专利名称：含有epo衍生物的血液相关疾病的治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明是关于以EPO衍生物为有效成分的血流增加剂、血管促进剂或者缺 血性疾患治疗剂的药物发明。
背景技术：
红细胞生成素(以下有时记载为EPO)是促进红血球前驱细胞分化、增殖 的酸性糖蛋白质激素，主要由肾脏产生。血液中含有非常丰富的红血球，它们 在一定的期间内发挥作用后，在脾脏等处被破坏(人体红血球的平均寿命约为 120天)，在正常状态下，通过骨髓不间断地供应，使末稍的全血红细胞数量经 常保持稳定。EPO在这种维持生体内红细胞数量的稳定性方面起着核心性的作 用。临床上利用EPO治疗贫血以及进行术前术后的管理。有报导EPO具有促进血管新生的作用，作为缺血性疾患的治疗剂有效 (Anatole B et al"The New England Journal of Medicine，339(9)，584誦590,(1998)、 Christopher H et al.，Blood， 102(4)， 1340-1346,(2003)、 Ferdinand H B et al., Blood, 103(3)， 921-926,(2004)、 Kyle J S et al.，Cardiovascular Research, (59)，538-548, (2003)、 Ferdinand H B et al.，Kidney Intemationa1,64， 1648-1652,(2003))。但是，在以促进血管新生作用为目的的EPO给药时，有可能引起非本来治 疗目的的红血球数量增加。为此，临床上需要能尽量抑制红血球增加作用的， 并且能作为缺血性的血液相关疾患治疗剂使用的新型治疗药物。发明内容本发明的目的是，提供治疗缺血性疾患等的治疗药物。 诸位发明者发现EPO衍生物、特别是去唾液酸EPO具有增加血流、促进血 管以及治疗疾患的作用，完成了此项发明。即，本发明提供以下内容 (1 )以EPO衍生物作为有效成分的缺血性疾患治疗剂。(2) EPO衍生物是去唾液酸EPO (1)的治疗剂。(3) 与含有干细胞物质同时给药的(1)或者(2)的治疗剂。(4) 含有干细胞物质为骨髓细胞的(3)的治疗剂。 (5 )以EPO衍生物为有效成分的血管促进剂。(6) EPO衍生物是去唾液酸EPO的(4)的促进剂。(7) 以含有干细胞物质同时给药的(5)或者(6)的促进剂。(8) 含有干细胞物质为骨髓细胞的(7)促进剂。(9) 以EPO衍生物为有效成分的血流增加剂。(10 )促EPO为去唾液酸EPO的(9 )的促进剂。(11) 与含有千细胞物质同时给药的(9)或者(10)的增加剂。(12) 含干细胞物质为骨髓细胞的(11)的增加剂。
图l是使用ICR小鼠下肢缺血标本的治疗实验结果表示图。图2是使用I CR小鼠下肢缺血标本的治疗实验结果表示图。图3是使用无处置I C R小鼠，进行的E P O以及去唾液酸E P O的红细胞增多症诱发效果表示图。
具体实施方式
EPO本发明所使用的EPO，虽然可以使用任何EPO，但理想的是使用高纯度 EPO。更具体的说，是具有与哺乳动物的EPO、特别是与人类的EPO实质性相 同的生物学活性物质的高纯度EPO。本发明所使用的EPO，可以使用各种方法制造。例如，可以使用从人类抽 取物精制而成的天然的人体EPO (特公平1-38800号公报，等)，或者使用通过遗传工程的方法，由大肠杆菌、酵母菌、中国田鼠卵巢细胞(CHO细胞)、C127 细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、BHK细胞、昆虫细胞等生成的，用各种方法提 取、分离、精制出的人体EPO等。本发明所使用的EPO,理想的是使用通过遗 传工程的方法，用哺乳动物细胞(特别是CHO细胞)制造的EPO (例如特公 平1-44317号公报，Kenneth Jacobs et al. ， Nature, 313 806-810(1985)等)。通过遗传基因置换法所得到的EPO，可以是与天然形成EPO的氨基酸排列 相同的EPO，也可以是该氨基酸排列中的存在l个或多个氨基酸缺失、置换、 附加等的，具有与天然形成的EPO相同的生物学活性的EPO。氨基酸的缺失、 置换、附加等，可以通过对该同业者公布的方法进行。例如，如果是该同业者， 使用部位特异的变异诱发法等(Gotoh， T. et al.(1995) Gene 152， 271-275; Zoller， M丄and Smith, M(1983) Methods Enzymol. 100， 468-500; Kramer,W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12,9441-9456 ; Kramer，W.and Fritz,H丄(1987) Methods Enzymol. 154,350-367; Kunkel,T.A.(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.82,488-492; Kunkel (1988) Methods Enzymol.85,2763-2766 ),通过向EPO的氨基酸导入适宜 的变异，就可以调制与EPO同等功能的多肽。而且，氨基酸的变异在自然界也 会发生。 一般情况下，被置换氨基酸的残基，理想的是被保存氨基酸支链性质 的别的氨基酸置换。例如作为氨基酸支链的性质，可以列举出有疏水性氨基 酸(A、 I 、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V )、亲水性氨基酸(R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T )、有脂肪族支链的氨基酸(G、 A、 V、 L、 I、 P )、有含氢氧基支链的氨基酸(S 、 T、 Y )、有含硫原子支链的氨基酸(C、 M)、有含羧酸以及含酰胺酸支链的氨基酸(D、 N、 E、 Q )、有含碱基支链 的氨基酸(R、 K、 H)、有含芳香族支链的氨基酸(H、 F、 Y、 W)(括弧 内字母均为氨基酸的直列标记)。已经知道，相对某氨基酸排列的l个或者多个 氨基酸残基的缺失、附加以及/或者有通过其他氨基酸的置换修饰的具有氨基 酸排列的多肽，可以维持其生物学的活性(Mark, D.R et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984) 81， 5662-5666; Zoller， M丄& Sm池，M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500; Wang,A.et al.， Science 224， 1431-1433; Dalbadie-McFariand, G. et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA( 1982)79, 6409-6413 )。还可以使用EPO与其他蛋白质结合的结合蛋白质。在制作结合多肽时，例 如，使EPO编码的DNA与其他蛋白质编码的DNA结构一致地相结合，导入发 现媒介物，由宿主发现即可。本发明中，与EPO结合的其他蛋白质无特别地限定。还可以使用经过化学修饰的EPO。作为化学修饰EPO的事例，可以列举结 合了聚乙二醇.维生素B12等无机化合物或者有机化合物的EPO等。EPO的衍生物本发明中所指的EPO衍生物，是指修饰了 EPO分子中的氨基酸，或者是修 饰了 EPO分子中糖链的EPO。作为EPO糖链的修饰，包括糖链的附加、置换、缺换等内容。作为本发明 中理想的糖链修饰，可以列举为EPO分子中的唾液酸缺失。通常，无论是通过转换动物细胞所生产的EPO，还是尿中提取的EPO，都 可得到含有多种不同糖链构造EPO的EPO组成物。在每个EPO分子中的EPO 组成物中，EPO分子附加的唾液酸的数量是不同的，通常，l个EPO分子附加 有11 ~ 15个唾液酸。通过除去这些唾液酸可以制作去唾液酸化的EPO (去唾液 酸EPO)。在去唾液酸化时，除去唾液酸的数量无特别限定，既可以除去所有的 唾液酸，也可以除去1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、或者14 个唾液酸。本发明中理想的去唾液酸EPO的EPO分子附加唾液酸^t量为10个 以下，更理想的是在5个以下，最理想的是在2个以下。本发明所使用的唾液 酸的数量是包含在EPO组成物中的EPO分子的平均数。1个分子的唾液酸平均 数量，可以使用向该同业者公布的方法进行测定(E P 0428267公报，等)。除去唾液酸的EPO (去唾液酸EPO)可以使用向该同业者公布的方法进行 制作。例如，可以通过使用唾液酸酶等的酶对EPO进行处理的方法制作。可以 使用市售的唾液iK特表2005 - 507426号，Nobuo lnai et al.., Eur.J.Biochem, .194， 457-462(1990)，等)。作为EPO分子中的氨基酸的修饰，虽然可以列举出氨基甲酰化、生物素化、 脒化、乙酰化、胍化等方法，但本发明理想的氨基酸修饰是氨基曱酰化法。修饰的氨基酸残基无特别的限定，例如，虽然可以列举出赖氨酸、精氨酸、 谷氨酸、色氨酸等，但本发明的理想修饰氨基酸为赖氨酸。因此，作为本发明的氨基酸修饰EPO的理想状态，可以列举出氨基曱酰化 6勺EPO ( Marcel L et al. Derivatives of eryt hropoietin that are tissue protective but not erythropoietic.Science，2004; 305: 239、 Fiordaliso E et al. A nonerythropoietic derivative of erythropoietin protects the myocardium trom ischemia-reperfUsion injury.PNAS，2005; 102: 2046、等)。在EPO氨基甲酰化中，包括通过与氰酸盐 离子等反应的氨基曱酰化，通过与异氰酸烷基脂等反应的烷基氨基曱酰化，通 过与烯丙异丙氰酸盐等反应的芳基氛基曱酰化等。疾患本发明的治疗剂，作为血流增加剂、血管促进剂、缺血性疾患治疗剂有治 疗作用。本发明的血流量增加是指，局部投给EPO衍生物的部位，或者从该部位到 末梢部位的血流量比投药前增加。而且，还意味着到达缺血组织的血流量增加。 关于是否具有增加血流量的作用，可以使用对该同业者公布的方法进行测定。 例如，可以通过流体技术，使用微量放射性元素的方法进行定量测定 (An丄PhysioL243:H378, (1982)。进一步还可以通过皮肤温度、热描记法、激 光血流计、下血上肢血压比、组织氧分压等方法测定和确认。本发明的血管促进是指，促进血管的新生、促进血管的再生、以及促进血 管的生长、发达。虽然通过EPO衍生物促进新生、再生、成长、发达等的血管 无特别限定，但是在动脉，特别是末梢动脉表现理想。关于是否具有血管促进 作用，可以使用对该同业者公布的方法进行测定。例如，可以通过使用碱性磷 酸酯酶染色等方法测定毛细血管密度。进一步还可以使用血管造影等方法进行 测定、确认。本发明的治疗剂对缺血性疾患的有治疗效果。缺血性疾患是由于血管内腔 狭窄、血栓形成、血管闭塞、血管炎、血管收缩、血液粘性增加等各种原因， 所造成的血管血流量减少，组织陷入缺血状态的病症。作为缺血性疾患，有末 梢循环障害、缺血性心脏疾患(心肌缺血症、心肌梗塞症、缺血性心功能不全 等)、缺血性肾脏疾患、缺血性肺疾患、感染症相关的缺血性疾患等)。本发明的缺血性疾患治疗剂对缺血性疾患的对象无特别限定，虽然任何缺 血性疾患都可作为治疗对象，但以末梢循环障害作为治疗对象较为理想。末梢 循环障害是由于血管内腔狭窄、血栓形成、血管闭塞、血管炎、血管收缩、血液粘性增加等原因，造成末梢动脉血流量减少，使组织陷入缺血的病症。伴有 末梢循环障害的疾患可以列举出闭塞性动脉硬化症、血栓闭塞性脉管炎等慢性 动脉闭塞症、进行性全身硬化症、全身性红斑、雷诺病、振动病、动脉瘤、血 管炎等。治疗用制剂本发明的治疗剂，可以根据需要，随意地添加混悬剂、溶解辅助剂、稳定剂、等渗化剂、保存剂、吸附防止剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、PH调 整剂、无痛化剂、緩冲剂、含硫还原剂、氧化防止剂等。作为混悬剂的事例，可以列举出纤维素、聚山梨醇酯80、羟乙基纤维素、 阿拉伯胶、黄蓍胶末、羧甲基纤维素纳、缩聚山梨醇单十二酸酯等。作为溶液辅助剂，可以列举聚氧化乙烯硬化蓖麻油、聚山梨醇酯80、烟酰 胺、缩聚山梨醇单十二酸酯、聚乙二醇、蓖麻油脂肪酸乙酯等。作为稳定剂，可以列举出葡聚糖40、纤维素、明胶、亚硫酸钠、偏亚硫酸 钠等。作为稳定剂，还可以添加某种氩基酸(例如，特开平10-182481号公报等)。 作为可以添加的氨基酸中，包含游离氨基酸、氨基酸的钠盐、钾盐、盐酸盐等 盐类。可以添加1种或者2种以上组合的氨基酸。虽然作为稳定剂添加的氨基 酸无特别限定，但理想的氨基酸可以列举出白氨酸、色氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸。作为等渗化剂的事例，可以列举出D-甘露醇、山梨醇等。作为保存剂的事例，可以列举出对择基苯甲酸甲酯、对轻基苯甲酸乙酯、 山梨酸、苯酚、甲酚、氯化甲酚等。作为吸附防止剂的事例，可以列举出人血清白蛋白、卵磷脂、右旋糖酐、 环氧乙烷、曱基氧丙环共聚合体、羟丙基纤维素、曱基纤维素、聚氧化乙烯硬 化蓖麻油、聚乙二醇等。作为表面活性剂的非离子表面活性剂可以列举出单辛基山梨聚糖单、单月桂基山梨聚糖单、单棕榈基山梨聚糖、等山梨脂肪酸酯；单辛基丙三醇、单 肉豆蔻基丙三醇、单硬脂酸丙三醇等的丙三醇脂肪酸酯；单硬脂甘油基癸酸酯、 甘油基半胱氨癸酸酯、单甘油基亚麻酸癸酸酯等的聚甘油脂肪酸酯；聚氧化乙 烯单月桂酸山梨聚糖、聚氧化乙烯油酸山梨聚糖、聚氧化乙烯单硬脂酸山梨聚 糖、聚氧化乙烯单棕榈酸山梨聚糖、聚氧化乙烯三油酸酯山梨聚糖、聚氧化乙 烯单三硬脂酸山梨聚糖等的聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯；聚氧化乙烯四硬脂 酸山梨糖醇、聚氧化乙烯四油酸山梨糖醇等的聚氧化乙烯山梨糖醇脂肪酸酯 聚氧乙烯单硬脂酸甘油等的聚氧化乙烯甘油脂肪酸酸；聚乙烯硬脂酸乙二醇等 的聚乙烯乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂基醚等的聚氧化乙烯烷基醚；聚氧乙 烯聚氧丙烯乙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙醚、聚氧乙烯聚氧丙烯椋榈醚等的聚 氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚等的聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧 乙烯蓖麻子油、聚氧乙烯硬化蓖麻子油(聚氧乙烯氢蓖麻子油)等的聚氧乙烯 硬化蓖麻子油；聚氧乙烯山梨糖醇蜂蜡等的聚氧乙烯蜂蜡衍生物聚氧乙烯羊 毛脂等的聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯氨基硬脂酸等的含有聚氧乙烯脂肪 酸氨基等的HLB6 ~ 1 8的物质；阴离子表面活性剂，例如椋榈基At酸钠、月 桂基硫酸钠、硫酸油醇钠等的含有碳原子数l 0 ~ 1 8的烷基的烷基硫酸盐； 聚氧乙烯月桂基硫酸钠等的环氧乙烷的平均附加摩尔数为2 ~ 4 ,烷基的碳原 子数为1 0 ~ 1 8的聚氧乙烯烷基醚硫酸盐；月桂基硫代琥珀酸酯钠等的烷基 碳原子数为8 ~ 18的烷基疏代琥珀酸酯盐；天然系列的表面活性剂，可以列举如卵磷指、甘油磷酸脂、鞘磷脂等的鞘磷脂脂类；碳原子数l 2 - 1 8的脂肪 酸的蔗糖脂肪酸酯等典型事例。本发明的制剂中，可以添加这些表面活性剂的1种或者2种以上的組合。 希望的表面活性剂是，聚山梨醇酯2 0 , 4 0, 6 0或者8 0等的聚氧乙烯山 梨聚糖脂肪酸酯，特别希望的是聚山梨醇酯2 0以及8 0。而且，也希望泊洛 沙姆(Pluronic F-68 (登陆商标)等)代表的聚氧乙烯聚氧丙烯乙二醇。作为含硫还元剂，可以列举出N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰高胱氨酸、硫 辛酸、硫二甘醇、疏乙醇胺、疏代甘油、硫代山梨醇、硫代乙醇酸以及其盐、 硫代硫酸钠、谷胱甘肽、含有碳原子数l ~ 7的硫醇酸等氬硫基物质等。作为防氧化剂，可以列举出异抗坏血酸、二丁基羟基曱苯、叔丁对曱氧 酚制剂、a-生育酚、醋酸生育酚、L-抗坏血酸以及基盐、L-抗坏血酸棕榈酸、 L-抗坏血酸硬脂酸、亚疏酸氬钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊基、没食子酸丙基、 或者乙二胺四醋酸二钠(EDT A)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等的螯合剂。甚至，还可以含有氯化钠、氯化钾、氯化钓、磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钠 等无机盐，以及枸橼酸钠、枸橼酸钾、醋酸钠等有机盐等通常的添加成分。将本发明作为緩释制剂时，緩释性制剂可以通过使用聚合体作为基剂等的 众所周知的方法进行调制。作为基剂的聚合体，希望使用能够在生体内分解的 聚合体。本发明治疗剂的EPO衍生物投药量，通常为O.O 0 l吗/kg/day 1 0 0 0昭/kg/day，但希望投药量为O.O lpg/kg/day 1 0 0昭/kg/day, 最佳希望投药量为0.1昭/kg/day 3 0吗/kg/day。对于使用本发明治疗 剂的患者，由医师综合考虑各个患者的年龄、体重、症状、给药途径等因素， 决定投药量。本发明的治疗剂EPO衍生物希望局部投药。局部投药的部位无特别限定， 可以对名欠促进血管新生、增加血流量的部位(组织、器官等)以及发生缺血状 态的部位等投药。作为具体的局部投药部位的事例，可以列举出，下肢骨格肌、 上肢骨格肌、心脏(心肌)等。只要不会对全身造成大影响，而对患部局部有效，EPO书于生物的局部投药 方法无特别的限定。使用一般的注射器、注射针头、局部针等，都可以进行局 部给药。本发明中所谓的局部给药， 一般是指直接向欲促进血管新生、增加血流量 的部位和陷入缺血状态的部位以及其近旁等处，投与EPO衍生物。但是，也可 以通过直接连接这些部位的血管进行给药。(例如，在肝脏为缺血部位时，从肝 动脉投与EPO衍生物等。)本发明的治疗剂也包括以预防为目的的预防剂。干细胞含有物质干细胞是具有自我复制和分化能力的细胞，本发明所采用的干细胞即可以 是造血干细胞，也可以是除此之外的其他干细胞。本发明中所谓的干细胞物质，如果是含有千细胞的组成物，则无特别限定。 既可以仅含有干细胞，也可以包含有干细胞之外的其他成分。作为干细胞含有 物质，可以列举出骨髓、脐带血、末稍血等。希望的干细胞含有物质是骨髓细 胞。骨髓细胞即可以是自体骨髓，也可以是异体骨髓。而且，投与的骨髓组织 匹配抗原(HLA或者MHC)的类型不一定必须与患者一致，但是，希望与患者 一致。骨髓细胞可以通过向同业者公开的方法调制，例如，可以将哺乳动物全 身麻醉，从骨盆的部位(髂骨、大腿骨等)采集。采集的骨髓可以通过比重离 心法等众所周知的方法，分离有核细胞成分或者低比重细胞成分。骨髓细胞的投与量一般为lxl 0 6 ~ lxl 0"个/body，希望投与量为1 x 1 0 8 ~ 1 x 1 0 10个/body,最希望的投与量为3xi(T 6xio9个/ body。给药的方法无特别限定，尽管可以使用任何的方法给药，但是，希望的是 使用局部给药，特别希望对缺血部位进行肌肉内注射。骨髓细胞的给药可以向复数的部位或者分为复数的次数进行投药。例如，作为对四肢缺血的治疗给药的事例，可以列举出将浓缩为5 Oml的骨髓细胞含有溶'液，分别向5 0个部4立进4亍肌肉内给药的方法(每个部4立1 ml )。作为心月几 缺血治疗剂的事例，可以列举出将浓缩为1 Oml的骨髓含有溶液，分别向5 0 个部位进行肌肉内给药的方法(每个部位0.2ml)。本发明提供，以EPO衍生物和干细胞含有物质组合为特征的血流增加剂、 血管促进剂或者缺血性疾患治疗剂。EPO衍生物和干细胞含有物质即可以同时 给药，也可以依次给药。本发明的效果如后述的实施事例所示，本发明项目的发明者们在使用下肢缺血的标本进 行治疗效果实验时，观察到与EPO单独给药相比，去唾液酸EPO单独给药对下 肢坏死具有更强的抑制作用(生存效果)。在EPO单独给药的实验中，未见从发 绀状态的恢复，但是，通过去唾液酸EPO单独给药，观察到了从发绀状态恢复 的情况(实效性血管再生效果)。通过骨髓细胞移植和去唾液酸EPO给药的合并 给药，进一步显著地增加了生存效果以及实效性血管再生效果。使用未进行人工造成下肢缺血的无处置ICR小鼠，进行红细胞增多症的发 诱效果实验时，在投与EPO的实验中，观察到了成红细胞的亢进(Ret)、脾脏 的髓外造血的亢进(Sp)以及红细胞增多症(Hb、 Hct )。但在投与去唾液酸EPO 的实验中，未观察到这些副作用。本发明者虽然不受以下理论束缚，但是推测因为去唾液酸EPO比EPO在血 液中的分解速度快，不在血液中滞留，所以不引起红细胞增多症那样的副作用。根据本项发明，通过投与EPO衍生物，不会诱发红细胞增多症等不希望发 生的作用，可以使用于增加血流、促进血管新生以及治疗缺血性疾患。通过本项发明的实施事例，可作出进一步的说明，但是，本项发明不受这 些限定。当业者可以进行各种变更、修饰，这些变更、修饰也包含在本项发明 之内。以下实施事例的统计学解析，全部数据使用平均值士SD表示。通过使用 ANOVA进行群间的比较，然后，通过BON=FERRONI进行确率的检定。P<0.0024定义为无显著差异。实施例1:去唾液酸EPO的调制从使用CHO细胞通过遗传子组换法制作的EPO(中外制药抹式会社制)中， 才艮才居文献(Im ai N.Higuchi M. Kawamura A. Tomonoh K. Oh-Eda M. Fujiware M.Shimonaka Y. Ochi N. Physicochemical and biological characterization of asialoerythropoietin. Supp ressive effects of sialic acid in the expression of biological activity of human erythropoietin in vitro. European Journal of Biochemistry. 194(2):457-62.1990 Dec 12.)记载的方法，调制了去唾液酸EPO。通过SDS凝胶 电泳分子量的降低，以及等电点电泳pl的变化，确认除去了唾液酸。而且，通 过以EPO依存性细胞株的增殖作为指标的生物测定，确认去唾液酸EPO保持着 生物活性。去唾液酸EPO的制作将EPO冻干粉末以及神经氨(糖)酸甘酶(生化学工业)，用1 0 mM枸橼 酸-磷酸緩沖液(pH 6.5 )溶解，各自混合成lmg/ml以用2 5 0 mU。以3 7 。C孵化1小时后，通过C 4逆相HPLC纵列(VYDAC )的乙腈浓度梯度溶 出，精制出去唾液酸EPO。所得到的去唾液酸EPO中的唾液酸已经除去，可以通过SDS凝胶电泳确认 分子量降低，以及通过等电点电泳确认pl的变化得以证实。也就是说，将去唾 液酸EPO5.0昭，在SDS-PAGE样品緩冲剂(TEFCO)中，进行1 0 0 °C ,1 0分钟的转换处理，用其全量l 4 %的丙烯酰胺(TEFCO)进行了电泳。将 凝胶进行C B B染色，确认分子量约降低了 5 KDa。使用PhastGel正F 3-9(Amersham)进行等电点电泳后，用2 0 %三氯醋酸溶液进行固定化处理，使 用PhastGel蛋白银染试剂盒进行银染色。确认了由于唾液酸的解离，pi变化至8.0的附近。去唾液酸E P O的生物活性通过以E P O依存性细胞抹的增殖作为指标，确认了去唾液酸E P O具有生物活性。既，将E P O依存性增殖细月包A S - E 2细月包4朱(文献Miyazaki Y.Kuriyama K. Higuchi M. Tsushima H. Sohda H. Imai N. Saito M. Kondo T. Tomonaga M. Establishment and characterization of a new erythropoietin-dependentacute myeloid leukemia cell line，AS-E2丄eukemia.11(11 ):1941-9， 1977 Nov.)在0 .0 4 ~ 1 0ng/ml的去唾液酸E P O或者含有E P O的2 0 % F C S / I MD M培养基中(Hyclone),在3 7 °C 5 . 0 % C O 2条件下，培养3 ~ 4天，使用WS T - 1试剂(宝酒造)测定活细胞数。确诊了去唾液酸E P O也具有与E P O同样的增殖刺激。实施例2 :从日本横滨的Charles Riner购入雄性8周龄的I CR小鼠用于实验。所有 的实验顺序按照Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH出版号 86-23;National Institute of Health，Bethesda，MD),在无菌条件下进行。通过向小 鼠的腹腔内投与氯胺酮(6 0 mg / kg BW)以及甲苯p塞。秦6 mg / kg BW )麻 醉小鼠。按照Isner的方法切开左下肢中间部位的皮肤，暴露血管(Couffinhal T， Silver M， Zheng LP, Kearney M， Witzenbichler B, Isner JM: Mouse model of angiogenesis. Am JPathol 152: 1667 - 1679， 1998 )。结扎大腿动脉起始部后，结扎该潜在动脉，剥离其他的侧枝，与主动脉一同切除。 所有的小鼠都给以通常的饮食和饮水。实施例3 : ^吏用下肢缺血标本的治疗效果实施 (实施方法)使用实施例2的方法制作的I CR小鼠下肢缺血标本进行了治疗实验。在 实验中，将下肢的坏死定义为死(survival )。并将下肢发绀的恢复定义为恢复 (recovery)。实验中使用了以下各群(各群1 3匹)。 C群无治疗14E群E P O ( 4 0 0 U /kg体重，缺血部^f立月几肉内注射)连续6天给药的治疗。AE群同剂量同给药方法的去唾液酸EPO治疗。B群将lxl 0 7个骨髓细胞，在缺血部位进行肌肉内注射的治疗(在第1天， 分4个部位给药)B + E群合并使用B (骨髓细胞)和E ( EPO)。 B + AE:合并使用B和AE (去唾液本EPO) (结果)各治疗的生存效果、恢复效果以及结果如图l、图2所示。将结果总结如下(1 ) E P O单独给药对下肢坏死有抑制作用，但去唾液酸E P O单独 给药对下肢坏死有更强的抑制作用(生存效果)。(2 ) E P O单独给药时未观察到从发绀状态的恢复，但去唾液酸E P O单独给药时，观察到了从发绀状态的恢复(实效性血管再生效果)。(3)虽然观察到骨髓细胞移植具有生存效果以及实效性血管再生效果， 但是，合并使用EPO给药可以增强这些效果，如果将去唾液酸EPO代替E PO合并使用，则能更有效地显著增强这些效果。实施例4:导致红细胞增多症发病的效果 (实验方法)以观察E P O的副作用红细胞增多症的发病为目的，对不进行人工制作下 肢缺血的未经处置的I C R小鼠，连续6天的E P O给药或者去唾液酸E P O 给药(下肢肌肉内注射)，在给药第l天起算的l 0天后，采血后实施安乐死， 测定脾脏的重量(Sp)。并测定血红蛋白浓度(Hb)、红细胞压积值(Hct)以 及网状红细胞比率(Ret)。实验中使用了以下各群(各群8匹)。 C群对照E群E P O的每;欠给药量为4 0 ， 4 0 0或者4 0 0 0 U / kg。 AE群同等剂量的去唾液酸E P O (结果)各给药剂量的Sp:脾脏重量，Hb:血红蛋白浓度，Hct:红细胞压积值， Ret:网状红细胞的效果如图3所示。结果总结如下(1 )观察到通过E P O给药，造成的成红细胞造血亢进(Ret),脾脏的 髓外造血亢进(Sp)以及红细胞增多症(Hb、 Hct)。(2 )未观察到通过去唾液酸E P O给药造成的这些副作用。
权利要求
1. 以红细胞生成素(EPO)衍生物为有效成分的缺血性疾病治疗剂。
2. EPO衍生物是去唾液酸EPO的在权利要求1记载的治疗剂。
3. 与干细胞含有物质一同投药的在权利要求1或权利要求2记载的治疗剂。
4. 干细胞含有物质是骨髓细胞的在权利要求3记载的治疗剂。
5. 以EPO衍生物作为有效成分的血管促进剂。
6. EPO衍生物是去唾液酸EPO的在权利要求5记载的促进剂。
7. 与干细胞含有物质一同投药的在权利要求5或权利要求6记载的促进剂。
8. 干细胞含有物质是骨髓细胞的在权利要求7记载的促进剂。
9. 以EPO衍生物为有效成分的血流增加剂。
10. EPO衍生物是去唾液酸EPO的在权利要求9记载的增加剂。
11. 与干细胞含有物质一同投药的在权利要求9或权利要求IO记载的增加剂。
12. 干细胞含有物质是骨髓细胞的在权利要求7记载的增加剂。
全文摘要
本发明公开了一种以红细胞生成素(EPO)衍生物作为有效成分的血流增加剂、血管促进剂以及缺血性疾患治疗剂。
文档编号A61K38/22GK101247822SQ20068001951
公开日2008年8月20日 申请日期2006年6月1日 优先权日2005年6月1日
发明者加藤公则, 樋口正人, 鸟羽健 申请人:新潟Tlo株式会社