mM。当评估小鼠时，基本上是，参与试验的 所有42只小鼠具有大于10 mM的血糖值，而且小鼠之间的差异很小。 因此，如果许多小鼠没有严重的糖尿病(尽管某些是)，试验的开始 时间应该延迟一周并且应该测量新的基础血糖值。基于基础血糖值，将小鼠分为7组(n-6)，与组的平均血糖值匹配。在测定基础血糖值的当天，如上面描述的测定早晨值并测定每只 小鼠的基础体重。在0时，在颈部的颈背皮下施用化合物(剂量为约 300 jnl/50 g小鼠)。然后测量一直到48小时的血糖值(在1、 3、 6、 24和48小时时)并测定最后的体重。将所有数据输入Graphpad Prism中计算平均血糖和平均△体重。本发明的一个方面是制备适合每周施用一次的，具有延长的血浆 物。药物动力学特性可以如下面描述地在 迷你猪或家猪中评估。每周施用一次的GLP-1类似物的药物动力学篩选 用于鉴定适合每周施用一次的候选物的GLP-1类似物的药物动力 学篩选在这样的候选物上进行，所述候选物根据该筛选方案显示了十 分有效的降低糖尿病小鼠模型(db/db小鼠)中的葡萄糖的潜力，并 且随后在db/db小鼠模型中具有48小时或更长的持续时间。 初步的筛选药物动力学筛选的第一部分由皮下施用2認ol/kg的单次剂量给 重8-12 kg的三只迷你猪组成。在施用剂量前、注射后0.5、 1、 2、 4、 6、 8、 12、 24、 48、 72、 96和120小时，抽取每只动物的血样。 >使用 pH调节至7. 4的特定稳定緩沖液来稳定所有血样以防止GLP-1类似物 的酶降解，所述的稳定緩沖液由EDTA (二钠)0. 18 M、 Aprotenin 15000 KIE/ml、 Val-Pyr 0.30 raM组成。通过离心(4 °C, 10分钟，1270 G (4000 rpm))收集每种经稳定的血样的血浆，并通过ELISA测定法 分析GLP-1类似物的含量。三种不同的ELISA检测法用于血浆分析 使用抗体组合Fl/Ra2135，以35 pM的检测限度(LOD)和35-30000 pM 动态分析范围检测N端完整的7-37GLP-l分子和N端经酶促降解的 9-37GLP-l分子两者的"Total测定法"。使用抗体组合Fl/Mab26. 1 的"Intact测定法"。该检测法只检测N端完整的7-37GLP-l分子。 LOD是35 pM并且动态分析范围是35-30000 pM。使用抗体组合 F1/GLP162-3F15的"Aib-intact检测法"。该检测法检测GLP-1分 子的Aib稳定的N端，使得能够检测稳定的GLP-1类似物。LOD是45 pM 并且动态分析范围是45-30000 pM。所有的血浆浓度-时间曲线通过非房室模型分析来进行药物动力 学分析。如果数据允许则计算下列药物动力学参数tmax、 Cmax、 AUC、 AUC/Dose、 AUC仏uap。,、 Az、 t1/2、 CL/F、 Vz/F和MRT。第二次篩选药物动力学筛选的第二部分在具有60-70小时或更长的初始终末
半衰期的那些化合物上进行。这次筛选由静脉内和皮下施用单次剂量2 nmol/kg给迷你猪组成，每种施用途径6只。在静脉内和皮下施用 后，血液取样时间分别从0-120小时延长至0-432和0-504小时。这 样作是为了增加药物动力学参数评估值(尤其是终末半衰期、AUC和 推导出的参数清除率以及分布容量)的精确度和准确度，并且是为了 评估皮下施用后的生物利用率。 GLP-1 (AIB8- INTACT)测定法该检测法是将分析物与捕获物和检测抗体同时孵育的双位点测定 法。用即用型化学发光底物使信号最大化。该测定法既不识别内源性GLP-1 ( 7-37 )也不识别经DPPIV裂解 的GLP-1 ( 9-37 )。GLP-1测定法的参照血浆血浆制备。将混合的EDTA血浆在37 。C下孵育4小时以除去痕量的 GLP-1并在孵育后加入缬氨酸Pyrrolidide和抑肽酶。緩沖液包被緩沖液PBS用作包被緩沖液调节至pH 7. 4的10mM磷酸钠和l"raM氯 化钠。洗涤緩冲液含有0. 05 % (v/v)吐温20的PBS 测定緩沖液含有0. 05 % (v/v)吐温20、 10 g/L BSA和10 mg/L抗TNP的PBS。链霉抗生物素蛋白緩沖液含有额外的0. 5 M NaCl的洗涤緩沖液。底物即用型底物SuperSignal EUSA Femto( Pierce, cat. no. 37075 )。 标准品 标准品从0113-0000-0217的25 pM储液制备。将该肽系列稀释 进参照血浆中产生具有30000-10000-3333-1111-370-123-41和0 pM 的终浓度的标准品。在-20 。C下将标准品以100 PL等份存储于 Micronic试管中。测定法步骤在4 。C下用PBS中100 juL 5 pg/mL的单克隆抗体GLPbl-7Fl包 被Crystal 2000微量滴定板(black)过夜。在自动化平板洗涤器(SkanWasher， Skatron)中用洗涤緩沖液洗 涤平板5次并让其保持至少30分钟，用洗涤緩冲液封闭剩余的位点。将20 fiL样品或标准品加入至每个孔中(一式两份)，随后立即 加入100 iaL检测緩沖液中lpg/mL的生物素化GLP162-3F15。 在室 温下将该板在平板振荡器上孵育2小时，随后如先前描述的进行5次 洗涤循环。加入IOO ^L链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液(KPL，编码为 14-30-00， 1:20000于链霉抗生物素蛋白緩沖液中)至每个孔中并在 室温下于平板振荡器上孵育1小时。如先前描述的洗涤平板并在倒空 后加入100 |uL SuperSignal femto。将该板置于振荡器中1分钟并在 Orion Luminometer (Berthold)中测量。将数据传送到MultiCalc 并使用加权的4PL方法计算标准曲线。从标准曲线计算样品浓度。 GLP-1 (TOTAL)测定法该检测法是将分析物与捕获物和检测抗体同时孵育的双位点测定 法。该测定法识别N-端裂解直至GLP-1 ( 12-37)的GLP-l。緩沖液包被緩沖液将PBS用作包被緩沖液调节至pH 7. 4的10mM磷酸钠和l45 mM 氯化钠。洗涤緩沖液含有0. 05 % (v/v)吐温20的PBS 测定緩沖液 含有0. 05 % (v/v)吐温20、 10 g/L BSA和10 mg/L抗TNP的PBS。链霉抗生物素蛋白緩冲液含有额外的0. 5 M NaCl的洗涤緩沖液。底物即用型底物TMB (KemEnTec code 4380A)终止緩沖液4 M H3P04标准品标准品从0113-0000-0217的25 pM储液制备。将该肽系列稀释 进参照血浆中产生具有30000-10000-3333-1111-370-123-41和0 pM 的终浓度的标准品。在-20 。C下将标准品以100 iaL的等份存储于 Micronic试管中。检测法步骤在4 。C下用PBS中100 iliL 5 ^g/mL的单克隆抗体GLPbl-7F1包 被Maxisorp微量滴定板(NUNC)过夜。在自动化平板洗涤器(SkanWasher, Skatron)中用洗涤緩冲液洗 涤平板5次并让其保持至少30分钟，用洗涤緩沖液封闭剩余的位点。将20 样品或标准品加入至每个孔中，随后立即加入100 检测緩沖液中1 pg/mL的生物素化Ra2135。在室温下将板在平板振 荡器上孵育2小时，随后如先前描述地进行5次洗涤循环。将100 链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液(Amersham Bioscinces code RPN4401V， 1: 8000于检测緩冲液)加入至每个孔中 并在室温下于平板振荡器上孵育1小时。如先前描述的洗涤平板并且 在倒空后加入100 nL TMB并在5分钟后用100 ^tL 1^04终止。在Victor Multilabel Reader (Wallac)中测量平板。将数据传 送到MultiCalc并使用加权的4PL方法计算标准曲线。从标准曲线计 算样品浓度。
活体实验方法、血浆分析和药物动力学分析与"初步的筛选"中 描述的一样。药物配制本发明化合物可以如下配制 实施例4的化合物6. 25 mg/ml 丙二醇 14. 0 mg/ml 苯酚5. 5 mg/ml 磷酸盐緩冲液pH 8. 15任选地，化合物在制备之前如PCT/EP2005/055946中描述的可用 热和/或碱处理。
权利要求
1.在相对于序列GLP-1(7-37)(SEQ ID No 1)的位置7和/或8上具有至少一种非蛋白质源性氨基酸残基的修饰的GLP-1类似物，所述的类似物在位置26的赖氨酸残基处用部分进行酰化，并且其中所述的部分包含至少两个酸性基团，其中一个酸性基团在末端连接。
2. 根据权利要求1的GLP-1类似物，其中在位置26连接的部分 包含亲水性连接物。
3. 根据权利要求2的GLP-1类似物，其中所述的亲水性连接物包 含至少5个非氢原子，其中30-50 y。的这些非氢原子是N或0。
4. 根据任一上述权利要求的GLP-1类似物，其中在位置26处连 接的部分包含通过亲水性连接物与肽隔开的白蛋白结合部分。
5. 根据权利要求4的GLP-1类似物，其中白蛋白结合部分是在末 端具有酸性基团的含有4-40个碳原子的直链或支链的亲脂性部分。
6. 根据任一上述权利要求的GLP-1类似物，其中酰化的部分是 B-U，，其中U，选自<formula>formula see original document page 3</formula>m是0、 1、 2、 3、 4、 5或6， n是1、 2或3， s是0、 1、 2或3, t是0、 1、 2、 3或4，p是l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 17、 18、 19、 20、 21、 22或23;并且其中B是选自下列的酸性基团
7.其中1是12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20,GLP-l类似物，所述的类似物是式I (SEQ ID No. 2)的化合物<formula>formula see original document page 3</formula>Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-<formula>formula see original document page 4</formula>Xaa23-Ala-Xaa25-—n ~"Xaa27-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa:<formula>formula see original document page 4</formula>式I其中Xaa,是L-组氨酸、咪唑并丙酰基、a-羟基-组氨酸、D-组氨酸、 脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、p-羟基-组氨酸、高组氨酸、Na-乙酰基-组氨酸、F-曱酰基-组氨酸、a-氟甲基-组氨酸、a-甲基-组氨酸、3-吡啶丙氨酸、2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸Xaas是Ala、 Gly、 Val、 Leu、 Ile、 Thr、 Ser、 Lys、 Aib、 (l-氨 基环丙基)羧酸、(l-氨基环丁基)羧酸、(l-氨基环戊基)羧酸、(l-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸或(l-氨基环辛基)羧酸；Xaa6是Val或Leu;Xaa8是Ser、 Lys或Arg;Xaai9是Tyr或Glir，Xaa2。是Leu或Met;Xaau是Gly、 Glu或Aib;Xaa23是Gln、 Glu、 Lys或Arg;Xaa"是Ala或Val;Xaa27是Glu或LeujXaa3o是Ala、 Glu或Arg'，Xaa33是Val或LysjXaa"是Lys、 Glu、 Asn或ArgjXaa"是Gly或Aib;Xaaw是Arg、 Gly或Lys，或缺失；Xaa"是Gly、 Ala、 Glu、 Pro、 Lys，或缺失； 并且B和U， 一起是酰化的部分，其中U，选自<formula>formula see original document page 5</formula>m是0、 1、 2、 3、 4、 5或6, n是1、 2或3， s是0、 1、 2或3， t是0、 1、 2、 3或4，p是l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16 17、 18、 19、 20、 21、 22或23;并且其中B是选自下列的酸性基团HO其中1是12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20, <formula>formula see original document page 6</formula>m是2、 3、 4或5，n是1或2，s是0、 1或2，t是0、 1、 2或3，p是1、 2、 3、 4、 7、 11或23。
8.根据权利要求6-7的GLP-1类似物，其中U，选自
9.根据权利要求6-8的GLP-1类似物，其中B-U，-是<formula>formula see original document page 7</formula>
10.根据权利要求9的GLP-1类似物，其中 其中1是14、 15、 16、 17或18, p是1、 2、 3、 4或11， s是0、 1或2, t是0或1。
11. 根据权利要求6-10任一项的GLP-1类似物，其中s是l。
12. 根据权利要求6-10任一项的GLP-1类似物，其中1是16。
13. 根据权利要求6-10任一项的GLP-1类似物，其中p是3或4。
14. 根据权利要求6-10任一项的GLP-1类似物，其中n是l。
15. 根据权利要求7-14任一项的GLP-1类似物，其中 Xaa7是His或脱氨基-组氨酸；Xaas是Ala、 Gly、 Val、 Leu、 Ile、 Lys或Aib;Xaai6是Val;Xaa8是SerjXaai9是Tyr;Xaa20是Leu5Xaau是Gly、 Glu或Aib;Xaa23是Gln或Glu;Xaa25是Ala5Xaa27是GlujXaa3。是Ala或GlujXaa"是Val;Xaa34是Lys或Arg'，Xaa^是Gly或Aib;Xaa36是Arg或Lys'，Xaa37是Gly、酰胺或缺失。
16. 根据权利要求15的GLP-1类似物，其中 Xaa7是HisXaa^是Gly或Aib;Xaa"是Val.，Xaa8是Ser;Xaa9是Tyr;Xaa20是Leu5Xaa"是Glu或AibjXaa"是Gln;Xaa25是Ala^Xaa27是Glu.，Xaa3。是Ala;Xaa"是Val;Xaa"是Lys或Arg;Xaa"是Gly或AibjXaa36是Arg;Xaan是Gly。
17. ^4居4又利要求1-15任一项的GLP-1类似物，其中所述的GLP-1 类似物包含在GLP-1 (7-37)序列位置7的N-端L-组氨酸的^^饰。
18. 根据权利要求17的GLP-l类似物，其中所述的GLP-1类似物包 含咪唑并丙酰基7、 a-幾基-组氨酸7或N-甲基-组氨酸7、 D-组氨酸7、 脱氨基-组氨酸7、 2-氨基-组氨酸7、 p-羟基-组氨酸7、高组氨酸7、 Na -乙酰基-组氨酸7、 a-氟曱基-组氨酸7、 a-甲基-组氨酸7、 3-吡咬丙 氨酸7、 2-吡啶丙氨酸7或4-吡啶丙氨酸7。
19. 根据权利要求l-18任一项的GLP-1类似物，其中所述的GLP-1 类似物包含用另一种氨基酸残基对GLP-1 (7-37)序列位置8的L-丙氨酸 的取代。
20. 根据权利要求19的GLP-1类似物，其中所述的GLP-l类似物包 含Aib8、 Gly8、 Val8、 Ile8、 Leu8、 Ser8、 Thr8、 (1-氨基环丙基)羧酸、 (l-氨基环丁基)羧酸、(l-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、 (l-氨基环庚基)羧酸或(l-氨基环辛基)羧酸。
21. 根据权利要求20的GLP-l类似物，其中所述的GLP-1类似物包 含Aib8。
22.根据上述权利要求任一项的GLP-1类似物，其中所述的GLP-1 类似物与GLP-1 (7-37) (SEQ ID No. 1)比较包含不超过15个已4皮交换、 加入或缺失的氨基酸残基。
23.根据权利要求22的GLP-1类似物，其中与GLP-1 (7-37) (SEQ ID No. l)比较有不超过IO个已被交换、加入或缺失的氨基酸残基。
24. 根据权利要求23的GLP-1类似物，其中所述的GLP-1类似物 与GLP-1 (7-37) (SEQ ID No. 1)比较包含不超过6个已被交换、加入 或缺失的氨基酸残基。
25. 根据任意上述权利要求的GLP-1类似物，其中所述的GLP-l 类似物包含不超过3个不是由遗传密码编码的氨基酸残基。
26.根据上述权利要求任意一项的GLP-1类似物，其中所述的 GLP-1类似物只包含一个赖氨酸残基。
27. 根据任意上述权利要求的GLP-1类似物，所述的GLP-1类似物是Aib8, Arg"-GLP-1 (7-37), Aib8'22, Arg34-GLP-1 (7-37)， Arg"-GLP-1 (7-37)，[3-(4-咪唑基)丙酰基7， Arg34]GLP-l-(7-37)肽,GlyS， Arg34-GLP-1 (7-37)，Aib8， Arg34， Pro"-GLP-l (7-37),Aib8'22'27'30'35, Arg34, Pro37- GLP-1 (7-37)酰胺，它们都在位置26由B-U，取代。
28. 根据上述权利要求任意一项的化合物，所述的化合物选自N-s26- (17-羧基十七烷酰)-[Aib8， Arg34] GLP-1- (7-37)-肽，N- s 26- (19-羧基十九烷酰)-[Aib8， Arg34] GLP-l- (7-37)-肽，N- e 26- (4- {[N- (2-羧乙基)-N- (15-羧基十五烷酰)氨基]甲基)苯 曱酰)[Arg34]GLP-l-(7-37)，EGTFTSDVSSYLEGQA A-N^~E F I AWLVRGR G—嗎nh2- HAEGTFTSDVSSYLEG3AA——N ^~~ EF I /V\LVRG R G c。。h <formula>formula see original document page 12</formula>N- s 26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰基氨 基)-4 (S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基) 乙酰基][Aib8， Arg34]GLP-l-(7-37)肽，<formula>formula see original document page 12</formula><formula>formula see original document page 13</formula>
29.用于增加GLP-1类似物在患者中的作用时间的方法，所述方 法的特征是在所述GLP-1类似物位置26的赖氨酸残基上用如在任意上 述权利要求中公开的B-U，酰化所述的GLP-l类似物。
30.用于增加GLP-1类似物在患者中的作用时间至长于约40个小 时的方法，所述方法的特征是修饰GLP-1 (7-37)肽或其类似物的位置7 和8的至少一个氨基酸残基，并且在所述GLP-1类似物的位置26的赖氨 酸残基上，用如任意上述权利要求中公开的B-U，-酰化所述GLP-l类似 物。
31. —种药物组合物，所述的药物组合物包含根据权利要求1-28 任意 一 项的化合物和可药用赋形剂。
32. 根据权利要求31的药物组合物，所述的药物组合物适合肠胃 外施用。
33. 根据权利要求l-28任意一项的化合物在制备药物中的用途。
34. 根据权利要求l-28任意一项的化合物的用途，其中所述的化 合物用于制备治疗或预防高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、1 型糖尿病、肥胖症、高血压、X综合征、血脂障碍、认知障碍、动脉 粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中风、炎性肠综合 征、消化不良和胃溃疡的药物。
35. 根据权利要求l-28任意一项的化合物的用途，其中所述的化 合物用于制备延緩或预防2型糖尿病发展的药物。
36. 根据权利要求l-28任意一项的化合物的用途，其中所述的化 合物用于制备减少食物摄取、减少P-细胞凋亡、增加P-细胞功能和 P -细胞量和/或恢复p -细胞的葡萄糖敏感性的药物。
全文摘要
长效GLP-1化合物及其治疗用途。
文档编号A61K47/48GK101133082SQ200680006674
公开日2008年2月27日 申请日期2006年3月20日 优先权日2005年3月18日
发明者F·Z·多沃尔德, H·斯蒂芬森, J·劳, K·迈德森, P·布洛克, T·K·汉森 申请人:诺和诺德公司