控制脱粒反应和细胞因子产生的药剂的制作方法

专利名称：控制脱粒反应和细胞因子产生的药剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及可控制脱粒反应和细胞因子产生的药剂，特别是涉及可 产生细胞因子的细胞(例如肥大细胞)相关。
背景技术：
目前的抗过敏药剂包括抗组胺剂、具有免疫抑制作用的类固醇等。 抗组胺剂抑制从肥大细胞之类的效应细胞所释放的组胺与其在靶细胞 上表达的特异受体的相互作用。但效应细胞释放的化学介导物不局限于组胺，而是包括5-羟色胺，前列腺素等。抗组胺剂并不能对这些化学介导物有作用。另一方面，已知虽然类固醇具有较强的免疫抑制和抗炎症 活性，而且经常被用作抗过敏药物，但经常观察到机会感染之类的副作用。已知肥大细胞具有含组胺和细胞因子之类的化学介导物的颗粒 体，肥大细胞中的脱粒反应在花粉病、支气管哮喘和遗传性过敏性皮炎 等过敏性疾病、及包括自身免疫性疾病在内的多种炎症性疾病中具有重 要作用。因此，抑制脱粒反应是治疗这些疾病的有效方法。通过稳定肥大细胞的细胞膜来抑制由于脱粒反应而导致的化学介导物释放的药剂包括Intal (色甘酸钠)、Rizaben (曲尼司特)等，这 些药剂已在临床应用中作为抗过敏药剂。脱粒反应是由IgE受体通过信 号传导而引起的。由于该过程依赖于钙离子，因此已尝试通过控制细胞 内钙浓度来控制脱粒反应。但由于钙离子在机体的任何情况下都具有重 要作用，因此控制细胞内钙浓度可能会对其它生物学功能产生影响。关于脱粒反应和抗过敏药剂的常规技术可参见Turner H. & Kinet JP. Signalling through the high-affinity IgE receptor Fc epsilon RI. Nature 402, B24-30 (1999),及Blank U, Rivera J. The ins and outs of IgE-dependent mast-cell exocytosis. TRENDS m Immunology 25, 266-273 (2004)。关于月巴 大细胞中细胞因子产生的常规技术可参见Burd PR， Rogers HW, GordonLR, Martin CA, Jayaraman S, Wilson SD, Dvorak AM, Galli SJ, Dorf ME. Interleukin 3-dependent and -independent mast cells stimulated with IgE and antigen express multiple cytokines.丄Exp. Med. 170, 240-257 (1989), 及Song JS， Haleem-Smith H, Arudchandran R, Gomez J, Scott PM, Mill JF, Tan TH, Rivera J. Tyrosine phosphorylation of Vav stimulates IL-6 production in mast cells by a Rac/c-Jun N-terminal kinase-dependent pathway. J. Immunology. 163， 802-810 (1999)。发明概述本发明的 一个目的是提供控制脱粒反应和细胞因子产生的新型药 剂，具体地，提供可控制组胺这样的化学介导物的释放的药剂，和/或可 控制如肥大细胞这样的细胞中细胞因子产生的药剂。另外，本发明的一 个目的是提供控制脱粒反应的药剂和/或控制细胞因子产生的药剂在过 ^:性疾病和炎症性疾病中的用途。为了解决这一技术问题，本发明人进行了深入的研究，发现可通过 控制细胞内锌离子浓度而控制脱粒反应和细胞因子产生。另外，本发明 人验证了通过控制锌离子浓度而控制脱粒反应是可逆的，从而完成了本 发明。即，本发明如下所述。[l]一种控制脱粒反应的药剂，其中包括作为活性组分的、可控制细 胞内锌离子浓度的物质。[2 ]如上[1 ]所述的可控制脱粒反应的药剂，其中可控制锌离子浓度的物质是锌离子。[3]如上[2]所述的可控制脱粒反应的药剂，其中锌离子是通过锌离子 载体引入细胞中的。[4]如上[1]所述的可控制脱粒反应的药剂，其中可控制锌离子浓度的物质是锌离子螯合剂。[5]如上[4]所述的可控制脱粒反应的药剂，其中锌离子螯合剂是选自 2,3_二巯基-1-丙磺酸(DMPS) 、 N,N,N',N'-四(2-吡啶基甲基)乙二胺 (TPEN)、乙二胺四乙酸(EDTA)、和N-(6-曱氧基-8-喹啉基)-对曱苯 磺酰胺(TSQ)中的至少一种。[6]如上[1 ]所述的可控制脱粒反应的药剂，其中可控制锌离子浓度的 物质是可调控需要锌离子的蛋白质的表达和/或功能的物质。[7]如上[6]所述的可控制脱粒反应的药剂，其中需要锌离子的蛋白质是选自Raf-l 、 PKCa、 GEF-H1 、 HDAC、 SQSTMl 、泛素蛋白质连4矣酶 E3、泛素交联酶E2、金属硫蛋白质、磷酸酶、Snail、 TRAF6、桩蛋白 质、斑联蛋白质和Jade-l中的至少一种。[8]如上[1]所述的可控制脱粒反应的药剂，其中可控制锌离子浓度的物质是可调控锌离子转运蛋白质的表达和/或功能的物质。[9]如上[8]所述的可控制脱粒反应的药剂，其中锌离子转运蛋白质是 选自包括LIV家族和人CDFs在内的人ZIPs中的至少一种。[10]如上[1]到[9]任一项中所述的可控制脱粒反应的药剂，其中细 胞是选自嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、肥大细胞、自然杀伤 细胞、自然杀伤T细胞、细胞毒T细胞和血小板中的至少一种。[11]如上[10]所述的可控制脱粒反应的药剂，其中细胞是肥大细胞。[12 ]—种控制细胞因子产生的药剂，其中包括作为活性组分的可控 制细胞内锌离子浓度的物质。[13]如上[12]所述的可控制细胞因子产生的药剂，其中可控制锌离子 浓度的物质是锌离子。[14]如上[13]所述的可控制细胞因子产生的药剂，其中锌离子是通过 锌离子载体引入细胞中的。[15]如上[12]所述的可控制细胞因子产生的药剂，其中可控制锌离子浓度的物质是锌离子螯合剂。[16]如上[]5]所述的可控制细胞因子产生的药剂，其中锌离子螯合剂 是选自2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS) 、 N,N,N',N'-四(2-吡啶基甲基) 乙二胺(TPEN)、乙二胺四乙酸(EDTA)、和N-(6-甲氧基-8-喹啉基)-对甲苯磺酰胺(TSQ)中的至少 一种。[17]如上[12]所述的可控制细胞因子产生的药剂，其中可控制锌离子浓度的物质是可调控需要锌离子的蛋白质的表达和/或功能的物质。[18]如上[17]所述的可控制细胞因子产生的药剂，其中需要锌离子的蛋白质是选自Raf-l、 PKCa、 GEF-H1、 HDAC、 SQSTM1、泛素蛋白质连接酶E3、泛素交联酶E2、金属硫蛋白质、磷酸酶、Snail、 TRAF6、桩蛋白质、斑联蛋白质和Jade-1中的至少 一种。[19]如上[12]所述的可控制细胞因子产生的药剂，其中可控制锌离子浓度的物质是可调控锌离子转运蛋白质的表达和/或功能的物质。[20]如上[19]所述的可控制细胞因子产生的药剂，其中锌离子转运蛋 白质是选自包括LIV家族和人CDFs在内的人ZIPs中的至少一种。[21]如上[12]到[20]任一项中所述的可控制细胞因子产生的药剂,其 中细胞是选自嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、肥大细胞、自然 杀伤细胞、自然杀伤T细胞、细胞毒T细胞和血小板中的至少一种。[22]如上[21 ]所述的可控制细胞因子产生的药剂，其中细胞是肥大细胞。[23]—种预防和/或治疗过敏性疾病和/或炎症性疾病的药物，它含有 如上[l]到[ll]任一项中所述的控制脱粒反应的药剂，或如上[12]到[22]任一项中所述的控制细胞因子产生的药剂。[24]—种预防和/或治疗过敏性疾病和/或包括自身免疫性疾病在内 的炎症性疾病的药物，它含有作为活性组分的可控制细胞内锌离子浓度 的物质。[25]如上[24]所述的预防性和/或治疗性药物，其中可控制锌离子浓 度的物质是锌离子。[26]如上[25]所述的预防性和/或治疗性药物，其中锌离子是通过锌离子载体引入细胞中的。[27]如上[24]所述的预防性和/或治疗性药物，其中可控制锌离子浓度的物质是锌离子螯合剂。[28]如上[27]所述的预防性和/或治疗性药物，其中锌离子螯合剂是 选自2>二巯基-1-丙磺酸(DMPS) 、 N，N,N',N'-四(2-吡啶基曱基)乙 二胺(TPEN)、乙二胺四乙酸(EDTA)、和N-(6-甲氧基-8-喹啉基)-对曱苯磺酰胺(TSQ)中的至少 一种。[29]如上[24]所述的预防性和/或治疗性药物，其中可控制锌离子浓 度的物质是可调控需要锌离子的蛋白质的表达和/或功能的物质。[30]如上[29]所述的预防性和/或治疗性药物，其中需要锌离子的蛋 白质是选自Raf-l、 PKCa、 GEF-H1、 HDAC、 SQSTM1、泛素蛋白质连 接酶E3、泛素交联酶E2、金属硫蛋白质、磷酸酶、Snail、 TRAF6、桩 蛋白质、斑联蛋白质和Jade-l中的至少一种。[31 ]如上[24]所述的预防性和/或治疗性药物，其中可控制锌离子浓 度的物质是可调控锌离子转运蛋白质的表达和/或功能的物质。[32]如上[31]所述的预防性和/或治疗性药物，其中锌离子转运蛋白质是选自包括LIV家族和人CDFs在内的人ZIPs中的至少一种。[33]如上[24]到[32]任一项中所述的预防性和/或治疗性药物，其中细 胞是选自嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、肥大细胞、自然杀伤 细胞、自然杀伤T细胞、细胞毒T细胞和血小板中的至少一种。[34]如上[33]所述的预防性和/或治疗性药物，其中细胞是肥大细胞。[35]—种控制脱粒反应的方法，它包括在体外控制细胞内锌离子浓度。[36]如上[35]所述的方法，其中锌离子浓度是通过锌离子控制的。 [37]如上[36]所述的方法，其中锌离子是通过锌离子载体引入细胞中的。[38]如上[35]所述的方法，其中锌离子浓度是通过锌离子螯合剂控制的。[39]如上[38]所述的方法，其中锌离子螯合剂是选自2，3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS) 、 N，N,N',N'-四(2-吡咬基曱基)乙二胺(TPEN)、乙 二胺四乙酸(EDTA)、和N-(6-曱氧基-8-喹啉基)-对曱苯磺酰胺(TSQ)中的至少一种。[40]如上[35]所述的方法，其中锌离子浓度是通过调控需要锌离子的 蛋白质的表达和/或功能控制的。[41]如上[40]所述的方法，其中需要锌离子的蛋白质是选自Raf-l、 PKCa、 GEF-H1、 HDAC、 SQSTM1、泛素蛋白质连接酶E3、泛素交联 酶E2、金属硫蛋白质、磷酸酶、Snail、 TRAF6、桩蛋白质、斑联蛋白 质和Jade-l中的至少一种。[42]如上[35]所述的方法，其中锌离子浓度是通过调控锌离子转运蛋 白质的表达和/或功能控制的。[43]如上[42]所述的方法，其中锌离子转运蛋白质是选自包括LIV 家族和人CDFs在内的人ZIPs中的至少一种。[44]如上[35]到[43]任一项中所述的方法，其中细胞是选自嗜中性粒 细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T 细胞、细胞毒T细胞和血小板中的至少一种。[45]如上[44]所述的方法，其中细胞是肥大细胞。[46]—种控制细胞因子产生的方法，它包括在体外控制细胞内锌离子浓度。[47]如上[46]所述的方法，其中锌离子浓度是通过锌离子控制的。[48]如上[47]所述的方法，其中锌离子是通过锌离子载体引入细胞中的。[49]如上[46]所述的方法，其中锌离子浓度是通过锌离子螯合剂控制的。[50]如上[49]所述的方法，其中锌离子螯合剂是选自2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS) 、 N,N,N',N'-四(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN )、乙 二胺四乙酸(EDTA)、和N-(6-甲氧基-8-喹啉基)-对甲苯磺酰胺(TSQ)中的至少一种。[51]如上[46]所述的方法，其中锌离子浓度是通过调控需要锌离子的 蛋白质的表达和/或功能控制的。[52]如上[51]所述的方法，其中需要锌离子的蛋白质是选自Raf-l、 PKCoc、 GEF-H1、 HDAC、 SQSTM1、泛素蛋白质连接酶E3、泛素交联 酶E2、金属硫蛋白质、磷酸酶、Snail、 TRAF6、桩蛋白质、斑联蛋白 质和Jade-1中的至少一种。[53]如上[46]所述的方法，其中锌离子浓度是通过调控锌离子转运蛋 白质的表达和/或功能控制的。[54]如上[53]所述的方法，其中锌离子转运蛋白质是选自包括LIV 家族和人CDFs在内的人ZIPs中的至少 一种。[55]如上[46]到[54]任一项中所述的方法，其中细胞是选自嗜中性粒 细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T 细胞、细胞毒T细胞和血小板中的至少一种。[56]如上[55]所述的方法，其中细胞是肥大细胞。[57]—种筛选具有控制脱粒反应作用的化合物的方法，它包括测定 细胞内锌离子浓度。[58]如上[57]所述的筛选方法，其中细胞是选自嗜中性粒细胞、嗜曙 红细胞、嗜石威细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、细胞 毒T细胞和血小板中的至少一种。[59]如上[58]所述的筛选方法，其中细胞是肥大细胞。[60] —种筛选具有控制细胞因子产生的化合物的方法，它包括测定 细胞内锌离子浓度。[61]如上[60]所述的筛选方法，其中细胞是选自嗜中性粒细胞、嗜曙 红细胞、嗜碱细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、细胞 毒T细胞和血小板中的至少 一种。[62]如上[61]所述的筛选方法，其中细胞是肥大细胞。[63]—种控制脱粒反应的方法，它包括给药有效剂量的可控制细胞 内锌离子浓度的物质。[64]—种可控制细胞内锌离子浓度的物质在产生可控制脱粒反应的 药剂中的用途。[65]—种控制细胞因子产生的方法，它包括给药有效剂量的可控制 细胞内锌离子浓度的物质。[6 6 ]—种可控制细胞内锌离子浓度的物质在产生可控制细胞因子产 生的药剂中的用途。[67]—种预防和/或治疗过敏性疾病和/或包括自身免疫性疾病在内 的炎症性疾病的方法，它包括给药有效剂量的可控制细胞内锌离子浓度 的物质。[68] —种可控制细胞内锌离子浓度的物质的在产生预防和/或治疗 过敏性疾病和/或包括自身免疫性疾病在内的炎症性疾病的药剂中的用途。附图简要描述

图1所示的是锌离子螯合剂(TPEN)对抗原刺激依赖的化学介导 物(P-己糖胺酶)从肥大细胞中释放(脱粒)的作用。图2所示的是锌离子螯合剂(TPEN)对抗原刺激依赖的化学介导 物(P-己糖胺酶)从肥大细胞中释放(脱粒)的作用可通过增强锌离子 的引入而恢复。图3所示的是锌离子螯合剂(TPEN)对肥大细胞中的细胞因子产 生的作用。上图所示的是TPEN对IL-6产生的作用，下图所示的是对 TNF-oc产生方面的作用。图4所示的是锌离子螯合剂(TPEN)在I型过敏(被动皮肤过敏) 应答方面的作用。实现发明的优选方式本发明中，"控制锌离子浓度"不仅是指使细胞内锌离子浓度(量) 增加或降低，而且也指可最终诱导与细胞内锌离子浓度增加或降低而《I 起的相同现象的作用，在这种情况下，该用语不受细胞内锌离子浓度水 平的限制。本发明中，作为控制锌离子浓度的靶细胞是可释放如组胺这 样的炎症性化学介导物的细胞和/或可产生细胞因子的细胞，例如嗜中性 粒细胞、嗜曙红细胞、嗜碱粒细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、自然杀 伤T细胞、细胞毒T细胞和血小板等。优选地，细胞是肥大细胞。在这 里，作为这种控制的靶的细胞有时为了方便称为"靶细胞"。本发明中，"细胞因子"通常是指在过量产生或释放时可诱导多种 过敏性疾病和多种包括自身免疫性疾病在内的炎症性疾病的分子，细胞因子包括白介素(IL) -1、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL画5、 IL-6、 IL-IO、 IL-12、 IL-13、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子-oc (TNF-a)、转化生长因子-(3 ( TGF-(3 )、 干扰素-Y (IFN-y)、巨噬细胞集落刺激刺激因子(M-CSF)、单核细胞 趋化蛋白质(MCP-1) 、 MIPI(3、 MIPIa、白血病抑制因子(LIF)等。"可控制细胞内锌离子浓度的物质"包括"锌离子"，"锌离子螯 合剂"、"锌离子离子载体"、"调控需要锌离子的蛋白质的表达和/ 或功能的物质"、"调控锌离子转运蛋白质的表达和/或功能的物质"等。"锌离子"和"锌离子载体"可通过增加其浓度而直接增加靶细胞的细胞内锌离子浓度。"调控需要锌离子的蛋白质的表达和/或功能的物质" 和"调控锌离子转运蛋白质的表达和/或功能的物质"可在靶细胞脱粒反 应中和/或细胞因子产生中，通过调控需要锌离子的蛋白质的表达和/或 功能或调控锌离子转运蛋白质的表达和/或功能而诱导与增加或降低细 胞内锌离子浓度相同的现象。即，它们可以起间接控制锌离子的作用。 当"调控需要锌离子的蛋白质的表达和/或功能的物质"或"调控锌离子 转运蛋白质的表达和/或功能的物质"是指通过启动表达或功能而调控的 物质时，细胞对锌离子的反应性可被增强，当物质是指通过抑制表达或 功能而调控的物质时，细胞对锌离子的反应性可被抑制。即，在本发明 中，"控制，，同时指正向和反向调控。"锌离子"通过锌离子载体导入靶细胞中。即，锌离子以与锌离子 载体形成复合物的形式导入到靶细胞中。锌离子载体包括多种本领域常 用的化合物，优选地是那些已商品化的物质。例如，2-巯基吡啶氧化锌、杂环胺、二硫代氨基曱酸盐、维生素等。"锌离子螯合剂"是可与锌离子在靶细胞中形成复合物从而可除去细胞中锌离子的物质，包括，例如，2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS)、 N,N,N',N'-四(2-吡咬基甲基)乙二胺(TPEN )、乙二胺四乙酸(EDTA )、 和N-(6-曱氧基-8-喹啉基)-对曱苯磺酰胺(TSQ)等。它们都是已商品化 的。在本发明的控制脱粒反应的药剂和控制细胞因子产生的药剂、以及防和/或治疗药物'(此后4时简称为:;防性和/或治疗';l药物:，'')中，、均含有作为活性成分的、用作调控锌离子浓度的物质的锌离子螯合剂， 其在每种药剂或药物中的量被适当确定在可对细胞内锌离子浓度进行 控制的范围内。其中可包括一种或多种类型的锌离子螯合剂。当包括两 种或多种类型的锌离子螯合剂时，其量根据其类型而适当设定。"调控需要锌离子的蛋白质的表达和/或功能的物质"不受其作用机 制特别限定，只要最终可调控需要锌离子的蛋白质的表达和/或功能即 可，调控可以是在基因水平或蛋白质水平。基因水平的调控包括转录调 控、基因表达调控等。蛋白质水平的调控包括代谢调控、磷酸化、去磷 酸化、糖基化、脂化、与锌形成配位键、降解、泛素化、乙酰化等。"需 要锌离子的蛋白质"是在靶细胞的脱粒反应和/或细胞因子产生中其功能 表达需要锌的蛋白质，包括，例如，具有锌指的蛋白质、具有RING指 的蛋白质、具有LIM结构域的蛋白质、具有PHD锌指的蛋白质等。锌 指是具有独特的核酸结合能力的元件，仅通过如半胱氨酸和组氨酸这样 的氨基酸与锌配位而形成更高级结构。例如，具有锌指的蛋白质可由转 录因子Snail、 PKCa、 GEF-H1、 HDAC、 SQSTM1等来作为示例，其中 Snail在称为上皮细胞间质转化现象(其中通常互相紧密贴附的细胞通过 解除与临近细胞的贴附而获得运动，并在人和其它生物发育早期的形态 发生时期以及在伤口愈合和癌症转移等过程中迁移到其它位置的现 象)中是主调控子。RING指可被视为锌指的变种，认为它可参与蛋白 质-蛋白质相互作用。报道的具有RING指的蛋白质包括那些具有泛素蛋 白质连接酶E3活性的蛋白质、那些具有泛素交联酶E2结合活性的蛋白 质、及那些具有TRAF6 (TNFoc信号分子)结合活性的蛋白质。LIM结 构域由60个氨基酸组成，其中6个半胱氨酸和1个组氨酸的位点是保 守的。虽然这种结构域在结构上与锌指非常相似，但其DNA结合活性是未知的。它也具有作为介导与PKC结合的结构域的功能。具有LIM结构域的蛋白质包括参与细胞骨架控制的桩蛋白质、斑联蛋白质等。PHD锌指是核蛋白质中类似锌指的结构域，参与染色体介导的转录调 控，可能具有DNA结合能力。具有PHD锌指的蛋白质包括参与组蛋白 质乙酰化的Jade-l等。"调控需要锌离子的蛋白质的表达和/或功能的物质"可以是已知的 化合物或将来开发的新型化合物。可以是低分子量化合物或高分子量化 合物。在本文中，低分子量化合物是分子量小于约3000的化合物，它 包括，例如，通常可作为药剂组分的有机化合物及其衍生物和无机化合质、天然产生的化合物及其衍生物、如启动子这样的小核酸分子、多种 金属等，以及所需的可作为药剂的有机化合物及其衍生物和核酸分子。 高分子量化合物是指分子量不小于约3000的化合物，包括，例如，蛋 白质、多核酸、多糖及其组合，优选地是蛋白质。这些低分子量或高分 子量化合物，如果它们是已知的，则是已商品化的，或根据相关的报道 文献通过例如收集、产生和纯化步骤而获得。这些化合物可以是天然存 在的或通过基因工程制备的，或者也可以通过半合成等方式获得。具体 地，需要锌离子的蛋白质Snail的表达通过TGF-(3或FGF而被MAPK调 控(Peinado, H., Quintanilla, M. & Cano, A. Transforming growth factor beta-l induces snail transcription factor in epithelial cell lines: mechanisms for epithelial mesenchymal transitions. JL Biol. Chem. 278, 21113-23 (2003))。另外，Snail可被锌离子转运蛋白质LIV1激活(如下所述) (Yamashita， S., Miyagi, C., Fukada, T., Kagam， N., Che, Y.-S. & Hirano， T. Zinc transporter LIVI controls epithelial-mesenchymal transition in zebrafish gastmla organizer. Nature 429, 298-302 (2004))。在Jirakulaporn T, Muslin A丄Cation diffusion facilitator proteins modulate Raf-1 activity. J. Biol. Chem. 279, 27807-15 (2004), Krendel M, Zenke FT, Bokoch GM. Nucleotide exchange factor GEF-H1 mediates cross-talk between microtubules and the actin cytoskeleton. Nature Cell Biology 4, 294-301 (2002), Korichneva I, Hoyos B, Chua R, Levi E, Hammerling U. Zinc release from protein kinase C as the common event during activation by lipid second messenger or reactive oxygen.丄Biol. Chem. 277, 44327-31(2002)， Haase H, Maret W. Intracellular zinc fluctuations modulate protein tyrosine phosphatase activity in insulin/insulin-like growth factor-1 signaling. Exp. Cell Research 291, 289-298 (2003)和Seikagaku Jiten (3rd ed.), Tokyo Kagaku Dozin Co., Ltd., pp.1393 (1998)中分别描述了关于 Rafl、 GEF-H1、 PKCot磷酸酶和金属硫蛋白质和其它需要锌离子的蛋白 质的详纟田情况。在Kobayashi N, Kadono Y, Naito A, Matsumoto K, Yamamoto T， Tanaka S, Inoue J. Segregation of TRAF6-mediated signaling pathways clarifies its role in osteoclastogenesis. The EMBO丄20, 1271-1280 (2001)， Brown MC, Perrotta JA, Turner CE. Identification of LIM3 as the principal determinant of paxillin focal adhesion localization and characterization of a novel motif on paxillin directing vinculin and focal adhesion kinase bmdmg. J. Cell Biol. 135, 1109-1123 (1996), Sadler I, Crawford AW, Michelsen JW, Beckerle MC. Zyxm and cCRP: two interactive LIM domain proteins associated with the cytoskeleton. J. Cell Biol. 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Cell 115， 727-738 (2003)中分别描述了关于SQSTM1和HDAC的详细情况。"调控锌离子转运蛋白质的表达和/或功能的物质"不受其作用机制 的特别限定，只要最终可调控锌离子转运蛋白质的表达和/或功能即可， 调控可以是基因水平或蛋白质水平的。基因水平的调控包括转录调控、 基因表达调控等。蛋白质水平的调控包括代谢调控、磷酸化、去磷酸化、 糖基化、脂化、与锌形成配位键、降解、泛素化、乙酰化等。"锌离子 转运蛋白质"包括，例如，包含LIV家族(例如BAB70848、 hZip4、 BIGM103 、 KIAA0062 、 KIAA1265 、 hLiv-l 、 AAH08853 、 hKE4 、 XP 208649、 hZIP1、 hZIP2、 hZIP3、 BAA92100、 BAC04504 )、人CDFs(例如hZnt-5、 hZnt-7、 hZnt-l、 hZnt-6、 hZnt-3、 hZnt-2、 hZnt-8、 hZnt陽4、 hZnt-3、 hZnt-9)等在内的人ZIPs。 LIV1最初被鉴定为雌激素控制的乳 腺癌蛋白质，最近发现它属于称为LZT (ZIP锌离子转运蛋白质的LIV 超家族)的ZIP锌离子转运蛋白质家族(Zrt-、 Irt-类似蛋白质)(Taylor, K. M. & Nicholson, R. I. The LZT proteins; the LIV-1 subfamily of zinc transporters. Biochim. Biophys. Acta 1611, 16-30 (2003)),作为锌离子转 运蛋白质发挥作用(Taylor, K. M., Morgan, H. E., Johnson, A., Hadley, L. J. & Nicholson, R. I. Structure-function analysis of LIV-1, the breast cancer-associated protein that belongs to a new subfamily of zinc transporters. Biochem. J. 375, 51-9 (2003))。另外，也包括CDF (阳离子扩散促进器) 等。例如，锌离子转运蛋白质LIVI的表达由STAT3调控(Yamashita, S., Miyagi， C., Fukada, T., Kagara, N., Che, Y.-S. & Hirano, T. Zinc transporter LIVI controls epithelial-mesenchymal transition in zebrafish gastrula organizer. Nature 429, 298-302 (2004))。"调控锌离子转运蛋白质的表达和/或功能的物质"可以是已知的化 合物或将来开发的新型化合物。可以是低分子量化合物或高分子量化合 物。在本文中，低分子量化合物是分子量小于约3000的化合物，它包 括，例如，通常可作为药剂组分的有机化合物及其衍生物和无机化合质、天然产生的化合物及其衍生物、如启动子这样的小核酸分子、多种 金属等，以及所需的可作为药剂的有机化合物及其衍生物和核酸分子。 高分子量化合物是指分子量不小于约3000的化合物，包括，例如，蛋 白质、多核酸、多糖及其组合，优选地是蛋白质。这些低分子量或高分 子量化合物，如果它们是已知的，则是已商品化的，或根据相关的报道 文献通过例如收集、产生和纯化步骤而获得。这些化合物可以是天然存 在的或通过基因工程制备的，或者也可以通过半合成等方式获得。由于锌离子转运蛋白质LIVI增强了需要锌离子的蛋白质Snail的活 性(具体地为抑制子活性)(Yamashita, S., Miyagi, C., Fukada, T., Kagara, N., Che, Y.-S. & Hirano， T. Zinc transporter LIVI controls epithelial-mesenchymal transition in zebrafish gastrula organizer. Nature 429, 298-302 (2004)),本发明中的"调控需要锌离子的蛋白质的表达和/或功能的物质"的例子包括以下(1) 根据以下a)到d)中任一项的DNA:a) 编码具有SEQ ID NO: 2、 4或6中所述的氨基酸序列的蛋白质 (LIV1蛋白质)的DNA;b) 由SEQ ID NO: 1、 3或5中所述序列所组成的DNA(LIV1基因)；c) 编码下述的蛋白质(与LIV1类似的蛋白质)的DNA，所述的蛋 白质具有SEQIDNO: 2、 4或6中所述的氨基酸序列，并在其氨基酸序 列中含有一个或多个氨基的酸替代、缺失、插入和/或增加；d) 与SEQIDNO: 1、 3或5中所述序列在严格条件下杂交的DNA;(2) 插入了以下a )到d )任一项中的DNA的载体a) 编码具有SEQ ID NO: 2、 4或6中所述的氨基酸序列的蛋白质的 DNA;b) 由SEQIDNO: 1、 3或5中所述序列所组成的DNA;c) 编码下述蛋白质的DNA，所述的蛋白质具有SEQIDNO: 2、 4或 6中所述的氨基酸序列，并在其氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸的 替代、缺失、插入和/或增加；d) 与SEQIDNO: 1、 3或5中所述序列在严格条件下杂交的DNA;(3) 由以下a)到d)任一项中的DNA编码的蛋白质a) 编码具有SEQ ID NO: 2、 4或6中所述的氨基酸序列的蛋白质的 DNA;b) 由SEQIDNO: 1、 3或5中所述序列所组成的DNA;c) 编码下述蛋白质的DNA,所述蛋白质具有SEQ ID NO: 2、 4或6 中所述的氨基酸序列，并在其氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸的替 代、缺失、插入和/或增加；d) 与SEQIDNO: 1 、 3或5中所述序列在严格条件下杂交的DNA;(4) 其耙序列为由SEQ ID NO: ]、 3或5中所述序列所组成的DNA 的反义寡核苷酸；(5) 具有与由SEQ ID NO: 1、 3或5中所述序列所组成的DNA部分 相同或相似的双链RNA;(6) 针对具有SEQIDNO:2、 4或6中所述的氨基酸序列的蛋白质的 抗体；(7) 与具有SEQIDNO: 2、 4或6中所述的氨基酸序列的蛋白质结合并调控所述蛋白质功能的物质(包括天然和非天然产物)。(1)到(3)中的物质可正向调控需要锌离子的蛋白质Snail的表达和/ 或功能(增强表达和/或激活功能)，(4)和(5)中的物质反向调控Snail 的表达和/或功能(降低表达和/或抑制功能)。可通过本领域技术人员熟知的多种方法制备LIV1蛋白质。例如， 可通过转化子蛋白质产生，并对其进行纯化，其中转化子含有插入了由 SEQIDNO: 1、 3或5中所述的碱基序列所组成的DNA ( LIV1基因)的载体。根据蛋白质产生所用的翻译体系选择合适的载体。另外，已知 LIV1可在激素组织，例如乳腺、前列腺、垂体腺和脑中表达(Taylor, K. M. & Nicholson, R. I. The LZT proteins; the LIV-1 subfamily of zinc transporters. Biochim. Biophys. Acta 1611, 16-30 (2003))。可用已知方法 通过制备抗LIV1蛋白质的抗体，然后用抗体产生亲和柱而从LIV1表达 细胞的提取物中纯化LIV1蛋白质。LIV1的蛋白质类似物是可调控需要锌离子的蛋白质(例如Snail) 活性的蛋白质，包括，例如含SEQIDNO: 2、 4或6中所述的氨基酸序 列、并在所述的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸序列替代、缺失、 插入和/或增加的蛋白质，及由在严格条件下可与由SEQIDNO: 1、 3或 5中所述的碱基序列所组成的DNA进行杂交的DNA所编码的蛋白质。LIV1蛋白质类似物可通过例如与编码LIV1的碱基序列杂交，产生 含高同源性的DNA的转化子，并用转化子产生所需蛋白质的方法来制 备。获得具有高同源性的DNA的方法的例子包括在严格条件下用SEQ ID NO: 1、 3或5中所述的碱基序列部分为探针进行杂交，从而从细胞 或人或非人脊推动物中获得这种DNA。本领域技术人员可适当选择上述严谨杂交条件。作为示例，在含25 %曱酰胺，或在更为严格条件下含50%甲酰胺、4xSSC、 50mMHepes pH 7.0、 10 x Denhardt's溶液和20 |Lig/mL变性鲑鱼精DNA的杂交液中进 行预杂交，于42。C过夜，然后加入标记的探针进行杂交，于42。C温育 过夜。随后在如下的洗液和温度条件下进行洗涤严格条件为约"1 x SSC, 0.1%SDS, 37°C" ， "0.5xSSC， 0.1%SDS， 42°C"，更严谨的 条件为约"0.2xSSC， 0.1%SDS， 65°C"。这样，杂交在越严谨的洗涤 条件下进行，则经分离的DNA序列与探针序列的同源性越高。但所述 的SSC、 SDS和温度条件的组合仅用于举例，本领域技术人员可适当组合上述或其它杂交严谨性的决定因素(例如，探针浓度、探针长度、杂 交反应时间等)，从而达到与上述相似的严谨性。由通过杂交技术分离的DNA所编码的多肽通常与LIV1在氨基酸序 列上具有高同源性。高同源性是指序列同源性至少为40 %或更高，优选 地为60%或更高，更优选地为80%或更高，更优选地为90%或更高， 更优选地为95 %或更高，特别优选地为97 %或更高(例如98到99 % )。 氨基酸序列相似性可通过例如BLAST算法(Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990;及Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877， 1993 )来测定。基于该算法，开发了称为BLASTX的程序 (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990 )。当用BLASTX分析 氨基酸序列时，参数可设置为，例如，分数=50,字长=3。当使用BLAST 和空位BLAST程序时，可使用程序的缺省参数。这些分析方法的具体 途^至是已知的(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov.)。LIV的蛋白质类似物也可通过另外已知方法制备。例如，通过用外 切核酸酶的缺失突变产生和如盒突变这样的定点突变，来人工修饰LIV1 DNA,修饰的LIV1 DNA可用于制备所需蛋白质。可获得的作为"调控需要锌离子的蛋白质的表达和/功能的物质"的 物质的另一个优选例子包括由SEQ ID NO: 1、 3或5中所述序列所组成 的DNA。上述DNA编码LIV1蛋白质，当导入细胞后，可通过LIV1蛋 白质的表达作为间接调控如Snail这样的需要锌离子的蛋白质的活性的 物质。上述所需DNA也可通过本领域技术人员公知的杂交技术，以SEQ ID NO: 1 、 3或5中所述序列的 一部分作为探针从LIV1表达细胞的cDNA 进行制备。也可通过RT-PCR，以SEQ ID NO: 1、 3或5中所述序列的 一部分为引物从mRNA获得DNA。选择性地，也可用已商品化的DNA 合成4义人工合成DNA。另外，与上述DNA类似的DNA也是"调控需要锌离子的蛋白质的 表达和/功能的物质"的例子。类似的DNA包括可与SEQ ID NO: 1、 3 或5中所述序列在严格条件下杂交，并编码可调控需要锌离子的蛋白质 的表达和/或调控的物质的DNA，例如，可调控Snail活性的蛋白质。 DNA可如前所述进行制备。当使用上述每种DNA时，可将DNA插入到合适的载体中使用。插入到载体中的DNA也是本发明的一个方面。作为使用的载体，可根据 目的选择合适的载体。具体地，载体包括哺乳动物来源的载体(例如pcDNA3 (由Invitrogen制造)、pEGF画BOS ( Nucleic Acids. Res., 18(17), p. 5322, 1990 ) 、 pEF、 pCDM8、 pCXN )，昆虫细胞来源的载体(例如， "Bac-to-BAC ^干状病毒表达系统，，(由Invitrogen制造)、pBacPAK8 ), 植物来源的表达载体(例如pMHl、 pMH2),动物病毒来源的载体(例 如pHSV、 pMV、 pAdexLcw),逆转录病毒来源的载体(例如pZIPneo )， 酵母来源的载体(例如"毕氏酵母表达试剂盒"(由Invitrogen制造)、 pNVl]、 SP-Q01 )，枯草芽孢杆菌来源的载体(例如pPL608、 pKTH50 ), 大肠杆菌载体(M13类型的载体。pUC-类型的载体、pBR322、 pBluescnpt、 pCR-Script)等。在本发明中，优选地是使用可在哺乳动物 细胞中表达的载体和表达载体。载体可通过从以下选择的方法导入到细 胞中，例如，磷酸钙方法(Virology, Vol. 52, p. 456, 1973 ) 、 DEAE葡 聚糖方法、使用阳离子脂质体DOTAP的方法(由Roche Diagnostics制 造)、电穿孔方法(Nucleic Acids Res., Vol. 15, p. 1311, 1987)、脂质体 转染方法(丄Clin. Biochem. Nutr., Vol. 7, p. 175, 1989 )、通过病毒感染 的导入方法(例如pMX、 pMSCV; Sci. Am., p. 34, 1994 )、粒子枪等。 "调控需要锌离子的蛋白质的表达和/功能的物质"的一个例子，例 如，可抑制Snail活性的试剂，包括针对编码LIV1的DNA或mRNA的 反义寡核苷酸。针对编码LIV1的DNA的反义寡核苷酸被认为可抑制内 源LIV1基因的表达，从而负调控Snail活性。这种反义寡核苷酸可包括 其靶序列为由SEQ ID NO: 1 、 3或5中所述序列所组成的DNA或由DNA 序列所产生的mRNA序列的反义寡核苷酸。其例子也包括SEQ ID NO: 7 或8中所述的寡核苷酸。另外，任何可与由上述SEQ IDNO: 1、 3或5 等中所述序列所组成的DNA的任何部位杂交、并可有效抑制LIV1表达 的反义寡核苷酸也包括在本发明的反义寡核苦酸中。这种反义寡核苷酸 不必与由上述SEQ IDNO: 1、 3或5中所述序列所组成的DNA或对应 的mRNA完全互补。根据目的可将上述反义寡核苷酸插入到合适的载体中使用。例如， 为了用于基因治疗，载体可适当地从如逆转录病毒、腺病毒和痘病毒载 体这样的病毒载体、如阳离子脂质体和配体-DNA复合物这样的非病毒 载体以及其它类似物中选择。也可以不使用载体，将棵质粒DNA(棵pDNA)与大体积水溶液一起给药。"调控需要锌离子的蛋白质的表达和/功能的物质"的另 一 个例子，具体地，可抑制Snail活性的试剂，包括具有与编码LIV1的DNA部分 相同或相似的序列的双链RNA 。具有与靶基因序列相同或相似的序列的 双链RNA可诱导RNA干涉(RNAi)，它可抑制靶基因的表达。RNAi 是指当双链RNA ( dsRNA )导入到细胞中时，RNA序列对应的细胞内 mRNA被特异降解，从而不能表达为蛋白质的现象。双链RNA可完全 包含能形成双链的区域，或具有形成单链的部分区域(例如在两端或一 端)等。因此，本发明的双链RNA也可含有不是双链的区域。RNAi 中所用的寡聚RNA经常为10到100-bp的RNA,通常为19到23-bp的 RNA。可根据Nature, Vol. 391, p. 806, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 95, p. 15502, 1998, Nature, Vol. 395, p. 854, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 96, p. 5049, 1999, Cell, Vol. 95, p. 1017, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 96, p. 1451， 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 95, p. 13959, 1998, Nature Cell Biol., Vol. 2, p. 70, 2000等的描述进行 RNAi。"调控锌离子转运蛋白质的表达和/或功能的物质"，例如，当底物 是LIV1时，是通过那些与上述"调控需要锌离子的蛋白质的表达和/功 能的物质"相类似的物质来示例的。当"锌离子转运蛋白质"不是LIV1时，例如是hZnt-l、 hZnt-2、 hZnt-5、 hZnt-6、 hZnt-7、 hZIPl、 hZIP2、 hZIP3、 BAA92100、 BAC04504、 hLiv-1、 hKE4、 KIAA1265、 KIAA0062或hZip4时,可根据已知的锌离 子转运蛋白质的氨基酸序列或碱基序列，通过与LIV1相同的方式制备 多种"调控锌例子转运蛋白质的表达和/或功能的物质"或"调控需要锌 离子的蛋白质的表达和/功能的物质"。关于各自氨基酸序列和碱基序列的信息可从NCBI上的多种数据库 及其它类似数据库获得。根据本发明的控制脱粒反应的药剂、控制细胞因子产生的药剂、过剂，如果需要，除了上u述,舌性组分(锌离v:锌离子载体、锌i子螯:剂、调控需要锌离子的蛋白质的表达和/或功能的物质及调控锌离子转运 蛋白质的表达和/或功能的物质)外，还包括药学上可接受的赋形剂和添加剂。药学上可接受的赋形剂和添加剂包括载体、黏合剂、香料、緩冲 液、增稠剂、着色剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、悬浮剂、防腐剂等。 另外，可联合使用不同类型的"控制锌离子浓度的物质"作为活性组分。药学上可接受的载体包括，例如碳酸镁、硬脂酸镁、云母、糖、乳 糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄芪胶、曱基纤维素、羧曱基纤维素钠、 低熔点蜡、可可脂等。另外，如果需要，可制备成用常用敷料包被的片剂，例如，糖包衣 片剂、肠溶包衣片剂、薄包衣片剂，或双层片剂或多层片剂。也可用药 学上可接受的基质制备成粉剂。基质包括云母、乳糖、淀粉等。可与水 溶性或非水溶性基质以及一种或多种药学上可接受的分散剂、悬浮剂、 增溶剂等一起制备滴剂。可通过填充作为活性组分的化合物以及药学上 可接受的载体来制备胶嚢。化合物可与或不与药学上可接受的赋形剂混 合，制备成胶嚢。也可用同样方法制备扁胶剂。当本发明制备为栓剂时， 可与基质，例如植物油(例如，蓖麻油、橄榄油、花生油)、矿物油(例 如凡士林、白色凡士林)、蜡、及部分或完全合成的甘油脂肪酸脂通过 常用方法制备成栓剂。用于注射的液体制剂包括溶液、悬浮液、乳状液等。其例子包括水 溶液、水-丙二醇溶液等。液体制剂也可以以含水的聚乙二醇和/或丙二 醇溶液的形式来制备。适于口服的液体制剂可通过向水中加入作为活性组分的化合物以 及，如果必要，加入着色剂、香料、稳定剂、甜味剂、增溶剂、增稠剂 或类似物质来制备。选择性地，适于口服的液体制剂可通过向水中加入 化合物和分散剂，从而得到粘性液体来制备。增稠剂的例子包括药学上 可接受的天然或合成胶、树脂、甲基纤维素，羧曱基纤维素钠、已知的 悬浮剂等。局部给药的药剂包括上述液体制剂，及乳剂、气雾剂、喷雾、粉末、 洗剂、软膏等。上述用于局部给药的药剂可通过将作为活性组分的化合 物与药学上可接受的稀释剂和载体混合来制备。软膏和乳剂可通过，例 如向水溶性或油性基质中加入增稠剂和/或凝胶试剂来制备。基质的例子 包括水、液体石蜡、植物油等。增稠剂的例子包括软石蜡、硬脂酸铝、 十六醇十八醇混合物、丙二醇、聚乙二醇、羊毛脂、氢化羊毛脂、蜂蜡 等。如果需要，可向用于局部给药的药剂中加入防腐剂，例如羟基苯曱酸曱酯、羟基苯甲酸丙酯、氯曱酚、苯扎氯铵等，或细菌生长抑制剂。 洗剂可通过向水溶性或油性基质中加入 一 种或多种药学上可接受的稳 定剂、悬浮剂、乳化剂、分散剂、增稠剂、着色剂、香料等来制备。获得的可控制脱粒反应的药剂、控制细胞因子产生的药剂、及过敏药物可口服或肠胃外给药。当口服给药时，可以按本领域通常使用的剂量给药。当肠胃外给药 时，可以按局部给药的药剂(例如透皮药剂)、直肠给药的药剂、注射、 透皮药剂等的剂量形式进行给药。口服药剂或直肠给药的药剂的例子包括胶嚢、片剂、丸剂、粉剂、 滴剂、扁囊剂、栓剂、液体制剂等。注射的例子包括无菌溶液或悬浮液 等。局部给药的药剂的例子包括乳剂、软膏、洗剂、透皮药剂(通常为 片剂或基质药剂)等。给药剂量和次数根据所用的控制锌离子浓度的物质的类型、条件、 患者的年龄和体重、剂量形式等而改变，可适当地进行估算。所有"锌离子"、"锌离子螯合剂"、"调控需要锌离子的蛋白质 的表达和/或功能的物质"和"调控锌离子转运蛋白质的表达和/或功能 的物质"都可在细胞、具体地在能够脱粒化学介导物的细胞和/或能产生 细胞因子的细胞中控制锌离子的浓度，从而可在包括人和牛、马、狗、 小鼠、大鼠等在内的哺乳动物细胞中起同样作用。因此，它们可抑制和 /或治疗多种过敏性疾病及包括自身免疫性疾病在内的炎症性疾病，其中 能够脱粒化学介导物的细胞和/或能产生细胞因子的细胞参与这些疾 病。当药剂对脱粒反应有抑制作用时，药剂可抑制诸如血管通透性增 加、平滑肌收缩、腺体分泌增加、血管舒张等这样的由于I型过敏性反 应而引起的症状表达，并通过抗组胺作用等改善由上述作用所导致的症复畸形，例如，Thl细胞和Th2细胞、及辅助T细胞的亚群的功能紊乱。 Thl细胞的功能紊乱被认为可引起过敏性疾病。另外，这种化合物也可 控制肥大细胞中细胞因子的产生和释放，对多种过敏性疾病和包括自身 免疫性疾病在内的炎症性疾病是有效的。因此，本发明可用于抑制和治 疗与I型过敏性反应相关的疾病和/或由于Thl和Th2的不平衡而产生的 疾病，例如，过敏性休克、过敏性鼻炎。过敏性结膜炎、支气管哮喘、风渗、遗传性过敏性皮炎等。另外，本发明对预防和治疗过敏性疾病和 /或包括自身免疫性疾病在内的炎症性疾病非常有用，例如，由杉树粉、 屋尘、霉菌、螨或头发、宠物的皮肤或粪便等引起的过敏性鼻炎和过敏 性炎症，和全身性红斑狼疮、混合结締组织病、风湿性关节炎、干燥综 合征、风湿热、古德帕斯丘综合征、巴塞杜氏病、桥本氏病、阿狄森氏 病、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、 溃疡性结肠炎、克罗恩病、交感性眼炎、多发性硬化、银屑癣、肝炎等。 根据本发明人获得的发现，即脱粒反应和/或细胞因子的产生可通过 控制锌离子浓度来控制，可以通过测定细胞内锌离子浓度，筛选具有控 制脱粒反应作用和/或控制细胞因子产生作用的化合物。例如，该筛选方法是通过以下步骤进行的1) 将细胞分为两组，要求这些细胞可以控制脱粒反应和/或控制细胞因子产生，对一组用待测化合物进行处理(另一组作为对照)；2) 测定处理细胞和未处理对照细胞的细胞内锌离子浓度；3) 筛选与对照细胞的细胞内锌离子浓度相比较，可显著性改变处理 细胞中的细胞内锌离子浓度的化合物，并确定待测化合物就是具有控制 脱粒反应作用和/或控制细胞因子产生作用的化合物。所要求的控制脱粒反应和/或控制细胞因子产生的细胞，是那些其脱内的炎症性疾病的细胞，包括，例如，嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜 碱细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、细胞毒T细胞和 血小板等。肥大细胞是优选的。将细胞随机分为两组，其中一组用待测 化合物处理。另一组不处理，作为对照细胞。另外，已知可影响锌离子 浓度的化合物，例如锌离子螯合剂TPEN等可作为阳性对照化合物。待 测化合物可以是已知的化合物或将来开发的新型化合物。可以是低分子 量化合物或高分子量化合物。在本文中，低分子量化合物是分子量小于 约3000的化合物，它包括，例如，通常可作为药剂组分的有机化合物 及其衍生物和无机化合物，并涉及作为药剂组分的通过完全使用有机合 成产生的化合物及其衍生物或类似物质、天然产生的化合物及其衍生 物、诸如启动子这样的小核酸分子、多种金属等，以及所需的可作为药 剂的有机化合物及其衍生物和核酸分子。高分子量化合物是指分子量不 小于约3000的化合物，包括，例如，蛋白质、多核酸、多糖及其组合，优选地是蛋白质。这些低分子量或高分子量化合物，如果它们是已知 的，则是已商品化的，或根据相关的报道文献通过例如收集、产生和纯 化步骤而获得。这些化合物可以是天然存在的或通过基因工程制备的， 或者也可以通过半合成等方式获得。化合物而适当设定。当使用诸如TPEN这样的阳性对照化合物时，则可通过用对照化合物处理时锌离子的浓度变化作为指导来进行处理。用于 处理时间适当设定。可通过本领域常规使用的方法或其所遵循的(pursuant)方法来测 定细胞内锌离子浓度。例如，浓度可通过原子吸收方法(火焰法)直接 测定或用特异探针(例如荧光试剂)通过荧光分光光度计进行测定。实施例以下参考实施例对本发明进行详细描述，但这些实施例不对本发明 的范围进行任何方式的限制。所有本发明中引用的参考文献均通过参考 整合在文中。除非特别说明，本发明中所用的试剂、仪器和材料是已商品化的。[实施例1]用锌离子螯合剂N，N,N',N'-四(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN; SIGMA, P4413 )研究锌离子对抗原刺激依赖的化学介导物从肥大细胞中释放的影响。所用肥大细胞是骨髓来源的肥大细胞，其分化通过用白介素-3培养 骨髓细胞5周而诱导产生。将获得的骨髓来源的肥大细胞(1 x 107细胞) 用1 pg/mL IgE抗体(SPE-7克隆；从SIGMA获得)激活6小时。激活 后，将细胞悬浮在Tyrode's緩冲液(pH 7.4 )中。Tyrode's緩沖液的组成 参见表1。[表l]10mMHEPES 1. 2g130mMNaCl 3.8g5mM KC 1 0. 1 9 g1. 4mM C a C 1 2 0, 1 glmM Mg C 1 2 0. 5 g5. 6mM glucose 0. 5g0. 1 % B S A_总体积 5 0 0mL将获得的肥大细胞悬浮液在每个浓度(如图1所示)用抗原 (DNP-HAS; 二硝基苯基偶联的人血清白蛋白质；从SIGMA获得)刺 激30分钟。为了考察锌离子的作用，将锌离子螯合剂TPEN (0、 2、 5 和10 viM)与细胞在激活阶段共存2小时，并刺激30分钟。测定从肥 大细胞释放的化学介导物(3-己糖胺酶。用吸收分光光度计在波长405 nm，以4-硝基苯基N-乙酰基-卩-D-氨基葡糖苷(从SIGMA获得)为底 物测定(3-己糖胺酶的活性。将细胞中存在的胞外释放的所有(3-己糖胺酶 定义为100%。结果如图l所示。通过加入TPEN可获得关于化学介导物释放的浓度依赖性的抑制作用。[实施例2]检测实施例1中验证的TPEN对化学介导物释放的抑制作用是否依赖于锌离子。由于肥大细胞可用IgE抗体激活，因此使用与实施例1中相同的方 法制备细胞。激活后，将肥大细胞悬浮在Tyrode's缓冲液中。用抗原 (DNP-HSA)在每个浓度(如图2)对肥大细胞悬浮液刺激30分钟。 在激活阶段，将锌离子螯合剂TPEN (10 pM)与细胞共存2小时，并 刺激30分钟。为了向细胞中导入锌离子，将细胞在激活阶段用1^M2-5克基口比口定IU匕4勿(Molecular probes， p-24193 )进4亍处J里，向Tyrodev，s 緩冲液中加入各个浓度的锌离子(如图2)。以与实施例1相同方式测 定(3-己糖胺酶的活性。未用TPEN处理的细胞作为对照，将细胞中存在 的胞外释放的所有p-己糖胺酶定义为100%。结果如图2所示。TPEN对化学介导物释;改的抑制作用可通过加入 锌离子而恢复。[实施例3]通过锌离子螯合剂TPEM (SIGMA, P4413)检测锌离子对肥大细胞 中细胞因子产生的作用。由于肥大细胞用IgE抗体激活，因此可使用与实施例1所述相同的 方法制备细胞。激活后，将肥大细胞重悬在Tyrode's緩冲液中。用抗原 (DNP-HSA)在浓度100 ng/ml对肥大细胞悬浮液刺激6小时。为了考 察锌离子的作用，将锌离子螯合剂TPEN (0、 2、 5和10 ^M)与细胞 在激活阶段共存2小时，并刺激6小时。上清中细胞因子(IL-6和TNF-a)的浓度通过ELISA(BIOSOURCE) 测定。结果如图3所示。通过加入TPEN可获得细胞因子产生的剂量依赖的抑制作用。[实施例4]检测锌离子螯合剂是否在过敏性疾病模型鼠中具有抑制作用。 通过耳的皮下给药0.5 nglgE抗体(SPE-7, SIGMA)而激活鼠(6 周龄，雌性，Balb/cAjcl, CLEA,日本)，从而诱导被动皮肤过敏反应。 12小时后，对鼠腹膜内给药如图4所示剂量的TPEN ( SIGMA, P4413 )。 30分钟后，通过鼠尾静脉内注射250 |ag抗原DNP-BSA ( COSMOBIO ) 和1.25 mg伊文思蓝(Evans blue) (SIGMA)而诱导被动皮肤过敏反 应。为了定量伊文思蓝染料的泄露，从鼠耳用曱酰胺提取染料。通过波 长620 nm的吸收测定提取的染料。从分析曲线通过已知的伊文思蓝的 量计算每个实验中染料的量。结果如图4所示。伊文思蓝染料泄露可被锌离子螯合剂以剂量依赖 的方式所抑制。因此，结果表明锌离子螯合剂可在体内抑制I型过敏性 应答(被动皮肤过敏反应)。序列表SEQIDNo: 7:反义序列 SEQIDNo: 8:反义序列工业应用性本发明的可控制细胞中化学介导物的释放的控制脱粒反应的药 剂，本发明的可控制细胞中细胞因子产生的控制细胞因子产生的药剂，疗性药物:'通ii用锌离子和;争i离子螯合剂，或通过调控需要锌离子:勺蛋白质和锌离子转运蛋白质的表达和/或功能而控制细胞内锌离子浓度，从 而控制脱粒反应的方法及控制细胞因子产生的方法，与于传统的、其作 用机制是抑制释放的组胺等对靶细胞的作用的抗过敏性药剂有根本上 的不同。因此，该药剂可同时抑制肥大细胞及其它类似细胞中多种化学 介导物和细胞因子的释放。另外，它可能避免产生由如类固醇等这样的 传统抗过敏药剂和抗炎症药剂引起的副作用。本申请基于日本专利申请2005-023196(于2005年1月31日提交)， 其内容通过参考完全整合在文中。
权利要求
1.一种控制脱粒反应的药剂，它含有作为活性组分的可控制细胞内锌离子浓度的物质。
2. 如权利要求1所述的控制脱粒反应的药剂，其中可控制锌离子浓 度的物质是锌离子。
3. 如权利要求2所述的控制脱粒反应的药剂，其中锌离子通过锌离 子载体导入到细胞中。
4. 如权利要求1所述的控制脱粒反应的药剂，其中可控制锌离子浓 度的物质是锌离子螯合剂。
5. 如权利要求4所述的控制脱粒反应的药剂，其中锌离子螯合剂是 选自2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS) 、 N,N,N'，N'-四(2-吡啶基曱基)乙 二胺(TPEN)、乙二胺四乙酸(EDTA)、和N-(6-甲氧基-8-喹啉基)-对曱苯磺酰胺(TSQ)中的至少 一种。
6. 如权利要求1所述的控制脱粒反应的药剂，其中可控制锌离子浓度的物质是调控需要锌离子的蛋白质的表达和/或功能的物质。
7. 如权利要求6所述的控制脱粒反应的药剂，其中需要锌离子的蛋 白质是选自Raf-、PKCot、 GEF-H1、 HDAC、 SQSTM1、泛素蛋白质连 接酶E3、泛素交联酶E2、金属硫蛋白质、磷酸酶、Snail、 TRAF6、桩 蛋白质、斑联蛋白质和Jade-中的至少一种。
8. 如权利要求1所述的控制脱粒反应的药剂，其中可控制锌离子浓 度的物质是调控锌离子转运蛋白质表达和/或功能的物质。
9. 如权利要求8所述的控制脱粒反应的药剂，其中锌离子转运蛋白 质是选自包括LIV家族和人CDFs在内的人ZIPs中的至少一种。
10. 如权利要求1到9任一项中所述的控制脱粒反应的药剂，其中 细胞是选自嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、肥大细胞、自然杀 伤细胞、自然杀伤T细胞、细胞毒T细胞和血小板中的至少一种。
11. 如权利要求10所述的控制脱粒反应的药剂，其中细胞是肥大细胞。
12. —种控制细胞因子产生的药剂，其含有作为活性组分的控制细 胞内锌离子浓度的物质。
13. 如权利要求]2所述的控制细胞因子产生的药剂，其中控制锌离 子浓度的物质是锌离子。
14. 如权利要求13所述的控制细胞因子产生的药剂，其中锌离子是 通过锌离子载体导入到细胞中的。
15. 如权利要求12所述的控制细胞因子产生的药剂，其中控制锌离 子浓度的物质是锌离子螯合剂。
16. 如权利要求15所述的控制细胞因子产生的药剂，其中锌离子螯 合剂是选自2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS) 、 N,N,N',N'-四(2-吡啶基甲 基)乙二胺(TPEN)、乙二胺四乙酸(EDTA)、和N-(6-甲氧基-8-喹 啉基)-对曱苯磺酰胺(TSQ)中的至少 一种。
17. 如权利要求12所述的控制细胞因子产生的药剂，其中控制锌离 子浓度的物质是调控需要锌离子的蛋白质表达和/或功能的物质。
18. 如权利要求17所述的控制细胞因子产生的药剂，其中需要锌离 子的蛋白质是选自Raf-l、 PKCa、 GEF-H1、 HDAC、 SQSTM1、泛素蛋 白质连接酶E3、泛素交联酶E2、金属硫蛋白质、磷酸酶、Snail、 TRAF6、 桩蛋白质、斑联蛋白质和Jade-l中的至少一种。
19. 如权利要求12所述的控制细胞因子产生的药剂，其中控制锌离子浓度的物质是调控锌离子转运蛋白质的表达和/或功能的物质。
20. 如权利要求19所述的控制细胞因子产生的药剂，其中锌离子转 运蛋白质是选自包括LIV家族和人CDFs在内的人ZIPs中的至少一种。
21. 如权利要求12到20任一项中所述的控制细胞因子产生的药 剂，其中细胞是选自嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜石成细胞、肥大细胞、 自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、细胞毒T细胞和血小板中的至少一种。
22. 如权利要求21所述的控制细胞因子产生的药剂，其中细胞是肥 大细月包。的预防和/或治疗性药物，其含有如权利要求到11任一项中所述的控 制脱粒反应的药剂或权利要求12到22任一项中所述的控制细胞因子产生的药剂。
23.
24. —种过敏性疾病和/或包括自身免疫性疾病在内的炎症性疾病 的预防和/或治疗性药物，其含有作为活性组分的可控制细胞内锌离子浓 度的物质。
25. 如权利要求24所述的预防和/或治疗性药物，其中可控制锌离 子浓度的物质是锌离子。
26. 如权利要求25所述的预防和/或治疗性药物，其中锌离子通过锌离子载体导入到细胞中。
27. 如权利要求24所述的预防和/或治疗性药物，其中可控制锌离子浓度的物质是锌离子螯合剂。
28. 如权利要求27所述的预防和/或治疗性药物，其中锌离子螯合 剂是选自2,3-二琉基-1-丙磺酸(DMPS) 、 N,N,N',N'-四(2-吡啶基曱基) 乙二胺(TPEN)、乙二胺四乙酸(EDTA)、和N-(6-甲氧基-8-喹啉基)-对曱苯磺酰胺(TSQ)中的至少 一种。
29. 如权利要求24所述的预防和/或治疗性药物，其中可控制锌离 子浓度的物质是调控需要锌离子的蛋白质的表达和/或功能的物质。
30. 如权利要求29所述的预防和/或治疗性药物，其中需要锌离子 的蛋白质是选自Raf-l、 PKCot、 GEF-H1、 HDAC、 SQSTM1 、泛素蛋白 质连接酶E3、泛素交联酶E2、金属硫蛋白质、磷酸酶、Snail、 TRAF6、 桩蛋白质、斑联蛋白质和Jade-1中的至少一种。
31. 如权利要求24所述的预防和/或治疗性药物，其中可控制锌离 子浓度的物质是可调控锌离子转运蛋白质表达和/功能的物质。
32. 如权利要求31所述的预防和/或治疗性药物，其中锌离子转运 蛋白质是选自包括LIV家族和人CDFs在内的人ZIPs中的至少一种。
33. 如权利要求24到32任一项中所述的预防和/或治疗性药物，其 中细胞是选自嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、肥大细胞、自然 杀伤细胞、自然杀伤T细胞、细胞毒T细胞和血小玲反中的至少一种。
34. 如权利要求33所述的预防和/或治疗性药物，其中细胞是肥大 细胞。
35. —种控制脱粒反应的方法，包括在体外控制细胞内锌离子浓度。
36. 如权利要求35所述的方法，其中锌离子浓度是由锌离子控制的。
37. 如权利要求36所述的方法，其中锌离子通过锌离子载体导入到 细月包中。
38. 如权利要求35所述的方法，其中锌离子浓度是由锌离子螯合剂控制的。
39. 如权利要求38所述的方法，其中锌离子螯合剂是选自2，3-二巯 基画l-丙磺酸(DMPS ) 、 N,N,N',N'-四(2-吡咬基曱基)乙二胺(TPEN )、 乙二胺四乙酸(EDTA)、和N-(6-甲氧基-8-喹啉基)-对甲苯磺酰胺(TSQ)中的至少一种。
40. 如权利要求35所述的方法，其中锌离子浓度是由调控需要锌离 子的蛋白质的表达和/或功能而控制的。
41. 如权利要求40所述的方法，其中需要锌离子的蛋白质是选自 Raf-l、 PKCoc、 GEF-H1、 HDAC、 SQSTM1、泛素蛋白质连4妄酶E3、泛 素交联酶E2、金属硫蛋白质、磷酸酶、Snail、 TRAF6、桩蛋白质、斑 联蛋白质和Jade-l中的至少一种。
42. 如权利要求35所述的方法，其中锌离子浓度是由调控锌离子转运蛋白质的表达和/或功能而控制的。
43. 如权利要求42所述的方法，其中锌离子转运蛋白质是选自包括 LIV家族和人CDFs在内的人ZIPs中的至少 一种。
44. 如权利要求35到43任一项中所述的方法，其中细胞是选自嗜 中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、自然 杀伤T细胞、细胞毒T细胞和血小板中的至少一种。
45. 如权利要求44所述的方法，其中细胞是肥大细胞。
46. —种控制细胞因子产生的方法，包括在体外控制细胞内锌离子 浓度。
47. 如权利要求46所述的方法，其中锌离子浓度是由锌离子控制的。
48. 如权利要求47所述的方法，其中锌离子通过锌离子载体导入到 细胞中。
49. 如权利要求46所述的方法，其中锌离子浓度是由锌离子螯合剂控制的。
50. 如权利要求49所述的方法，其中锌离子螯合剂是选自2,3-二巯 基-l-丙磺酸(DMPS) 、 N,N，N'，N'-四(2-吡。定基曱基)乙二胺(TPEN)、 乙二胺四乙酸(EDTA)、和N-(S-曱氧基-8-喹啉基)-对曱苯磺酰胺(TSQ)中的至少一种。
51. 如权利要求46所述的方法，其中锌离子浓度是由调控需要锌离 子的蛋白质的表达和/或功能而控制的。
52. 如权利要求51所述的方法，其中需要锌离子的蛋白质是选自 Raf-l、 PKCa、 GEF-H1、 HDAC、 SQSTM1、泛素蛋白质连接酶E3、泛 素交联酶E2、金属硫蛋白质、磷酸酶、Snail、 TRAF6、桩蛋白质、斑 联蛋白质和Jade-l中的至少一种。
53. 如权利要求46所述的方法，其中锌离子浓度是由调控锌离子转 运蛋白质的表达和/或功能而控制的。
54. 如权利要求53所述的方法，其中锌离子转运蛋白质是选自包括 LIV家族和人CDFs在内的人ZIPs中的至少一种。
55. 如权利要求46到54任一项中所述的方法，其中细胞是选自嗜 中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、自然 杀伤T细胞、细胞毒T细胞和血小板中的至少一种。
56. 如权利要求55所述的方法，其中细胞是肥大细胞。
57. —种筛选具有控制脱粒反应作用的化合物的方法，包括测定细 胞内锌离子浓度。
58. 如权利要求57所述的筛选方法，其中细胞是选自嗜中性粒细 胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细 胞、细胞毒T细胞和血小板中的至少一种。
59. 如权利要求58所述的筛选方法，其中细胞是肥大细胞。
60. —种筛选具有控制细胞因子产生作用的化合物的方法，包括测 定细胞内锌离子浓度。
61. 如权利要求60所述的筛选方法，其中细胞是选自嗜中性粒细 胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细 胞、细胞毒T细胞和血小板中的至少一种。
62. 如权利要求61所述的筛选方法，其中细胞是肥大细胞。
63. —种控制脱粒反应的方法，包括给药有效剂量可控制细胞内锌 离子浓度的物质。
64. —种可控制细胞内锌离子浓度的物质在制备控制脱粒反应的药 剂中的用途。
65. —种控制细胞因子产生的方法，包括给药有效剂量可控制细胞 内锌离子浓度的物质。
66. —种可控制细胞内锌离子浓度的物质在制备控制细胞因子产生 的药剂中的用途。
67. —种过敏性疾病和/或包括自身免疫性疾病在内的炎症性疾病 的预防和/或治疗的方法，包括给药有效剂量可控制细胞内锌离子浓度的 物质。
68. —种可控制细胞内锌离子浓度的物质在制备过敏性疾病和/或 途。 "J 、 J 、' J、 5''、乡' 全文摘要
提供控制肥大细胞及其它类似细胞中的脱粒反应和细胞因子产生的药剂。本发明提供控制脱粒反应的药剂和控制细胞因子产生的药剂，其含有作为活性组分的可控制细胞内锌离子浓度的物质，具体地，锌离子、锌离子螯合剂、控制需要锌离子的蛋白质的表达和/或功能的药剂，或控制锌离子转运蛋白质的表达和/或功能的药剂。
文档编号A61K45/00GK101151050SQ20068001084
公开日2008年3月26日 申请日期2006年1月31日 优先权日2005年1月31日
发明者平野俊夫, 西田圭吾 申请人:独立行政法人理化学研究所