增强细胞、组织、器官和生物的存活力的方法、组合物和制造品的制作方法

专利名称：增强细胞、组织、器官和生物的存活力的方法、组合物和制造品的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于在分离的组织中诱导停滞的方法，该方法包括a)鉴定其中期望停滞的组织；以及b)将该组织暴露于有效量的氧拮抗剂来诱导停滞。
本发明的组合物、方法和制造品可用于生物物质上，该生物物质将被转移回到生物物质来源的(自体的)供体生物或不同的接受(异源的)受试者中。在一些实施方案中，生物物质直接从供体生物获得。在另一些实施方案中，在暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物前，将生物物质置于培养物中。在一些情况中，生物物质从在取出该生物物质前实施了体外膜式人工氧合法的供体组织获得，体外膜式人工氧合法是一种实施来帮助保存生物物质的技术。而且，方法包括将其中诱导了停滞的生物物质施用或移植至活的接受生物。
在一些实施方案中，将要取回并然后移植的器官或组织暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物，同时仍然在供体受试者中。考虑在一些案例中，将供体的脉管系统用于将器官或组织暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物。如果心脏仍然搏动或者泵、导管或注射器可用于施用氧拮抗剂或其它活性化合物至脉管系统中来递送至器官或组织，可以进行这种方法。
本发明的方法也涉及在分离的组织中诱导停滞，包括用氧拮抗剂或产生低氧条件的活性停滞化合物孵育组织有效量的时间，用于该组织进入停滞。
处于停滞状态或已经进行停滞的细胞可以在许多应用中使用。例如，它们可以用于输注或移植(治疗性应用)；用于研究目的；用于筛选检测来鉴别、表征或生产诱导停滞的其它化合物；用于检测从其获得细胞的样品(诊断应用)；用于保存或防止对将要放回细胞来源的生物中的细胞的损伤(预防性应用)；和用于保存或防止在运输或存储过程中对细胞的损伤。这种应用以及其它用途的细节在下面描述。
本发明涉及用于在与生物分离的一种或多种细胞中诱导停滞的方法，该方法包括a)鉴定其中期望停滞的细胞；以及b)将所述细胞暴露于有效量的氧拮抗剂或其它活性停滞化合物来诱导停滞。
考虑细胞可以是任何利用氧的细胞。细胞可以是真核或原核的。在某些实施方案中，细胞是真核的。更特别地是，在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。考虑用于本发明的哺乳动物细胞包括但不限于来自以下的那些细胞人、猴、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、山羊、猪、狗、猫、白鼬、奶牛、绵羊和马。
而且，本发明的细胞可以是二倍体，但在一些案例中，细胞是单倍体(性细胞)。而且，细部可以是多倍体、非整倍体或无核细胞。细胞可以来自特殊的组织或器官，例如来自以下的组织或器官心、肺、肾、肝、骨髓、胰、皮肤、骨、静脉、动脉、角膜、血、小肠、大肠、脑、脊髓、平滑肌、骨骼肌、卵巢、睾丸、子宫和脐带。而且，细胞也可以表征为以下细胞类型之一血小板、髓细胞、红血球、淋巴细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、内分泌细胞、神经胶质细胞、神经元、分泌细胞、屏障功能细胞、收缩细胞(contractile cell)、吸收细胞、粘膜细胞、缘细胞(来自角膜)、干细胞(全能性、多能性(pluripotent)或多潜能性(multipotent))、未受精的或受精的卵母细胞或精细胞。
本发明也提供用于通过减少目标生物物质中的代谢需求、需氧量、温度或它们的任意组合，来增加在不利条件下生物物质的存活力和/或减少对其损伤的方法、组合物和仪器。在本发明的一些实施方案中，生物物质的存活力通过提供给它有效量的保护性代谢剂来增强。该试剂通过防止或减少对生物物质的损伤、阻止全部或部分的生物物质死亡或衰老，和/或延长全部或部分的生物物质的寿命来增强存活力，相对于不暴露于该试剂的生物物质。可替代地，在一些实施方案中，试剂延长组织和/或生物的存活，否则所述的组织和/或生物在没有该试剂时则将不会存活。
考虑，“保护性代谢剂”是能够可逆地改变暴露于或与其接触的生物物质的新陈代谢或增强该生物质的存活力的物质或化合物。
在某些实施方案中，保护性代谢剂在受处理的生物物质中诱导停滞；同时，在另外的实施方案中，保护性代谢剂本身不直接在受处理的生物物质中诱导停滞。保护性代谢剂以及其它活性化合物可以增强生物物质的存活力和/或减少对它的损伤而本身在所述生物物质中不诱导停滞，而是通过减少细胞呼吸和对应的代谢活动至少于约50％的氧消耗或二氧化碳产生的降低的程度。而且，这类化合物可以引起生物物质响应损伤或疾病状态而更加快速、容易或有效地进入或达到停滞，例如通过诱导生物物质达到预停滞状态。
存活力包括当物质处于不利条件-即，在可能有对生物物质不利的和不可逆的损害或损伤的条件下时的存活力。不利的条件包括但不限于当环境中氧浓度降低时(低氧或无氧，例如在高海拔或在水下)；当生物物质不能接收那些氧时(例如在缺血时)，这可以由以下因素引起i)由于血管阻塞(例如，心肌梗塞和/或中风)引起的减少血液流向器官(例如，心脏、脑和/或肾脏)，ii)在心脏/肺旁路手术过程中发生的体外血液分流(例如，其中心脏或脑组织由于心肺旁路手术而受到损伤的“泵头(pumphead)综合征”)或iii)由于创伤引起的失血(例如，出血性休克或手术)；体温过低，其中生物物质经受低于生理学的温度，这是由于暴露于冷的环境或由于生物材料的低温状态，这样其不能维持足够的生物材料的氧合；高温，其中生物材料经受超过生理学的温度，这是由于暴露于热环境或例如由恶性发热引起的生物材料的高温状态；过量重金属的病状，例如铁障碍(遗传性的以及环境性的)如血色素沉着症、获得性铁超负荷、镰状细胞性贫血、青少年血色病、饮食性血铁质沉着症、地中海贫血症、迟发性皮肤卟啉症、高铁成红细胞性贫血、缺铁性贫血和慢性病性贫血。考虑，保护性代谢剂是本发明某些实施方案中的氧拮抗剂。也考虑，在某些其它实施方案中，氧拮抗剂不是保护性代谢剂。在本发明的其它实施方案中，一种或多种化合物可用于增加或增强生物物质的存活力；可逆地抑制生物物质的代谢和/或活性；减少生物物质的需氧量；减少或防止在不利条件下对生物物质的损伤；防止或减少对生物物质的损害或损伤；防止生物物质的老化或衰老，以及提供如整个申请中描述的关于氧拮抗剂的治疗好处。考虑，涉及诱导停滞的实施方案也可应用于这些其它实施方案。因此，关于停滞讨论的任何实施方案可根据这些其它实施方案实施。
用于诱导停滞的活性化合物或任意这些其它实施方案可以导致或提供它们的预期效果，在一些实施方案中，仅在它们在生物物质的环境中时提供预期效果(即没有持续的效果)和/或它们可以提供这些效果超过该生物物质不再暴露于它们后的24小时。而且，当使用活性化合物的组合时，这也可以是这种情况。
在某些实施方案中，将生物物质暴露于一定量的氧拮抗剂或其它活性化合物，其减少生物物质产生二氧化碳的速率或量至少2倍，而且是约、至少约或至多约3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、15-、20-、25-、30-、35-、40-、45-、50-、100-、200-、300-、400-、500-倍或更多，或可源于其中的任何范围。可替代地，考虑本发明的实施方案可以用约、至少约或至多约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或更多、或可源于其中的任何范围的生物物质产生二氧化碳的速率或量的减少来讨论。在更进一步的实施方案中，将生物物质暴露于一定量的氧拮抗剂或其它活性化合物，其减少生物物质消耗氧的速率或量至少2倍，而且是约、至少约或至多约3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、15-、20-、25-、30-、35-、40-、45-、50-、100-、200-、300-、400-、500-倍或更多，或可源于其中的任何范围。可替代地，考虑本发明的实施方案可以用约、至少约或至多约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或更多，或可源于其中的任何范围的生物物质消耗氧的速率或量的减少来讨论。在更进一步的实施方案中，将生物物质暴露于降低至少10％，而且降低约、至少约、或至多约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％或可源于其中的任何范围的运动或活动力的量氧拮抗剂或其它活性化合物。和其它实施方案一样，这些特征和参数与任何一种诱导进停滞状态的生物物质相关。因此，如果在生物的心脏诱导停滞，这些参数将根据心脏而不是整个生物来评估。关于生物，大概8倍量级的氧消耗的减少是一种称为“冬眠”的停滞。而且，在本申请中应该理解，约1000-倍量级的氧消耗的减少可以认为是“滞生”。应该理解，涉及停滞的本发明实施方案可以根据需要，在冬眠或滞生水平上完成。应该理解“-倍减少”减少的量有关；例如，如果非冬眠动物消耗800单位的氧，则冬眠动物消耗100单位的氧。
而且，在本发明的一些实施方案中，提供了方法用于减少细胞呼吸，所述的细胞呼吸可以是或可以不是与达到停滞所需的一样高。在本发明的方法中提供了约、至少约或至多约1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％的氧消耗的减少。这也可以以任何细胞呼吸指标来表示和评估。
考虑可将生物物质暴露于一种或多种氧拮抗剂或其它活性化合物多于一次。考虑，可将生物物质暴露于一种或多种活性化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次，这表示当将生物物质暴露多次时，其间有间歇期(就暴露于活性化合物来说)。
也考虑，可在有害损害或疾病状态的开始或进展之前、期间、之后或它们的任意组合施用活性化合物。在某些实施方案中，用活性化合物预处理生物物质足以增强存活力和/或减少有害损害或疾病损害引起的损伤。将预处理定义为在有害损害或疾病损害开始或检出前，将生物物质暴露于活性化合物。预处理之后，可以在伤害开始时或接近时终止暴露，或在伤害开始之后继续暴露。
在某些实施方案中，将包括预先暴露于活性化合物(即预处理)的方法用于处理这样的状况，在该状况中有害损害或疾病损害是1)预定的或预先选择的，或2)预先预测有可能发生的。符合条件1的实例包括但不限于，其中可能自发地或由操作导致出现失血的大外科手术、其中血液的氧合作用可能受损害或其中血液的血管递送可能减少(如在安装冠状动脉旁路嫁接(CABG)手术的环境中)的心肺旁路手术，或在将供体器官移出用于输送和移植进需要器官移植的接受者前处理器官供体中。符合条件2的实例包括，但不限于，其中损伤或疾病发展的风险是固有的医学病症(例如在不稳定的心绞痛、血管成形术后、出血性动脉瘤、出血性中风，大的创伤后或失血)，或其中风险可以用医学诊断检测诊断的医学病症。
当暴露在有害损害或疾病损害开始或检测后发生来获得治疗效果时，暴露于活性化合物可以增强存活力或减少损伤。暴露于活性化合物可以是短暂的或长期的。暴露持续时间可以仅为达到停滞活动或预停滞的指标(例如，血pCO2、pO2、pH、乳酸或硫血红蛋白水平或体温)所需的时间一样长，或可以更长。在某些实施方案中，暴露在生物受到创伤性损伤(包括医源性和/或非医源性损伤)后发生，并且用于在整个生物或其中受损伤的组织中诱导停滞或预停滞，以便在治疗前、治疗期间和/或治疗之后，防止损伤，例如局部缺血和再灌注损伤或使其最小化。
在一个实施方案中，本发明包括保护哺乳动物免于遭受由手术引起的细胞损伤的方法，其包括提供给哺乳动物足以诱导哺乳动物在手术前进入预停滞的量的硫化氢或其它活性化合物。手术可以是可选择的、经计划的或急救外科手术，例如心肺外科手术。硫化氢可以通过本领域中可利用的任何手段，包括，例如由静脉内或通过吸入来施用。
在另一个实施方案中，本发明包括保护哺乳动物免于遭受由疾病或不利医学状况引起的细胞损伤的方法，其包括提供给哺乳动物足以诱导哺乳动物在疾病或不利的医学状况开始或进展前进入预停滞或停滞的量的硫化氢或其它活性化合物。该实施方案可用于多种不同疾病和不利的医学状况，包括，例如不稳定的心绞痛、血管成形术后、动脉瘤、出血性卒中或休克、创伤或失血。
在特别的实施方案中，本发明涉及通过提供给哺乳动物足以防止动物出血死亡的量的硫化氢或其它活性化合物，来防止生物，例如哺乳动物出血死亡或遭受由出血引起的不可逆的组织损伤的方法。在某些其它的实施方案中，生物可以进入失血性休克，但不会由于过量出血死亡。术语“流血”和“失血”可交换使用来指血液从血管的任何流出。其包括但不限于，内出血和外出血、由损伤(其可能来自内部源或来自外部物理源，例如来自枪击、刺伤、物理创伤等)引起的出血。
而且，本发明的另外实施方案涉及防止由失血或其它对细胞或组织氧合作用的缺少，例如缺少足够的血液供应引起的死亡或不可逆的组织损伤。这可以是例如，实际的血液丧失引起，或可能是由防止细胞或组织得到灌注(例如再灌注损伤)、引起血液至细胞或组织的阻碍、局部或整体地降低生物中的血压、减少血液中携带的氧的量或减少血液中氧携带性细胞的数目的状况或疾病的结果。可能涉及的状况和疾病包括但不限于，血凝块和栓塞、囊肿、生长(growth)、肿瘤、贫血(包括镰状细胞性贫血)、血友病、其它血凝固疾病(例如，冯·威利布兰德病，ITP)和动脉粥样硬化。这些状况和疾病也包括由于损伤、疾病或状况，对细胞或组织产生基本低氧或无氧状况的那些。
在一些案例中，将亚致死总剂量或非致死总剂量施用给生物物质。如上面讨论的，关于在不是整个生物的生物物质中诱导停滞，“亚致死总剂量”表示多次施用活性化合物的量，其总体少于将引起至少大部分细胞在一次施用的24小时内死亡的活性化合物的量的一半。在其它实施方案中，将有效量表征为氧拮抗剂或其它活性化合物的近致死剂量。同样，“近致死总剂量”表示多次施用氧拮抗剂或其它活性化合物的量，其在将引起至少大部分细胞在一次施用的24小时内死亡的活性化合物的量的25％内。而且，“超致死总剂量”表示多次施用活性化合物的量，其至少为将引起至少大部分细胞(或整个生物)在一次施用的24小时内死亡的活性化合物的量的1.5倍。考虑可以施用多次剂量以便在整个生物中诱导停滞。“亚致死总剂量”、“近致死总剂量”和“超致死总剂量”的定义可以基于前面讨论的用于整个生物中停滞的单独剂量来推断。
可将生物物质暴露于多于一种氧拮抗剂或其它活性化合物或与其接触。可将生物物质暴露于至少一种活性化合物，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多氧拮抗剂或其它活性化合物，或可源于其中的任何范围。对于多种活性化合物，术语“有效量”指活性化合物的总量。例如，可将生物物质暴露于第一种活性化合物并然后将其暴露于第二种活性化合物。可替代地，可将生物物质同时或以重叠的方式暴露于多于一种的活性化合物。此外，考虑可将多于一种活性化合物包含或混合在一起，例如包含或混合于生物物质暴露的单个组合物中。因此考虑到，在一些实施方案中，在本发明的组合物、方法和制造品中采用活性化合物的组合。
可通过吸入、注射、导管插入、浸渍、灌洗、灌注、局部应用、吸收、吸附或经口施用，给生物物质提供或将其暴露于活性化合物。而且，可以通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、鞘内、玻璃体内、阴道内、直肠内、表面、瘤内、肌内、腹膜内、眼内、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、经口、表面、局部、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注、经由导管或经由灌洗施用至生物物质，给生物物质提供或将其暴露于活性化合物。
本发明的方法和装置涉及保护剂，该保护剂在一些实施方案中是氧拮抗剂。在更进一步的实施方案中，氧拮抗剂是还原剂。而且，氧拮抗剂可被表征为硫属化物化合物。应该理解，活性化合物也可以是保护剂。而且，只要其实现本发明的目标，任何硫属化物化合物都可以认为是活性化合物，而不管其是否是氧拮抗剂。
在某些实施方案中，硫属化物化合物包括硫，而在另外的实施方案中，其包括硒、碲或钋。在某些实施方案中，硫属化物化合物含有一种或多种暴露的硫化物基团。考虑，这种硫属化物化合物含有1、2、3、4、5、6或更多的暴露的硫化物基团，或可源于其中的任何范围。在特别的实施方案中，这种含硫化合物是CS2(二硫化碳)。
而且，在本发明的一些方法中，通过将细胞暴露于具有以下化学结构(称为式I)的还原剂在细胞中诱导停滞
其中X是N、O、Po、S、Se或Te； 其中Y是N或O； 其中R1是H、C、低级烷基、低级醇或CN； 其中R2是H、C、低级烷基、低级醇或CN； 其中n是0或1； 其中m是0或1； 其中k是0、1、2、3或4；以及， 其中p是1或2。
术语“低级烷基”和“低级醇”是根据它们的通常意义使用的，并且符号是用于指化学元素的符号。这种化学结构将称作“还原剂结构”，并且具有这种结构的任何化合物将称为还原剂结构化合物。在另外的实施方案中，在还原剂结构中k是0。而且，在其它实施方案中，R1和/或R2基团可以是胺或低级烷基胺。在其它实施方案中，R1和/或R2可以是短链醇或短链酮。而且，R1和R2可以是线性或支链的桥和/或该化合物可以是环状化合物。在更进一步的实施方案中，X也可以是卤素。术语“低级”意思是指1、2、3、4、5或6个碳原子或可源于其中的任何范围。而且，R1和/或R2可以是其它小有机基团，包括C2-C5酯、酰胺、醛、酮、羧酸、醚、腈、酐、卤化物、酰基卤、硫化物、砜、磺酸、亚砜和/或硫醇。关于R1和/或R2，明确地考虑这些取代。在某些其它的实施方案中，R1和/或R2可以是短链形式的上面讨论的小有机基团。“短链”表示1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳分子，或可源于其中的任何范围。
考虑在一些案例中，所述的还原剂结构化合物可以是硫属化物化合物。在某些实施方案中，硫属化物化合物具有烷基链，其含有暴露的硫属化物。在另外的实施方案中，所述的硫属化物化合物具有一旦为生物物质吸收则变得暴露的硫属化物。在这方面，所述的硫属化物化合物类似于作为氧拮抗剂的前药。因此，在将生物物质暴露于所述硫属化物化合物后，该化合物上的一个或多个硫、硒、氧、碲、钋或116号元素(ununhexium)分子变得可以利用。在该情况中，“可利用”表示硫、硒、氧、碲、钋或116号元素将保持负电荷。
在某些实施方案中，硫属化物是盐，优选是其中硫属元素是-2氧化态的盐。本发明的实施方案包含的硫化物盐包括但不限于，硫化钠(Na2S)、硫氢化钠(NaHS)、硫化钾(K2S)、硫氢化钾(KHS)、硫化锂(Li2S)、硫化铷(Rb2S)、硫化铯(Cs2S)、硫化铵((NH4)2S)、硫氢化铵((NH4)HS)、硫化铍(BeS)、硫化镁(MgS)、硫化钙(CaS)、硫化锶(SrS)、硫化钡(BaS)等。类似地，本发明的实施方案包含，但不限于对应的硒化物和碲化物盐。特别考虑，本发明包括具有可药用载体或制备为可药用制剂的含有硫属化物盐(是盐的硫属化物化合物)的组合物。在进一步的实施方案中，还原剂结构化合物选自H2S、H2Se、H2Te和H2Po。在一些案例中，式(I)的还原剂结构具有是S的X。在另外的案例中，X是Se，或X是Te，或X是Po，或X是O。此外，在一些实施方案中，还原剂结构中的k是0或1。在某些实施方案中，还原剂结构化合物是二甲亚砜(DMSO)、二甲硫醚(DMS)、一氧化碳、甲硫醇(CH3SH)、巯基乙醇、硫氰酸盐、氰化氢、甲硫醇(MeSH)或CS2。在特殊的实施方案中，氧拮抗剂是H2S、H2Se、CS2、MeSH或DMS。这些分子的大小量级的化合物是特别考虑的(即，在它们的分子量平均值的50％内)。
在某些实施方案中，采用含有硒的化合物例如H2Se。在本发明的一些实施方案中，H2Se的量可以在十亿分之1-1000份的范围内。进一步考虑，在含硫化合物的内容中讨论的任何实施方案可以用含硒的化合物实现。这包括用对应的硒原子替代含硫分子中的一个或多个硫原子。
本发明的进一步方面包含由式IV表示的化合物
其中 X是N、O、P、Po、S、Se、Te、O-O、Po-Po、S-S、Se-Se或Te-Te； n和m独立地是0或1；以及 其中R21和R22独立地是氢、卤素、氰基、磷酸酯、硫基、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、氨基烷基、氰基烷基、羟基烷基、卤代烷基、羟基卤代烷基、烷基磺酸、硫代磺酸、烷基硫代磺酸、硫代烷基、烷硫基、烷基硫代烷基、烷基芳基、羰基、烷基羰基、卤代烷基羰基、烷基硫代羰基、氨基羰基、氨基硫代羰基、烷基氨基硫代羰基、卤代烷基羰基、烷氧基羰基、氨基烷硫基、羟基烷硫基、环烷基、环烯基、芳基、芳氧基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、磺酸、磺酸烷基酯、硫代硫酸酯或磺酰氨基；以及 Y是氰基、异氰基、氨基、烷基氨基、氨基羰基、氨基羰基烷基、烷基羰基氨基、脒基、胍、肼基、酰肼、羟基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、环烷氧基、羰基氧基、烷基羰基氧基、卤代烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、羰基过氧基、烷基羰基过氧基、芳基羰基过氧基、磷酸酯、烷基磷酸酯、磺酸、磺酸烷基酯、硫代硫酸酯、硫代次磺酰基、磺酰胺、-R23R24，其中R23是S、SS、Po、Po-Po、Se、Se-Se、Te或Te-Te，以及R24是如在此关于R21的定义，或者Y是
其中X、R21和R22是如在本文中定义的。
而且，考虑在本发明的一些实施方案中，给生物物质提供前体化合物，这些前体化合物通过暴露于生物物质，例如通过化学或酶促手段而变成式I或IV化合物的活性形式。而且，可将化合物作为该化合物的盐、以游离基的形式或带负电荷、带正电荷或带多个电荷的形式提供给生物物质。一些化合物既符合式I又符合式IV结构，并且在该情形中，短语“式I或式IV”的使用无意于暗示排除这类化合物。
在某些实施方案中，由式I或式IV的结构确定的化合物也被表征为氧拮抗剂、保护性代谢剂或其前体、前药或盐。进一步考虑，所述的化合物本身不必表征或本身证明为用于本发明的化合物，只要其实现本发明的一个特殊的方法。在一些其它的实施方案中，化合物可以认为是硫属化物化合物。特别考虑，在本发明的方法、组合物和仪器中，由式I或式IV的结构确定或在本公开内容中提出的任何化物可代替氧拮抗剂使用或与氧拮抗剂组合使用；类似地，关于具有式I或式IV的任意结构所讨论的或在本公开中另外提出的任意实施方案可以代替氧拮抗剂使用或与氧拮抗剂组合使用。而且，由式I或式IV的结构确定或在本公开内容中陈述的任何化物可以与在此描述的任何氧拮抗剂或任何其它活性化合物组合。也考虑，在本发明的方法、组合物和其它制造品中，这些化合物的任意组合可以一起、连续(重叠或不重叠)和/或以重叠的连续方式(开始施用一种化合物并且在其完成之前，又开始施用另一化合物)提供或配制，来获得在此陈述的期望效果。
在某些实施方案中，提供了多于一种具有式I或式IV结构的化合物。在某些实施方案中，采用具有相同式(即式I或式IV)结构的多种不同化合物，而在另外的实施方案中，当采用多种不同化合物时，它们来自不同的式。
在特别的实施方案中，考虑使用多种活性化合物，其中一种化合物是二氧化碳(CO2)。考虑在一些实施方案中，至少一种其它化合物也是式I和/或是IV化合物。在某些案例中，将二氧化碳与H2S或H2S前体组合提供给生物物质(一起、连续或以重叠的连续方式)。
生物物质可以暴露的二氧化碳的量是约、至少约或至多约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30％或更多，或可源于其中的任何范围。在某些实施方案中，所述的量用ppm表示，例如约、至少约或至多约350、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、39000、40000、41000、42000、43000、44000、45000、46000、47000、48000、49000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000或更多ppm，或可源于其中的任何范围，以及以摩尔当量表示。考虑这些浓度可应用于气体形式的任何其它活性化合物。
在其它实施方案中，特别考虑活性化合物是硫化钠、硫代甲醇钠、巯乙胺、硫氰酸钠、巯乙胺-S-磷酸钠盐或四氢噻喃-4-醇。在另外的实施方案中，活性化合物是二甲亚砜、硫代乙酸、硒脲、2-(3-氨丙基)-氨基乙硫醇-二氢-磷酸酯、2-巯基-乙醇、巯基乙醚(thioglycolicether)、硒化钠、甲亚磺酸钠、硫脲或二甲硫醚。特别考虑，这些化合物或在此讨论的包括任何具有式I、II、III或IV的化合物在内的任何其它化合物可以以约、至少约或至多约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171，172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、10000mM或mmol/kg(生物物质)或可源于其中的任何范围的量提供给或施用至生物物质。
特别考虑，由名称或结构确定的活性化合物的任意子集可用于方法、组合物和制造品中。也特别考虑，可以放弃这些化合物的任意子集，其不构成本发明的实施方案。本发明也涉及含有治疗上有效量的一种或多种活性化合物的药物组合物。当然，将这类药物组合物配制成可药用组合物。例如，所述的组合物可以包括可药用稀释剂。
在某些实施方案中，药物组合物含有有效剂量的活性化合物，以在施用给患者时，提供Cmax或稳态的活性化合物血浆浓度，以产生治疗上有效的好处。在某些实施方案中，要达到的Cmax或稳态血浆浓度是约、至少约或至多约0.01、0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000(M或更多，或可源于其中的任何范围。在某些实施方案中，例如对于H2S，期望的Cmax或稳态血浆浓度是在约10μM至约10mM之间、约100μM至约1mM之间或约200μM至约800μM之间。可以考虑合适的手段并评估已经在血液中的化合物，例如硫的水平。
在某些实施方案中，药物组合物提供有效剂量的H2S，以在施用给患者时提供在约10μM至约10mM之间、约100μM至约1mM之间，或约200μM至约800μM之间的Cmax或稳态血浆浓度。在给予硫化氢与给予硫化物盐的关系方面，在典型的实施方案中，该盐的给药是基于施用与H2S的给药大概相同的硫当量。将考虑合适的手段并用来评估已经在血液中的硫的水平。
在某些实施方案中，组合物含有气体形式的一种或多种上面指定的活性化合物。在另一实施方案中，组合物包含一种或多种这些化合物的盐。在一个特别的实施方案中，药物组合物包含气体形式的式I或IV或式I或IV的盐。在本发明的一些方面特别考虑H2S的气体形式或盐。考虑提供给生物物质的气体的量是约、至少约或至多约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、39000、40000、41000、42000、43000、44000、45000、46000、47000、48000、49000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000或更多ppm，或可源于其中的任何范围。可替代地，气体的有效量可表示为关于在生物物质暴露的空气中的浓度，为约、至少约或至多约0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，或可源于其中的任何范围。而且，考虑到对于一些实施方案，提供给生物物质的气体的量是约、至少约或至多约十亿分之5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000份(ppb)或可源于其中的任何范围。在特别的实施方案中，提供给生物物质的硒化氢的量是在该量级大小上。
在本发明的一些实施方案中，药物组合物是液体。如在别处讨论的，组合物可以是具有溶解或鼓泡进该组合物中的相关化合物的液体。在一些情形中，药物组合物是医用气体。根据美国食品和药品管理局，“医用气体”是这样的气体该气体是联邦食品、药品及化妆品法(“法案”)(21U.S.C.§321(g))的§201(g)(1)含义内的药品，并且根据该法案的§503(b)(1)(A)(21U.S.C.§353(b)(1)(A))，要求处方配药。这样，这些医用气体需要合适的FDA标签。医用气体包括至少一种活性化合物。
本发明进一步包含仪器和制造品，其包含包装材料和包含于包装材料内的活性停滞化合物，其中包装材料包含表明其可以用于在体内的生物物质中诱导停滞的标签。
在一些实施方案中，仪器或制造品进一步包含药用稀释剂。在特别的其它实施方案中，仪器或制造品具有缓冲剂。所述的活性化合物在第一种密封的容器中提供，而所述的可药用稀释剂在第二种密封的容器中提供。在其它实施方案中，所述装置或物品进一步具有用于混合活性化合物和稀释剂的说明书。此外，可将活性化合物重构来实现本发明的任何方法，例如用于在体内的生物物质中诱导停滞。考虑任何标签将具体说明要获得的结果和化合物用于需要该结果的患者的应用。
本发明也涉及制造品，其包括包装在一起的以下物质活性化合物、使用所述活性停滞化合物的说明书，所述说明书包括(a)鉴别需要停滞处理的体内组织；和(b)施用有效量的活性化合物至所述的体内生物物质。
在本发明的进一步实施方案中，存在含有医用气体的制造品，其包括活性化合物和标签，标签包括用于在生物物质中诱导停滞或用于本发明的任何其它方法的细节或用法和施用。
本发明也涉及试剂盒和使用这些试剂盒的方法。在一些实施方案中，存在用于递送活性化合物至需要停滞处理或要求保护的发明的任何其它处理的组织位点的试剂盒，所述的试剂盒包括覆盖物(drape)，适用于对组织位点形成密封的包(envelope)；含有氧拮抗剂的容器；以及覆盖物中的一个入口，其中含有活性化合物的该容器与该入口连通。在某些实施方案中，试剂盒在覆盖物中包括一个出口，其中该出口与负压源连通。在一些情形中，该覆盖物包含弹性材料和/或具有覆盖该覆盖物边缘的压敏粘合剂。可以让该出口与负压源处于流体连通，所述的负压源可以是或可以不是真空泵。在出口和负压源之间也可以有柔性导管连通。在一些实施方案中，试剂盒包括一个小罐(canister)，其可以是可拆卸的或可以不是可拆卸的，与出口和负压源之间流体连通。考虑容器包含与入口进行气体连通的活性化合物。在某些实施方案中，容器包括是气体或液化气体的活性化合物。试剂盒也可以包含与含有氧拮抗剂的容器和入口之间连通的蒸发器。而且，其可以具有与含有活性化合物的容器连通的回流出口。
在特别的实施方案中，试剂盒中的活性化合物是一氧化碳、二氧化碳、H2Se和/或H2S。在某些实施方案中，试剂盒或方法应用的组织位点受到伤害。
而且，通常应该理解，在此作为氧拮抗剂讨论的任何化合物可以以前药的形式提供给生物物质，这表示生物物质或该生物物质环境中的其它物质将前药变成其活性形式，即变成氧拮抗剂。考虑术语“前体”涵盖被认为是“前药”的化合物。
氧拮抗剂或其它活性化合物可以是或可以作为气体、半固体液体(例如凝胶或糊)、液体或固体提供。考虑可将生物物质暴露于多于一种这类活性化合物和/或多于一种状态的该活性化合物。而且，可配制活性化合物用于特殊的施用模式，如在此讨论的。在某些实施方案中，活性化合物是在用于静脉内递送的可药用制剂中。
在某些实施方案中，活性化合物是气体。在特别的实施方案中，气体活性化合物包括一氧化碳、二氧化碳、氮气、硫、硒、碲或钋，或其混合物。而且，特别考虑，活性化合物是气体形式的硫属化物化合物。在一些实施方案，活性化合物是在含有多于一种气体的气体混合物中。在一些实施方案中，其它气体是无毒的和/或非活性气体。在一些实施方案中，其它气体是惰性气体(氦、氖、氩、氪、氙、氡或118号元素(ununoctium))、氮气、一氧化二氮、氢气或其混合物。例如，非活性气体可以简单地是构成“室内空气”的混合物，其为氮气、氧气、氩和二氧化碳，以及痕量的其它分子例如氖、氦、甲烷、氪和氢气的混合物。尽管典型的样品可能含有约78％的氮气、21％的氧气、0.9％的氩和0.04％的二氧化碳，但每种气体的精确量是变化的。考虑在本发明的环境中，“室内气体”是含有约75-约81％的氮气、约18-约24％的氧气、约0.7至约1.1％的氩以及约0.02％-约0.06％的二氧化碳的混合物。可以在施用或暴露于生物物质前，首先将气体活性化合物用无毒性和/或非反应性气体稀释。额外地或可替代地，可在施用或暴露于生物物质前将任何气体活性化合物与室内空气混合，或可将化合物施用或暴露于室内空气中的生物物质。
在一些情形中，气体混合物也含有氧气。在本发明的其它实施方案中，活性化合物气体与氧气混合形成氧气(O2)混合物。特别考虑的是其中所述氧气混合物中氧气的量少于该混合物中所有其它气体的总量的氧气混合物。
在一些实施方案中，活性化合物是一氧化碳，并且一氧化碳的量大约等于或超过氧气混合物中氧气的任何量。在特别的实施方案中，将一氧化碳用于无血生物物质。术语“无血生物物质”指其氧合作用不依赖于、或不再依赖于脉管系统的细胞和器官，例如用于移植的器官。优选地，气氛将是100％的CO，但是对本领域技术人员明显的是，CO的量可以用不是氧的气体平衡，使得可利用的氧的量减少至阻止细胞呼吸的水平。在该方面，一氧化碳与氧的比率优选是85∶15或更高、199∶1或更高或399∶1或更高。在某些实施方案中，该比率是约、至少约或至多约1∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1，4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1、55∶1、60∶1、65∶1、70∶1、75∶1、80∶1、85∶1、90∶1、95∶1、100∶1、110∶1、120∶1、130∶1、140∶1、150∶1、160∶1、170∶1、180∶1、190∶1、200∶1、210∶1、220∶1、230∶1、240∶1、250∶1、260∶1、270∶1、280∶1、290∶1、300∶1、310∶1、320∶1、330∶1、340∶1、350∶1、360∶1、370∶1、380∶1、390∶1、400∶1、410∶1、420∶1、430∶1、440∶1、450∶1、460∶1、470∶1、480∶1、490∶1、500∶1或更多，或可源于其中的任何范围。
在更进一步的实施方案中，上面的数字适合于一氧化碳与氧和一种或多种其它气体的混合物的比率。在一些情形中，考虑所述的其它气体是非活性气体，例如氮气(N2)。因此，在本发明的其它实施方案中，上面的数字应用于可用于本发明的方法和仪器的一氧化碳与氧气和氮气的组合(O2/N2)的比率。因此，应该理解可能存在或可能不存在其它气体。在一些实施方案中，CO氧气的比率用一种或多种其它气体(非一氧化碳和非氧气)平衡。在特别的实施方案中，CO氧气的比率用氮气平衡。在更进一步的实施方案中，CO的量是CO相对于室内空气的比率，如由上面的数字描述的。
在一些情形中，一氧化碳的量是相对于氧气的量，而在另外的情形中，其为绝对量。例如，在本发明的一些实施方案中，氧气的量是以“百万分之份数(ppm)”为单位，其为在20℃和一个大气压的标准温度和压力下的一百万份空气中氧气体积份数的测量，其中气体体积的平衡用一氧化碳补足。在这方面，以每百万用一氧化碳平衡的氧气的份数计，一氧化碳与氧气的量是相关的。考虑生物物质暴露或孵育的气氛可以是至少百万分之0、50、100、200、300、400、500、1000或2000(ppm)的用一氧化碳平衡的氧气，并且在一些情形中是用与非毒性和/或非活性气体混合的一氧化碳平衡的氧气。术语“环境”指生物物质的直接环境，即其直接接触的环境。因此，生物物质必须直接暴露于一氧化碳，密封的一罐一氧化碳与生物物质处于相同室内并且认为是在根据本发明的“环境”中孵育是不充分的。可替代地，气氛可以以kPa表示。通常认为在1个大气压下1百万份数＝101kPa。在本发明的实施方案中，生物物质在其中孵育或暴露的环境是约、至少约或至多约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.5、0.90、0.95、1.0kPa或更多O2，或可源于其中的任何范围。如上描述的，这些水平可以用一氧化碳和/或其它非毒性和/或非活性气体平衡。而且，气氛可以用以kPa为单位的CO水平定义。在某些实施方案中，气氛是约、至少约或至多约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、101、101.3kPaCO或可源于其中的任何范围。在特别的实施方案中，分压是约或至少约85、90、95、101、101.3kPa CO或可源于其中的任何范围。
在本发明的实施方案中，样品孵育或暴露于一氧化碳的时间量也可以不同。在一些实施方案中，将样品孵育或暴露于一氧化碳约、至少约或至多约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或更多分钟和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时，和/或1、2、3、4、5、6，7、8、9、10或更多天。
在一些实施方案中，本发明涉及含有一种或多种活性化合物的组合物和制造品。在某些实施方案中，组合物具有一种或多种作为气体的这些活性化合物，使该气体在组合物中鼓泡，使得在将生物物质暴露于该组合物时该组合物提供化合物至该生物物质。这些化合物可以是凝胶剂、液体或其它半固体物质。在某些实施方案中，溶液具有作为通过它鼓泡的气体的氧拮抗剂。考虑气体中鼓泡的量将提供合适量的化合物至暴露于该溶液的生物物质。在某些实施方案中，鼓泡进入溶液中的气体的量是有效提供给生物物质的量的约、至少约或至多约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100倍或更多倍，或可源于其中的任何范围。
在本发明的一些实施方案中，将生物物质暴露于密闭容器中的气体。在一些案例中，密闭容器可以保持特殊的环境或按所期望的调节环境。所述的环境指生物物质暴露的氧拮抗剂的量和/或该环境的温度、气体组成或压力。在一些情形中，在暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物之前、期间或之后，将生物物质置于真空下。而且，在其它情形中，在暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物后将生物物质暴露于含氧正常的环境。在某些实施方案中，本发明包括用于诱导停滞或保护生物物质免受损伤或免于疾病的方法，该方法包括提供一种活性化合物给生物物质，联合提供另一种诱导停滞的活性化合物或环境条件给该生物物质。这种联合处理以任何顺序，例如同时或连续发生。在某些实施方案中，将一种活性化合物提供给生物物质，并将该生物物质随后置于缺氧条件下例如，5％的O2下，或将其随后暴露于递增缺氧的条件下，例如5％O2、随后4％O2、3％O2、2％O2、1％O2或无O2条件，或这些条件的任意次序组合的条件下。
而且，在其它实施方案中，含有生物物质的环境循环至少一次至不同量或浓度的氧拮抗剂或其它活性化合物，其中量或浓度的差异是至少一个百分数的差别。环境可以在一种或多种量或浓度的氧拮抗剂或其它活性化合物之间来回循环，或其可以逐渐增加或降低那种化合物的量或浓度。在一些情形中，不同的量或浓度是在约0和99.9％的生物物质最初暴露的氧拮抗剂或其它活性化合物的量或浓度之间。考虑，量和/或浓度的差异是约、至少约或至多约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或更多，或可源于其中的任何范围。
本发明的方法也可以包括让生物物质处于受控温度环境下的步骤。在某些实施方案中，将生物物质暴露于是“非生理温度环境”的温度，该温度指生物物质在其中不能存活多于96小时的温度。受控温度环境可以具有约、至少约或至多约-210、-200、-190、-180、-170、-160、-150、-140、-130、-120、-110、-100、-90、-80、-70、-60、-50、-40、-30、-20、-10、-5、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200℃或更高，或可源于其中的任何范围的温度。也可以将生物物质暴露于室温下的氧拮抗剂或其它活性化合物，室温表示在约20℃和约25℃之间的温度。此外，考虑生物物质达到所讨论的任何量或量的范围的核心温度。
考虑可让生物物质在暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物之前、期间或之后接受非生理温度环境或受控温度环境。此外，在一些实施方案中，让生物物质接受非生理温度环境或受控温度环境约一分钟至约一年之间的一段时间。时间量可以是约、至少约或至多约30秒、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时、1、2、3、4、5、6、7天、1、2、3、4、5周、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多年以及可源于其中的任何组合或范围。而且，也可以有相对于降低的温度而增加环境温度的步骤。
而且，考虑可以在其中温度受到控制的过程期间改变或循环所述的温度。在一些实施方案中，在将生物物质置于具有氧拮抗剂或其它活性化合物的环境前，可首先将它的温度降低，而在另外的实施方案中，可以通过将生物物质置于低于其温度的、具有活性化合物的环境中，将该生物物质冷却。生物物质和/或环境可以逐渐冷却或加热，这样生物物质或环境的温度开始处于一种温度，但然后达到另一温度。
本发明的方法也可以包括让生物物质处于受控压力环境下的步骤。在某些实施方案中，将生物暴露于低于该生物物质通常所处的压力的压力下。在某些实施方案中，让生物物质接受“非生理压力环境”，其指生物物质在其中不能存活多于96小时的压力。受控压力环境可以具有约、至少约或至多约10-14、10-13、10-12、10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、0.2、0.3、0.4或0.5个大气压或更大，或可源于其中的任何范围的压力。
考虑可让生物物质在暴露于活性化合物之前、期间或之后接受非生理压力环境或受控压力环境。此外，在一些实施方案中，让生物物质接受非生理压力环境或受控压力环境约一分钟至约一年之间的一段时间。时间量可以是约、至少约或至多约30秒、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时、1、2、3、4、5、6、7天、1、2、3、4、5周、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多年，以及可源于其中的任何组合或范围。
而且，考虑可以在其中压力受到控制的过程期间改变或循环所述的压力。在一些实施方案中，在将生物物质置于具有活性化合物的环境前，可首先将其暴露的压力降低，而在另外的实施方案中，在暴露于活性化合物后将生物物质置于压力下。压力可以逐渐降低，这样环境的压力开始处于一种压力，但随后在10、20、30、40、50、60秒、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时和/或1、2、3、4、5、6、7天或更久，或可源于其中的任何组合或范围内达到另一种压力。在某些实施方案中，方法包括调节环境的氧水平或将生物材料从具有氧的环境移走。可操作地是，将生物材料暴露于其中氧气减少或缺少的环境中，可模拟将生物物质暴露于氧拮抗剂。考虑在本发明的一些实施方案中，在其中生物物质的环境是缺氧或无氧的条件下，将生物物质暴露于或给其提供活性化合物，如下面进一步详细描述的。这可以是有意的或无意的。因此，在本发明的一些实施方案中，有意将生物物质置于无氧或低氧的环境中或置于造成无氧或低氧的环境中。在其它实施方案中，生物物质处于由无意的情况引起的这种条件下，例如，如果生物物质是处于局部缺血或潜在缺血状况下时。因此，考虑在一些情形中，在缺少活性化合物时缺氧或无氧条件将损伤所述物质。
在本发明的某些方法中，也存在评估在其中诱导停滞的生物物质中的氧拮抗剂和/或氧化磷酸化水平的步骤。而且，在本发明的一些实施方案中，存在评估生物物质中通常发生的细胞代谢的水平的步骤。在一些情形中，测量生物物质中活性化合物的量和/或评估生物物质中温度的降低。而且，在本发明的一些方法中，评价一种或多种治疗效果的程度。
在某些其它实施方案中，活性化合物和/或环境变化(温度、压力)对生物物质的任何毒性效果受到监测或控制。考虑可以通过改变活性化合物的水平、量、持续时间或频率和/或生物物质暴露的环境的变化来控制毒性。在某些实施方案中，所述的改变是减少，而在某些其它实施方案中，所述的改变是增加。考虑熟练的技术人员知道许多评价生物物质中的毒性效果的方法。
本发明方法的其它可选步骤包括鉴定合适的活性化合物；诊断患者；在施用或给患者开活性化合物前，考虑患者的历史和/或对患者进行一种或多种检测。
本发明的组合物、方法和制造品可用于将被转移回到生物物质来源的(自体的)供体生物中或不同的接受(异源的)受试者的生物物质上。在一些实施方案中，生物物质直接从供体生物获得。在另一些实施方案中，在暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物前将生物物质置于培养物中。在一些情况中，生物物质从在取出该生物物质前实施了体外膜式人工氧合法的供体组织获得，体外膜式人工氧合法是一种实施来帮助保存生物物质的技术。而且，方法包括将其中诱导了停滞的生物物质给予或移植至活的接受生物。
本发明的方法也涉及在体内的生物物质中诱导停滞，包括用氧拮抗剂或产生低氧条件的其它活性化合物孵育生物物质有效量的时间，用于使该组织进入停滞。
此外，本发明的其它实施方案包括减少体内生物物质中的氧需求的方法，该方法包括让生物物质与有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物接触，以减少它们的氧需求。考虑氧需求相对于不暴露于或不再暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物的生物物质细胞或来自生物物质的代表性细胞样品的氧需求量，减少约、至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，或可源于其中的任何范围。
本发明的其它方面涉及用于保藏体内生物物质的方法，该方法包括暴露体内生物物质于有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物，来体内保藏生物物质。
本发明也涉及延缓或减少生物上或在生物内的创伤的影响的方法，该方法包括暴露有创伤风险的生物物质于有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物。
在本发明的其它方面，存在用于在患者中治疗或预防出血性休克的方法，该方法包括暴露患者于有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物。可替代地，在一些实施方案中，方法防止由出血和/或出血性休克引起的患者中的致死率。在这类防止患者出血死亡或防止出血患者中的致死率的方法中，步骤包括暴露患者于有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物。在某些实施方案中，特别考虑氧拮抗剂是硫属化物化合物例如H2S。
也包括用于减少生物中的心率的方法作为本发明的部分。这类方法涉及用有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物接触生物样品或生物。
本发明的一个实施方案涉及在哺乳动物中诱导冬眠的方法，该方法包括用有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物接触哺乳动物。
在另一个实施方案中，存在麻醉生物的方法，该方法包括将在其中期望麻醉的生物物质暴露于有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物。考虑所述的麻醉可以类似于局部或全身麻醉。
本发明进一步包括保护哺乳动物不受放射治疗或化疗伤害的方法，该方法包括在放射治疗或化疗前或期间，用有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物接触所述哺乳动物。关于局部施用癌疗法，特别考虑也可将氧拮抗剂或其它活性化合物局部施用至受到影响的器官、组织和/或细胞。在某些实施方案中，方法可用于防止或减少化疗患者中的脱发。考虑这样的患者可能已经接受了化疗或是化疗的候选人。在特别的情形中，考虑将活性化合物作为局部用凝胶提供给患者，应用于预期出现或存在脱发的地方。
本发明也覆盖减少生物物质的氧需求，这意思是指生物物质存活需要的氧的量得以减少。这可以通过提供有效量的一种或多种活性化合物来达到。通常知道特殊的生物物质需要多少氧来存活，这也取决于时间、压力和温度。在本发明的某些实施方案中，与不存在有效量的活性化合物时生物物质的需求比较，生物物质的氧需求减少约、至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，或可源于其中的任何范围。
在另外的实施方案中，存在治疗患者中的过度增生性疾病(例如癌)的方法，该方法包括用有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物接触哺乳动物并让哺乳动物接受过热疗法。
虽然本发明的方法可以应用于保藏用于移植的器官，但本发明的其它方面涉及接受者生物。在一些实施方案中，存在在哺乳动物中抑制器官移植的排斥的方法，该方法包括提供哺乳动物有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物。
可通过采用氧拮抗剂或其它活性化合物在生物中完成温度调节。在一些实施方案中，存在治疗具有低体温的受试者的方法，该方法包括(a)用有效量的氧拮抗剂接触受试者，并然后(b)让受试者接受高于受试者的环境温度。在其它实施方案中，本发明包括治疗具有高体温的受试者的方法，该方法包括(a)用有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物接触受试者。在一些情形中，高体温的治疗也包括(b)让所述的受试者接受至少低于受试者的温度约20℃的环境温度。如上面讨论的，暴露受试者于非生理或受控温度环境可以用于另外的实施方案中。考虑该方法通常可以用活性化合物完成。
在一些情形中，本发明涉及用于在进行旁路手术的患者中诱导心麻痹的方法，该方法包括施用该患者有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物。考虑施用可以是心脏局部，以便保护它。
本发明的其它方面涉及用于在患者中预防出血性休克的方法，该方法包括施用给患者有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物。
而且，存在用于在生物中促进伤口愈合的方法，该方法包括施用给生物或创伤以有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物。
而且，本发明覆盖用于在哺乳动物中预防或治疗神经变性的方法，该方法包括施用给哺乳动物有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物。
本发明也涵盖减少生物物质的氧需求，这意思是指生物物质存活需要的氧的量得以减少。这可以通过提供有效量的一种或多种活性化合物来实现。通常知道特殊的生物物质需要多少氧来存活，这也取决于时间、压力和温度。在本发明的某些实施方案中，与不存在有效量的活性化合物时生物物质的需求比较，生物物质的氧需求减少约、至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，或可源于其中的任何范围。
本发明另外的实施方案涉及用于预防脱发，例如由化疗引起的脱发的方法，该方法通过施用给已经或将进行化疗的患者有效量的至少一种活性化合物。
在其中保护生物物质免受损伤或进一步损伤的情形中，考虑可在初次损伤(创伤或外伤或变性)发生后约、至少约或至多约30秒、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时、1、2、3、4、5、6、7天、1、2、3、4、5周、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多年和可源于其中的任意组合或范围内，将生物物质暴露于氧拮抗剂。因而在本发明另外的实施方案中，方法包括任何损伤、创伤、外伤或变性的初始评估。
在本发明的某些实施方案中，存在用于治疗受到血液学障碍影响的患者的方法，血液学障碍意思是指影响任何造血细胞或组织的疾病、障碍或病状。实例包括镰状细胞病和地中海贫血病。因此，在一些实施方案中，存在用有效量的活性化合物治疗患有镰状细胞病和地中海贫血病的患者的方法。在其它实施方案中，存在用于通过施用或提供有效量的活性化合物来增强患有囊性纤维化病(CF)的患者的存活力的方法。在本发明的其它方法中，存在用于在受试者中治疗氰化物中毒的方法，该方法包括施用有效量的活性化合物。在某些实施方案中，所述的化合物是H2S。
本发明的其它方面涉及用于保藏一种或多种与生物分离的细胞的方法，该方法包括用有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物接触细胞以保藏一种或多种细胞。除了上面以及该申请其它地方讨论的细胞和细胞类型，考虑到特别考虑将虾胚用于本发明。
而且，在本发明的一些实施方案中，存在用于保藏血小板的方法。使用本公开内容的技术，减少或消除了现有技术的缺点。涉及血小板和氧还原的实施方案有广泛的应用，包括但不限于将受益于长期保存血小板的任何应用。
在一个实施方案中，氧还原技术可在试剂盒中体现。例如，BectonDickinson提供的目前以产品号261215销售的试剂盒利用在这里描述的选择技术。该试剂盒包括无氧发生器(例如氢气发生器)、钯催化剂、无氧指示器和不透气、可密封的“BioBag”，上面的组分(与不透气的口袋中的血小板一起)置于其中并密封。
在本发明的其它实施方案中，存在通过提供有效量的活性化合物，可逆地抑制细胞和/或生物的代谢的方法。特别考虑鱼藤酮不是该方法或可能本发明的其它方法中采用的化合物。而且，也考虑在一些实施方案中，排除鱼藤酮作为活性化合物。类似地，考虑可排除一氧化氮作为活性化合物。
在本发明的其它实施方案中，提供方法用于通过提供有效量的活性化合物，增强生物物质响应损伤或疾病进入停滞的能力，从而保护生物物质免受损害或损伤，因此增强生物物质的存活。相关的实施方案包括通过提供有效量的活性化合物，让物物质准备或引发生物物质响应损伤或疾病进入停滞的方法。其它相关的实施方案包括诱导生物物质进入预停滞，因而保护生物物质免于损害或损伤的方法。例如，用少于诱导停滞所需的剂量的活性化合物处理或用活性化合物处理少于诱导停滞所需的时间，使得生物物质能响应损伤或疾病而更容易或更完全地达到停滞的有利状态，而不用该活性化合物处理时，生物物质将在其达到保护性水平的停滞，例如足以赋予生物物质抵抗致死性缺氧的水平前死亡或遭受损害或损伤。
某些损伤和疾病状态引起生物物质降低其代谢作用和/或温度至可能不达到停滞的程度。例如，缺氧、局部缺血和失血都降低了可利用并且提供给利用氧的生物物质的氧的量，因而减少了生物物质细胞中氧利用，减少了源于氧化磷酸化作用的能量产生，并因而降低了产热，导致低体温。取决于有害伤害或疾病伤害开始或进展后的严重性或经历的时间，“停滞”可能已实现或可能没有实现。用活性化合物处理降低了诱导停滞的阈值(即达到停滞所需的损害的严重性或持续时间)，或其可以增加或增效致伤性刺激或疾病刺激来在处于有害条件下的生物物质中诱导停滞，其中所述的有害条件假如不用于活性化合物处理，将不会导致停滞。活性化合物的这种活性通过将有害刺激或疾病刺激单独诱导停滞的效果(大小、动力学)与其中将生物物质预先暴露、同时暴露、之后暴露或它们的任意组合暴露于活性化合物的那些效果比较来测定。例如，如本专利申请的实施例11中描述的，在暴露于缺氧(5％O2)前，将小鼠预先暴露于空气中的150ppm H2S，引起CO2产生大约降低2倍。随后，在缺氧过程中，经预处理的小鼠中的CO2产生降低约50倍。相比之下，虽然在对照的、未用H2S处理的小鼠中CO2产生也下降，但不能达到小鼠的缺氧存活力，可能是因为在达到停滞前小鼠就死了。
在本发明其它方面，存在用于在生物中诱导睡眠的方法，该方法包括将生物暴露于有效量的活性化合物，其中所述的有效量小于可在生物中诱导停滞的量。术语“睡眠”是根据其在医学方面中通常且普通的意义使用。睡眠区别于无意识的其它状态，无意识状态也考虑为可用本发明的方法获得的状态。
本发明也涉及用于麻醉生物物质的方法，该方法包括暴露该物质于有效量的活性化合物，其中所述的有效量小于可在生物物质中诱导停滞的量。
在上面讨论的方法中，可减少少于可在生物物质中诱导停滞的量的有效量的持续时间和/或量。所述的减少可以是诱导停滞的量的百分之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或可源于其中的任何范围的量的减少。减少可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时、1、2、3、4、5、6、7天、1、2、3、4、5周和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或可源于其中的任何范围的持续时间的减少。可替代地，所述的减少可以是关于提供给生物物质的总有效量，其可以是相对于在所述物种和/或大小的生物中诱导停滞的总有效量，百分之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或可源于其中的任何范围的减少。
特别考虑本发明可用于保藏用于消费或实验室研究的生物，例如蝇类、蛙类、鱼类、小鼠、大鼠、狗、虾以及它们的胚胎。
本发明的方法可以涉及使用维持生物物质在其中放置或暴露的环境的仪器或系统。本发明包括一种仪器，在该仪器中提供氧拮抗剂或其它活性化合物，特别是作为气体。在一些实施方案中，所述的仪器包括具有容纳生物物质的样品室的容器，其中该容器连接至含有氧拮抗剂的气体供给。特别考虑该容器可以是坚固的或者其可以是柔性的，例如袋子。
在一些实施方案中，本发明是用于保藏细胞的仪器，该仪器包括具有体积不大于775升的样品室的容器；与该样品室进行流体连通的第一个气体供应，第一个气体供应包括一氧化碳。在进一步的实施方案中，该仪器也包括调节样品室内温度的冷却单元，和/或调节样品室内的氧拮抗剂或其它活性化合的量或样品室内的溶液中的氧拮抗剂或其它活性化合物的量的气体调节器。
考虑可以有用于第二种或额外的气体的气体供应或用于氧拮抗剂或其它活性化合物的第二种或额外的气体供应。第二种气体供应可以与样品室相连或者其可以与第一种气体供应相连。如上讨论的，额外的气体可以是非毒性和/或非活性气体。
在本发明的一些实施方案中气体调节器是所述仪器的一部分。可以使用一个、两个、三个或更多个气体调节器。在一些情形中，气体调节器调节从第一个气体供应提供给样品室的气体。可替代地，其调控从第二种气体供应提供给样品室或第一种气体供应的气体，或存在既用于第一种又用于第二种气体供应两者的调节器。进一步考虑可以程序控制任何气体调节器来控制供应样品室和/或其它气体供应的气体的量。所述的调节可以是或可以不是对于指定的一段时间。可以有气体调节器，对于直接或间接与样品连接的任何气体供应，其可以是或可以不是可程序控制的。在一些情形中，气体调节器是通过电子程控的。
在一些情形中，样品室内的压力和/或温度可以分别用压力调节器或温度调节器调节。和气体调节器一样，这些调节器可以是可通过电子程控的。本发明的仪器也可以具有冷却和/或加热单元以获得上面讨论的温度。该单元可以或可以不是通过电子程控的。
在其它实施方案中，所述仪器包括一个有轮车(wheeled cart)，容器放置在上面，或其可以具有一个或多个把柄。
特别考虑，本发明包括用于细胞、组织、器官以及甚至整个生物的仪器，其中该仪器具有具有样品室的容器；与样品室流体连通的第一种气体供应，第一种气体供应包括氧拮抗剂或其它活性化合物；可电子程控的气体调节器，其调节从第一种气体供应供给样品室的气体。
在一些实施方案中，所述仪器也具有配置来在样品室内提供真空的结构。
而且，考虑本申请中所述的任何氧拮抗剂或其它活性化合物与本发明的仪器一起使用。在特别的实施方案中，可以用该仪器施用一氧化碳。在其它情形中，可以施用硫属化物化合物或具有还原剂结构的化合物。在更进一步的实施方案中，用所述仪器施用活性化合物。在特别的实施方案中，本发明涵盖一种装置或其用途。在某些实施方案中，该装置是单次剂量递送装置。在其它实施方案中，该装置是吸入器或喷雾器。在更进一步的实施方案中，其它装置包括，但不限于注入装置，例如笔、泵例如输注泵，或贴片。而且，考虑这些装置可以是或可以不是单次剂量递送装置。
此外，本发明涉及筛选测定法。在一些实施方案中，筛选候选物质作为氧拮抗剂或活性化合物，特别是包括保护性代谢剂的能力。这可以用在此描述的任何测定法，例如通过测量二氧化碳输出来完成。可进一步表征或检测经鉴定体现出氧拮抗剂或其它活性化合物特性的任何物质。而且，考虑可以施用这种物质至生物物质来诱导停滞或随后生产该物质。
在某些实施方案中，存在用于活性化合物，包括活性停滞化合物的筛选方法。此外，筛选方法可以用于氧拮抗剂或用于可实现在此讨论的方法的任何其它化合物。在一些实施方案中，存在筛选方法，该方法包括a)将斑马鱼胚暴露于物质；b)测量该胚的心率；c)将存在该物质时胚胎的心率与不存在该物质时的心率比较，其中心率的减少，例如减少50％或更多，鉴定该物质为候选活性化合物。除了斑马鱼胚，考虑也可以使用其它非人的生物，例如鱼、蛙类、蝇类、虾或它们的胚。在进一步的实施方案中，通过计数心跳数测量胚的心率。在一些情形中，这可以通过在解剖显微镜下观察胚来完成。
其它筛选实施方案包括a)暴露线虫于物质；b)测定以下细胞呼吸因素的一种或多种i)核心体温；ii)氧消耗；iii)活动力；或iv)二氧化碳产生；c)将存在该物质时线虫的细胞呼吸因素与不存在该物质时的细胞呼吸因素比较，其中所述特征的减少鉴定该物质为候选活性化合物。在本发明的一些方法中，特别考虑测定线虫的活动力。
在一些实施方案，所述方法首先涉及鉴定合适的筛选物质。在某些实施方案中，所述的物质将是硫属化物化合物、还原性物质或具有式I或式IV的结构，或在此讨论的任何其它化合物。
进一步考虑，随后的筛选可以在被认为是比用于初步筛选或初始筛选的那些更高级或更复杂的生物中进行。因此，考虑将在这些其它生物中检测一种或多种细胞呼吸因素以进一步评价候选化合物。在某些实施方案中，随后的筛选涉及使用小鼠、大鼠、狗等。
考虑在本发明的筛选方法中，可使用许多不同的生物或生物物质(其它细胞或组织)，并且可以测定许多不同的细胞呼吸因素。而且，考虑在本发明的一些实施方案中，同时进行多次这类筛选。
当然应该理解，为了将物质认为是候选活性化合物(或氧拮抗剂，或停滞诱导剂或保护性代谢剂等)，该物质在测定法中不可以杀死生物或细胞并且效果必须是可逆的(即改变的特征需要恢复至其暴露于所述物质前的水平)。
当然应该理解，任何处理方法可用于制备用于治疗或抵抗特定疾病或状况的药物。这包括但不限于用于治疗出血性或血液学休克、伤口和组织损伤、高体温、低体温、神经变性、脓毒症、癌和创伤的药物的制备。而且，本发明包括但不限于，制备用于治疗防止死亡、休克、创伤、器官或组织排斥、癌症疗法引起的损伤、神经变性以及伤口或组织损伤的药物。
如上面讨论的，生物的停滞不是以下状态中的任何一种睡眠、昏迷、死亡、麻醉或癫痫大发作。然而，考虑在本发明的一些实施方案中，这类状态是使用本发明到方法、组合物和制造品的期望目标。关于本发明的一方面讨论的任何实施方案也应用于本发明的其它方面。而且，可以合并实施方案。
涉及“暴露”生物物质于活性化合物的任何实施方案也可以实施，使得给生物物质提供活性化合物或施用活性化合物给生物物质。术语“提供”是根据其通常且普通的意义使用的。“供应或提供来使用”(牛津英语字典)，就患者来说，其可以指处方特殊的活性化合物或直接将其施用给患者的医生或其它医务人员进行的行为。
在实施例部分中的实施方案应该理解为可应用于本发明所有方面的本发明实施方案。
权利要求书中术语“或”的使用是用于表示“和/或”除非明确指明是仅指备选物或备选物相互排斥，尽管本公开内容支持仅指备选物和“和/或”的定义。
在整个本申请中，术语‘大约“用于表示包括用于测定该值的设备或方法的误差的标准偏差的值。在与术语“大约”结合使用的数值的上下文中讨论的任何实施方案中，特别考虑可以省略术语大约。
根据长期存在的专利法，单词“a”和“an”，当在权利要求书或说明书中与单词“包含”结合使用时，指一个或多个，除非具体指出。
从下面的详述中，本发明的其它的目标、特征和优势将变得显而易见。然而应该理解，尽管显示了本发明的特定实施方案，该详述和特定实施例仅以举例说明的方式给出，因为从该详述来看在本发明的精神和范围内的各种改变和修正对本领域的技术人员将变得显而易见。 附图简述 下面的附图构成了本说明书的一部分并且包含在内以进一步证明本发明的某些方面。可以通过参考这些附图中的一个或多个，结合在此提供的具体实施方案的详细描述来更好的理解本发明。


图1人角质形成细胞在暴露于100％CO时存活。细胞用倒置相差显微镜肉眼观察。通过台盼蓝染色判断的活角质形成细胞数的定量，台盼蓝染色是细胞死亡的的指示物。
图2.在缺氧时存活力的不连续性。在野生型胚中，在暴露于无氧(纯N2)、中度缺氧((0.01kPa O2、0.05kPa O2或0.1kPa O2)或轻度缺氧24小时后评估到成虫期的存活力。所有数据点是至少3个独立试验的结果，并且将不能解释的蠕虫从总数中除去。
图3.一氧化碳保护免受缺氧伤害。在野生型胚中暴露于纯一氧化碳、0.05kPa O2/N2或0.05kPa O2/CO 24小时后，评估到成年期的存活力。所有数据点是至少3个独立试验的结果，并且将不能解释的蠕虫从总数中除去。
图4A当小鼠暴露于硫化氢时，代谢率在身体核心温度前降低。小鼠暴露于80ppm(在X轴上的0分钟时)导致在少于5分钟内CO2产生(黑线)降低大约3倍。这在动物的核心温度朝环境温度降低(灰线)之前。
图4B暴露于硫化氢的小鼠的温度。每条线表示暴露于80ppm的H2S或室内空气的个体小鼠的核心体温的连续测量。垂直轴上的数字是摄氏温度。在横轴上，数字反映以小时为单位的时间。试验在进行6小时后，记录了恢复。起始点是在1:00，6小时处理结束是约7:00。
图5暴露于80ppm硫化氢引起小鼠的核心体温逼近环境温度。在时间0:00开始，开启气体，温度降低。在时间6:00，气氛换回至室内空气。三角形表示通过无线电遥测术测定的小鼠的核心体温。这在时间0:00时为大约39℃。菱形表示环境温度，其在试验最初的3小时中从23℃降到13℃，并随后从6:00时再次上升接近23℃，在约9:00时稳定。
图6身体核心温度下降的速度取决于给予小鼠的硫化氢的浓度。所有的线表示由无线电遥测术测定的单个小鼠的核心体温。接受20ppm和40ppm H2S的小鼠表现出小的核心温度降低。暴露于60ppm诱导了从大约4:00开始的温度的大幅下降。暴露于80ppm的小鼠表现出了从大约2:00开始的温度的大幅下降。
图7最低的核心体温。记录的暴露于80ppm硫化氢的小鼠的最低核心体温是10.7℃。三角形表示通过无线电遥测术测定的小鼠的核心体温，其在时间0时从大约39℃开始。菱形表示以大约23℃开始的环境温度，并且在试验的中点时降低至低于10℃，之后其然后再次上升接近室温。
图8A适应温和温度的小鼠内源性硫化氢水平增加。灰色的直方图(左边的两条)表示适应4℃的两只单独小鼠的内源性H2S浓度；黑色的直方图(右边的两条)表示适应30℃的两只单独小鼠的内源性H2S浓度。硫化氢浓度通过GC/MS测定。
图8B环境温度对依赖硫化氢的温度下降的影响。由于暴露于硫化氢引起的核心温度下降的速率依赖适应温度。在1:00时将小鼠暴露于气体。三角形表示通过无线电遥测术测定的适应12℃的小鼠的核心温度。正方形表示适应30℃的动物的核心体温。
图9是说明根据本发明实施方案的呼吸气体递送系统的方块图。
图10是说明根据本发明实施方案的呼吸气体递送系统的示意图。
图11是说明根据本发明进一步的实施方案的呼吸气体递送系统的示意图。
图12是说明根据本发明实施方案的操作的流程图。
图13是说明根据本发明实施方案的组织处理气体递送系统的示意图。
图14是说明根据本发明实施方案的操作的流程图。
图15代谢抑制保护线虫免于低体温诱导的死亡。暴露于冷温(4℃)的线虫在24小时后不能存活。然而，如果在低体温期间保持无氧条件(并且在其之前和之后保持1小时)，大比例的线虫存活。
图16短的CO2预处理导致最长的无氧存活。将成年蝇类暴露于100％CO2持续标明的时间，通过用N2冲洗造成气氛为缺氧，并然后将试管密封。22小时后，将试管向室内空气开放。在给存活力打分前，让蝇类恢复24小时。
图17CO2不同程度地增强了缺氧存活。将成年蝇类在低-流量试验中造成缺氧，直接在室内空气中(不进行预处理)，或在暴露于100％的CO210分钟后。在指定的时间后，将试管向室内空气开放。在给存活力打分前，让蝇类恢复24小时。
图18向CO中加50ppm H2S增加了幸免于缺氧的蝇类的比率。将成年蝇类在低-流量试验中造成缺氧，直接在室内空气中(不进行预处理)，或在暴露于用CO平衡的50ppm H2S后。
图19是用于将氧气从血小板中除去的示例性系统和根据本公开内容的实施方案的方案的示意图。
图20A-B显示了暴露于硫化氢的大鼠(A)和暴露于二氧化碳的小鼠(B)的核心温度的变化。
图21显示了用于测定活性化合物的浓度的分步试验计划的气体矩阵(matrix)。
图22A-B显示了可用于递送或施用活性化合物的负压装置。
图23在5％的氧气中小鼠的存活。将小鼠或者在暴露于5％O2前暴露于30分钟的室内空气(对照；黑线；n＝9)或者在暴露于5％O2前暴露于10分钟的室内空气，然后暴露于20分钟150ppm H2S(实验；红线；n＝20)，并测量它们存活的长度。在60分钟时终止试验，并且如果动物仍然存活(在实验中的都存活，而在对照组中的没有一只存活)，将它们放回它们的笼中。
图24H2S增加了在致死的氧张力下的存活。图显示了在图23中描述的试验结果。x-轴显示了小鼠在低氧张力下存活的以分钟为单位的时间。黑色直方图显示了当H2S不存在时的存活时间，而浅色直方图显示了存在H2S的存活时间。在后面的组中，在氧气分压降低至5％和2.5％之间前，将小鼠暴露于150ppm H2S。测量存活时间并且在所有H2S处理组中存活时间至少为60分钟。
图25在5％氧气中的小鼠的代谢率。将小鼠在暴露于5％O2前，暴露于10分钟的室内空气，随后暴露于20分钟的150ppm H2S。代谢率通过CO2的输出测量。在暴露前CO2输出为大约2500ppm，在暴露于20分钟的H2S后则代谢率降低大约2倍，并且在暴露于5％O2几个小时后，CO2输出已经降低大约50倍，从暴露前的水平降低至大约50ppm。在6小时时，将小鼠放回至室内空气并让其恢复。该数据来自在图23(实验组)中所包括的小鼠之一。
图26暴露于100ppb H2Se的小鼠。该图显示了以分钟为单位的向H2Se的暴露(x-轴)伴随核心体温的下降(在右边显示的摄氏温度用显示逐渐下降的线画出)，并伴随着呼吸的降低(在左边显示的ppmCO2用显示降低的锯齿线画出)。
图27暴露于10ppb H2Se的小鼠。该图显示了以分钟为单位的向H2Se的暴露(x-轴)伴随核心体温的下降(在右边显示的摄氏温度用显示逐渐下降的线画出)，并伴随着呼吸的降低(在左边显示的ppmCO2用显示降低的锯齿线画出，在暴露5分钟时出现最低点)。
图28H2S预处理增强小鼠在低氧条件下的存活。将小鼠在暴露于5％O2(5％)、4％O2(4％)、5％O21小时然后暴露于4％O2(4％+1小时5％)或5％O21小时然后暴露于3％O2(3％+1小时5％)前，暴露于30分钟的室内空气(无PT)或暴露于10分钟的室内空气随后暴露于20分钟的150ppm H2S(PT)，并测量它们的存活时间长度。在60分钟时终止试验，并且如果动物仍然存活则将其放回它们的笼中。
图29在转换至致死的低氧期间CO2的产生。在小鼠中测量在转换至5％O2或4％O2时CO2产生的变化，所述的小鼠暴露于室内空气30分钟(无PT)，或暴露于室内空气10分钟后暴露于150ppm H2S20分钟(PT)。而且，测量了分步转换至5％O21小时，随后转换至4％O2时CO2产生的变化。画出了CO2产生变化的百分比，同时标出了标准误差。
图30在暴露于100％一氧化碳(CO)时人角质形成细胞的存活。用倒置相差显微镜肉眼检察细胞。通过台盼蓝染色判断的活角质形成细胞数的定量，台盼蓝染色是细胞死亡的的指示物。
图31长期暴露于低水平的H2S导致秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的抗热性。与单独在室内空气中饲养的同胞相比，适应在室内空气中含有大约50ppm H2S的环境的线虫显著地对升高环境温度至35℃的致死效应更有抗性。
图32长期暴露于低水平的H2S增加了秀丽隐杆线虫的寿命。适应于室内空气中含有大约50ppm H2S的环境的线虫与未受处理的对照比较具有更长的寿命。
图33斯普拉-道来(Sprague-Dawley)大鼠中暂时的核心温度降低的实例。暴露于与室内空气混合的0.03％硫化氢的大鼠(灰色/虚线)或暴露于15％二氧化碳/8％氧/77％氦的大鼠(黑色/实线)的核心温度测量。在本试验中，在处理阶段环境室的温度是10℃。当气体还回为室内空气时，将环境室的温度恢复至室温(22℃)。在每种情形中，这是核心温度开始上升时的时间点(对于黑色/实心线为大约2小时，而对于灰色/虚线是大约7.4小时)。
图34在5℃环境温度下在室内空气中，在暴露于1.2ppm的硒化氢2小时10分钟期间的小鼠核心体温。
图35在10℃的环境温度下，在环境室中暴露于室内空气期间的大鼠核心体温。黑线描述了大鼠的核心体温。灰线描述了环境温度。
图36在7℃的环境温度下暴露于80％氦气20％氧气的大鼠的核心体温。时间在X轴上以小时为单位描述。总的暴露时间是大约5小时(从9:15AM至2:15PM)。没有看见核心体温显著下降。
图37在7℃的环境温度下，在暴露于15％的二氧化碳、20％的氧气和75％的氦期间大鼠的核心体温。暴露的时间大约是2小时。在温度开始上升的时间点(在标记为38512.6的点后不久)开始，将大鼠暴露于室内空气。在将大鼠暴露于室内空气期间，将环境温度恢复至室温。
图38在7℃的环境温度下，暴露于15％的二氧化碳、8％的氧气和77％的氦气的大鼠核心体温。暴露时间大约是4小时。灰线描述了环境温度。黑线描述了核心温度。在环境和核心温度上升的时间点是气体转换为室内空气时的时间点。
图39暴露于二氧化碳/氦气/氧气的狗的核心温度。虚线是当气体放开(大约24分钟)和关闭(大约55分钟)时的核心温度。图40.暴露于增加浓度的二氧化碳的狗的核心温度。虚线表示对气体进行改变的时候。在大约63分钟时，将气体从室内空气改变为室内空气中9％的二氧化碳。在大约85分钟时，将气氛从室内空气中9％的二氧化碳改变为室内空气中12％的二氧化碳。在大约115分钟时，将气氛从室内空气中12％的二氧化碳改变为室内空气中15％的二氧化碳。该试验在大约135分钟时结束。
图41.在筛选方法中采用的仪器。
图42每天暴露于硫化氢4小时进行至少1周的动物和暴露于缺少硫化氢的相同条件的对照动物的氧消耗(灰色直方图)和二氧化碳产生(黑色直方图)。
图43每天暴露于硫化氢4小时进行至少1周的动物(H2S 2900和H2S 2865)和暴露于缺少硫化氢的相同条件的对照动物(2893和2894)的呼吸商。
说明性实施方案的描述 I.停滞 在“停滞”或“滞生”中，细胞、组织或器官或生物(统称为“生物物质”)是活的，但是细胞分裂、发育进展所必需的细胞功能和/或代谢状态减缓或甚至停止。该状态在许多情况中是期望的。停滞本身可以用作保藏方法，或可以诱导它作为深低温保藏方案的一部分。可以保藏生物物质用于例如研究用途、用于运输、用于移植、用于治疗性处理(例如离体疗法)以及用于预防外伤发作。关于整个生物的停滞具有类似用途。例如，如果生物已经进入停滞，可以有助于生物的运输。这可能通过减少或除去应激或物理损伤，减少对生物的物理和生理损伤。这些实施方案在下面进一步详细讨论。停滞可以通过降低生物物质对氧气的需要并因而降低了血流量而是有益的。这可以延长可将生物物质从维持生命的环境分离并暴露于诱导死亡的环境的时间周期。
虽然已经报道了从相对长时间的意外性低体温中恢复(Gilbert等，2000)，最近已经有兴趣于有意诱导生物中的滞生。(任何参考文献的讨论不应理解为承认该参考文献构成现有技术。事实上，在此讨论的一些参考文献就优先权申请来说不是现有技术)。已经研究了受控制的过热疗法，以及施用冷的溶液流至主动脉中(Tisherman，2004)、诱导心搏停止(Behringer等，2003)或一氧化氮诱导的滞生(Teodoro等，2004)。
停滞的生物不同于于处于全身麻醉的生物。例如，暴露于室内空气的轻度停滞的生物(2倍到5倍之间的细胞呼吸的降低)将开始战栗，而处于麻醉的生物将不会。而且，预期轻度停滞的生物对脚趾挤压有反应，而处于麻醉的生物没有反应。因此，停滞与处于通常实践的麻醉状态不是相同的事情。
CO2产生是与生物的代谢作用相关的细胞呼吸的直接标志。这可能与“CO2放出”不同，CO2放出指肺呼出的CO2的量。某些活性化合物，例如，硫化氢，可以抑制肺中的碳酸酐酶活性，这抑制了碳酸转化为CO2以及其从肺部血液的释放，因而表现出伴随的CO2放出的减少，而没有相应的细胞CO2产生的降低。
本发明基于观察到某些类型的化合物在生物物质中有效地诱导可逆的停滞。其它的专利申请讨论了停滞的诱导，包括以下申请美国专利申请10/971,576、10/972,063和10/971,575；美国专利申请10/971,576；美国专利申请10/972,063；和美国专利申请10/971,575，将所有这些申请在此通过引入作为参考。
A.体温调节 温血动物中的停滞将影响体温调节。体温调节是所谓的“温血”动物的一个特性，其使得生物保持相对恒定的核心体温，甚至是当暴露于显著改变的(冷的或热的)环境温度时。通过诱导停滞控制体温调节的能力是本发明的一个方面，并且允许类似于上面讨论的那些用途。
体温调节可以通过将生物、四肢或分离的器官或组织置于其温度可以控制的室/装置内来促进。例如，类似于高压仓的温室或腔室类设备可以容纳整个生物并且可以连接至可调节温度的设备。也考虑更小的装置例如毯子、套筒、套袖(cuff)或手套(glove)(例如AVAcoreTechnologies，Palo Alto，CA的CORE CONTROL冷却系统，美国专利6,602,277)。这种室/装置可用于增加或降低环境温度。
B.生物物质 考虑用于本发明的生物物质包括源于无脊椎动物和脊椎动物(包括哺乳动物)的材料；生物材料包括生物。除了人以外，本发明还可用于兽医或农业重要的哺乳动物，所述的哺乳动物包括来自以下类型的那些犬科动物、猫科动物、马科动物、牛科动物、绵羊、鼠科动物、猪科动物、山羊、啮齿动物、兔类动物、狼科动物和熊。本发明还延伸至鱼类和鸟类。其它实例在下面公开。
而且，生物物质的类型不同。其可以是细胞、组织或器官以及不同的组合物、方法和仪器有关的生物。将非临时美国专利申请10/971,576、10/972,063和10/971,575在此通过全文引入作为参考。
在一些实施方案中，生物材料是或包含细胞。考虑细胞可以是任何利用氧的细胞。细胞可以是真核或原核的。在某些实施方案中，细胞是真核的。更特别地是，在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。考虑用于本发明的哺乳动物细胞包括但不限于来自以下的那些细胞人、猴、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、山羊、猪、狗、猫、白鼬、奶牛、绵羊和马。
而且，本发明的细胞可以是二倍体，但在一些案例中，细胞是单倍体(性细胞)。而且，细胞可以是多倍体、非整倍体或无核细胞。细胞可以来自特殊的组织或器官，例如来自以下组织或器官的细胞心、肺、肾、肝、骨髓、胰、皮肤、骨、静脉、动脉、角膜、血、小肠、大肠、脑、脊髓、平滑肌、骨骼肌、卵巢、睾丸、子宫和脐带。而且，细胞也可以被表征为以下细胞类型之一血小板、髓细胞、红血球、淋巴细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、内分泌细胞、神经胶质细胞、神经元、分泌细胞、屏障功能细胞、收缩细胞、吸收细胞、粘膜细胞、缘细胞(来自角膜)、干细胞(全能性、多能性或多潜能性)、未受精的或受精的卵母细胞或精细胞。
1.不同的来源 下面是可从中获得生物物质的来源的实例本发明的实施方案包括但不限于这些实例。
a.哺乳动物 在本发明的某些方面，哺乳动物是单孔目、有袋目、食虫目、岩鼠目(Macroscelidia)、皮翼目、翼手目、攀兽目(Scandentia)、灵长目、贫齿目、鳞甲目、管齿目、兔形目、啮齿目、鲸目、食肉目、长鼻目、蹄兔目、海牛目、奇蹄目或偶蹄目。
单孔目的实例包括针鼹科(例如针鼹属类)和鸭嘴兽科(例如鸭嘴兽)。有袋目的实例包括负鼠科(例如负鼠类)、小

科(Microbiotheriidae)(例如Monito del Monte)、新袋鼠科(例如新袋鼠类)、袋鼬科(例如袋鼬类)、袋食蚁兽科(例如袋食蚁兽)、袋狼科(例如袋狼)、袋狸科(例如袋狸类)、兔袋狸科(例如兔袋狸类)、袋鼹科(例如袋鼹类)、袋貂科(例如袋貂类)、袋鼯科(例如浣熊类、袋鼯类)、鼯科(例如矮小负子袋鼠(Pygmy Possums))、袋鼠科(例如袋鼠类、小袋鼠类)、蜜貂科(例如蜂蜜负子袋鼠(Honey Possum))、袋熊科(例如袋熊类)和树袋熊科(例如树袋熊类)。
食虫目包括，例如，沟齿鼩科(例如沟齿鼠类)、马岛猬科(例如无尾猬、獭鼩)、金鼹科(例如金鼹类)、刺猬科(例如刺猬、鼠猬)、鼩鼱科(例如鼩鼱)和鼹鼠科(例如鼹鼠、麝鼹)。岩鼠目目包括岩鼠科(例如象鼩)。攀兽目包括树鼩科(例如树鼩)。皮翼目包括飞狐科(例如斑鼯猴)。翼手目包括如下科狐蝠科(例如果蝠、飞狐)、鼠尾蝠科(例如鼠尾狐)、凹脸蝠科(例如猪鼻蝙蝠或大黄蜂蝙蝠)、鞘尾蝠科(例如鞘尾蝠)、夜凹脸蝠科(例如凹脸蝠)、巨耳蝠科(例如假吸血蝠)、菊头蝠科(例如菊头蝠)、兔唇蝠科(例如，斗牛狗蝠、鱼人蝠(FishermanBats))、髯蝠科、叶口蝠科(例如新世界叶鼻蝠(New World Leaf-NosedBats))、长腿蝠科、烟蝠科、盘翼蝠科、吸足蝠科、蝙蝠科(例如，普通(Common)蝙蝠)、短尾蝠科(例如，短尾蝠)、以及皱鼻蝠科(例如，皱鼻蝠)。
灵长目包括下列科狐猴科(例如狐猴)、鼠狐猴科(例如，小嘴狐猴)、大狐猴科(例如，大狐猴、被绒毛狐猴)、指猴科(例如，指狐猴)、懒猴科(例如，懒猴，婴猴、丛猴)、眼镜猴科(例如，眼镜猴)、卷尾猴科(例如新大陆猴、绒猴、绢毛猴)、长臂猿科(例如长臂猿)、猩猩科(例如，猿)、以及人科(例如，人类)。
贫齿目的实例包括食蚁兽科(例如，食蚁兽)、树懒科(例如，三趾树懒)、二趾樹懶科(例如，二趾树懒)、以及犰狳科(例如犰狳)。鳞甲目的实例包括穿山甲科(例如，穿山甲)。管齿目的实例包括土豚科(例如，土豚)。兔形目的实例包括鼠兔科(例如，鼠兔)和兔科(例如野兔和兔)。
啮齿目包括下列科山河狸科(例如，山河狸(MountainBeavers))、松鼠科(例如，松鼠、土拨鼠、花栗鼠)、囊鼠科(例如，囊鼠)、异鼠科(例如，袋小鼠(Pocket Mice)、更格卢鼠(KangarooRats))、河狸科(例如，河狸)、鳞尾松鼠科(例如，鳞尾松鼠)、跳兔科(例如，跳鼠)、鼠科(例如，大鼠和小鼠)、睡鼠科(例如，睡鼠)、荒漠睡鼠科(例如，沙漠睡鼠)、林跳鼠科(例如，跳鼠(Jumping Mice))、跳鼠科(例如，跳鼠)、豪猪科(例如，旧世界豪猪(Old WorldPorcupines))、美洲豪猪科(例如，新世界豪猪)、豚鼠科(例如，豚鼠、巴塔哥尼亚野兔(Maras))、水豚科(例如，水豚)、花背豚鼠科(例如，长尾豚鼠)、驼鼠科(例如，无尾刺豚鼠)、刺豚鼠科(例如，刺豚鼠)、毛丝鼠科(例如，毛丝鼠、兔鼠)、硬毛鼠科(例如，硬毛鼠)、河狸鼠科(例如，河狸鼠)、梳鼠科(例如，Tuco-Tucos)、八齿鼠科(例如，齿鼠(Octodonts)、八齿鼠)、华毛鼠科(Abrocomidae)(例如南美栗鼠)、棘鼠科(Echimyidae)(例如，刺鼠(Spiny Rat))、藤鼠科(Thryonomyidae)(例如，甘蔗鼠(Cane Rat))、岩鼠科(Petromyidae)(例如，非洲岩石鼠(African Rock Rat))、滨鼠科(Bathyergidae)(例如，Mole Rat)、以及栉趾箭猪科(例如，栉趾箭猪)。
鲸目(Cetacea)目包括如下科亚河豚科(Iniidae)(例如亚马逊江豚(Amazon Popoise))、白鱀豚科(Lipotidae)、恒河豚科(Platanistidae)、普河豚科(Pontoporiidae)、喙鲸科(Ziphiidae)(例如，突吻鲸(Beaked Whales))、抹香鲸科(Physeteridae)(例如，抹香鲸(Sperm Whales))、一角鲸科(Monodontidae)(例如，白鲸(Beluga Whale)、一角鲸(Narwhal))、海豚科(Delphinidae)(例如，海豚(Marine Dolphin)、虎鲸(Killer Whale))、鼠海豚科(Phocoenidae)(例如，海豚(Porpoises))、须鲸科(Balaenopteridae)(例如，鲸)、露脊鲸科(Balaenidae)(例如，脊美鲸(Right Whale))、以及灰鲸科(Eschrichtiidae)(例如，灰鲸(Gray Whale))。
食肉目(Carnivora)包括如下科犬科(Canidae)(例如，狗、狐、狼、豺、丛林狼)、熊科(Ursidae)(例如，熊)、浣熊科(Procyonidae)(例如，浣熊、长吻浣熊、蜜熊、小熊猫)、大熊猫科(Ailuropodidae)(例如，大熊猫)、鼬科(Mustelidae)(例如，鼬、臭鼬、獾、水獭)、灵猫科(Viverridae)(例如，灵猫香、香猫)、獴科(Herpestidae)(例如，猫鼬)、土狼科(Protelidae)(例如，土狼)、鬣狗科(Hyaenidae)(例如，鬣狗)、猫科(Felidae)(例如，猫)、海狮科(Otariidae)(例如，突耳海豹(Eared Seal)、海狮)、海象科(Odobenidae)(例如，海象)、以及海豹科(Phocidae)(例如，无耳海豹(Earless Seal))。
长鼻目(Proboscidea)包括科象科(Elephantidae)(例如，象)。蹄兔目(Hyracoidea)包括蹄兔科(Procaviidae)(例如，蹄兔)。海牛目(Sirenia)包括儒艮科(Dugongidae)(例如，儒艮)和海牛科(Trichechidae)(例如，海牛)。奇蹄目(Perissodactyla)包括马科(Equidae)(例如，马、驴、斑马)、貘科(Tapiridae)(例如，貘)、以及犀科(Rhinocerotidae)(例如，犀牛)。偶蹄目(Artiodactyla)包括如下科猪科(Suidae)(例如，猪、野猪)、西貒科(Tayassuidae)(例如，西貒)、河马科(Hippopotamidae)(例如，河马)、驼科(Camelidae)(例如，骆驼、美洲驼羊、小羊驼)、鼷鹿科(Tragulidae)(例如，hevrotains)、麝科(Moschidae)(例如，麝鹿)、鹿科(Cervidae)(例如，鹿、麋鹿、驼鹿)、长颈鹿科(Giraffidae)(例如，长颈鹿、霍加狓)、叉角羚科(Antilocapridae)(例如，叉角羚)、以及牛科(Bovidae)(例如，牛、绵羊、羚羊、山羊)。
b.爬行类动物 在一些实施方案中，生物材料是爬行动物或源自爬行动物。爬行动物可以是龟鳖目、侧颈龟亚目、有鳞目、喙头目或鳄目。龟鳖目的爬行动物可以是，例如两爪鳖科、鳄龟科(例如，甲鱼)、海龟科(例如，蠵龟、海龟)、泥龟科(例如，棱皮龟)、龟科(例如，锦龟、黄腹滑龟、水龟、蜗牛龟、箱龟)、动胸龟科(例如，麝香龟)、晰蜴科(Saurotypidae)、陆龟科(例如象陆龟、沙漠地鼠龟、阿尔达布拉陆龟、欧洲陆龟、赫曼陆龟)、鳖科(例如，中华鳖、刺鳖)或平胸龟科。侧颈龟亚目的爬行动物可以是，例如蛇颈龟科(例如，蛇颈龟)或侧颈龟科(例如，沼泽侧颈龟)。
有鳞目的爬行动物可以是，例如鬣蜥科(例如冠毛树蜥、松狮蜥、印度吸血动物(Bloodsucker)、叙利亚刺尾蜥)、蜓科(Chamaeleontdidae)(例如，变色龙)、美洲鬣蜥科(例如，安乐蜥、皇冠鬣蜥、普通有领蜥蜴、鬣鳞蜥、冠状角蜥、黑叩壁蜥、细强棱蜥、雄性侧边斑点蜥蜴)、壁虎科(例如，蛤蚧)、鳞脚蜥科、美洲蜥蜴科(例如，鞭尾蜥、树栖蜥)、蜥蜴科(例如，捷蜥蜴、单眼晰蜴、胎生蜥蜴、壁虎、长尾蜥蜴)、黄蜥科、石龙子科(例如，石龙子属)、非洲蜥蜴科(例如，看日蜥)、双足蜥科、异蜥科、蛇蜥科(例如，鳞脚蜥、短吻鳄(Alligator)晰蜴，褐蛇蜥、脆蛇蜥)、毒蜥科(例如，毒蜥)、婆罗蜥科、巨蜥科(例如，巨蜥)、细盲蛇科、盲蛇科、异盾盲蛇科、筒蛇科(例如，管蛇)、Uropeitidae、闪鳞蛇科、蚺科(例如，蚺、水蟒、岩蟒)、瘰鳞蛇科(例如，爪哇瘰鳞蛇)、游蛇科(例如，红树林蛇、翠绿林神蛇、滑蛇、食卵蛇、南非树蛇、捕鼠蛇、艾斯库拉普蛇、四纹蛇、东方锦蛇、吻突蝣蛇、猪鼻蛇、王蛇、(Montpelier)蛇、草蛇、游蛇、乌蛇、藤蛇、龙骨背(Keelback)蛇)、眼镜蛇科(例如，致死毒蛇、金环蛇、窄头眼镜蛇、珊瑚蛇、眼镜蛇、铜头蛇、鼓腹毒蛇)、蝰科(例如，毒蛇、右蝰蛇(Right Adders)、响尾蛇、链侏响尾蛇、蝰蛇)、海蛇科(例如，海蛇(Sea Brait))、蚓蜥科(例如，蛇蜥)、双足蚓蜥科或短头蚓蜥科(例如，打洞(Burrowing)晰蜴)。
喙头目的爬行动物可以是，例如楔齿蜥科(例如，楔齿蜥)。鳄目的爬行动物可以是，例如鼍科(例如，鳄鱼、凯门鳄属)、鳄科(例如，鳄鱼)或长吻鳄科(例如，食鱼鳄)。
c.两栖动物 本发明的生物材料可以是两栖动物或源自两栖动物。两栖动物可以是，例如蛙或蟾蜍。蛙或蟾蜍可以是，例如节蛙科(例如，赖歇节蛙)、尾蟾科(例如，尾蟾)、短头蟾科(例如，金蛙和盾(shield)蟾蜍)、蟾蜍科(例如，真(true)蟾蜍)、附蛙科(例如，玻璃蛙和叶蛙)、箭毒蛙科(例如，箭毒蛙)、盘舌蟾科(例如，欧洲铃蟾)、沼蟾科(例如，鬼(ghost)蛙)、铲鼻蛙科(例如，铲鼻蛙)、雨蛙科(例如，新大陆树蛙)、非洲树蛙科(例如，非洲树蛙)、滑跖蟾科(例如，新西兰蛙)、细趾蟾科(例如，新热带区蛙frogs)、角蟾科(例如，南亚蛙)、姬蛙科(例如，姬娃(microhylid frogs))、龟蟾科(例如，澳洲蛙)、锄足蟾科(例如，锄足蟾)、合附蟾科(例如，斑点铲足蟾)、负子蟾科(例如，无舌蛙)、多指节蟾科(例如，怪(paradox)蛙)、蛙科(例如，栖岸蛙和其(true)蛙)、树蛙科(例如，新大陆树蛙)、尖吻蟾科(例如，达尔文蛙)、异舌穴蟾科(例如，泥(burrowing)蟾蜍)、塞舌蛙科(例如，Seychelle蛙)、有尾目(例如，蝾螈)或蚓螈目(例如，蚓螈)。
两栖动物可以是蝾螈。蝾螈可以是，例如钝口螈科(例如，钻地蝾螈)、两栖鲵科(例如，两栖螈属)、隐腮鲵科(例如，大鲵和毕氏隐鳃鲵)、陆巨螈科(例如，剑陆巨螈)、小鲵科(例如，亚洲蝾螈)、无肺螈科(例如，无肺螈)、洞螈科(例如，美洲蝾螈和斑泥螈)、急流螈科(例如，急流(torrent)蝾螈)、蝾螈科(例如，东方蝾螈和蝾螈)或鳗螈科(例如，sirens)。可替代地，两栖动物可以是蚓螈。蚓螈可以是，例如真蚓科(例如，真蚓)、鱼螈科(例如，亚洲有尾蚓螈)、吻蚓科(例如，新热带区有尾蚓螈)、蠕蚓科(例如，非洲蚓螈)、盲游蚓科(例如，水生蚓螈)或盲尾蚓科(例如，印度蚓螈)。
d.鸟类 本发明的生物材料可以是鸟或可源自鸟。鸟可以是，例如雁形目(例如，水鸟)、雨燕目(例如，巨峰鸟和雨燕)、夜鹰目(例如，夜鸟)、雉科(例如，岸边鸟(shorebirds))、鹳形目(例如，鹳)、鼠鸟目(例如，鼠鸟)、鸽形目(例如，鸽和鸠鸽)、佛法僧目(例如，翠鸟)、凤冠雉目(例如，稚冠雉、凤冠雉、冠雉、冢雉)、鹃形目(例如，杜鹃、麝雉、蕉鹃)、隼形目(例如，灰色昼夜鸟)、鸡形目(例如，鸡样鸟)、潜鸟目(例如，潜鸟)、鹤形目(例如，骨顶鸡、鹤、秧鸡)、雀形目(例如，栖木(perching)鸟)、鹈形目(例如，鹈鹕)、红鹳目(例如，火烈鸟)、啄木鸟科(例如，啄木鸟)、鸊鹈目(例如，鸊鷉)、信天翁目(例如，管鼻海鸟)、鹦形目(例如，鹦鹉)、企鹅目(例如，企鹅)、鹗形目(例如，枭)、鸵形目(例如，食火鸡(cassowaires)、鸸鹋，几维，鸵鸟、美洲鸵)、形目(例如，鹬鸵)、咬鹃目(例如，咬鹃)或三趾鹑目(例如，三趾鹑)。
e.鱼类 本发明的生物材料可以是鱼或可源自鱼。鱼可以是，例如鲟形目(例如，匙吻鲟、匙鱼(oonfishes)和鲟鱼)、多鳍鱼目(例如，多鳍鱼(bichirs)、多鳍鱼(birchers)、肉鳍鱼(lobed-finned pike)和芦苇鱼(reed fishes))、铡汉鱼目(例如，绿锦鱼和月银汉鱼)、颔针氩目(例如，鱼和颌针鱼)、金眼鲷目、遮目鱼目、齿鲤目(例如，鳉鱼)、豹鲂鮄目(例如，豹鲂鮄)、剌鱼目(例如，海龙和刺鱼)、鲻形目(例如，鲻)、海蛾鱼目(例如，巨口鱼和海蛾)、鲈形目(例如，河鲈样(perch-like)鱼)、鲽形目(例如，比目鱼、鲽和舌鳎)、鲉形目(例如，蝎子鱼和杜父鱼)、奇金眼鲷目、合鳃鱼目(例如，黄鳝)、鲀形目(例如，箱鲀、豚鱼、鳞魨、河豚、扳机鱼和箱魨)、海鲂目(例如，豚鼻鱼、海鲂和鲂)、银汉鱼总目、鲱形目(例如，凤尾鱼和青鱼)、仙女鱼目、北梭魚目、鳗鲡目(例如，鳗)、海鲢目(例如，阿邦鱼(arpons))、背棘鱼目(例如，刺鳗和背棘鱼)、咽囊鱼目、月鱼目(例如，月鱼和细尾带鱼)、脂鲤目(例如，野兔鱼(leporins)和水虎鱼)、鲤形目(例如，鲦鱼、胭脂鱼、斑马鱼)、鼠鱚目(例如，遮目鱼和壳耳鱼(shellears))、裸背电鳗目、鲇形(例如，鲶鱼)、鲑鲈目(Aphredoderiforme)(例如，洞穴鱼和河鲈)、蟾鱼目、鳕形目(例如，鳕和鳕鱼)、喉盘鱼目、鮟鱇目(例如，鮟鱇)、鼬鳚目、鲑鲈目(例如，鲑鲈)、须鳂目(例如，须鳂)、鲸口鱼目、栉鱤目、狗鱼目(例如，荫鱼和狗鱼)、胡瓜鱼目(例如，水珍鱼和胡瓜鱼)、鲑形目(例如，鲑鱼)、灯笼鱼目(例如，灯笼鱼(Latern Fishes))、辫鱼目、巨口鱼目、弓鳍鱼目(例如，弓鳍鱼)、半椎鱼目(例如，雀鳝)、海龙目(例如，海龙和海马)、单鳔肺鱼目(例如，澳洲肺鱼)、双鳔肺鱼目(例如，美洲肺鱼和非洲肺鱼)或腔棘鱼目(例如，腔棘鱼)。
f.无脊椎动物 生物材料可以是无脊椎动物或源自无脊椎动物。无脊椎动物可以是，例如，多孔动物门(例如，海绵)、刺胞动物门(例如，水母、水螅、海葵、僧帽水母和珊瑚)、扁形动物门(例如，叶状软体蜗虫，包括涡虫、吸虫和绦虫)、线虫动物门(例如，圆虫，包括轮虫和线虫)、软体动物门(例如，软体动物、蜗牛、蛞蝓、章鱼、鱿鱼)、环节动物门(例如，分节的蠕虫，包括蚯蚓、水蛭和海洋蠕虫)、棘皮动物门(例如，海星、海参、沙钱、海胆)、帚虫动物门(例如，帚虫类)、缓步动物门(例如，缓步类)、棘头动物门(例如，棘头虫)、栉水母门(例如，栉水母)或节肢动物(例如，蜘蛛、甲壳动物、多足类、唇足类、昆虫类)。
节肢动物可以是，例如鞘翅目(例如，甲虫)、双翅目(例如，蝇)、膜翅目(例如，蚂蚁、蜜蜂、黄蜂)、鳞翅目(例如，蝴蝶、蛾)、长翅目(例如，蝎蛉)、广翅目、脉翅目(例如，草蜻蛉及相关的动物)、蚤目(例如，跳蚤)、捻翅目(例如，寄生性昆虫和捻翅虫)、毛翅目(例如，石蚕蛾)、虱目(例如，吸吮虱)、半翅目(例如，半翅目长虫和它们的相关动物)、食毛目(例如，咬虱)、啮虫目(例如，啮虫)、缨翅目(例如，牧草虫)、直翅目(例如，蝗虫、蝉)、革翅目(例如，蠼螋)、网翅目、纺足目(例如，足丝蚁)、蛩蠊目、螳螂竹节目(例如，斛士(gladiators))、_翅目(例如，石蝇)、缺翅目(例如，绝翅目(zorapterans))、蜉蝣目(例如，蜉蝣)、蜻蜓目(例如，蜻蜓和豆娘)、竹节虫目(例如，竹节虫)、缨尾目(例如，蛀虫)、石蛃亚目、弹尾目(例如，雪蝇(snow flies)和跳虫)、唇足亚纲(例如，唇足类)、倍足亚纲(例如，多足类)、蜥脚类(例如，少足纲、纲(pauropodans)和前殖孔类)、综合纲(例如，假蜈蚣(pseudocentipedes)和综合纲(symphylans))、软甲亚纲(例如，螃蟹、磷虾、丸虾、河虾)、颚足纲、鳃足亚纲(例如，鳃足动物)、头虾纲、介形亚纲(例如，介形亚纲动物)、桨足纲、鳃尾纲、蔓足亚纲(例如，藤壶)、蛛形纲(例如，蛛形类，包括鞭蛛、蜘蛛、盲蜘蛛、盲蜘、微型蝎(microscorpions)、书蝎(book scorpions)、伪蝎、假蝎、蝎子、避日虫、日蜘蛛和尿蛛(uropygids))、肢口纲(例如，鲎)或海蛛纲(例如，海蜘蛛)。
g.真菌 本发明的生物材料可以是真菌或可源自真菌。真菌可以是，例如子囊菌门(子囊菌)、担子菌门(珊瑚菌)、壶菌门(壶菌)、半知菌门或接合菌门。真菌可以是根霉属(Rhizopus)、水玉霉属(Pilobolus)、节丛孢属(Arthrobotrys)、曲霉菌属(Aspergillus)、异水霉属(Allomyces)、壶菌属(Chytridium)、蘑菇属(Agaricus)、捕蝇蕈属(Amanita)、丝膜菌属(Cortinarius)、链孢霉属(Neurospora)、羊肚菌属(Morchella)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、念珠菌属(Candida)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或麦角菌属(Ergot)。在特别的实施方案中，真菌可以是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、白色念珠菌(Candida albicans)或毕赤酵母(Pichia pastoris)。
h.植物 本发明的生物材料可以是植物或可源自植物。植物可以是苔藓植物(例如，藓类、苔类、金鱼藻)、石松植物(例如，石松类、扁叶石松)、木贼纲植物(例如，木贼类)、蕨类植物(例如，蕨类)、苏铁纲植物(例如，苏铁类)、麻藤类(例如，买麻藤属、麻黄属、千岁兰属)、针叶植物(例如，松柏类)、银杏类植物(例如，银杏)或有花植物(例如，显花植物)。有花植物可以是单子叶植物或双子叶植物。单子叶植物的非限制性实例包括小麦、玉米、裸麦、水稻、草坪草、高粱、粟、甘蔗、百合、鸢尾、龙舌兰、芦荟、兰科植物、凤梨科植物和棕榈科植物。双子叶植物的非限制性实例包括烟草、番茄、马铃薯、大豆、向日葵、苜蓿、芸苔、玫瑰、拟南芥、咖啡树、柑橘类水果、豆、苜蓿和棉花。
i.原生生物 本发明的生物材料可以是原生生物或可源自原生生物。原生生物可以是红藻门(例如，红藻)、褐藻门(例如，褐藻、海藻)、绿藻门(例如，绿藻)、裸藻门(例如，裸藻)、粘菌门(例如，粘菌)、卵菌纲(例如，水霉、霜霉、马铃薯疫病)或硅藻门(例如，硅藻)。
j.原核生物 在本发明的某些方面，生物材料是原核生物或源于原核生物。在某些实施方案中，原核生物是古细菌(archaebacteria)。古细菌可以是例如泉古菌门(Euryarchaeota)、广古菌门(Euryarchaeota)、初古菌门(Korarchaeota)或纳古菌门(Nanoarchaeota)。在某些方面，泉古菌门是杆菌纲(Halobacteria)、甲烷杆菌纲(Methanobacteria)、甲烷球菌纲(Methanococci)、甲烷微菌纲(Methanomicrobia)、甲烷叠球菌科(Methanosarcinae)、甲烷火菌纲(Methanopyri)、古球状菌纲(Archeoglobi)、热原体纲(Thermoplasmata)或热球菌纲(Thermococci)。古细菌具体的非限制性实例包括嗜热古菌(Aeropyrum pernix)、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、死海盐盒菌(Halobacterium marismortui)和嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)。
在某些实施方案中，原核生物是真细菌(Eubacteria)。真细菌可以是例如，放线菌门(Actinobacteria)、产水菌门(Aquificae)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿色硫细菌(Green sulfur bacteria)、衣原体门(Chlamydiae)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、绿弯菌门(Chloroflexi)、产金菌门(Chrysiogenetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、网团菌门(Dictyoglomi)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)/酸杆菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、杂食细菌门(Omnibacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)或热袍菌门(Thermotogae)。放线菌门的非限制性实例包括放线菌属(Actinomyces)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、弗兰克菌属(Frankia)、细球菌属(Micrococcus)、单孢丝菌属(Micromonospora)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、丙酸菌属(Propionibacterium)和链霉菌属(Streptomyces)的细菌。放线菌的具体实例包括麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosise)、鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)和马红球菌(Rhodococcus equi)。
产水菌门的非限制性实例包括产水菌属(Aquifex)、Hydrogenivirga、氢杆菌属(Hydrogenobacter)、氢杆菌(Hydrogenobaculum)、Thermocrinis、Hydrogenothermus、Persephonella、Sulfurihydrogenibium、巴氏丝菌属(Balnearium)、除硫杆菌属(Desulfurobacterium)和热弧菌属(Thermovibrio)。厚壁菌门的非限制性实例包括牙胞杆菌属(Bacilli)、梭菌属(Clostridia)和柔膜菌(Molecutes)的细菌。厚壁菌门的具体实例包括无害李斯特氏菌(Listeria innocua)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis)、金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens)、生殖器支原体(Mycoplasma genitalium)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、肺支原体(Mycoplasma pulmonis)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。
衣原体门/疣微菌门的非限制性实例包括细菌例如沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)。异常球菌-栖热菌门的非限制性实例包括异常球菌属和栖热菌属。
变形菌门是革兰氏阴性细菌。变形菌门的非限制性实例包括埃希杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、弧菌属(Vibrio)、立克次体属(Rickettsia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、布鲁氏杆菌属(Brucella)、根瘤菌属(Rhizobium)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、博尔德氏杆菌(Bordetella)、伯克氏菌属(Burkholderia)、Buchnera、耶尔森菌属(Yersinia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、巴斯德菌属(Pasteurella)、放线杆菌属(Actinobacillus)、军团杆菌属(Legionella)、Mannheimia、柯克斯体属(Coxiella)、气单胞菌属(Aeromonas)、土拉菌属(Francisella)、莫拉菌属(Moraxella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、弯曲菌属(Campylobacter)和螺杆菌属(Helicobacter)。变形菌门的具体实例包括康氏立克次氏体(Rickettsia conorii)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、地方性斑疹伤寒立克次氏体(Rickettsia typhi)、牛埃里希体(Ehrlichiabovis)、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、羊流产布氏杆菌(Brucella melitensis)、根瘤菌(Rhizobium rhizogenes)、脑膜炎萘瑟氏菌(Neisseria meningitides)、副百日咳博代氏(杆)菌(Bordetella parapertussis)、百日咳博代氏(杆)菌(Bordetellapertussis)、鼻疽伯克氏菌(Burkholderi mallei)、类鼻疽伯克氏菌(Burkholderi pseudomallei)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、弗氏志贺氏菌(Shgella flexneri)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)、志贺痢疾杆菌(Shigella dysenterica)、流感(嗜血)杆菌(Haemophilusinfluenzae)、出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、放线共生放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、嗜肺性军团病杆菌(Legionellapneumophila)、曼氏溶血杆菌(Mannheimia haemolytica)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、伯纳特氏立克次氏体(Coxiella burnetii)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularesis)、粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)和幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)。
螺旋体门的非限制性实例包括短螺旋体科(Brachyspiraceae)、钩端螺旋体科(Leptospiraceae)和螺旋体科(Spirochaetaceae)的细菌。螺旋体门的具体实例包括博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)和梅毒螺旋体(Treponema pallidum)。
2.不同类型的生物物质 本发明的方法和仪器可应用于生物。可以诱导生物的停滞或可以诱导生物的细胞、组织和/或器官内的停滞。考虑用于本发明方法和仪器的、可以在其中诱导停滞的生物物质仅限于包含利用氧来产生能量的细胞的范围。
可以在包括心、肺、肾、肝、骨髓、胰、皮肤、骨、静脉、动脉、角膜、血、小肠、大肠、脑、脊髓、平滑肌、骨骼肌、卵巢、睾丸、子宫和脐带在内的细胞、组织或器官中诱导停滞。
而且，可以在以下类型的细胞中诱导停滞血小板、髓细胞、红血球、淋巴细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、内分泌细胞、神经胶质细胞、神经细胞、分泌细胞、屏障功能细胞、收缩细胞、吸收细胞、粘膜细胞、缘细胞(来自角膜)、干细胞(全能性、多能性或多潜能性)、未受精的或受精的卵母细胞或精细胞。
此外，可以在植物或植物的部分，包括果实、花、叶、茎、种子、插条中诱导停滞。植物可以是农业、药用或观赏植物。在植物中停滞的诱导可以增强整株植物或植物的部分的储藏期或病原体抗性。
本发明的方法和仪器可以用于诱导体内生物物质的停滞。这可用于保护和/或保藏生物物质或生物自身或用于预防对它们或整个生物的损害或损伤。
3.测定法 停滞可以通过许多方式，包括通过定量生物样品消耗的氧的量、样品产生的二氧化碳的量(细胞呼吸的间接测量)或通过表征运动力来测量。
为了测定氧消耗的速率或二氧化碳产生的速率，将生物物质置于具有两个开口(用于气体输入和输出)密封的腔室内。将气体(室内空气或其它气体)以给定流速通入所述腔室内并流出出口以在该腔室内维持大约1个大气压。在暴露于该腔室之前和之后，将该气体通过二氧化碳检测器和或氧气检测器来测量(每秒)该气体混合物中每种化合物的量。比较随时间变化的这些值得到氧消耗或二氧化碳产生的速率。
II.氧拮抗剂和其它活性化合物 本发明涉及方法、组合物和制造品，所述的方法、组合物和制造品涉及一种或多种可作用于生物物质以至于产生许多效应的试剂，所述的效应包括，但不限于，诱导停滞、增强或增加存活力、可逆地抑制代谢、诱导细胞或生物的代谢和活性、减少氧需求、减少或防止损伤、防止缺血型损伤、防止老化或衰老，和/或获得多种在此讨论的治疗性应用。在某些实施方案中，所述的试剂适格作为“活性化合物”。
在一些实施方案中，所述的试剂是氧拮抗剂，其可以直接或间接起作用。氧代谢是需氧后生动物生命的一个基本要求需氧呼吸负责多数动物中绝大多数的能量产生，并也用于维持进行重要的细胞反应必须的氧化还原电位。在低氧时，降低的氧利用度导致在电子传递链最终步骤中电子到分子氧的无效转移。这种无效既导致需氧能量产生的降低和又导致破坏性自由基产生的增加，这主要是由于在复合物III处电子的过早释放以及通过细胞色素氧化酶形成的O2-(Semenza，1999)。有限的能量供应和自由基损伤可以干扰基本的细胞过程，例如蛋白质合成和细胞膜极性的维持(Hochachka等，1996)，并且将最终导致细胞死亡。
在其它实施方案中，所述试剂是保护性代谢剂。代谢通常理解为指生命所需要的(细胞或生物中)化学过程；它们涉及多种反应来维持能量产生和合成(合成代谢)和分解(分解代谢)复杂分子。
在本发明的某些实施方案中，活性化合物具有如在此描述的式I或IV列出的化学结构，或是式I或IV的前体。
在此描述了多种化学结构和化合物。以下定义应用于用于描述在此讨论的这些结构和化合物的术语 “烷基”，在单独使用或在其它术语例如“芳基烷基”、“氨基烷基”、“硫代烷基”、“氰基烷基”和“羟基烷基”中使用时，指具有一个至大约20个碳原子的直链的或分支的基团。术语“低级烷基”指C1-C6烷基基团。如在此使用的，术语烷基包括用羟基、卤素(例如F、Cl、Br、I)、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷硫基、氰基、异氰基、羧基(-COOH)、烷氧羰基(-COOR)、酰基、酰氧基、氨基、烷基氨基、脲(--NHCONHR)、巯基、烷硫基、硫氧基(sulfoxy)、磺酰基、芳基磺酰基、烷基磺酰基、磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基、杂环基、杂环烷基、酰氨基(amidyl)、烷基亚氨羰基、脒基、胍基(guanidono)、肼基、酰肼、磺酰基钠(-SO3Na)、磺酰烷基钠(-RSO3Na)等基团取代的那些基团。这些基团的实例包括(但不限于)甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。
“羟基烷基”指用一个或多个羟基基团取代的、如在此定义的烷基基团。羟基烷基基团的实例包括但不限于羟甲基、2-羟乙基、2-羟丙基、3-羟丙基、2-羟丁基、3-羟丁基、4-羟丁基、2，3-二羟基丙基、1-(羟甲基)-2-羟乙基、2，3-二羟基丁基、3，4-二羟基丁基和2-(羟甲基)-3-羟丙基等。
“芳基烷基”指基团R′R-，其中烷基基团“R”用芳基基团“R′”取代。芳基烷基基团的实例包括但不限于苄基、苯乙基、3-苯基丙基等。
“氨基烷基”指基团H2NR′-，其中烷基基团用氨基基团取代。这种基团的实例包括氨甲基、氨乙基等。“烷基氨基烷基”指用烷基氨基基团取代的烷基基团。
“烷基磺酰氨基”指附加至如在此定义的烷基的磺酰氨基(-S(O)2-NRR′)。
“硫烷基”指其中烷基用一个或多个巯基取代。“烷基硫烷基”指其中烷基用一个或多个烷硫基取代。实例包括但不限于甲基硫甲基、乙基硫异丙基等。“芳基硫烷基”指其中如在此定义的烷基用一个或多个芳硫基取代。
“羧基烷基”指基团-RCO2H，其中烷基基团用羧基取代。实例包括但不限于羧甲基、羧乙基、羧丙基等。
“亚烷基”指桥连烷基基团。
术语“链烯基”指不饱和的、无环烃基，因为其含有至少一个双键。这种链烯基含有大约2至大约20个碳原子。术语“低级链烯基”指C1-C6链烯基基团。如在此使用的，术语链烯基团包括用烷基基团取代的那些基团。合适的链烯基团的实例包括丙烯基、2-氯丙烯基、丁烯-1-基、异丁烯基、戊-1-烯-1-基、2-2-甲基-1-丁烯-1-基、3-甲基-1-丁烯-1-基、己-2-烯-1-基、3-羟己-1-烯-1-基、庚-1-烯-1-基和辛-1-烯-1-基等。
术语“炔基”指不饱和的、无环烃基，因为其含有一个或多个三键，这种基团含有大约2至大约20个碳原子。术语“低级炔基”指C1-C6炔基基团。如在此使用的，术语炔基包括用烷基基团取代的那些基团。合适的炔基基团的实例包括乙炔基、丙炔基、羟基丙炔基、丁-1-炔-1-基、丁-1-炔-2-基、戊-1-炔-1-基、戊-1-炔-2-基、4-甲氧基戊-1-炔-2-基、3-甲基丁-1-炔-1-基、己-1-炔-1-基、己-1-炔-2-基、己-1-炔-3-基、3，3-二甲基-1-丁炔-1-基等。
“烷氧基”指基团R′O-，其中R′是如在此定义的烷基基团。实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、异丙氧基、叔丁氧基等。“烷氧基烷基”指用一个或多个烷氧基取代的烷基基团。实例包括但不限于甲氧基甲基、乙氧基乙基、甲氧基乙基、异丙氧基乙基等。
“烷氧羰基”指基团R-O-C(O)-，其中R是如在此定义的烷基基团。烷氧羰基基团的实例包括但不限于甲氧羰基、乙氧羰基、仲-丁氧羰基、异丙氧羰基等。烷氧硫代羰基指R-O-C(S)-。
“芳基”指由一个单独的环或一个或多个稠合的环组成的单价芳香碳环基团，稠合环中的至少一个环在性质上是芳香的，其可任选被一个或多个，优选一个或两个以下取代基取代，除非另外指出，例如羟基、卤素(例如F、Cl、Br、I)、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷硫基、氰基、羧基(-COOH)、烷氧羰基(-COOR)、酰基、酰氧基、氨基、烷基氨基、脲(--NHCONHR)、巯基、烷硫基、硫氧基、磺酰基、芳基磺酰基、烷基磺酰基、磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基、杂环基、杂环烷基、酰氨基、烷基亚氨基、脒基、胍基、肼基、酰肼、磺酰基钠(-SO3Na)、磺酰烷基钠(-RSO3Na)。可替代地，芳环的两个邻接原子可以用亚甲二氧基或亚乙二氧基取代。芳基基团的实例包括但不限于苯基、萘基、联苯基、茚满基、二苯二丁对蒽二酚基、叔丁基苯基、1，3-苯并间二氧杂环戊烯基等。
“芳基磺酰氨基”指附加至如此处定义的芳基的、如此处定义的磺酰氨基。
“硫芳基”指用一个或多个巯基取代的芳基。
“烷基氨基”指用一个或两个烷基基团取代的氨基基团。实例包括单取代的N-烷基氨基基团和N，N-二烷基氨基基团。实例包括N-甲氨基，N-乙氨基、N，N-二甲基氨基、N，N-二乙基氨基、N-甲基，N-乙基-氨基等。
“氨基羰基”指基团H2NCO-。“氨基羰基烷基”指一个或多个氨基羰基基团取代的如此处定义的烷基基团。
“酰氨基”指RCO-NH-，其中R是H或如此处定义的烷基、芳基或杂芳基。
“亚氨基羰基”指4个共价键位点中的两个与亚氨基共有的碳基。这种亚氨基羰基基团的实例包括，例如，C＝NH、C＝NCH3、C＝NOH和C＝NOCH3。术语“烷基亚氨基羰基”指用烷基取代的亚氨基。术语“脒基”指键合至亚氨基羰基基团的两个可利用键之一的、经取代或未经取代的氨基。这种脒基基团的实例包括，例如，NH2-C＝NH、NH2-C＝NCH3、NH-C＝NOCH3和NH(CH3)-C＝NOH。术语“胍基”指如上面定义的键合至氨基的脒基，其中所述的氨基可键合至第三个基团。这种胍基基团的实例包括，例如NH2-C(NH)-NH-、NH2-C(NCH3)-NH-、NH2-C(NOCH3)-NH-和CH3NH-C(NOH)-NH-。术语“肼基”指-NH-NRR′，其中R和R′独立地是氢、烷基等。“酰肼”指-C(＝O)-NH-NRR′。
术语“杂环基”指饱和的和部分饱和的含杂原子的环形基团，其具有4到15个环成员，在此称为“C4-C15杂环基”，环成员选自碳、氮、硫和氧，其中至少一个环原子是杂原子。杂环基基团可以含有一个、两个或三个环，其中这种环可以以悬垂的方式连接，或可以稠合。饱和的杂环基团的实例包括含有1至4个氮原子的饱和3至6元杂单环基团[例如吡咯烷基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基等]；含有1至2个氧原子和1至3个氮原子的饱和的3至6元杂单环基团[例如吗啉基]；含有1至2个硫原子和1至3个氮原子的饱和的3至6元杂单环基团[例如噻唑烷基等]；部分饱和的杂环基团的实例包括二氢噻吩、二氢吡喃、二氢呋喃和二氢噻唑。杂环基团的非限制性实例包括2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、吡咯烷基(pyrrolindinyl)、1，3-二氧戊环基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、哌啶基、1，4-二_烷基、吗啉基、1，4-二噻烷基、硫代吗啉基等。这种杂环基团可以任选用基团如取代基，例如羟基、卤素(例如F、Cl、Br、I)、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷硫基、氰基、羧基(-COOH)、烷氧羰基(-COOR)、酰基、酰氧基、氨基、烷基氨基、脲(--NHCONHR)、巯基、烷硫基、硫氧基、磺酰基、芳基磺酰基、烷基磺酰基、磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基、杂环基、杂环烷基、酰氨基、烷基亚氨基羰基、脒基、胍基、肼基、酰肼、磺酰基钠(-SO3Na)、磺酰烷基钠(-RSO3Na)取代。
“杂芳基”指具有一个或多个环，优选一个到三个环的单价芳香环基团，每个环有4到8个原子，在环内整合了一个或多个杂原子，优选一个或两个(选自氮、氧或硫)，所述杂芳基可任选用一个或多个，优选一个或两个选自以下的取代基取代，除非另外指出，例如羟基、卤素(例如F、Cl、Br、I)、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷硫基、氰基、羧基(-COOH)、烷氧羰基(-COOR)、酰基、酰氧基、氨基、烷基氨基、脲(--NHCONHR)、巯基、烷硫基、硫氧基、磺酰基、芳基磺酰基、烷基磺酰基、磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基、杂环基、杂环烷基、酰氨基、烷基亚氨基羰基、脒基、胍基、肼基、酰肼、磺酰基钠(-SO3Na)、磺酰烷基钠(-RSO3Na)。杂芳基的实例包括但不限于咪唑基、_唑基、噻唑基、吡嗪基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻喃基、苯并咪唑基、苯丙_唑基、苯并噻唑基、苯并吡喃基、吲唑基、吲哚基、异吲哚基、喹啉基、异喹啉基、二氮杂萘基、苯磺酰基-噻吩基等。
“杂芳氧基”指连接至氧基的杂芳基基团。这种基团的实例包括，但不限于，2-硫代苯氧基、2-嘧啶氧基、2-吡啶氧基、3-吡啶氧基、4-吡啶氧基等。
“杂芳氧基烷基”指用一个或多个杂芳氧基取代的烷基基团。这种基团的实例包括2-吡啶氧基甲基、3-吡啶氧基乙基，4-吡啶氧基甲基等。
“环烷基”指由一个或多个环，典型地一个或两个环组成的单价饱和的碳环基团，每个环有3个到8个碳，所述环烷基可通常用一个或多个以下取代基取代，除非另外指出羟基、卤素(例如F、Cl、Br、I)、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷硫基、氰基、羧基(-COOH)、烷氧羰基(-COOR)、酰基、酰氧基、氨基、烷基氨基、脲(--NHCONHR)、巯基、烷硫基、硫氧基、磺酰基、芳基磺酰基、烷基磺酰基、磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基、杂环基、杂环烷基、酰氨基、烷基亚氨基羰基、脒基、胍基、肼基、酰肼、磺酰基钠(-SO3Na)、磺酰烷基钠(-RSO3Na)。环烷基基团的实例包括但不限于环丙基、环丁基、3-乙基环丁基、环戊基、环庚基等。“环烯基”指具有3至10个碳原子和一个或多个碳-碳双键的基团。典型的环烯基基团具有3至7个碳原子。实例包括环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基等。“环烯基烷基”指其中此处所定义的烷基被一个或多个环烯基取代的基团。
“环烷氧基”指连接至氧基的环烷基基团。实例包括但不限于环己氧基、环戊氧基等。
“环烷氧基烷基”指用一个或多个环烷氧基取代的烷基基团。实例包括环己氧基乙基、环戊氧基甲基等。
“亚磺酰基”指-S(O)-。
“磺酰基”指-S(O)2-，其中“烷基磺酰基”指用烷基基团取代的磺酰基RSO2-，芳基磺酰基指连接至磺酰基的芳基。“磺酰氨基”指-S(O)2-NRR′。“磺酸”指-S(O)2OH。“磺酸酯”指-S(O)2OR，其中R是基团例如磺酸烷基酯中的烷基。
“硫基”指-S-。“烷硫基”指RS-，其中巯基基团用烷基R取代。实例包括甲硫基、乙硫基、丁硫基等。“芳硫基”指R′S-，其中硫基用如此处定义的芳基取代。实例包括但不限于苯硫基等。实例包括但不限于苯硫甲基等。“烷基硫代磺酸”指基团HO3SR′S-，其中烷硫基用磺酸基团取代。
“硫代次磺酰基”指-S-SH。
“酰基”，在单独或组合时，指键合至选自例如以下基团的羰基或硫代羰基羟基(hydrido)、烷基、链烯基、炔基、卤代烷基、烷氧基、烷氧基烷基、卤代烷氧基、芳基、杂环基、杂芳基、烷基亚磺酰烷基、烷基磺酰烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基、烷硫基、芳硫基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳烷氧基、芳硫基和烷硫基烷基。“酰基”的实例是甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、丙二酰基、烟酰基等。
术语“酰硫基”和“酰基二硫基”分别指RCOS-和RCOSS-基团。
术语“硫代羰基”指含有以双键连接至硫原子的碳的化合物和部分，-C(＝S)-。“烷基硫代羰基”指其中硫代羰基用如此处定义的烷基基团R取代而形成单价基团RC(＝S)-。“氨基硫代羰基”指用氨基取代的硫代羰基，NH2C(＝S)-。
“羰基氧基”指-OCOR。
“烷氧羰基”指-COOR。
“羧基”指-COOH。
对于具有立体异构体的那些化合物，考虑其其所有的立体异构体，包括顺式/反式几何异构体、非对映体和单独的对映异构体。
A.一氧化碳 一氧化碳(CO)是无色、无臭和无味的气体，其可以对动物，包括人是有毒的。根据疾病控制中心，每年有多于450人意外地死于一氧化碳。
它可以对其血液携带氧来维持其生存的生物是有毒性的。它可以通过经由正常呼吸进入肺并代替血流中的氧而是有毒的。中断正常的氧供应危害心脏、脑的功能以及身体的其它生命机能。然而，正在研究将一氧化碳用于医学应用(Ryter等，2004)。
在百万分之50份(ppm)的量时，一氧化碳对暴露于它的人不表现出症状。然而，在200ppm时，在2到3小时内，一氧化碳可以引起轻度的头疼；在400ppm时，在1到2小时内，其可以引起额痛，这可以在3小时内变得分别广泛；并且在800ppm时，其可以在45分钟内引起头昏眼花、恶心和/或抽搐，并且使受试者在2小时内无感觉。在大约1000ppm的水平，生物可以在暴露多于大约1-2分钟后死亡。
由于众所周知的和充分证明了的一氧化碳对生物的毒性效应，因而可将一氧化碳用于诱导活生物样品的停滞和/或帮助其保藏是令人惊奇和意外的。因而考虑可将一氧化碳用于在分离的生物物质，例如无血液的生物物质中诱导停滞(由于一氧化碳具有的对血红蛋白的效应，其为与涉及诱导停滞的途径不同的途径)。
除了暴露于一氧化碳来诱导停滞或来限制或防止由停滞诱导剂引起的任何损伤，本发明考虑可将一氧化碳与有助于生物材料的保藏和/或移植/嫁接过程的试剂或方法组合使用。
B.硫属化物化合物 含有硫属元素(元素周期表第6族中的那些)的化合物(但是氧化物除外)通常被称为“硫属化物”或“硫属化物化合物”(在此可相互交换使用)。这些元素是硫(S)、硒(Se)、碲(Te)和钋(Po)。普通的硫属化物除了其它元素外，还含有S、Se和Te的一种或多种。硫属化物包括元素形式例如S和Se的微粉化的和/或纳米粒化的粒子。可采用硫属化物化合物用作还原剂。
本发明人，尽管不受以下理论约束，认为硫属化物诱导细胞中的停滞，以及允许调节动物中的核心体温的能力源于这些分子结合至细胞色素氧化酶。这样一来，硫属化物抑制或降低了氧化磷酸化的活性。硫属化物阻断自发的体温调节，即允许“温血”动物的核心体温可通过控制环境温度来操纵的能力，被认为源于与上面列出的相同的机制-结合至细胞色素氧化酶，并阻断或降低氧化磷酸化的活性。硫属化物可以以液体以及气体形式提供。
硫属化物对哺乳动物可以是有毒性的，并且在一些水平上是致死的。根据本发明，预期硫属化物的水平不应该超过合适环境中的致死水平。硫属化物的致死水平可以例如在每种硫属化物的物质安全资料表(Material Safety Data Sheets)中，或从可从美国政府的职业安全与卫生管理局(OSHA)获得的信息表中找到。
虽然一氧化碳和硫属化物化合物都可以通过用作氧拮抗剂来诱导停滞，它们具有不同的毒性效应，该效应与它们诱导停滞的能力是分离的。而且，因为细胞色素氧化酶的不同亲和性，介导停滞效应所需的浓度是不同的。细胞色素氧化酶对氧的亲和性与对一氧化碳的亲和力比较是约1∶1，而对H2S的亲和力与对氧的亲和力比较表现在约300∶1的量级上。这影响了使用停滞诱导浓度会观察到什么毒性效应。因此，考虑硫属化物化合物特别适合用于在整个生物中诱导生物物质的停滞和诱导整个生物的停滞。
也可以证明在撤除硫属化物前提供额外的刺激给生物物质是有用的。特别是，预想可在移除硫属化物源前让动物接受增加的环境温度。
1.H2S和其它含硫的化合物 硫化氢(H2S)是一种通常与石油化学和天然气体、污水、纸浆、鞣革和食品加工相联系的潜在毒性气体。在细胞水平上的主要效应表现为细胞色素氧化酶或其它氧化酶的抑制，导致细胞低氧。暴露于极端水平(500ppm)导致暴脱和无意识(所谓的“击倒”效应)，然后恢复。暴露后的效果可能持续多年，并且包括协调不能、记忆丧失、运动功能障碍、人格改变、幻觉和失眠。
然而，多数的H2S接触在远低于这种急性毒性水平下发生。然而，通常关心长期在亚急性水平上的接触。存在一些报道指出，在慢性的低水平H2S暴露后，持久性的平衡能力和记忆的损伤以及改变的感觉运动功能可能在人中发生。Kilburn和Warshaw(1995)；Kilburn(1999)。其他人已经报道，在围产期从妊娠到生产后21天每天暴露大鼠于低的(20或50ppm)H2S 7小时，导致脑内浦肯野细胞的具有减少的树状分歧(reduced aborization)的更长的树状分支。与相对低水平的H2S相关的其它神经缺损包括改变的脑神经递质浓度和改变的神经反应，例如增加的海马иEEG活动。
在暴露于中等水平的H2S的大鼠中研究了行为毒性。结果显示，在暴露结束后H2S立即抑制了辨别回避反应(Higuchi和Fukamachi，1997)，并且还干扰了大鼠学习诱饵诱导的辐射臂状迷宫任务(baitedradial arm maze task)的能力(Partlo等，2001)。在另一个使用80ppm H2S围产期研究中，在暴露的大鼠幼崽中没有发现神经病理学效应或改变的运动活动、被动回避或声响惊恐反应(coustic startleresponse)。Dorman等，(2000)。最后，Struve等，(2001)在连续的5天每天通过多种水平的气体，让大鼠暴露于H2S 3小时。观察到在暴露于80ppm或更高的H2S后，运动活动、水迷宫表现和体温的显著减少。总起来看，这些报道表明，H2S可以对哺乳动物组织的生物化学具有多种效应，但是关于行为没有明显的反应模式。
一旦溶解于血浆中，H2S将参与一系列化学反应。所述的化学反应是(1)分子H2S解离形成硫氢根离子(bisulfide ion)，(2)硫氢根离子解离形成硫离子，以及(3)水的自电离。反应在下面给出


利用pH 7.4时平衡常数K1＝1.039E-07、K2＝6.43E-16和Kw＝1.019E-14，计算得到的不同物质相对于总S浓度的量是大约23％的H2S和77％的HS-，而S2-的量趋向于0。
本发明人利用与气相色谱法和质量特异性检测偶联的萃取烷基化(extractive alkylation)技术来定量硫化氢(根据Hyspler等，2002改编)。这种方法包括首先与150μL由5mM的苯扎氯铵(BZK)组成的反应缓冲液一起加入50μL血液、血清或组织提取液样品于饱和的硼酸盐缓冲液中，所述的样品已经稀释于氮净化了的脱氧水中至1mg/mL的浓度。首先将100μL乙酸乙酯中的15μM的4-氯-苄基甲硫醚(4CBMS)溶液加入其中，然后加入100μL甲苯中的20mM的五氟苄基溴(PFBBr)溶液。然后密封这种溶液并在55℃下伴随旋转或振摇孵育2小时。在该孵育期后，然后加入200μL饱和的KH2PO4溶液，并且移出有机相并根据Hyspler等，2002中描述的方法，通过气相色谱法和质量特异性检测来分析。然后将这些测量值与用上面描述的相同的方法，以已知的标准浓度(在氮净化了的脱氧水中制备，范围为1μM-1mM的Na2S)开始而产生的标准曲线比较，以便测定内源性的硫化氢水平。为了分析结合的和/或氧化的硫化物水平，应用相同的方法，除了使用了变性/还原反应缓冲液外，所述的缓冲液由具有1％的氢氧化四乙铵(TEAH)的5mM BZK和饱和的硼酸盐缓冲液中的1mM的盐酸三(2-羧乙基)-膦(TCEP)组成，而不是上面描述的反应缓冲液。
考虑根据本发明使用的典型的硫化氢水平包括大约1至大约150ppm、大约10至大约140ppm、大约20至大约130ppm和大约40至大约120ppm或其当量的经口、静脉内或经皮肤剂量。其它有关的范围包括大约10至大约80ppm、大约20至大约80ppm、大约10至大约70ppm、大约20至大约70ppm、大约20至大约60ppm和大约30至大约60ppm或其等效的经口、静脉内或经皮肤剂量。也考虑，在给定时间段内对于给定的动物，应该减少硫属化物气氛来避免受试者中可能致死的硫属化物的积累。例如，80ppm的初始环境浓度可以在30分钟后减少至60ppm，随后在1小时(40ppm)和2小时(20ppm)时进一步减少。
a.H2S前体 本发明也涉及使用可以在某些条件下，例如在暴露于生物物质时或暴露不久后，产生H2S的化合物和试剂。考虑这种前体在发生一种或多种酶促或化学反应时产生H2S。
3.其它硫属化物 在某些实施方案中，还原剂结构化合物是二甲亚砜(DMSO)、二甲硫醚(DMS)、甲硫醇(CH3SH)、巯基乙醇、硫氰酸、氰化氢、甲硫醇(MeSH)或CS2。在特殊的实施方案中，氧拮抗剂是CS2、MeSH或DMS。这些分子的大小量级的化合物是特别考虑的(即，在它们的分子量的大约50％内)。
设想对于诱导停滞有用的其它化合物包括，但不限于以下结构，这些结构的许多可容易获得并且对本领域技术人员是已知的(通过CAS号确定)104376-79-6(头孢曲松钠盐)；105879-42-3；1094-08-2(盐酸二乙异丙嗪)；1098-60-8(盐酸三氟丙嗪)；111974-72-2；113-59-7；113-98-4(青霉素G K+)；115-55-9；1179-69-7；118292-40-3；119478-56-7；120138-50-3；121123-17-9；121249-14-7；1229-35-2；1240-15-9；1257-78-9(乙二磺酸甲哌氯丙嗪盐)；128345-62-0；130-61-0(盐酸甲硫哒嗪)132-98-9(青霉素V K+)；13412-64-1(双氯青霉素Na+水合物)；134678-17-4；144604-00-2；146-54-3；146-54-5(盐酸氟非纳嗪)；151767-02-1；159989-65-8；16960-16-0(促肾上腺皮质激素片段1-24)；1982-37-2；21462-39-5(盐酸氯林霉素)；22189-31-7；22202-75-1；23288-49-5(普罗布考)；23325-78-2；24356-60-3(头孢吡硫)；24729-96-2(克林霉素)；25507-04-4；26605-69-6；27164-46-1(头孢唑啉Na+)；2746-81-8；29560-58-8；2975-34-0；32672-69-8(苯磺酸美索达嗪)；32887-01-7；33286-22-5((+)-顺式-盐酸地尔硫_)；33564-30-6(头孢西丁钠)；346-18-9；3485-14-1；3511-16-8；37091-65-9(苯咪唑青霉素钠)；37661-08-8；3819-00-9；38821-53-3(头孢雷定)；41372-02-5；42540-40-9(头孢孟多甲酸酯钠)；4330-99-8(异丁嗪半-(+)-酒石酸盐)；440-17-5(二盐酸三氟比拉嗪)；4697-14-7(替卡西林二钠)；4800-94-6(羧苄基青霉素双钠)；50-52-2；50-53-3；5002-47-1；51481-61-9(西咪替丁)；52239-63-1(6-丙基-2-硫尿嘧啶)；53-60-1(盐酸丙嗪)；5321-32-4；54965-21-8(丙硫咪唑)；5591-45-7(替沃噻吨)；56238-63-2(头孢呋肟钠)；56796-39-5(头孢美唑钠)；5714-00-1；58-33-3(盐酸异丙嗪)；58-38-8；58-39-9(羟哌氯丙嗪)；58-71-9(头孢噻吩钠)；59703-84-3(哌拉西林钠)；60-99-1(马来酸左美丙嗪盐)；60925-61-3；61270-78-8；6130-64-9(青霉素G普鲁卡因盐水合物)；61318-91-0(氯苄硫咪唑硝酸盐)；61336-70-7(三水合阿莫西林)；62893-20-3(头孢哌酮钠)；64485-93-4(头孢噻肟钠)；64544-07-6；64872-77-1；64953-12-4(拉塔头孢霉素钠)；66104-23-2(培高利特甲磺酸盐)；66309-69-1；66357-59-3(盐酸雷尼替丁)；66592-87-8(Cefodroxil)；68401-82-1；69-09-0(盐酸氯丙嗪)；69-52-3(氨苄青霉素钠)；69-53-4(氨苄青霉素)；69-57-8(青霉素G钠)；70059-30-2；70356-03-5；7081-40-5；7081-44-9(氯唑西林钠H2O)；7177-50-6(萘夫西林钠H2O)；7179-49-9；7240-38-2(苯唑西林钠H2O)；7246-14-2；74356-00-6；74431-23-5；74849-93-7；75738-58-8；76824-35-6(法莫替丁)；76963-41-2；79350-37-1；81129-83-1；84-02-6(丙氯拉嗪马来酸氢盐)；87-08-1(苯氧甲基青霉酸)；87239-81-4；91-33-8(苄噻嗪)；91832-40-5；94841-17-5；99294-94-7；154-42-7(6-硫鸟嘌呤)；36735-22-5；536-33-4(乙硫异烟胺)；52-67-5(D-青霉胺)；304-55-2(内消旋-2，3-二巯基丁二酸)；59-52-9(2，3-二巯基+丙醇)6112-76-1(6-巯嘌呤)；616-91-1(N-乙酰基-L-半胱氨酸)；62571-86-2(卡托普利)；52-01-7(螺内酯)和80474-14-2(丙酸氟替卡松)。考虑作为对于停滞可能有用的其它化合物包括具有式I或IV的化学结构的那些。
C.其它拮抗剂或活性化合物和相关的环境条件 1.低氧和缺氧 低氧是一种普通的天然应激并且存在数种十分保守的反应，其促进细胞适应低氧环境。为了抵偿低氧中需氧能量产生能力的降低，细胞必须增加无氧能量产生或降低能量需求(Hochachka等，1996)。这两种反应的实例在后生动物中是普通的并且利用的特殊反应通常取决于可提供给细胞的氧的量。
在轻度低氧中，氧化磷酸化作用仍然部分活跃，所以一些需氧能量产生是可能的。对这种情况的细胞反应(其部分通过可诱导低氧的转录因子HIF-1介导)是通过上调涉及无氧能量产生的基因，例如糖酵解酶和葡萄糖转运蛋白来补足减少的需氧能量产生(Semenza，2001；Guillemin等，1997)。这种反应也促进了防止自由基诱导的损伤的抗氧化剂例如过氧化氢酶(catylase)和过氧化物歧化酶的上调。因此，在轻度低氧中细胞能维持接近含氧正常水平的活动。
在极端形式的低氧(称为“无氧”-在此定义为＜0.001kPa O2)中-氧化磷酸化作用停止并因而产生能量的能力显著降低。为了在这种环境中存活，细胞必须通过减少细胞活动来降低能量需求(Hochachka等，2001)。例如，在剥夺了氧的海龟肝细胞中，细胞限制活动例如蛋白质合成、离子通道活性和合成代谢途径的定向反应导致ATP需求减少94％(Hochachka等，1996)。在斑马鱼(Danio rerio)胚中，暴露于无氧导致心搏、运动、细胞周期进展和发育进展的完全停止(Padilla等，2001)。类似地，秀丽隐杆线虫通过进入滞生而对无氧发生反应，在滞生中，所有可观察到的运动，包括细胞分裂和发育进展停止(Padilla等，2002；Van Voorhies等，2000)。秀丽隐杆线虫可以保持滞生24小时或更久，并且一旦回到含氧量正常，将恢复高的存活力。这种反应使得丽隐杆线虫能通过减少在能量方面消耗大的过程的比率并防止损伤、不可撤销的事件(例如非整倍状态)的发生而在低氧应激下存活(Padilla等，2002；Nystul等，2003)。
一个最近发现的反应是由血红素加氧酶-1进行的低氧诱导一氧化碳的产生(Dulak等，2003)。内源性产生的一氧化碳可以激活信号级联反应，该级联反应通过抗细胞凋亡(Brouard等，2003)和抗炎性(Otterbein等，2000)活性来减轻低氧损伤，并且通过灌注外源性的一氧化碳在移植模型中可获得类似的细胞保护效果(Otterbein等，2003；Amersi等，2002)。在更高的浓度下，一氧化碳与氧竞争结合至含有铁的蛋白质，例如线粒体细胞色素和血红蛋白(Gorman等，2003)，可是还没有研究在低氧中这种活性可能具有的细胞保护效果。
尽管存在对抗低氧损伤的这些复杂的防御机制，低氧仍然常常是一种损伤性应激。例如，哺乳动物具有血红素加氧酶-1和HIF-1两者，并且一些证据提示滞生在哺乳动物中也是可能的(Bellamy等，1996；Alam等，2002)。然而，由于创伤例如心脏病发作、中风或失血导致的低氧性损伤是死亡的一个主要原因。幸免于低氧应激的两种基本策略(保持活跃或滞生)的局限性的理解受这样的事实阻碍其是基于在多种条件下的多种系统中进行的研究。
当正常生理水平的氧没有供应至细胞或组织时，出现“低氧”。“含氧量正常”指所讨论的特殊细胞类型、细胞状态或组织的正常生理水平的氧。“缺氧”是没有氧。“低氧条件”是导致细胞低氧的那些条件。这些条件依赖于细胞类型，和取决于组织或器官内的细胞的特殊结构或位置以及细胞的代谢状况。为了本发明的目的，低氧条件包括其中氧浓度是或低于正常大气状况的条件，其少于20.8、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0％；可替代地，这些数字可以代表在1个大气压(101.3kPa)下的气氛的百分比。0百分比的氧浓度定义了缺氧条件。因此，低氧条件包括缺氧条件，尽管在一些实施方案中，实施不少于0.5％的低氧条件。如在此使用的，“含氧量正常的条件”等同于大约20.8％或更高的氧浓度。
获得低氧或缺氧的标准方法是充分确立的，并且包括使用依赖于化学催化剂来从其中除去氧的环境室。这类室可以从例如BDDiagnostic Systems(Sparks，MD)商业获得，其为GASPAK DisposableHydrogen+Carbon Dioxide Envelopes或BIO-BAG环境室。可替代地，氧可以通过用非氧气体，例如氮气交换室内的空气来耗竭。氧浓度可以例如用FYRITE氧分析仪(Bacharach，Pittsburgh PA)测定。
考虑本发明的方法可使用暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物和与室内空气比较改变氧浓度的组合。而且，含有生物物质的环境的氧浓度可以是约、至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，或可源于其中任何范围。而且，考虑浓度的变化就与室内空气或与对照环境相比的降低或增加来说可以是任何上面的百分比或范围。
D.线粒体靶向试剂 在一些方面本发明的实施方案考虑选择性靶向线粒体以便增强活性。这种选择性的线粒体靶向已经通过缀合试剂至亲脂性三苯基_阳离子来实现，三苯基_阳离子通过跨越线粒体内膜的大电位(150至-180mv)驱动，很容易穿过脂双层并且在线粒体基质内蓄积大约1000倍。已经制备了维生素E和辅酶Q两者的类似物并用于成功地靶向线粒体。(Smith等，1999；Kelso等，2001；Dhanasekaran等，2004)。已经制备了硫醇，溴化丁基三苯_(thibutyltriphosphoniumbromide)(在下面显示)并用于靶向线粒体，其在线粒体中蓄积数百倍(Burns等，1995；Burns & Murphey，1997)。

这种缀合物看起来是活性化合物的合适候选物。除了游离的硫醇试剂，硫代次磺酰基取代的化合物(H-S-S-R)可能是有用的。考虑在一些实施方案中，所述的试剂具有以下结构
其中Z是P或N； R1、R2和R3是芳基、杂芳基、烷基芳基、环烷基或烷基(合适的是苯基、苄基、甲苯基、吡啶基、环己基、C3-C10烷基，任选经卤化)； R4是-R5SR6，其中R5是C1-C10烷基，R6是H或SH、SO3H或PO3H。
III.停滞的检测 多种可用于诱导停滞的化合物可用多种不同的检测法进行初始地评价。停滞可以通过许多方式，包括通过定量生物样品消耗的氧的量、样品产生的二氧化碳的量(细胞呼吸的间接测量)或通过表征能动性来测量。
为了测定氧消耗的速率或二氧化碳产生的速率，将生物物质置于具有两个开口(用于气体输入和输出)密封的腔室内。将气体(室内空气或其它气体)以给定流速通入所述腔室内并流出出口以在该腔室内维持大约1个大气压。在暴露于该腔室之前和之后，将该气体通过二氧化碳检测器和或氧气检测器来测量(每秒)该气体混合物中每种化合物的量。比较随时间变化的这些值，得到氧消耗或二氧化碳产生的速率。
已经建立了其它筛选方法来鉴定候选的活性停滞化合物。可以采用这些筛选方法及其变体作为本发明的一部分或用于实现本发明的方面。
A.使用斑马鱼的测定法 用于停滞诱导剂的筛选测定法用48小时大的斑马鱼(D.rerio)胚胎建立。这些胚是透明的，允许人用具有4-20倍透镜的解剖显微镜观察心搏和导致的血液流入沿背面的主血管中并流入尾部。这些动物中的心率是生物代谢活动的一个指标，这样心率的减少表示代谢的减少。将胚胎从它们的卵外壳解剖出来并在平底聚苯乙烯组织培养板中的每个孔分配5个，并且在1mL标准鱼水中孵育。所述的鱼水由每5加仑1茶匙Instant Ocean(人造海水混合物，Aquarium Systems公司)构成。将氯化钙调整至150ppm并且将碳酸氢钠调整至～100ppm。该水的电导率是900微西门子，pH是约6.5-7.4。硫化氢溶液通过将用室内空气平衡的硫化氢的混合物以每分钟100立方厘米的速度在含有150mL鱼水的烧瓶中鼓泡60-90分钟。据估计这足以获得饱和的或近饱和的或大部分饱和的硫化氢溶液。基于在1个大气压和室温下已知的硫化氢在pH 7的林格氏溶液中的溶解度，据估计鱼水含有大约0.1摩尔硫化氢。将鱼暴露于硫化氢溶液并在随后的24小时通过计数每分钟的心搏次数来监测它们的心率。对照鱼(仅暴露于鱼水)具有每分钟大约160-200次搏动的心搏次数，这在24小时的观察期间没有显著改变。到暴露于含有硫化氢的鱼水后2-3小时，心搏次数减少大约一半至每分钟60-80次搏动。到4小时，心搏次数进一步减少，包括一些实例的心搏次数为0或每分钟仅几次。在暴露5小时后，用正常的鱼水替换硫化氢溶液，并让胚胎在28摄氏度下恢复过夜。到起始暴露于硫化氢后24小时，经处理过并经冲洗的动物表现出每分钟160-200次搏动的正常心率。由于硫化氢引起了心搏的休眠，在一些情形中引起了停止，随后恢复到常态，认为硫化氢已经通过该筛选测定法的标准鉴定为停滞诱导剂或其它活性化合物。
B.使用线虫的测定法 用线虫(秀丽隐杆线虫)建立筛选测定法。线虫在4摄氏度下不能很好的存活，这样在该温度下24小时，它们全部死亡。将蠕虫在将它们暴露于4摄氏度下16小时之前，在室温下暴露于含有Y％一氧化碳的气氛X分钟。与全都死亡的预先暴露于室内空气的对照蠕虫比较，一氧化碳处理的蠕虫在暴露于低温后以高的存活力存活。由于一氧化碳是一种已知的线虫和新生儿包皮角质形成细胞中的停滞诱导物，线虫测定法能够在蠕虫预平衡于停滞诱导物或其他活性化合物中时，通过它们增加暴露于致死性低温的蠕虫的存活力的能力鉴定诱导停滞的化合物。
IV.治疗或预防性应用 A.创伤 在一些实施方案中，本发明可用于治疗遭受或易遭受损伤的患者。创伤可由外部伤害(例如烧伤、伤口、切除伤、枪击伤，或手术创伤)内部伤害(例如导致循环急剧下降的中风或心脏病发作)或由于非-侵入性应激(例如暴露于低温或辐射)而引起的循环下降引起。在细胞水平上，创伤常常导致细胞、组织和/或器官暴露于低氧，从而导致诱导程序化细胞死亡，或“细胞凋亡”。系统性地，创伤导致诱导了一系列的生化过程，例如凝固、炎症、低血压，并可引起休克，如果休克持续，则其可导致器官机能障碍、不可逆的细胞损害和死亡。生物学过程是设计用来防卫躯体以免于创伤性伤害；然而它们可导致一连续事件，这些事件证明是有害的，并在一些情况下是致命的。
因此，本发明考虑让组织、器官、四肢和甚至整个生物进入停滞，作为保护它们免于创伤的有害作用的手段。在其中医学看护不容易获得的特定情况中，体内或离体诱导停滞，可替代地，结合降低组织、器官或生物的温度，可为受试者“争取时间”，给受试者提供医学看护，或运送受试者去接受医学看护。本发明还考虑了用于通过防止/延缓可导致延缓的创伤愈合和组织再生的生物学过程来诱导组织再生和创伤愈合的方法。关于这一点，在其中存在对肢体或生物有大的伤口的情况中，体内或离体诱导停滞，可替代地，结合降低组织、器官或生物的温度可通过管理抑制愈合和再生的生物学过程来帮助创伤愈合和组织再生过程。
除了下面论述的创伤愈合和出血性休克，可实施本发明方法来预防或治疗创伤例如心跳停止或中风。本发明对于来自急救外科手术操作，例如开胸术、剖腹术和脾横切的损伤风险具有特别的重要性。
1.伤口愈合 在许多情况下，伤口和组织损害是难治疗的或需要过多的时间来愈合。实例是慢性开放性创伤(糖尿病性足溃疡和3&4期压迫性溃疡)、急性和创伤性伤口、皮瓣和移植物，以及亚急性创伤(即，裂开的切口)。这也可应用于其它组织损伤，例如来自烟/热气吸入的烧伤和肺损伤。
先前的试验显示冬眠可保护对抗损伤(例如，脑中的pin’s)，因此它可能具有愈合效果。因此，该技术可用于通过让组织进入更加代谢控制的环境来控制创伤愈合过程。更特别地，细胞或组织保持停滞的时间长短可根据损伤而变化。在本发明的一些实施方案中，将生物物质暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物约，至少约，或至多约30秒；1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时；1、2、3、4、5、6、7天；1、2、3、4、5周；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长。
2.血液学休克(出血性休克) 休克是一种在延迟干预时迅速进展的危及生命的状态。休克是其中不存在充分的灌注来维持器官组织的生理需要的状态。这是深度的血液动力学和代谢紊乱状态，其特征为循环系统不能维持对生命器官的充分灌注。它可能由血容量不足(低血容量性休克)、心脏功能不足(心源性休克)或血管舒缩紧张性不足所致，也称为分布性休克(神经原性休克、败血症性休克、过敏性休克)。这通常导致患者迅速死亡。许多病症，包括脓毒症、失血、自身调节受损和自主紧张性丧失可产生休克或类似休克的状态。预期本发明能预防休克的所有上述状态的不利效果，并维持经历这种休克的生物物质的生命。
在出血性休克中，失血超出了身体补偿和提供充分的组织灌注和氧合的能力。这通常归因于创伤，但还可以由自发性出血(例如胃肠道出血、分娩)、手术和其它原因引起。最常见地是，临床出血性休克是由伴随不连续的突发(precipitating)事件的急性出血事件引起。较不不常见地是，出血性休克可在有亚急性失血的慢性病症中见到。
出血的生理补偿机制包括最初的外周和肠系膜血管收缩来使血液流回中枢循环。这随后通过进行性心搏过速来加强。侵入性监测可显示心脏指数增加、氧输送(即DO2)增加，以及组织的氧消耗(即VO2)增加。乳酸水平、酸-碱状态和其它标记也可提供有用的生理状态指标。年龄、用药和共发病因素都可能影响患者对出血性休克的响应。
出血性休克中的补偿机制失败可导致死亡。没有干预时，在严重的出血性休克中观察到典型三峰分布的死亡。最初的死亡峰由于即刻放血而在出血数分钟内发生。另一个峰由于进行性失代偿而在1至数小时后发生。第三个峰由于脓毒症和器官衰竭而在数天至数周后发生。
在美国，意外伤害是年龄为1和44步之间的人中死亡率和发病率的主要原因。在2001年，157,078名居民由于伤害而发生死亡。这些人中，64.6％归为意外死亡，19.5％是自杀，12.9％为谋杀，2.7％未确定意图，以及0.3％涉及法律干预或战争行动。伤害性死亡的主要原因是机动车辆交通事故、火器和跌倒。大比例这些死亡事故起因于外伤引起的大量失血，导致出血性休克。
在大多数外伤性损伤事件中，到达医院急诊室的患者通过急诊医师处理并无需进行手术或外伤科(trauma service)护理而出院。然而，有严重损伤的患者需要在损伤发生后的“黄金时间”内稳定，以提高存活的机会并使伤残最小化。
由于多数休克事件是归因于事故导致的损伤，院前急救(pre-hosiptal care)对于患者的存活是关键性的。院前急救包括快速评估、稳定以及迅速运送到合适的中心进行评估和确定的护理。在患有休克综合征的所有患者中，维持开放的气道、充分的呼吸和充分的循环是急救治疗的主要聚焦点。评估是必需的，因为就诊者状况的变化表明休克综合征的进展。早期干预对使组织和器官的损害最小化和使永久性残疾最小化是至关重要的，并且早期确定主要的临床原因是关键性的。治疗集中在纠正休克综合征的原因和减缓进展。静脉内输入和流体复苏(通常为IV盐水)是标准的，可是，关于这一点存在一些争论。迅速逆转血容量过低可能增加出血、移动部分形成的血块以及稀释凝固因子。
一旦到急诊室，则集中于使生命器官的灌注和氧合最佳化。潜在的出血的诊断和处理必须迅速实施并与处理休克同时进行。休克存在两个主要阶段早期代偿阶段和进行性阶段。考虑本发明的实施方案可应用于处于任一阶段或这两个阶段的患者。
当低血容量性休克由大量出血所致时，选择的替代流体是全血或浓缩(packed)的红细胞。拟晶体溶液将会暂时提高循环容量，但患者还需要红细胞替代物来运送氧到组织。休克的管理集中在流体管理、酸-碱平衡，以及提高心肌收缩。也应该处理休克的潜在原因以便减小休克综合征的进展。在小鼠中诱导全身冬眠，则存在整体的代谢状态的立即下降(通过CO2放出测量)。这是可逆的，并且小鼠似乎正常发挥功能，甚至是在反复的暴露后。因此，本发明涉及用H2S(或其它氧拮抗剂或其它活性化合物)诱导整个躯体冬眠状态，来保存患者的生命器官和生命。这将使得能运送至受控制的环境(例如，手术)，在该环境中可解决休克的最初原因，并然后患者以受控制的方式恢复正常机能。对此适应症，称为“黄金时间”的损伤后的第一时间对成功的结果至关重要。在该时间段稳定患者是主要目的，并将患者运送到病危护理机构(例如，急诊室、手术室等)，在那里损伤可得以适当解决。因此，将患者保持处于停滞以使得能达到该目的，并解决直接的问题，例如休克的源、补充失血，以及重建内环境稳定是理想的。虽然这将会有很大不同，但在多数情况下，将保持停滞的时间的量是在损伤后约6-约72小时之间。在本发明的一些实施方案中，将生物物质暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物约，至少约，或至多约30秒；1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时；1、2、3、4、5、6、7天或更长，以及其中的任意范围或组合。
致死性出血和导致休克并最终死亡的生理事件的生物学未完全了解。然而，存在一些机制，通过该机制H2S可减少缺血性低氧的致死效果。硫化氢抑制细胞色素C氧化酶并可通过抑制该酶3来减少需氧量。需氧量减少可减少低氧水平的有害作用，包括减少代谢性酸中毒。此外，组织巯基水平在休克过程中减少(Beck等，1954)。外来的H2S可防止这种低硫化物(hyposulfidic)状态并维持硫的内环境稳定。
硫化氢在动物中自然产生并显示出有效的生物活性(Kamoun，2004)。多数蛋白质含有二硫化物连接的半胱氨酸残基，并且从游离的巯基到二硫化物的可逆转变可调节特定的酶活性(Ziegler，1985)。此外，硫化物是负电性的并表现出对过渡金属的高亲和力。含有过渡金属原子的蛋白质，例如细胞色素氧化酶可深受H2S的影响。并且最后，H2S代谢成含有还原的硫的其它分子增加了可表现特定的生物活性的硫醇的数量。除了(或者可能由于)这些潜在的作用模式，H2S可对心肺系统、神经内分泌系统、免疫系统和/或止血系统施加作用，该作用最后证明在损伤和疾病中是有利的。
Mark B.Roth、Mike Morrison和Eric Blackstone在2006年4月20日申请的、标题为“Methods，compositions and articles ofmanufacture for treating shock”的美国临时申请描述了对休克的治疗并因此通过引用作为参考。
B.低体温 在又一个实施方案中，本发人建议用本发明来处理极度低体温的患者。本发明的方法和组合物可用于在需要低体温的哺乳动物中诱导低体温。低体温可以是轻度、中度或深度的。轻度低体温包括使核心体温达到低于哺乳动物的正常核心体温约0.1-5摄氏度。哺乳动物的正常核心体温通常在35和38摄氏度之间。中度低体温包括使核心体温达到低于哺乳动物的正常核心体温约5-15摄氏度。深低体温包括使核心体温达到低于哺乳动物的正常核心体温约15-37摄氏度。
轻度低体温在本领域已知为在非人哺乳动物和人中都是治疗上有用和有效的。轻度低体温的治疗益处已经在人临床试验中，在关于医院外心搏停止方面观察到。与有正常体温，或缺少轻度低体温的护理的标准比较，将人在心搏停止时暴露于轻度低温导致生存优势和改善的神经学结果(Bernard等，2002；The Hypothermia After CardiacArrest Study Group等，2002)。
本发明的方法和组合物可具有优于本领域已知的其它方法的优势，用于在哺乳动物或人中诱导轻度、中度或深度低体温，所述的其它方法包括，但不限于将受试者包裹在冰中，或用循环冷空气或液体的“致冷帷罩”包裹受试者。在这些情形中，受试者抵抗降低核心体温低于正常体温并试图通过战栗来产生热量。颤栗，以及其中产生的体热可通过，例如减慢用标准的低体温诱导方法实现的核心体温降低的速度，而对达到轻度低体温具有负面影响。因此，接受治疗水平的低体温的人也用抑制颤栗(通过阻断神经肌接点处的神经传递)的药物处理(Bernard等，2002)。
在优选的实施方案中，本发明的方法和组合物与本领域已知的侵入性方法或医疗器械组合在哺乳动物或人中诱导治疗性的低体温。这种侵入性方法和装置包括，但不限于可插入需要低体温的受试者的脉管系统的柔性探针或导管，其中导管的温度调节至低于受试者的正常体温，导致与导管接触的血液冷却。冷却的血液随后引起哺乳动物的核心体温下降。通过结合来自监测哺乳动物核心体温的热电偶监测的反馈，可调节导管的温度以便维持预先指定的核心体温。这种用于达到并维持轻度或中度低体温的医疗器械，在本领域中称为血管内温度疗法，是本领域已知的并例如在www.innercool.com和www.radiantmedical.com上有描述。
所述方法提供，给极度低体温的患者施用或让其暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物，然后在以控制的方式撤除氧拮抗剂或其它活性化合物时让其逐渐恢复到正常温度。以这种方式，氧拮抗剂或其它活性化合物缓冲了受试者体内的生物系统，以便它们可逐渐开始而不冲击(或伤害)受试者。
在一个实施方案中，将会给予遭受低体温的受试者经口或静脉内剂量的氧拮抗剂或其它活性化合物。由于受试者潜在的非-反应性和在一段时间内提供受控制的剂量的能力，静脉内供给是优选的。可替代地，如果可利用，氧拮抗剂或其它活性化合物可以以气态提供，例如利用用于吸入的面罩或甚至是可容下整个受试者的密闭室。
理想地，在实现任何变化之前，将要稳定患者的心率、呼吸和温度。一旦稳定，周围环境温度将会再次逐渐上升。这可容易地通过将受试者从低温条件下移出完成。温度更受调节的增加可通过这样实现添加连续层的衣物或毯子、利用热度逐渐增加的热包裹物，或如果可能，将受试者置于其温度可逐渐增加的室内。
优选在温度增加过程中监测受试者的生命体征。而且，结合增加温度，将氧拮抗剂或其它活性化合物从受试者的环境中去除。热和氧拮抗剂(或其它活性化合物)的处理都在合适的终点停止，该终点由监测情况的医务人员判断，但在任何情况下该终点是在受试者的温度和其它生命体征恢复到正常范围时。建议在停止处理后持续监测至少24小时的一段时间。
C.高体温 在可由遗传、感染、药物或环境原因引起的某些情况下，患者可以放松内环境稳定的体温调节，导致严重的不可控制的发热(高体温)。这可导致死亡或长期的发病，尤其是脑损害，如果它没有得到适当控制。
吸入80ppm H2S的小鼠立即经历冬眠。这包括在环境温度下降低于室温时不能调节它们的体温。因此，该技术可用于在某些高体温的状态中控制全身的体温。这将可能包括通过吸入或灌注入血液供给施用H2S(或其它氧拮抗剂或活性化合物)来诱导冬眠状态。让患者处于停滞下约6-约24小时之间将是有用的，在这段时间内发热源可得到解决。在本发明的一些实施方案中，让患者暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物约，至少约，或至多约30秒；1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时；1、2、3、4、5、6、7天或更长，以及其中的任意范围或组合。
这可与一些全身体温调节(冰浴/毯子/冷却系统)组合。
D.心麻痹和冠心病 在一些实施方案中，本发明可用作用于治疗冠心病(CHD)(包括用于心脏旁路手术(CABG)的心麻痹)的溶液。
CHD由动脉粥样硬化引起，动脉粥样硬化是提供富氧血液给心肌的动脉狭窄和硬化。由于动脉内壁或内衬上斑块的积累，动脉变硬且变得狭窄。流向心脏的血液由于斑块使冠状动脉变窄而减少。这减少了对心肌的氧供应。这可表现为1)心绞痛，其为在心脏未获得足够的血液时发生的胸痛或不适；2)心脏病发作，其可在血块突然切断对心脏部分的大部分或全部血供应时发生，并且心肌中没有接受到足够的携氧血液的细胞开始死亡，可能导致对心肌的永久性损害；3)心力衰竭，其为在心脏不能有效地把血液泵至身体其它部分时发生；心律不齐，其为心搏的正常节律的改变。
自1990年以来，更多的人死于CHD而不是任何其它原因。每年有3.8百万的男性和3.4百万的女性死于CHD。在2002年，仅在美国就有超过500,000个人直接死于心脏病。尽管提高了存活率，但在美国四分之一的男性，以及三分之一的女性仍然在认可第一次心脏病发作的一年内死亡。
CHD的医学治疗包括药物治疗来降低心脏病发作、心力衰竭和中风的风险，同时改变重要的生活方式来防止冠状动脉中脂肪沉积的进一步积累。但是，也常常需要某些类型的外科手术干预。
约三分之一的CHD患者将经历冠状动脉血管成形术和支架术(stenting)。在气囊血管成形术过程中，采用顶端气囊(balloon-tipped)导管将斑块推回动脉壁以使得能提高动脉中的血流量。冠状动脉支架术通常伴随有血管成形术操作。支架是提供支架支撑受损害的动脉壁的小的线网金属管，其减少血管在血管成形术后再次闭合(再狭窄)的可能性。在美国，每年实施接近1百万次气囊血管成形术。不是所有的患者都能用该技术治疗；这类患者必须进行心脏手术。Michaels等，2002。
约10％的CHD患者将进行冠状动脉旁路嫁接术(CABG)手术。患有严重的左总冠状动脉狭窄或阻塞的患者，或者患有涉及两条或三条冠状动脉的疾病的那些患者通常被认为是旁路手术的候选人。在CABG中，外科医生用来自身体另一部分的健康血管(动脉或静脉)建立环绕冠状动脉的闭塞部分的绕路(或旁路)。在给定的手术中，患者通常接受1至5根旁路。在该过程中，通常让心脏处于麻痹状态，称为心麻痹(CP)，在该过程中心肺机人工地维持循环。患者在手术过程中处于全身麻痹，其一般持续3-6个小时。
大约13％的所有患者将由于与CABG相关的原因而在30天内再次进入医院。Hannan等，2003；Mehlhorn等，2001。再次住院的主要原因之一是心力衰竭，可能是由于手术过程中的缺血性损害。因此，要做许多工作来提高在心脏没有得到正常灌流的期间对心肌的保护。
心脏手术的最近进展已集中于优化心麻痹参数，期待能防止手术后的心室机能障碍并改善总的结果。Cohen等，1999。
将心麻痹溶液灌流通过血管和心脏的室并导致其固有的搏动停止，同时维持器官的存活力。心麻痹(心脏的麻痹)在打开心脏手术过程中、在获取、运输和保存用于心脏移植手术的供体心脏过程中是期望的。
早期的心麻痹技术采用冷拟晶体溶液来起始并保持手术期间的心搏停止。然而，已经清楚，血液性心脏麻痹促进了交叉钳过程中的有氧心肌代谢并减少了厌氧乳酸的产生。而且，血液性心脏麻痹提高携氧能力，增加心肌耗氧量并保持心肌的高能磷酸储备。多种不同的心麻痹液是可利用的，并且使用心麻痹溶液的不同技术是本领域已知的。例如，心麻痹溶液通常具有不同量的钾、镁，以及多种其它微量成分。有时，将药物添加入心麻痹溶液中以帮助肌肉松弛和防止局部缺血。当前方法还包括补充了合适的电解质，例如谷氨酸-天冬氨酸的仅为血液的制剂。通常使用的溶液的具体实例是St Thomas医院溶液、威斯康星大学溶液、Stanford溶液和Bretschneider溶液。其它新发展的溶液的实例包括含有腺苷、胰岛素或L-精氨酸的先前提及的溶液。改变使用心麻痹溶液时的温度也同样具有有利的效果。
连续的退行性心麻痹与间断的顺行性心麻痹的组合可在交叉钳释放后减少心肌乳酸产生，保持ATP储备，并提高代谢恢复。温热(29℃)心麻痹减少心脏麻痹性停止过程中的乳酸和酸的产生，并提高手术后的心室功能。需要至少200mL/分钟的心麻痹液流速来洗出有害的代谢终产物并改善心室功能。目前已充分清楚，心麻痹处理的未来方向将涉及使用心麻痹添加剂来进一步改善保护效果。例如，已试图固定使用腺苷的缺血预调节的有利效果。类似地，已采用胰岛素心麻痹以便通过刺激早期术后有氧代谢来增强心室效能。最后，已经证明L-精氨酸、一氧化氮供体在试验研究中是有利的，并代表用于增强手术中的心肌保护的进一步选择。心麻痹补充的将来益处有可能在具有弱的心室功能的高危人群中观察到，对于所述的高危人群目前的保护技术是不够的。目前的高危患者的发生率稳定增加，并且这些病例，以及随后发生的并发症，给卫生保健系统增加了不成比例的负担。因此，该领域的改善大有希望发展这一领域中的护理。
尽管通过当前用于诱导心麻痹的方法提供了保护效果，但仍然存在对心肌某些程度的缺血-再灌注损伤。在心脏旁路手术过程中的缺血-再灌注损伤导致差的效果(发病率和死亡率两者)，尤其是由于已经削弱的心脏状态。心肌缺血导致厌氧型心肌代谢。无氧代谢的终产物迅速导致酸中毒、线粒体机能障碍和肌细胞坏死。几乎立即发生高能磷酸的损耗，10分钟内丧失了50％的ATP储备。收缩性减少在1至2分钟内发生，缺血性肌挛缩和不可逆的损伤在30-40分钟的常温(37℃)缺血后发生。
再灌注损伤是一种众所周知的在冠状循环恢复后的现象。再灌注损伤的特征为异常的心肌氧化性代谢。除了在缺血过程中产生的结构改变，再灌注可产生细胞毒性的氧自由基。这些氧自由基通过氧化肌纤维膜的磷脂并从而破坏膜的完整性，而在再灌注损伤的发病机理中发挥重大作用。氧化的游离脂肪酸释放进冠状静脉血中，并且是心肌膜的磷脂过氧化的标记。鱼精蛋白诱导补体激活，其激活了中性粒细胞。活化的中性粒细胞和其它白细胞是氧自由基和其它细胞毒性物质的另外来源。
本发明提供了用于诱导心麻痹的方法和组合物，这将在旁路手术过程中提供对心脏更好的保护。在某些实施方案中，本发明提供了含有溶解于溶液中或作为气体在溶液中鼓泡的H2S(或另一种活性化合物)的心麻痹溶液。在一些实施方案中，本发明进一步包含至少第一种装置，例如导管或插管，用于导入合适剂量的心麻痹溶液至心脏。在某些方面，本发明进一步包含至少第二种装置，例如导管或插管，用于将心麻痹溶液从心脏移出。
旁路手术通常持续3-6个小时，然而，并发症和多血管的CABG可延长持续时间为12个小时或更长。考虑心脏在手术过程中应该保持停滞。因而，在本发明的一些实施方案中，让心脏暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物约，至少约，或至多约30秒；1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个小时或更长，以及其中的任意范围或组合。
E.减少由癌治疗引起的损伤 癌是世界上工业化国家中死亡率的首要原因。治疗癌的最常规方法是通过施用细胞毒性剂给癌患者(或组织的离体处理)，这样所述药剂对癌细胞具有比对正常细胞更大的致死效应。剂量越高或者药剂的致死性越强，将会越有效；然而，出于同样原因，这类药剂到那种程度上对正常细胞更有毒性的(并且有时是致命的)。因此，化学治疗和放射治疗通常表征为严重的副作用，一些副作用是危及生命的，例如口腔溃疡、吞咽困难、口干、恶心、腹泻、呕吐、疲劳、出血、脱发和感染、皮肤刺激以及能量损耗(Curran，1998；Brizel，1998)。
最近的研究表明，暂时和可逆的降低核心体温，或“低体温”可导致对抗癌的改善。最近发现28℃的低体温可减少小鼠中的辐射、阿霉素-和顺铂-诱导的毒性。这些药物/治疗的抗癌活性在施用给低温的(cooled)动物时没有受损；相反，活性得以增强，尤其是顺铂的活性得以增强(Lundgren-Eriksson等，2001)。基于该研究以及其它公开的研究，本发明者提出核心温度的进一步降低将有利于癌患者。因此，本发明考虑使用氧拮抗剂或其它活性停滞化合物来诱导癌患者正常组织的停滞，从而减少化学治疗或放射治疗对那些组织的潜在影响。这也允许使用更高剂量的化学治疗和放射治疗，从而增强这些治疗的抗-癌效果。
考虑实际上任何过度增生疾病，包括良性和恶性瘤形成、非肿瘤性过度增生疾病、瘤前病症和癌前期病变的治疗。这类疾病包括再狭窄、癌、多重耐药性癌、原发性银屑病和转移性肿瘤、血管发生、类风湿性关节炎、炎性肠病、银屑病、湿疹和继发性内障，以及口腔毛状白斑、支气管发育异常、原位癌和上皮内增生。特别地，本发明旨在治疗人的癌包括前列腺癌、肺癌、脑癌、皮肤癌、肝癌、乳癌、淋巴样系统癌、胃癌、睾丸癌、卵巢癌、胰腺癌、骨癌、骨髓癌、胃肠癌、头与颈癌、子宫颈癌、食道癌、眼癌、胆囊癌、肾癌、肾上腺癌、心脏癌、结肠癌和血癌。也考虑治疗涉及上皮细胞和内皮细胞的癌。
通常，设计化学疗法和放射疗法来减小肿瘤大小、减少肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞调亡、减少肿瘤脉管系统、减少或防止转移、降低肿瘤生长速度、加速肿瘤细胞死亡，以及杀死肿瘤细胞。本发明的目标并无不同。因此，考虑将本发明的氧拮抗剂(或其它活性化合物)组合物与第二种有效治疗过度增生性疾病的抗-癌药剂(第二种药剂)组合。“抗-癌”剂能够负面地影响受试者中的癌，例如通过杀死癌细胞、诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞的生长速度、减少转移瘤的发生率或数量、减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供给、增强对抗癌细胞或肿瘤的免疫应答、防止或抑制癌进展，或延长患有癌的受试者的寿命。
第二种抗-癌剂包括生物剂(生物疗法)、化学治疗剂和放射治疗剂。更一般地，这些其它的组合物以有效杀死或抑制癌细胞或肿瘤细胞增殖，同时减少或最小化第二种药剂对正常细胞的影响的组合剂量提供。该方法可以涉及将细胞与氧拮抗剂(或其它活性化合物)和第二种药剂同时接触或暴露。这可通过这样实现将细胞与单一的包括这两类药剂的组合物或药理学制剂接触，或通过将细胞在同一时间与两种不同的组合物或制剂接触或暴露，其中一种组合物含有氧拮抗剂而另一组合物含有第二种药剂。
可替代地，氧拮抗剂(或其它活性化合物)治疗可在第二种药剂治疗之前或之后，间隔时间为数分钟至数周。在其中其它药剂和表达构建体分开施用给细胞的实施方案中，通常应该确保有效时段不会在每次递送时间之间终止，这样药剂和表达构建体将仍然能够对细胞发挥有利的联合作用。在这类情况下，考虑可将细胞与这两种用药程式接触，相互之间在约12-24小时内，更优选相互之间在约6-12小时内。然而，在一些情况中，延长有效治疗的时间，其中在各自的施用之间有数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)的时间间隔可能是理想的。在某些实施方案中，设想将生物物质保持停滞约2-和约4小时之间，同时实施癌治疗。在本发明的一些实施方案中，让生物物质暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物约，至少约，或至多约30秒；1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟；1、2、3、4、5、6个小时或更长，以及其中的任意范围或组合。
可采用多种组合；活性化合物是“A”而第二抗-癌剂，例如放射治疗剂或化学治疗剂是“B” A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/B B/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/A B/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A 将本发明的氧拮抗剂或其它活性化合物施用给患者将按照用于实施化学疗案的一般方法，如果有毒性的话，考虑化合物的毒性。预期应该根据需要重复治疗周期。还应考虑，多种标准疗法以及外科手术干预可与上面描述的抗-癌疗法联合应用。进一步考虑，对于多种活性化合物，可应用所考虑的使用活性化合物和非活性化合物(例如化学治疗)的任何联合治疗。
1.化学疗法 癌疗法也包括多种用基于化学和放射的治疗的联合疗法。联合化疗包括，例如顺铂(CDDP)、卡铂、甲基苄肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、紫杉醇、吉西他滨、诺维本、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨蝶呤)、Temazolomide(DTIC的含水形式)、或前述药物的任意类似物或衍生变体。化学疗法与生物疗法的组合称为生化疗法。
2.放射疗法 导致DNA损伤并已广泛利用的其它因素包括通常称为γ-射线、X-射线的那些，和/或直接递送放射性同位素至肿瘤细胞。其它形式的DNA损伤因素也被考虑，例如微波和紫外线照射。很有可能，所有这些因素实现对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复，以及染色体的装配和维持的广范损伤。X射线的剂量范围从长时间周期(3至4周)的50-200伦琴的日剂量，到2000-6000伦琴的单剂量。放射同位素的剂量范围变化很大，并取决于同位素的半衰期、发出的辐射的强度和类型，以及赘生细胞的吸收。
术语“接触”和“暴露”，在应用于细胞时，在此用于描述将本发明的组分(例如，低氧的抗肿瘤化合物)或者化学治疗剂或放射治疗剂递送至靶细胞或将其放置直接与靶细胞并列的方法。在联合疗法中，为了实现细胞杀死或停滞，可将两种制剂以有效用于杀死细胞或防止其分裂的组合剂量递送给细胞。
3.免疫疗法 通常，免疫治疗学依赖于使用免疫效应器细胞和靶向并破坏癌细胞的分子。免疫效应器可以是，例如对肿瘤细胞表面上的某些标记特异性的抗体。抗体独自可用作治疗的效应器，或者它可以募集其它细胞来实际实现细胞杀死。抗体也可与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并仅用作靶向剂。可替代地，效应器可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶相互作用的表面分子的淋巴细胞。多种效应器细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
免疫疗法还可用作联合疗法的一部分。用于联合疗法的一般方法在下面论述。在免疫治疗的一方面，肿瘤细胞必须具有一些受靶向作用的标记，即不存于大多数其它细胞上。存在许多肿瘤标记并且任意的这些标记可在本发明范围内适合用于靶向。普通的肿瘤标记包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿肿瘤相关抗原、胎儿抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、Sialyl Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的一个备选方面是具有免疫刺激效应的抗癌效应。也存在免疫刺激分子，包括细胞因子例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、г-IFN；趋化因子例如MIP-1、MCP-1、IL-8；以及生长因子例如FLT3配体。将免疫刺激分子作为蛋白质或用基因送递与肿瘤抑制物例如mda-7组合已显示增强了抗肿瘤效果(Ju等，2000)。
如先前论述的，当前正研究或使用的免疫疗法的实例是免疫佐剂(例如，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物)(美国专利5,801,005、美国专利5,739,169、Hui和Hashimoto，1998、Christodoulides等，1998)、细胞因子疗法(例如，干扰素α、β和γ；IL-1、GM-CSF和TNF)(Bukowski等，1998；Davidson等，1998；Hellstrand等，1998)、基因疗法(例如TNF、IL-1、IL-2、p53)(Qin等，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美国专利5,830,880和美国专利5,846,945)和单克隆抗体(例如抗神经节苷脂GM2、抗-HER-2、抗-p185)(Pietras等，1998；Hanibuchi等，1998)。赫赛汀(曲妥单抗)是阻断HER2-neu受体的嵌合(鼠-人)单克隆抗体。它具有抗-肿瘤活性并已经批准用于恶性肿瘤的治疗(Dillman，1999)。使用赫赛汀和化学疗法的癌的联合疗法已显示比单独的疗法更有效。因此，考虑一种或多种抗-癌疗法可与在此描述的抗-肿瘤疗法一起使用。
F.神经变性 本发明可用于治疗神经变性疾病。神经变性疾病的特征为神经元组织的变性，并通常伴随有记忆丧失、运动功能丧失，以及痴呆。关于痴呆疾病，智力和更高的综合认知能力随时间变得越来越受损。据估计约15％的65岁或更年长的人略微至中度痴呆。神经变性疾病包括帕金森病、原发性神经变性疾病、亨廷顿氏舞蹈病、中风和其它低氧或缺血性过程、神经外伤、代谢诱导的神经学损伤、脑性发作产生的后遗症、出血性休克、继发性神经变性疾病(代谢性的或毒性的)、阿尔茨海默氏病、其它记忆障碍或血管性痴呆、多梗塞性痴呆、路易体痴呆或神经变性痴呆。
有证据显示，生物的健康，并且尤其是神经系统的健康取决于氧化和还原状态之间的循环，其与昼夜节律密切相关。也就是说，在清醒过程中对身体产生的氧化应激在睡眠过程中循环至还原性环境。认为这是为什么睡眠对健康非常重要的一大原因。某些神经变性疾病状态，例如亨廷顿舞蹈病和阿尔茨海默氏病，以及正常的衰老过程与该循环模式中的不协调相关。还存在一些证据，即脑的H2S水平在这些状态下减少(Eto等，2002)。
本发明可用于调节和控制氧化和还原状态之间的循环，例如用以防止或逆转神经变性疾病和过程的影响。控制昼夜节律可具有其它应用，例如，用于在从一个时区旅行到另一个时区后调节这些循环模式，以便适应新的时区。此外，已显示总体上代谢活性降低与年老的动物和人的健康相关。因此，本发明还将可用于抑制总的代谢功能来增加老年人的寿命和健康。考虑这种类型的处理将可能每天在晚上，在睡眠过程中实施约6-10个小时。这可能需要在数月至数年的长时间内每天进行处理。
G.衰老 此外，在某些停滞状态下，包括但不限于其中生物物质处于滞生状态下的状态，衰老本身可在生物物质处于所述状态时的时段内受到充分或完全地抑制。因此，本发明可抑制生物物质的衰老，关于延长生物物质将正常生存的时间量和/或从生命的一个发育阶段进展到另一发育阶段。
H.血液病 大量血液疾病和病症可用本发明的组合物和方法解决。这些疾病包括，但不限于地中海贫血和镰状细胞性贫血。
1.地中海贫血 正常的血红蛋白含有两条б和两条в珠蛋白多肽(蛋白质)链，每条结合含铁的血红素环。地中海贫血是这样一组病症该疾病中存在б和в链的不平衡，导致不成对的链沉淀在通常脆弱的红细胞膜上，导致细胞破坏。这导致严重的贫血以至于骨髓试图通过设法产生更多的红细胞来补偿。不幸地是，由于不成对的链的毒性，该过程效率非常低，导致髓隙的大量扩张并且血液生成扩散到身体的其它部分。这以及贫血导致主要的毒性。存在几种关于不成对的珠蛋白链为什么有如此损伤性的模型，但是多数表明，由连接至不成对的珠蛋白链的铁产生的增加的自由基对红细胞的早期破坏来说是重要的。因此，可减少来自这些自由基的氧化损伤的任何干预能延长红细胞的寿命，改善贫血，导致减少对生产红细胞的需求，并减少来自髓隙扩张和散布的损伤。
据估计每年超过30,000名患有严重的地中海贫血的儿童出生，其中据估计在发达国家生活的大多数活到了他们的20多岁，而在第三世界国家(在那里生活着大多数的患者)中多数在年轻儿童时死亡。基于在这里介绍的其它模型体系中的当前结果，预期将患有地中海贫血的动物暴露于硫化物将增加它们的红细胞经受氧化损伤的能力，导致红细胞存活延长。
2.镰状红细胞病 正常的血红蛋白(HbA)含有两条б和两条в珠蛋白多肽(蛋白质)链，每条结合含铁的血红素环。镰状红细胞病(SCD；也称为镰状细胞性贫血)是其中突变的в链导致血红蛋白改变(HbS)的一类疾病。一旦脱氧，HbS可聚合(结晶)并沉淀，损伤通常脆弱的红细胞膜，导致细胞破坏和贫血、红细胞(RBC)减少。此外，具有聚合的HbS的细胞改变了形状(镰状)并变得有粘性，并且激活了导致血流凝固和阻滞的机制。这可导致周围组织的低氧损害，导致疼痛、器官机能障碍和最终过早死亡。在患者中观察到含硫的抗氧化剂的储量的减少。而且，氧化损害和增加的活性氧类(ROS)与结晶、RBC膜损害和与血流量不足相关的组织损害有关。硫化物与“补给”抗氧化剂储备，并且潜在地使氧化损害最小化有关。有理由认为硫化物可防止在镰状细胞病理学的几个阶段的问题。此外，鉴于氧拮抗剂在其它系统中抵抗低氧的能力，暗示着它应该也保护遭受由这种疾病状态引起的不利条件的动物和人。
每年有超过120,000名儿童生来具有SCD。发达国家中的患者现在活到了他们的40多岁和50多岁，然而具有极大的关于疼痛和器官损害的问题，包括中风、肺、心和皮肤问题。在第三世界国家(在那里生活着大多数的患者)，大多数在年轻儿童时死亡。我们的假设是，将患有SCD的动物并且最终是患有SCD的人暴露于硫化物，将导致健康改善。
IV.保藏应用 本发明可用于为运输和/或储藏目的保藏或保存多种生物物质，包括细胞、组织、器官，以及整个生物。在某些实施方案中，保藏生物物质以便防止来自不利条件的损害。
在本发明的实施方案中，生物物质可暴露于活性化合物约，至少约，或至多约30秒；1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时；1、2、3、4、5、6、7天；1、2、3、4、5周；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月；或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多年，以及可源于其中的任意组合或范围。考虑可将活性化合物用于诱导停滞，并考虑可将其它物质用于维持停滞并将它们保藏任意的有意义的一段时间。可替代地，考虑可将活性化合物用于诱导和/或维持停滞。这可与其它因素(例如压力和/或温度的环境变化)组合。
1.细胞 如上面论述的，考虑将多种细胞用于本发明。考虑可将该细胞在本发明的方法、装置和组合物中保藏。
a.血小板 在某些实施方案中，本发明可在血小板的保藏方面得到应用。血小板是在出血位置的血块形成中起至关重要作用的小的细胞片段(～红细胞的一1/3大小)。止血通过这样实现粘附至血管壁，释放凝固化学物质，形成血块以堵塞血管壁和/或狭窄的血管中的裂口。正常的血小板计数在150,000-400,000计数/μL之间。输注血小板浓缩液用于不同的适应症，例如1)防止由于血小板减少的出血；2)在出血患者中用于维持血小板计数大于50,000；3)用以解决血小板功能异常，所述的血小板功能异常是先天性的或归因于用药、脓毒症、恶性肿瘤、组织创伤、产科并发症、体外循环或器官衰竭例如肝或肾脏疾病。
每单位的血小板平均含有0.8-0.85×1011个血小板。血小板浓缩液还含有约60mL的血浆(凝血因子)以及少量的红细胞和白细胞。在储藏过程中血小板单位必须维持在室温(20℃-24℃)下并摇动。它们可在血站(Blood Center)储存至多5天。由于血小板的变质，以及微生物污染的风险，更长时间的储存目前是不可能的。目前存在两种血小板的来源 1)混合的随机供体血小板浓缩液从通过离心全血单位而采集的血小板制备。可将至多8个单位的血小板(每个单位来自不同的供体)混合进一个袋中用于输注。血小板在混合后4小时失效。所有单位来自相同的ABO型。如果ABO兼容的血小板不可获得，则可替换为ABO不兼容的血小板，有非常小的风险。通常成人剂量是4-6单位的混合随机的供体血小板。
2)单采血液成分术血小板，从单个供体收集，是以标准(相当于～4个混合单位)大小和“大的”(相当于～6个混合单位)大小制备的。单采血液成分术血小板浓缩物含有200-400mL的血浆。它们可收集为随机的单位(随机的单采血液成分术血小板)或可为特定接受者从家族成员或自愿的HLA兼容的“定向”供体获得。单采血液成分术血小板在处理而从血站释放后4小时失效。
血小板储存提出了在全血或其它成分的储存中未发现的问题。虽然全血、红细胞和白细胞可在4℃下储存数周，但血小板在冷藏中将聚集并然后沉积。因此，储存血小板的标准方法是在室温下，约20-24℃，伴随轻微搅动。甚至在这些条件下，血小板仅可保存5天，然后需要将它们丢弃。这种过期问题导致美国医院每年约$500百万的收入损失。如果可获得储存期的适度延长，约90％的该损失可避免。
血小板储存的另一问题是细菌污染。污染主要归因于在静脉切开放血术过程中来自皮肤的葡萄球菌，或者归因于供体菌血症。血小板的细菌污染代表了用任何输血操作都有最大的感染风险。
影响血小板的存活力的重要因素是pH的调节。按照目前普遍接受的方法储存的几乎所有的血小板单位都显示pH从它们约7.0的初值降低。这种降低主要归因于通过血小板糖酵解产生乳酸，并在较小程度上归因于来自氧化磷酸化作用的CO2的积累。随着pH下降，血小板改变形状，从圆盘状变成球状。如果pH下降低于6.0，血小板的形态学和生理学的不可逆改变使得它们在输液后没有活力。因此，血小板保藏的一个重要目标是防止这种pH降低。以前认为，血小板必须储存在氧可渗透的容器中，因为糖酵解在氧可获得性受到限制时受到刺激(参见，例如美国专利5,569,579)。然而，本发明证明了储存的血小板的存活力可通过将它们储存在缺氧环境中而得以延长。
本发明提供了增加储存的血小板的存活时间并减少细菌污染的方法和组合物。在一个实施方案中，本发明提供了可密封的、氧不可渗透的容器，将血小板置于该容器中。在密封后，厌氧发生器(例如，具有钯催化剂的硼氢化钠片)将容器中的大气氧转化为水。该容器还含有一个指示器，其指示氧张力的水平。一旦处于缺氧条件下，血小板也可在较低的温度下储存。
血小板可悬浮并储存于血浆或本领域已知的任意血小板储存溶液中。例如，美国专利4,828,976和4,447,415公开了多种通常使用的适合血小板储存的溶液。
典型地，将血小板储存于来自供体的血浆中并以那种形式施用。
通常，本发明由一个密封的环境(容器、罐、不可渗透的袋或室)组成，在该环境中氧张力可降低至低于1％(10,000ppm)并更特别是在10-100ppm的范围，或更小。该环境中的气氛氧气减少可通过本领域已知的许多方法实现。例如，减少气氛中的氧气可通过产生氢气(有或无催化剂)与氧气化合产生水实现。可催化其它反应来将氧气与其它化合物，例如碳化合而产生二氧化碳，等等。同样，氧气可通过将室内的所有空气转换成含有不包括氧的任意气体组合的气体来取代。此外，氧气可通过将该室置于真空下，除所有气体而除去。可替代地，氧气可通过用与氧竞争的另一种气体或化合物，例如CO来竞争。也可利用除去氧和竞争剩余的氧的组合。该装置还可包含测量氧气浓度的手段以确保获得合适的厌氧状态。例如，氧浓度可用基于亚甲蓝的厌氧指示剂测量，所述的亚甲蓝在没有氧时从蓝色变成无色。可替代地，可使用测氧计或其它测量氧的装置。
所述的装置还包括一些手段来将血小板包含于密闭的环境中，这样可将氧从含有血小板的溶液中除去，以及从血小板它们自身除去。这样的实例是让血小板处于透气的袋中，该袋置于密闭的环境中。血小板也可保持于密闭环境内的敞开的容器中。可替代地，可将血小板直接置于不可渗透的、密闭的容器/袋中。
来自Becton Dickinson的Bio-BagTM(商品号261215)是可密封的、氧-不可渗透的容器的一个实例，其可用于产生缺氧环境用于血小板的储存。Bio-Bag，其为出售用于分离厌氧细菌的试剂盒，包括一个可密封的、不透气袋子、厌氧指示剂、厌氧发生器(氢气发生器)和钯催化剂。透气的袋中的血小板将密封于Bio-Bag内来保存。
Bio-Bag中的厌氧发生器是通过添加水而激活的装置，水通过一系列的通道到达滤纸纱条(wick)。该纸条延缓和调节水引入进所述的片室中，提供氢气的控制释放。产生气体的片由硼氢化钠组成。从该反应中释放出的氢气与密闭容器中的气氛氧化合产生水。该反应通过容器中的钯催化。
Puget Sound Blood Center(PSBC)采用标准化的一组体外试验，独立地评估了在无氧条件下保存的血小板在第0天、第5天和第8天的状态。结果表明，在无氧条件下保存直到8天的血小板表现与在标准条件下保存的血小板一样好，或更好。正在进行的研究是重复该实验，并将观测时间延长到13天。
本领域中的那些技术人员将熟悉用于测定血小板功能的方法。例如，如美国专利6,790,603中描述的，血小板功能可通过如下因素测定(1)响应激活-诱导激动剂的攻击，内部蛋白质在细胞膜上的表达；(2)在受激动剂攻击时聚集的能力；以及(3)三磷酸腺苷的分泌。可导致血小板功能激活的激动剂的实例包括凝血酶、肾上腺素、ADP和胶原。
内部蛋白质的表达可通过将分子与荧光染料缀合，之后在荧光细胞分类器中分选而测量。通常，优选使用两种单克隆抗体，一种结合构成型表达的细胞表面分子，而另一种结合只在激活后表达的细胞表面分子。每种单克隆抗体与不同颜色的染料缀合，所述染料可通过荧光分光光度法区分。构成型表达的细胞表面分子的一个非限制性实例是GPIIbIIIa；在激活后表达的细胞表面分子的一个非限制性实例是血小板选择蛋白(P-selectin)。产生蛋白质的单克隆抗体是本领域熟知的。美国专利No.5,470,738是一个产生对抗GPIIIa的单克隆抗体的方法的实例。另一种抗-血小板单克隆抗体是对抗GP IV的单克隆抗体，如由美国专利No.5,231,025公开的。抗体也可从公司例如Becton-Dickinson(Philadelphia)商业购买。
血小板功能的另一个参数是在激动剂攻击时聚集的能力。血小板悬液是稠密的和乳白色的。聚集和随后的聚集物的沉降可通过肉眼评估，或用密度计测量。
然而血小板功能的另一种量度是ATP的分泌。能很好发挥作用的血小板能够分泌ATP，而已经被活化的细胞或已在其它方面丧失功能的细胞不能分泌ATP。
2.细胞培养 本发明可扩展到保护培养物中的细胞，其否则可能死亡或被诱导调亡。在本发明的背景中，将细胞在培养之前和/或培养时暴露于活性化合物。可以根据本发明培养的细胞包括可最后放回到生理学环境中的那些细胞，即用于随后移植的那些细胞。这些细胞包括，但不限于骨髓、皮肤细胞和上皮细胞。同样，一些可移植的细胞将非常受益于在培养物中的扩展，从而增加可引入至宿主中的材料的量。特别考虑将来自胃肠道的上皮细胞作为可受益于暴露于活性化合物的细胞。
此外，本发明延伸到了肿瘤细胞的培养。已知肿瘤细胞的培养可导致表型的改变，并在某些情况下导致死亡。这使得肿瘤细胞的组织培养试验非常不可预测。
一般的细胞培养技术是本领域那些技术人员熟知的。这种知识的实例可在Shaw(1996)和Davis(1994)中找到，将它们两者在此通过引入作为参考。传统的细胞培养技术的一般信息和修改也可在美国专利5,580,781中找到，将其通过引入作为参考。此外，用于培养皮肤细胞的技术在美国专利6,057,148中描述，将其通过引入作为参考。考虑将给这些技术，以及本领域那些技术人员已知的其它技术补充含有一种或多种活性化合物的培养基，或灌注流体和/或气体形式的活性化合物。
E.细胞、组织和器官的保藏 在本发明的某些实施方案中，期望保藏生物物质，以便尽可能地防止死亡或分解对该物质的损害。尽管第一次成功的肾移植在1954年完成并且第一次心脏和肝移植在1967年实施，但每年，成千上万的需要器官移植的人死亡。由于种种原因，他们需要心脏、肺、肾和肝。此外，存在可使用胰脏或角膜的患者。虽然存在对器官供体的持续需要，但提供器官给需要器官移植的那些患者另一重大障碍是当前的器官保藏技术的限制。例如，普遍认为人的心脏必须在4小时内运送，为了随后的移植有任何机会成功。Rager，2004(见下表)。最长的冷缺血时间 而且，在最初的30天内，移植的心脏的器官移植失败的主要原因是缺血-再灌注损伤。
器官获得和保藏、组织配型，以及免疫抑制是成功的实体器官移植的主要因素。器官获得操作的技术方面允许多个团队一起工作以从单个供者获得所有有用的器官。平均来说，从单个已故供体获得3.6个器官。
保藏实体器官取决于原位进行的快速血管内冷却，之后切除器官，将器官在冰冷的保藏流体中保存并迅速运送至接受者的医院。冷缺血时间是器官在冰上而没有血流的时间长度。最长的冷缺血时间限制了在器官恢复和器官移植之间可经过的时间量(表5)。2％-10％的匹配的且获得的器官由于拖延了缺血时间而不能使用，这取决于器官的类型。类似地，约10-20％的获得的器官由于弱的器官功能和/或感染(不包括HIV/CMV/肝炎)而不能使用。
当前的保藏技术包括利用冰冷的溶液，其包括电解质、抗氧化剂、氢离子缓冲液和糖。Punch等，2001。适合的组织配型取决于所有器官的血型匹配(例如，血型A、B或O)。免疫抑制方案通常包括三种药物糖皮质激素例如强的松、抗代谢药例如硫唑嘌呤或麦考酚酯，以及神经钙蛋白抑制剂例如环孢菌素或他克莫司。
两种最频繁使用的用于保藏/运送心脏用以移植的方法是低温储藏和持续灌注法。在前一种方法中，将心脏停止，从供者体内移出，然后迅速冷却并冷藏运输。在后一种方法中，通常采用下列步骤1)搏动性流动；2)低温；3)膜氧合，以及4)含有二者的灌注液。
为了改善成功移植的前景，已经发展了用于更好的保藏用于移植的器官的技术。已经出现了两个发展的一般领域，一个是保藏溶液领域，而另一个是器官容器领域。
在某些方面，例如移植，创伤愈合的不利结果可削弱或阻止移植组织的正常移入。在本发明背景下，设想将供献的组织和接受的组织在移植前用氧拮抗剂或其它活性化合物处理，如上文中有关创伤愈合所讨论的，致力于抑制生物学过程例如炎症、调亡和其它损害移入组织的创伤愈合/移植后事件。
F.生物 这类生物可用于研究目的，例如试验小鼠(小鼠堆积(banking))，或用于消费，例如鱼。在这些情况下，考虑停可无限期维持停滞。而且，停滞可在植物或植物的部分(包括果实、花、叶、茎、种子、插条)中诱导。植物可以是农作物、药用植物或观赏性植物。在植物中诱导停滞可增加整个植物或植物部分的储存期或病原体抗性。因此，在本发明的实施方案中，将生物或其部分暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物约，至少约，或至多约30秒；1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时；1、2、3、4、5、6、7天；1、2、3、4、5周；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月；或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多年，以及可源于其中的任意组合或范围。
G.保藏剂 已公开了多种保藏溶液，在运送器官时将器官用保藏溶液包围或用保藏溶液灌注。一种最普遍使用的溶液是ViaSpan_(Belzer UW)，其伴随冷藏使用。这类溶液或这类溶液的成分的其它实例包括St.Thomas溶液(Ledingham等，J.Thorac.Cardiobasc.Surg.93240-246，1987)、Broussais溶液、UW液(Ledingham等，Circulation82(Part 2)IV351-8，1990)、Celsior溶液(Menasche等，Eur.J.Cardio.Thorax.Surg.8207-213，1994)、Stanford University溶液和B20溶液(Bernard等，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.90235-242，1985)，以及在美国专利6,524,785、6,492,103、6,365,338、6,054,261、5,719,174、5,693,462、5,599,659、5,552,267、5,405,742、5,370,989、5,066,578、4,938,961和4,798,824中描述和/或要求保护的那些。
除了溶液，还已知其它类型的材料用于运输器官和组织。这些包括凝胶状的或其它半固体的材料，例如如在美国专利5,736,397中描述的那些。
一些用于器官保藏的系统和溶液特别涉及在所述溶液或系统中灌注氧，以将器官暴露于氧，因为人们相信将器官或组织维持在氧合的环境中可提高存活力。参见Kuroda等，(Transplantation 46(3)457-460，1988)和美国专利6,490,880、6,046,046、5,476,763、5,285,657、3,995,444、3,881,990和3,777,507。据认为剥夺氧长于4小时的分离的心脏丧失了活力并因为缺血/再灌注损伤而不可在接受者中使用。见美国专利6,054,261。
而且，多数(如果不是全部的话)用于器官保藏和移植的溶液和容器涉及低温(温度低于室温，通常接近但不会低于0℃)，其已被称为“所有有用的器官和组织保藏方法的基石”。美国专利6,492,103。
为了改善成功移植的前景，已经发展了用于更好的保藏用于移植的器官的技术。已经出现了两个发展的一般领域，一个是保藏溶液领域，而另一个是器官容器领域。
而且，多数(如果不是全部的话)用于器官保藏和移植的溶液和容器涉及低温(温度低于室温，通常接近但不会低于0℃)，其已被称为“所有有用的器官和组织保藏方法的基石”。美国专利6,492,103。
在器官移植领域中，据认为某些条件与器官的状态以及对成功移植的预后相关1)使细胞肿胀和水肿最小化；2)防止细胞内酸中毒；3)使缺血性损害最小化；以及4)在再灌注过程中提供用于再生高能磷酸化合物和ATP的底物。器官移植中的缺血性/再灌注损伤是尤其有问题，因为采集的器官从身体内移出，与血源分离，并因而在长时间内失去氧和营养物(美国专利5,912,019)。实际上，现今在移植中最关键的问题之一是移植物功能延迟(DGF)的相对高发生率，这归因于手术后的急性管状坏死。当前的方法依然在这些领域中经历困难，这突出了本发明的重要性。
然而，本发明可与其它保藏组合物和方法联合使用。如在美国专利5,952,168、5,217,860、4,559,258和6,187,529(特别将其通过引入作为参考)中论述的，可以保藏生物材料，例如用于长期保存可移植的或可置换的器官。
可给予细胞、组织/器官，或尸体增强或维持用于移植的器官的状态的化合物。这种方法和组合物包括在美国专利5,752,929和5,395,314中描述的那些。
此外，本发明的方法可包括除了暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物以外，还将生物物质暴露于保藏溶液，例如所论述的那些。
考虑，用于活的和将用作活材料的生物样品的任何药剂或溶液必须是可药用的或药理学上可接受的。短语“可药用”或“药理学上可接受的”指在施用给人时不会产生过敏性反应或类似的不利反应的分子实体和组合物。含有作为活性成分的蛋白质的含水组合物的制备是本领域充分了解的。通常，这类组合物可制备成液体溶液剂或混悬剂；也可制备成适合在使用前溶解或悬浮于液体中的固体形式。
可监测用于移植的器官以评估它们的状态，尤其关于用作移植物的状态。这种方法在美国专利5,699,793中描述。
可在接受器官移植后将大量药物施用给患者以促进恢复进程。这些药物包括减少或抑制对抗供献的器官的免疫应答的化合物和药剂。
此外，正在不断研究另外的药物并将其用于器官移植，例如在美国专利6,552,083(包含N-(3，4-二甲氧基肉桂酰基)邻氨基苯甲酸的抑制剂)和6,013,256(结合IL-2受体的抗体，例如人源化抗-Tax抗体)中描述的那些。
H.保藏仪器和应用 用于运输器官和组织的系统或容器通过这些年也得以发展。任意的这些实施方案可与本发明的仪器组合，所述的本发明仪器允许使用氧拮抗剂或其它活性化合物。
大多数涉及用于实现例如在美国专利4,292,817、4,473,637和4,745,759中描述的那些的冷却系统，其采用用冷却液体的主动制冷，所述冷却液体被泵出通过该系统。已设计了几种复杂的装置，其包含多个室或双容器，例如美国专利5,434,045和4,723,974所描述的。
一些组成了其中一种仪器设计用于灌注保藏溶液中的器官或组织的系统，如美国专利6,490,880、6,100,082、6,046,046、5,326,706、5,285,657、5,157,930、4,951,482、4,502,295和4,186,565中描述的。
一些用于器官保藏的系统和溶液特别涉及在该溶液或系统中灌注氧，以将器官暴露于氧，因为人们相信将器官或组织维持在氧合的环境中可提高存活力。参见Kuroda等，(Transplantation46(3)457-460，1988)和美国专利6,490,880、6,046,046、5,476,763、5,285,657、3,995,444、3,881,990和3,777,507。据认为剥夺氧长于4小时的分离的心脏丧失了活力并因为缺血/再灌注损伤而不可在接受者中使用。见美国专利6,054,261。
而且，在本发明的一些实施方案中，存在用于保藏血小板的方法，如上面提及的。使用本公开内容的技术，减少或消除了现有技术的缺点。涉及血小板和氧减少的实施方案有广泛的应用，包括但不限于将受益于较长期保存血小板的任何应用。
在一个实施方案中，氧减少技术可在试剂盒中体现。例如，BectonDickinson提供的目前销售产品号为261215的试剂盒利用在这里描述的选择技术。该试剂盒包括厌氧发生器(例如氢气发生器)、钯催化剂、厌氧指示器和不透气、可密封的“BioBag”，上面的组分(与透气口袋中的血小板一起)置于其中并密封。
该示例性试剂盒中的厌氧发生器通过添加水激活，水通过一系列的通道到达滤纸条。该纸条延缓和调节水引入进所述的片室中，提供氢气的控制释放。产生气体的片包括硼氢化钠。从该反应中释放出的氢气与密闭容器中的气氛氧化合产生水。该反应通过容器中的钯催化。
在一个更一般性的方面，本公开内容的技术可用任意数量的密封环境(例如，容器如罐、不可渗透的袋，或室)实施，在该密封环境中氧张力可减少。在一个实施方案中，容器和/或血小板或者相关溶液中的氧水平可减少至低于约1％(约百万分之10,000份)。在另一实施方案中，氧可减少至约百万分之10-100份的范围，或更少。在又一实施方案中，氧可减少至表示容器和/或血小板或相关溶液中的氧减少的任何百分比值。在优选的实施方案中，容器是不透气的，以及可密封的。本领域中一般技术人员将理解，“透气的”不一定意味着绝对或100％水平的不渗透性。相反，“不透气的”应该如它在本领域中所表示的来解释，表示例如能够保持少于10ppm(相对于室内空气的梯度，通常为210,000ppm)的气氛至少4天。通常，可商业获得的袋子在6周或更长的时间内是不可渗透的。
容器可在有关的减少氧的元件置于其内时密封。减少该环境中的气氛氧可通过产生氢气(有或无催化剂)与氧化合产生水实现。可催化其它反应来将氧与其它化合物，例如碳组合产生二氧化碳。其它反应和组合对于本领域一般技术人员来说将是显而易见的。同样，氧气可通过将室内的气体转换成含有不包括氧气的任意气体组合的气体来取代。另外，氧气可通过将容器置于真空中除去，所述真空足以除去气体并尤其足以除去氧气而达到期望的、减少的水平。可替代地，氧气可通过用与氧竞争的另一种气体或化合物，例如CO来竞争。可利用除去氧气和竞争剩余的氧气的组合。
在不同的实施方案中，可用装置测量氧水平以确保已经达到合适的厌氧状态。可使用基于亚甲蓝的厌氧指示剂，所述的亚甲蓝在没有氧时从蓝色变成无色。可替代地，可使用可商业获得的测氧计(例如机械和/或电子测量计)或其它测量氧的机制。
在不同的实施方案中，将血小板装在密封的环境中，这样可将氧从含有血小板的溶液，以及从血小板它们自身除去。例如，可将透气袋中的血小板置于密封的环境中。其它非限制性的实例可以具有一个敞开的容器在密封的环境内来装盛血小板。可替代地，可将血小板包含于一个不可渗透的、密封的容器(例如，袋)中并整合有除氧装置。
在一个实施方案中，本发明涉及其中将血小板和溶液引入不透气的容器中的方法。该容器是密封的。将氧气从容器或从血小板和溶液中除去。考虑将透气的袋中的约，至少约，或至多约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，或在此可引出的任意范围的氧气除去。
该方法还可包括标明在除去氧后容器内剩余的氧气水平。容器内的氧可减少至约百万分之10,000份或更少。容器内的氧可减少至约百万分之10-100份之间的水平。引入血小板可涉及将盛有血小板和溶液的透气容器加进不透气的容器中。引入血小板可涉及将血小板和溶液放进可密封的、柔性的袋子，或可密封的、刚性的室中。密封容器可涉及使用粘合剂，密封容器可在给定的方法的任何阶段发生。
去除氧可涉及将氧从容器中抽出，并且这种抽吸可涉及用低真空泵和/或涡轮泵抽吸。去除氧可涉及将氢气引入容器中，其与氧化合产生水。氢可通过化学反应引入。化学反应可以被催化。去除氧可涉及使用产生气体的片将氢气引入容器中。可将水加至含有硼氢化钠的产生气体的片来产生氢气。这种水可以以延时的和受调节的方式加入。例如，可使用滤纸条。水可通过一个或多个通道引入至滤纸条。钯可催化产生氢气的化学反应。去除氧可涉及将与氧结合的一种或多种试剂引入进容器中。可将CO引入进容器中，其与氧键合形成CO2。去除氧气可涉及用一种或多种气体置换氧气。
标出剩余氧的水平可涉及利用在无氧时变色的亚甲蓝指示剂。可替代地，可使用测氧计。标出容器内剩余氧的水平可涉及显示血小板或溶液中的剩余氧的水平。
在一个实施方案中，本发明涉及其中将血小板和溶液引入不透气的容器中的方法。该容器是密封的。氢气通过加入水至硼氢化钠的化学反应产生。该化学反应通过与氢化合形成水来除去血小板和溶液中的氧。标明在除氧后容器内的剩余氧的水平。
该化学反应可用钯催化。水的加入可涉及使用滤纸芯。
在一个实施方案中，本发明涉及用于将氧从血小板和溶液中除去的系统。该系统包括(a)一个可密封的、不透气的容器、(b)一个还原氧的发生器，以及(c)氧指示器。配置该可密封的、不透气的容器并调整尺寸以便接受血小板和溶液。将还原氧的发生器与该容器连接并设计用于通过抽吸或化学反应来除去血小板和溶液中的氧。将氧指示器与容器连接并设计用于标明在除氧后容器内的氧水平。
该容器可以是可密封的、柔性的袋。还原氧的发生器可包括氢气发生器，其设计来产生氢气用于与氧化合而产生水。氢气发生器可包括产生气体的物质，其在与一种试剂化合时产生氢气。这种产生气体的物质可包括硼氢化钠片，而所述试剂可包括水。氢气发生器还可包括钯催化剂。系统还可包括设计来通过控制化学反应的一种或多种成分的引入，来延缓或调节该化学反应的构件。例如，该构件可包括延缓和调节化学反应的芯。
在一个实施方案中，本发明涉及包含氢气发生器、不透气的可密封容器、以及氧指示器的试剂盒。
氢气发生器可包括产生气体的物质，其在与一种制剂化合时产生氢气。这种产生气体的物质可包括硼氢化钠片，而所述试剂可包括水。试剂盒还可包含钯催化剂。试剂盒也可包含设计来延缓或调节产生氢气的化学反应的芯。
如上论述的，本发明的方法可涉及使用一种仪器或系统，所述仪器或系统维持生物物质置于其中或暴露于其中的环境。本发明包括其中提供活性化合物(尤其作为气体)的仪器。在一些实施方案中，该仪器包括具有用于装盛生物物质的样品室的容器，其中该容器与含有活性化合物的气体的供应源连接。特别考虑该容器可以是固体容器或者它可以是柔性的，例如袋子。
在一些实施方案中，本发明是用于保藏细胞的仪器，该仪器包含具有容积不超过775升的样品室的容器，以及与该样品室流体通讯的第一种气体供应源，该第一种气体供应源包括一氧化碳。在其它实施方案中，该仪器还包括一个调节样品室内温度的冷却装置和/或气体调节器，该气体调节器调节室内的活性化合物的量或调节室内的溶液中的活性化合物的量。
考虑，可存在第二种或额外气体的气体供应源，或用于活性化合物的第二种或额外气体供应源。第二种气体供应源可与所述样品室连接，或者它可与第一种气体供应源连接。额外的气体(如上论述的)可以是无毒的和/或非活性气体。
在本发明的一些实施方案中，气体调节器是所述仪器的一部分。可采用一个、两个、三个或更多个气体调节器。在一些情形中，气体调节器调节由第一种气体供应源供应给样品室的气体。可替代地，它调节由第二种气体供应源供应给样品室或第一种气体供应源的气体，或可存在用于第一种和第二种气体供应源两者的调节器。进一步考虑，可程序化任何气体调节器来控制供应给样品室和/或另一种气体供应源的气体的量。调节可以进行或可以不进行指定的一段时间。可以有一个气体调节器，对于直接或间接与样品连接的任何气体供应源，其可以是或可以不是可程序控制的。在一些情形中，气体调节器是电子程控的。
在一些情形中，所述室内的压力和/或温度可以分别用压力调节器或温度调节器调节。和气体调节器一样，这些调节器可以是可电子程控的。本发明的仪器也具有冷却和/或加热装置以获得上面讨论的温度。该装置可以是或可以不是电子程控的。
在其它实施方案中，所述仪器包括一个有轮车，容器放置在上面，或其可以具有一个或多个手柄。
特别考虑本发明包括用于细胞的仪器，其中该仪器具有具有样品室的容器；与样品室流体通讯的第一种气体供应源，该第一种气体供应源包括活性化合物；以及可电子程控的气体调节器，其调节由第一种气体供应源供应给样品室的气体。
在一些实施方案中，所述仪器也具有配置来在样品室内提供真空的结构。
而且，考虑本申请案中描述的任何氧拮抗剂用本发明的仪器使用。在特定的实施方案中，一氧化碳可用该仪器施用。在其它情形中，可以施用硫属化物化合物或具有还原剂结构的化合物。
图19是一个实例性系统的示意图并体现了上面论述的概念，该系统用于将氧从血小板和溶液中除去。透气的袋子1920可置于可密封的不透气的容器1904中。不透气的容器1904可与还原氧的发生器1906连接。在一个实施方案中，还原氧的发生器1906可包围可密封的不透气的容器1904。在不同的实施方案中，还原氧的发生器1906可采用不同的形式。例如，它可以是泵(例如，低真空泵和/或涡轮泵)或氢气发生器。与还原氧的发生器1906有关的可以是一个或多个元件如芯或其它延缓机制。与可密封的不透气的容器1904连接的是传感器1908和调节器1910。在一个实施方案中，传感器1908可以是测氧计，其可采取多种形式。在其它的实施方案中，传感器1908可以是温度或压力计。当然，可使用多于一个的传感器。在一个实施方案中，调节器1901可以是温度或压力调节器。例如，调节器1901可以是加热或冷却装置用以调节可密封的不透气的容器1904内的温度。
v.诊断应用 亚硫酸盐在含硫氨基酸的正常代谢过程中，由体内的所有细胞产生。亚硫酸盐氧化酶除去，并因而调节了亚硫酸盐的水平。这些酶的不同活性将导致不同水平的亚硫酸盐以组织特异性方式放出。在上面描述的实例中，对于低氧条件下的实体瘤，亚硫酸盐可以更高的水平产生，用以通过减少代谢状态以及抑制免疫监督来为肿瘤细胞提供局部的保护状态。因此，测量亚硫酸盐水平并将其加入作为对几种疾病状态例如实体瘤的诊断的一部分是有利的。此外，由于我们建议利用亚硫酸盐用于多方面的应用，所以采用某些类型的成像或其它监测方法遵循这一建议将是有用的。
使用当前的技术(例如HPLC)测量血清中的亚硫酸盐水平以获得总的亚硫酸盐水平是可能的。值得研究使亚硫酸盐成像的可能性。可替代地，蛋白组学方法可使得能了解在某些疾病状态下可怎样改变参与亚硫酸盐代谢的酶的调节，使得该方法能用于诊断。
VI.筛选应用 在更进一步的实施方案中，本发明提供了用于鉴定以类似于诱导停滞的方式起作用的氧拮抗剂和分子以及其它活性化合物的方法。在一些情形中，所寻找的氧拮抗剂或活性化合物在低氧或缺氧环境中在降低核心体温或保留存活力方面类似硫属化物化合物起作用，如果不存在氧拮抗剂或其它活性化合物，则所述低氧或缺氧环境将会杀死生物物质。这些测定法可包括对候选物质的大型库的随机筛选；或者，该测定法可用于集中在根据着眼于如下性质而选择的特殊类型的化合物上该性质被认为使得它们更有可能作为氧拮抗剂或活性化合物起作用，提供一种候选活性化合物； (a)将该候选活性化合物与生物物质混合； (b)测量氧拮抗剂处理的特征性的一种或多种细胞反应；以及 (c)将所述的一种或多种反应与不存在候选活性化合物情况下的生物物质的反应比较。
测定法可用分离细胞、组织/器官或完整的生物进行。
当然将要理解，本发明的所有筛选方法本身是有用的，尽管事实上可能不会发现有效的候选物。本发明提供了用于筛选这类候选物的方法，不只是发现它们的方法。然而，还应理解，候选活性化合物可根据一种或多种测定法鉴定为有效的活性化合物，这意指候选活性化合物似乎具有一些充当活性化合物的能力，例如通过在生物物质中诱导停滞。在一些实施方案中，筛选包括使用本公开内容中的实施例或别处描述的测定法来鉴定调节剂。而且，除了在该部分中描述的方法以外或代替在该部分中描述的方法，可检测候选活性化合物作为氧拮抗剂或作为具有活性化合物性质的另一种化合物(例如保护性代谢剂或治疗性物质)的活性。在上文中提供了筛选方法的一些实施方案。
可以进一步表征或测定有效的活性化合物。此外，有效的活性化合物可在体内动物或动物模型(如下文中所讨论的)中使用，或可在其它的体内动物或动物模型中使用，所述的其它动物或动物模型可以涉及相同物种的动物或不同的动物物种。
此外，考虑到，根据本发明的实施方案鉴定的活性化合物还可在筛选后被生产。同样，根据本发明方法，尤其是关于治疗或预防的实施方案，可以将生物物质暴露于有效的活性化合物或与之接触。
A.活性化合物 如在此使用的，术语“候选活性化合物”指可通过例如，改变核心体温来在生物物质中诱导停滞的任何分子。候选活性化合物可以是蛋白质或其片段、小分子、甚或是核酸分子。还可以从各种商业来源、被认为符合有用药物的基本标准的小分子库获得候选活性化合物，以致力于“暴力”鉴定有用的化合物。筛选这些库，包括组合产生的库(例如肽库)，是筛选大量相关(和不相关的)化合物的活性的快速且有效的方法。组合方法本身还有助于通过产生活性的、然而在别的方面不期望的化合物的模建的第二代、第三代和第四代化合物，来迅速发展潜在的药物。
候选活性化合物可以包括天然存在的化合物的片段或部分，或以已知化合物的活性组合形式被发现，其否则是无活性的。有人提出，从天然来源例如动物、细菌、真菌、植物源(包括叶和树皮)和海产样品分离的化合物可作为候选物检测，检测潜在有用的药用物质的存在。应该理解，要筛选的药用物质还可源于化学组分或人造化合物或者用它们合成。因此，应该理解，通过本发明鉴定的候选活性化合物可以是从已知抑制剂或刺激剂开始，通过合理药物设计而设计的肽、多肽、多核苷酸、小分子抑制剂或任何其它化合物。
其它合适的活性化合物包括反义分子、siRNA、核酶和抗体(包括单链抗体)，它们各自对靶分子是特异性的。这类化合物在本文件中的其它地方更详细地描述。例如，结合至翻译起始位点或转录起始位点，或剪接点的反义分子将会是理想的候选抑制剂。
除了最初鉴定的活性化合物，本发明人还考虑制备其它结构相似的化合物以模拟活性化合物结构的关键部分。这类化合物(其可包括肽调节剂的肽模拟物(peptidomimetics))可以以与起始活性化合物相同的方式使用。
B.体内测定法 体内测定涉及多种动物模型的使用。由于它们的大小、容易处理，以及有关它们的生理和遗传组成的信息，小鼠是优选的实施方案。然而，其它动物也合适，包括大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、沙土鼠、土拨鼠、小鼠、猫、狗、绵羊、山羊、猪、奶牛、马和猴(包括黑猩猩、长臂猿和狒狒)。鱼也可考虑用于体内测定法，线虫也一样。调节剂的测定可用源自任意这些物种的动物模型进行。
在这类测定法中，将一种或多种候选物质施用给动物，并且与惰性载体(阴性对照)和H2S(阳性对照)比较，所述候选物质诱导停滞、降低核心体温，或赋予生物物质在低氧或缺氧环境条件下存活的能力的能力鉴定调节剂。用试验化合物处理动物将涉及将该化合物，以合适的形式，施用给动物。候选化合物(气体或液体)的施用可通过能用于临床或非-临床目的的任何途径，包括但不限于经口、经鼻(吸入或气溶胶)、经颊或甚至是局部施用。或者，施用可以通过气管内滴注法、支气管滴注法、皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射或静脉内注射进行。特别考虑的途径是全身性静脉注射、通过血液或淋巴供给的局部施用，或直接施用至受影响的部位。
VII.施用模式和药物组合物 硫属化物、氧拮抗剂或活性化合物的药物组合物的有效量通常定义为足以可检测地改善、减小、最小化或限制目标病症的程度的量。可采用更严格的定义，包括疾病的消除、根除或治愈。
A.施用 自然地，硫属化物或其它活性化合物的施用途径将随要处理的病症的部位和性质而变化，并包括例如，吸入、皮内、经皮肤、肠胃外、静脉内、肌内、鼻内、皮下、经皮、气管内、腹膜内、瘤内、灌注、灌洗、直接注射，以及经口施用和制剂。如下面详述的，活性化合物可作为医用气体通过吸入或插管法施用，作为注射用液体剂通过血管内、静脉内、动脉内、脑室内(intracerobroventicular)、腹膜内、皮下施用、作为局部用液体剂或凝胶剂、或固体口服剂型施用。
而且，所述量可以根据生物物质的类型(细胞类型、组织类型、生物的属和种等)和/或其大小(体重、表面积等)变化。通常是生物越大，剂量就越大。因此，用于小鼠的有效量通常将比用于大鼠的有效量低，用于大鼠的有效量通常将低于用于狗的有效量，用于狗的有效量通常将低于用于人的有效量。硫化氢在人体内实现停滞的有效浓度取决于剂型和施用途径。对于吸入法，在一些实施方案中，有效浓度在连续递送50ppm至500ppm的范围内。对于静脉内施用，在一些实施方案中，有效浓度在连续递送的每千克体重0.5至50毫克的范围内。
类似地，施用时间的长度可以根据生物物质的类型(细胞类型、组织类型、生物的属和种等)和/或其大小(体重、表面积等)改变，并且将会部分取决于剂型和施用途径。在特殊的实施方案中，提供活性化合物约或至少30秒钟、1分钟、2分钟、3分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时、24小时或长于24小时。活性化合物可以单次剂量或多剂量施用，施用的剂量之间的时间量不同。
在移植的情形中，本发明可在手术前和或手术后使用以使得宿主或嫁接材料休眠。在具体的实施方案中，外科手术位置可注射或灌注含有硫属化物的制剂。所述的灌注可手术后继续，如通过让导管植入于手术位置处。
B.可注射的组合物和制剂 用于递送本发明的氧拮抗剂或其它活性化合物的优选方法是吸入法、静脉内注射、特殊区的灌注和经口施用。然而，在此公开的药物组合物可备选如美国专利5,543,158、美国专利5,641,515和美国专利5,399,363(将每篇在此特别通过全文引入作为参考)中描述的，经肠胃外、皮内、肌内、经皮肤或甚至是腹膜内施用。
活性化合物的溶液可在适当与表面活性剂(例如羟丙纤维素)混合的水中制备。分散体也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及在油中制备。在一般的存储和使用条件下，这些制剂含有防腐剂用以防止微生物的生长。适合注射施用的药物形式包括无菌含水溶液或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉剂(美国专利5,466,468，特别在此通过全文引入作为参考)。在所有情形中，所述的形式必须是无菌的，并且应该是流动到容易进行注射的程度。在制造和储存条件下其必须是稳定的，并且必须将其防腐以防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。适当的流动性可例如通过用包衣如卵磷脂、在分散的情形中通过保持所需的粒度，以及通过使用表面活化剂来维持。对微生物作用的预防可通过多种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。在许多情形中，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。注射用组合物的延长吸收可通过在该组合物中使用延缓吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
对于以含水溶液的肠胃外施用，例如，如有必要应该适当地缓冲该溶液并用足够的盐水或葡萄糖首先赋予该液体稀释剂等渗性。这些特殊含水溶液特别适合静脉内、肌内、皮下、瘤内和腹膜内施用。就此而论，根据本公开内容，可使用的无菌含水介质将是本领域那些技术人员已知的。例如，可将一个剂量溶解于1ml等渗的NaCl溶液中，并加到1000ml皮下输注流体中或在建议的输注位点处注入(参见例如，“Remington′s Pharmaceutical Sciences”第15版，1035-1038和1570-1580页)。剂量的一些变化必然会根据受治疗的受试者的状况发生。在任何情况下，负责施用的人将确定用于个体受试者的合适剂量。此外，对于人施用，制剂应该符合如FDA生物制品标准办公室(Office of Biologics standards)要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。
无菌注射用溶液通过这样制备将需要量的活性化合物与需要的上文中列举的各种其它成分一起掺入合适的溶剂中，之后过滤灭菌。通常，分散体通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌载体中制备，所述载体含有基本分散介质和所需的来自上面列举的其它那些成分。在用于制备无菌可注射溶液剂的无菌粉剂的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术产生活性物质加上任何来自其事先无菌-过滤的溶液的额外所需成分的粉末。
如在此使用的，“载体”包括任何以及所有的溶剂、分散介质、赋形剂、包衣、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和延缓吸收的试剂、缓冲液、载体溶液、混悬液、胶体等。这种介质和试剂用于药学活性物质的用途在本领域中是熟知的。除了与活性成分不相容的任何常规介质或制剂外，考虑将它们用于治疗性组合物中。辅助的活性成分也可掺入该组合物中。
短语“可药用”或“药理学上可接受的”指在施用给人时不会产生过敏反应或类似的不利反应的分子实体和组合物。含有蛋白质作为活性成分的含水组合物的制备是本领域中充分了解的。通常，这类组合物可制备成可注射剂，作为液体溶液剂或混悬剂；也可制备成适合在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式。
C.静脉内用制剂 在一个实施方案中，本发明的活性化合物可配制用于肠胃外施用(例如静脉内、动脉内)。在其中活性化合物在室温下是气体的情况下，考虑含有已知和期望浓度的气体分子的溶液剂，所述气体分子溶解于用于肠胃外施用的液体或溶液中。活性化合物溶液的制备可通过例如，让气体与溶液接触(例如，鼓泡或注入)以使该气体分子溶解于溶液中完成。本领域中的那些技术人员将认识到，溶解于溶液中的气体的量将取决于许多变量，包括(但不限于)气体在液体或溶液中的溶解度、液体或溶液的化学组成、它的温度、它的pH、它的离子强度，以及气体的浓度和接触程度(例如，鼓泡或注入的速率和持续时间)。活性化合物在用于肠胃外施用的液体或溶液中的浓度可采用本领域那些技术人员已知的方法确定。活性化合物在液体或溶液中的稳定性可通过在制备或生产氧拮抗剂溶液后，在不同的时间间隔后测量溶解的氧拮抗剂的浓度而测定，其中与起始浓度比较氧拮抗剂浓度的减少表示活性化合物的损失或化学转化。
在一些实施方案中，含有硫属化物化合物的溶液剂通过将盐形式的硫属化物溶解于无菌水或盐水(0.9％氯化钠)中以产生可药用的静脉内剂型来生产。可缓冲静脉内液体剂型来达到某种pH，以增强硫属化物化合物的溶解度或影响硫属化物化合物的电离状态。在硫化氢或硒化氢的情形中，本领域那些技术人员已知的许多盐形式的任意一种可满足需要，包括但不限于钠、钙、钡、锂或钾。在另一优选的实施方案中，将硫化氢或硒化氢溶解于无菌磷酸盐缓冲盐水中，并用盐酸调节pH为7.0以获得可静脉内或动脉内施用给受试者的已知浓度的溶液剂。
考虑在一些实施方案中，到本发明的药物组合物是关于活性化合物饱和溶液。该溶液可以是任意可药用制剂，其中大多数是熟知的，例如林格氏溶液。在特定实施方案中，活性化合物的浓度是约，至少约或至多约0.001、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0M或更大，可源于其中的任何范围(在标准温度和压力下(STP))。对于H2S，例如，在一些实施方案中，浓度可以是约0.01至约0.5M(在STP下)。特别是考虑，上述浓度可应用于独立地或一起位于溶液中的一氧化碳和二氧化碳。
此外，当施用是静脉内施用时，考虑可使用下列参数。流速约，至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100gtts/分钟或μgtts/分钟，或可源于其中的任何范围。在一些实施方案中，溶液的量通过体积(取决于溶液的浓度)来说明。时间的量可以是约，至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60分钟；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时；1、2、3、4、5、6、7天；1、2、3、4、5周和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月，或可源于其中的任何范围。
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000ml或升，或其中的任何范围的体积可以总体施用或在单独的一段时间内施用。
在一些实施方案中，用于肠胃外施用的活性化合物的溶液剂在其中氧已在将液体或溶液与活性化合物接触之前被除去了的液体或溶液中制备。某些氧拮抗剂，尤其某些硫属化物化合物(例如硫化氢、硒化氢)在存在氧时，由于它们与氧进行化学反应的能力，导致它们的氧化和化学转化而是不稳定的。可使用本领域已知的方法将氧从液体或溶液中去除，所述的方法包括(但不限于)施加负压(真空除气)于液体或溶液，或将溶液或液体与引起氧结合或“螯合”的试剂接触，有效地将它从溶液中除去。
在另一个实施方案中，用于肠胃外施用的氧拮抗剂或其它活性化合物的溶液剂可在气密性容器中储存。当已将氧预先从溶液中除去以限制或防止氧拮抗剂或其它活性化合物氧化时，这尤其是期望的。此外，在气密性容器中储存将会抑制氧拮抗剂气体或其它活性化合物从液体或溶液中挥发，使得溶解的氧拮抗剂的恒定浓度得以维持。气密性容器是本领域那些技术人员已知的，并包括(但不限于)含有不透气的构建材料的“静脉内用袋”，或密封的玻璃瓶。为了防止暴露于气密性储存容器中的空气，可在封闭前将惰性气体，如氮或氩引入容器中。
D.局部用制剂及其用法 本发明的方法和组合物可用于在皮肤和口腔粘膜的浅层中诱导停滞，所述的皮肤和口腔粘膜的浅层包括(但不限于)口和舌的毛囊细胞、毛细管上皮细胞和上皮细胞。用于治疗癌的放射治疗和化学治疗会损伤毛囊和口腔粘膜中的正常细胞，分别导致不期望的，仅致虚弱的癌治疗的副作用、脱发和口腔粘膜炎。在提供血液给毛囊的毛囊细胞和/或脉管细胞中诱导停滞可减慢、限制或防止伴随放射治疗和化学治疗的对毛囊细胞的损伤和导致的脱发，或其它脱发症、男性型秃发、女性型脱发，或毛发从其通常存在的皮肤区域的其它缺失。在口腔上皮细胞和间质细胞中诱导停滞可减慢、限制或防止对内衬在口、食道和舌的细胞的损伤，以及导致的口腔粘膜炎的疼痛状况。
在某些实施方案中，局部施用活性化合物。这通过将该活性化合物配制成乳剂、凝胶剂、糊剂或漱口剂，并将该制剂直接施用至需要暴露于活性化合物的区域(例如，头皮、口、舌、喉)实现。
本发明的局部用组合物可通过选择合适的载体配制成油剂、乳剂、洗剂、软膏剂等。合适的载体包括植物油或矿物油、白凡士林(白软石蜡)、支链脂肪或油、动物脂肪和高分子量醇(大于C12)。优选的载体是活性成分在其中能溶解的那些载体。也可以包括乳化剂、稳定剂、保湿剂和抗氧化剂，以及赋予颜色或芳香的试剂，如果需要的话。另外，透皮渗透增强剂可用于这些局部用制剂中。这类增强剂的实例可在美国专利3,989,816和4,444,762中找到。
乳剂优选用矿物油、自乳化的蜂蜡和水的混合物配制，在该混合物中掺合了溶解于小量油(例如杏仁油)中的活性成分。这种乳剂的典型实例是含有约40份的水，约20份的蜂蜡、约40份的矿物油和约一份的杏仁油的乳剂。
软膏剂可通过将植物油(如杏仁油)中的活性成分溶液与温和的软石蜡混合，并让该混合物冷却而配制。这种软膏剂的典型实例是按重量计含有约30％的杏仁油和约70％的白软石蜡的软膏剂。
洗剂可通过将活性成分溶解于合适的高分子量的醇(例如丙二醇或聚乙二醇)中来方便地制备。
可经直肠使用的可能的药物制剂包括，例如栓剂，其由一种或多种活性化合物与栓剂基质的组合组成。合适的栓剂基质是例如，天然的或合成的甘油三酯或石蜡烃。此外，使用由活性化合物与基质的组合组成的明胶直肠用胶囊也是可能的。可能的基质材料包括例如，液体甘油三酯、聚乙二醇或石蜡烃。
E.固体剂型 药物组合物包括其中活性化合物被俘获或隐蔽于能达到晶态、固态的多孔载体构架中的固体剂型。具有气体储存能力的这种固体剂型是本领域已知的，并可以以可药用形式生产(例如，Yaghi等，2003)。这种药物组合物的一个特殊优势和硫属化物化合物(如，硫化氢、一氧化碳、硒化氢)有关，硫属化物化合物处于它们的游离形式时在某些浓度下对一些哺乳动物可能有毒性。在某些实施方案中，所述的化合物可配制用于经口施用。
F.灌流系统 用于细胞的灌流系统可用于将组织或器官暴露于液体或半固体形式的活性化合物。灌流指连续的溶液流穿过细胞群或从细胞群上流过。这意味着与连续流动培养相反，细胞滞留于培养物中，所述的连续流动培养用分离培养基(withdrawn media)来洗出细胞(例如恒化器)。灌流使得能更好地控制培养环境(pH、pO2、营养水平、活性化合物水平等)，并且是一种显著增加培养物内用于细胞附着的表面积的利用的方法。
开发灌流技术用以模拟其中持续给细胞以血液、淋巴或其它体液的体内细胞环境。不灌流生理营养液，培养物中的细胞经历被喂养和饥饿的交替阶段，从而限制了它们生长和代谢潜能的充分表现。在本发明范围中，灌流系统还可用于给细胞灌注氧拮抗剂用以诱导停滞。
本领域的那些技术人员熟悉灌流系统，并且存在许多可商业获得的灌流系统。在本发明中可采用这些灌流系统的任意一种。灌流系统的一个实例是使用无纺布的床基体的灌流填充床反应器(CelliGenTM，New Brunswick Scientific，Edison，NJ；Wang等，1992；Wang等，1993；Wang等，1994)。简而言之，该反应器包括用于培养锚着依存性细胞和非锚着依存性细胞两者的改良反应器。反应器设计为具有提供内部再循环的装置的填充床。优选地，将纤维基体载体置于反应器容器内的篮中。该篮的顶部和底部都有孔，让培养基能流过篮。特别设计的叶轮提供培养基再循环通过纤维基体占据的空间以确保均一提供营养物和除去废物。这同时确保了可忽略量的总细胞群悬浮于培养基中。篮和再循环的组合还提供氧合培养基无气泡地流过纤维基体。纤维基体是具有10μm至100μm“孔”径的无纺布，提供了很大的内容量，孔容量相当于单个细胞容量的1至20倍。
灌流填充床反应器具有几个优点。具有纤维基体载体，保护细胞免受来自搅动和起泡的机械应激。自由的培养基流过篮提供给细胞最佳调节水平的氧、pH和营养物。产物可不断地从培养基中移出，并且采集的产物是无细胞的并可在低-蛋白质培养基中产生，这可促进接下来的纯化步骤。该技术在WO 94/17178(1994年8月4日，Freedman等)中有详细解释，其因此将其通过全文引入作为参考。
CellcubeTM(Corning-Costar)模块为基质附着细胞的固定和生长提供了大的苯乙烯(styrenic)表面积。它是整体包封的无菌一次性使用装置，其具有一系列的平行培养平板，培养平板连接而在相邻平板间产生薄的密封的层流空间。
CellcubeTM模块具有彼此对角相对并帮助调节培养基的流量的入口和出口。在开始的数天生长过程中，通常将培养物在起始接种后通过包含于系统内的培养基来饱和。在起始接种和培养基灌流开始之间的时间量取决于接种的接种物中细胞的密度和细胞生长速率。循环的培养基中营养物浓度的测量是培养物状态的一个好的指标。当确定了程序后，有可能有必要监测多种不同灌流速率的营养物组合物，以确定最经济的和生产性的操作参数。
其它可商业获得的灌流系统包括，例如CellPerf_(LaboratoriesMABIO International，Tourcoing，法国)和Stovall Flow Cell(StovallLife Science，Inc.，Greensboro，NC)。
培养物的生产阶段的时间选择和参数取决于特殊细胞系的类型和用途。许多培养物需要不同于培养物生长阶段所需的培养基来用于生产。在传统的培养中，从一个阶段向另一个阶段的转换很可能需要多个洗涤步骤。然而，灌流系统的优点之一是提供多个操作阶段之间温和转换的能力。灌流系统还可促进从生长阶段向通过氧拮抗剂诱导的停滞(static)阶段转换。同样，灌流系统可促进通过用例如生理营养培养基替换含有氧拮抗剂的溶液，从停滞阶段向生长阶段转换。
G.导管 在某些实施方案中，导管用于将活性化合物提供给生物。特别重要的是施用这样一种药剂至心脏或脉管系统。通常，将导管用于该目的。Yaffe等，2004在关于滞生内容中特别论述了导管，虽然在该出版物之前导管的使用就是普遍已知。
H.气体的递送 1.呼吸系统 一种典型的气体递送系统100在图9中说明。递送系统100适合递送可以吸入的气体(包括活性剂)至受试者的呼吸系统。气体递送系统100包含一个或多个气体源102。
每个气体源102中的每一个连接至调节器104和流量计106。气体递送系统100还包含活性剂源107、任选的汽化器108、排出口控制器110、清除器(scavenger)112，和警报/监测系统114。递送系统100可包含通常在麻醉递送仪中使用的某些元件。例如，麻醉递送仪通常包含一个高压回路、一个低压回路、一个呼吸回路和一个清除回路(scavenging circuit)。如在图10-11中描述的，可提供一个或多个气体源102、汽化器108、出口控制器110、清除器112和/或警报/监测系统114作为具有高压、低压、呼吸和/或清除回路的装置的部分，并且这些元件可类似于在麻醉递送仪中通常使用的那些。麻醉递送仪例如在美国专利4,034,753、4,266,573、4,442,856和5,568,910中描述，因此将这些专利的内容通过全文引入作为参考。
气体源102可通过压缩气体罐提供；然而，应该理解，气体源102可以是气体源或可转化成气体的液体源。例如，汽化器108可用于使液化气体源汽化。调节器104包含降低每个气体源102的气压的阀。减压气体随后通过其中一个流量计106，该流量计测量并控制来自每个相应气体源102的气体的流量。
气体源102可以是用于递送活性剂107的载气。可选择载气用以提供给被递送了来自源107的活性剂的受试者一个期望的环境。例如，如果活性剂作为可吸入的气体递送给患者，则载气可包括足够量的氧、一氧化二氮或空气来满足患者的需要。可使用其它惰性气体或活性气体。
在一些实施方案中，气体源102之一包括活性剂源107。来自源107的活性剂可以是通过汽化器108汽化的液化气源，或者该活性剂可以是气体源，例如在高压下的压缩气体。活性剂可与气体源102中一个或多个混合。排出口控制器110控制提供给受试者的气体混合物的量。
清除器112是将提供给受试者的气体清除和/或通风换气的装置或系统。例如，如果来自源107的活性剂作为可吸入的气体提供给患者，则清除器112可用于去除吸入剂(例如活性剂)、未使用的氧和呼出的二氧化碳的废气。
警报/监测系统114包括在递送系统100中的一个或多个位置监测气体流量和/或气体含量的传感器。例如，可在来自源107的活性剂作为可吸入的气体提供给患者时监测氧的流量或流量，以确保载气包含对于患者足够的氧。警报/监测系统114还包含一个用户界面，该用户界面经设定用以提供声音或视觉报警信号或者监测给递送系统100的使用者的信息，例如视屏显示、光或声报警。可设定警报/监测系统114在满足预定条件时通知使用者和/或提供关于气体水平的信息。
关于图10，系统100A包含一个高压回路116、低压回路118、呼吸回路120和清除回路122。
高压回路116包括压缩气体源102，其连接至调节阀104b、104a。调节阀104a控制从每个气体源102流出的气体的量，并且可以打开调节阀104b用以例如通过提供通向周围气氛的开口来增加气体的压力。
低压回路118包括流量计106、活性剂源107和汽化器108。来自气体源102的气体混合物由流量计106提供，其控制来自气体源102的每种气体的量。如在图10中说明的，活性剂源107是液体。活性剂源107通过汽化器汽化并加入至气体混合物中。
呼吸回路120包括排出口控制器110、两个单向阀124、126以及吸收器128。清除回路122包括阀112a、储蓄器112b和排出口112c。受试者130接收来自排出口控制器110的气体混合物并且产生的气体通过清除回路122通风换气。更特具体地说，排出口控制器110控制通过单向阀124递送给受试者130的气体混合物的量。呼出气体流过单向阀126到达阀112a并到达储蓄器112b。过量气体通过清除器112的排出口112c排出。一些气体可以再循环并流过吸收器128并进入呼吸回路120中。吸收器128可以是用于减少呼出气体中的二氧化碳气体的二氧化碳吸收罐。在该构造中，呼出的氧和/或活性剂可再循环和再使用。
一个或多个传感器S可在系统100A中的不同位置加入。传感器S感知和/或监测系统100A中的气体。例如，如果其中一个气体源102是氧，则其中一个传感器S可以是经设定并置于适当位置用于监测系统100A中的氧，以便患者接受合适量氧的氧传感器。传感器S与警报/监测系统114通讯(见图9)。如果不期望的或危险的气体水平出现在系统100中，则警报/监测系统114可警告系统100A的使用者以便可以采取适当的措施，例如增加提供给受试者130的氧水平或让受试者130脱离递送系统100A。
关于图11，显示了系统100B，其中活性剂源107连接至两个调节阀104b、104a。如果活性剂源107是液化气源，则提供任选的汽化器108来使液化气源汽化。如果活性剂源107是气体的(如高压气体)，那么可省略汽化器108。来自源107的活性剂在低压回路118中以由流量计106控制的量与其它气体源102混合。低压回路118包括气体储蓄器109，其容纳在气体混合物流向呼吸回路120时任何溢出的气体混合物。应该理解，活性剂源107和/或任何气体源102可作为液化气源提供给汽化器。在图11中说明的系统100B的元件基本上与上文中描述的关于图10的那些元件相同，并将不会另外描述。
可采用系统100、100A、100B实施的，根据本发明的实施方案的方法在图12中说明。提供了一个或多个可吸入的气体源的混合物(202部件)。可吸入的气体源可如有关图9-11描述的从气体源102获得。将预定量的活性剂加入气体混合物(204部件)中，例如有关图9-11中的活性剂源107所显示的。将气体混合物施用给受试者120(306部件)。将呼出气体例如通过清除器112来通风换气和/或再循环(208部件)。虽然图12的方法是相对于图9-11的系统100、100A、100B来描述的，但应该理解任何合适的系统或装置可用于完成图12中的步骤。
2.减压递送系统 气体递送系统300的实施方案相对于图13来说明。气体递送系统300放置在受试者302上。气体递送系统300特别适合递送气体混合物中的活性剂给受试者302的组织，例如创伤组织。
系统300包括一个减压室304，其具有覆盖受试者302的处理区域的遮蔽物306。该减压室304通过泵出口310a连接至真空泵310。减压室304包括进气孔308a和排出口308b，其依次连接至活性剂源307。控制器320连接至活性剂源307和真空泵310。减压室和真空泵系统在美国专利5,645,081和5,636,643中论述，因此将其内容通过全文引入作为参考。
设置减压室304来围住受试者302的区域以提供流体密封的或气密性罩，来实现用减压或负压以及活性剂源307对该区域的处理。压力室304可用覆盖物(未显示)，例如柔性的、带粘性的、流体不可渗透的聚合物薄片贴在受试者302上。该覆盖物可具有一个粘性背衬，其用于环绕受处理区域的边缘覆盖住皮肤，并用于提供通常气密性的或流体密封的密封并用于固定室304于适当的位置。
遮蔽物306位于受试者302的处理区域上。例如，如果受试者302的处理区域包括伤口，则该遮蔽物306可位于伤口之上用以防止其过度生长。可调节遮蔽物306的大小和结构以适合个体的处理区域，并且其可用多种多孔材料形成。该材料应该是充分多孔的以使得氧及任何其它气体，例如来自活性剂源307的气体能到达处理区域。例如，遮蔽物306可以是开室聚合物泡沫的形式，如聚氨酯泡沫塑料，其是充分多孔的以使得气体能流至处理区域和/或自处理区域流出。可使用厚度和硬度不同的泡沫塑料，但如果患者在治疗过程中必须躺在该装置上，则为了患者的舒适使用海绵材料可能是理想的。该泡沫塑料还可进行打孔以增强气流并减轻系统300的重量。遮蔽物306可切割成合适的形状和大小以适合在处理区域内，或可替代地，遮蔽物306可足够大来与周围的皮肤重叠。
真空泵310提供了一个抽吸源于减压室304中。活性剂源307为减压室304提供了一定量活性剂。控制器320通过真空泵310控制施加于减压室304的真空的量以及通过活性剂源307控制供给室304的活性剂的量。
应该理解，控制器320可以充分恒定的方式、循环地、或采用多种波动或模式或它们的任意组合施加真空和/和活性剂。在一些实施方案中，活性剂通过活性剂源307提供，备选用真空泵310的真空泵出作用提供。也就是说，控制器320在活性剂源307失活时可替代地激活真空泵310，然后在真空泵310失活时激活活性剂源307。减压室304中的压力允许波动。在其它实施方案中，基本恒定的压力通过真空泵310维持，并且活性剂源307提供充分恒定量的活性剂给在减压环境中的室304。在一些实施方案中，基本恒定的压力通过真空泵310维持，而活性剂的量以周期性方式变化。在其它实施方案中，减压室304中的压力通过真空泵310来发生波动，并且由源307提供的活性剂的量也波动。真空泵310和产生的室304中压力的波动，或者由源307提供的活性剂的量的波动可以是周期性的或非周期性的。
可用系统300进行的根据本发明的实施方案的方法在图14中得以说明。室304位于受试者302的处理区域(402部件)上。室304中的压力通过真空泵310(404部件)来减少。将预定量的来自活性剂源307的活性剂施加至室(406部件)。虽然图14的方法是相对于图12中的系统300描述的，但应该理解，任何合适的系统或装置都可用于实施图14中的步骤。例如，排出口308b可以省略，并且活性剂可通过单个进气孔308a供应给室304。其它气体也可例如用单个进气孔或一个进气孔和一个排出口来加入至室304中，如相对于活性剂源307和进气孔308a及排出口308b来说明的。在一些实施方案中，真空泵310连接至泵310和室304之间用于收集来自处理区域的渗出物的另外的收集容器，例如，如美国专利5,636,643中描述的。
在一些实施方案中，负压气体递送系统500，如图22A中说明的，包含于容器502中的一个活性氧拮抗剂源，容器502通过导管508，经过进气孔506连接至盖层504。该盖层相对于组织位点510(可能是伤口位置)形成密封的封袋。在一些实施方案中，该盖层具有通过导管516与负压源514连通的排出口512。在一些实施方案中，废物罐518，其可以是可拆卸的废物罐，与排出口和负压源之间连通。在一些实施方案中，回路排出口520通过导管522与容器502连通。在一些实施方案中，如图22B中显示的，汽化器524被插入容器502和遮盖物504之间的连通物中。
导管可以是柔性的，并且可适合为类似塑料的材料软管。负压源514，其可适合为真空泵，在一些实施方案中通过导管516与排出口512进行流体通讯，用于促进流体排出，如本领域已知的。在一些实施方案中，废物罐518位于真空下，通过流体通讯来收集排出的流体。优选地，将一个过滤器(未显示)，其可以是疏水性膜滤器，插入废物罐和负压源之间，用来防止吸入废物罐中的排出流体的污染。在一些实施方案中，盖层504含有弹性材料，因此其可在负压源的间歇性操作过程中适应组织位点区域上的压力变化。在一些实施方案中，盖层的边缘覆盖有压敏胶粘剂，其可以是丙烯酸系粘合剂，用于将盖层密封于组织位点上。
如图12和图22A-B中说明的负压气体递送系统300和500可用于处理不同区域用于治疗，并尤其用于处理伤口。可采用系统300处理的伤口包括受感染的开放性创伤、褥疮、裂开的切口、部分厚度烧伤，以及多种已连接了皮瓣或移植物的损伤处。对伤口的治疗可这样进行将气体递送系统如先前显示和描述的固定于治疗位置，减压室304内维持基本上持续减少或周期性减少的压力，并以基本上持续或周期性的方式提供活性剂给室304直到伤口达到期望的改善状况。选择的改善状况的状态可包括形成足以用于附着皮瓣或移植物的肉芽组织、减少伤口处的微生物感染、阻止或逆转烧伤穿透、伤口的闭合、皮瓣或移植物与下面的损伤的组织整合、伤口的完全治愈、或适于给定类型的伤口或伤口综合征的其它改善或治愈阶段。尤其在使用结合了遮蔽物在伤口上或伤口中的气体递送系统时，气体递送系统在治疗过程中可周期性地改变，例如以48小时的间隔改变。该方法可用0.01至0.99大气压范围的负压或减压来实践，或者该方法可用0.5至0.8大气压之间范围的负压或减压来实践。用于在伤口上使用该方法的时间周期可以是至少12小时，但是可例如延长至1天或数天。不存在该方法的使用超过它则不再有效的上限；该方法可增加闭合的速度一直到伤口确实闭合时。多种类型的伤口的令人满意的治疗可通过利用相当于比大气压低约2至7Hg的减压来完成。
以间歇或周期性的方式提供减压给气体递送系统，例如如上文中描述的，可用于在存在活性剂时治疗伤口。间歇或周期性提供减压给气体递送系统可通过手动或自动控制真空系统来实现。在这种间歇性减压处理中的周期比，即“工作”时间与“不工作”时间的比率可以低到1∶10或高达10∶1。典型的比率是约1∶1，其通常以交替进行的5分钟的减压提供和不提供的间隔来完成。
合适的真空系统包括能够提供至少0.1磅抽吸力给伤口，或至多3磅的抽吸力，或至多14磅抽吸力的任何抽吸泵。该泵可以是能够提供所需抽吸力的任何适合医疗目的的普通抽吸泵。泵和减压装置中间连接的导管的尺寸由该泵提供操作所需的抽吸力水平的能力控制。1/4英寸直径的导管可以是合适的。
本发明的实施方案还包括处理受损组织的方法，其包括在选择的时间内且以选择的量值(其足以减少伤口处的细菌密度)施用负压至伤口和施加活性剂的步骤。开放性创伤几乎总是受有害细菌污染。一般而言，每克组织105个细菌生物的细菌密度认为是受感染的。一般认为在这种感染水平，移植的组织将不会附着于伤口上。这些细菌必须在伤口闭合之前，通过伤口宿主的天然免疫应答或通过一些外部方法杀死。施用负压和活性剂至伤口可减少伤口的细菌密度。人们相信，这种作用可能是由于细菌与负压环境的不相容或伤口区域的血流量增加与暴露于活性剂的组合，因为血液给它带来了细胞和酶来破坏细菌。根据本发明的实施方案的方法可用于将伤口处的细菌密度减少至少一半。在一些实施方案中，其可用于将细菌密度减少至少1,000倍或至少1,000,000倍。
本发明的实施方案还包括处理烧伤的方法，该方法包括以预定的负压和在足以抑制全厚度烧伤形成的时间内施加负压和活性剂至一定区域上的烧伤的步骤。部分厚度烧伤是具有死组织的表面层和下面的停滞层的烧伤，通常受到充分感染，这样它将在24-48小时内转变成全厚度烧伤，即其中所有表皮结构都受到破坏的烧伤。施加负压和一定量的活性剂至伤口可防止感染变得充分严重而导致下面的表皮结构破坏。压力施用的大小、模式和持续时间可随个体伤口变化。
本发明的实施方案还包括用于增强活组织附着至伤口的方法，该方法包括下面的步骤首先连接活组织至伤口以形成伤口-组织复合体，然后施加选择的大小的负压或减压以及一定量的活性剂至区域上的伤口-组织复合体，所述的负压或减压以及活性剂的量足以促进上皮和皮下组织迁移至该复合体，让负压和暴露于活性剂保持足以促进伤口闭合的选择的周期。活组织附着至伤口是可采取多种形式的普通方法。例如，一种普通技术是利用“皮瓣”，即其中将来自伤口邻近区域的皮肤组织的三面分离但保持在第四面上连接，然后将其移至伤口上的技术。另一种经常使用的技术是开放性皮肤移植，其中皮肤与另一皮肤表面完全分离并移植到伤口上。施加负压和活性剂至伤口-移植物复合体减少了该复合体中的细菌密度并增加了至伤口的血流量，从而改善了移植组织的附着。
I.其它仪器 在本发明的某些实施方案中，补充本发明的用于治疗将会遭受或已经遭受外伤的患者的方法以外部操纵患者的核心体温的能力是期望的。在这点上，患者的核心体温可以结合本发明的方法，通过侵入性或非侵入性途径操纵。用于操作核心体温的侵入性方法包括，例如，利用心肺泵来加热或冷却患者的血液，从而升高或降低患者的核心体温。操纵核心体温的非侵入性途径包括将热传递进或转移出患者身体的系统和仪器。
J.其它的递送装置或仪器 在一些实施方案中，考虑方法或组合物将涉及特定的递送装置或仪器。在此论述的任何方法可用用于递送或施用的任何装置，包括但不限于在这里论述的那些装置完成。
对于局部施用本发明的活性化合物，可将本发明的活性化合物配制成溶液剂、凝胶剂、软膏剂、乳剂、混悬剂等，如本领域熟知的。全身用制剂可包括设计用于通过注射或输注，例如皮下、静脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射施用的那些制剂，以及设计用于透皮肤、透粘膜、经口或经肺施用的那些制剂。
对于经口施用，本发明的活性化合物将被配制成用于通过受治疗患者经口摄取的片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、流体剂、凝胶剂、糖浆剂、於浆剂、混悬剂等，或经口的液体制剂，例如悬浮剂、酏剂和溶液剂。
对于口腔施用，组合物可采取以常规方式制备的片剂、锭剂等形式。其它的粘膜内递送可通过栓剂或鼻内递送。
对于通过吸入直接施用至肺部，本发明的化合物可通过多种不同的装置方便地递送至肺部。例如， 定量吸入器(MDI)可将使用含有合适的低沸点推进剂(如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体)的气罐的定量吸入器(“MDI”)用于直接递送本发明的化合物至肺部。MDI装置可从许多供应商获得，例如3M Corporation(例如网址3m.com/us/healthcare/manufacturers/dds/pdf/idd_valve_canister_brochure.pdf-)、来自阿凡斯(Aventis)的Nasacort(例如网址products.sanofi-aventis.us/Nasacort_HFA/nasacort_HFA.html-63k-)、保尔因海姆(Boehringer Ingelheim)，(例如网址boehringer-ingelheim.com/corporate/home/download/r_and_d2003.pdf)、来自弗斯特实验室(Forest Laboratories)的Aerobid(例如网址frx.com/products/aerobid.aspx)、葛兰素-威尔康(Glaxo-Wellcome)(例如网址www.gsk.com/research/newmedicines/newmedicines pharma.html上)以及先灵保尔(Schering Plough)，(网址www.schering-plough.com/schering_plough/pc/allergy_respiratory.jsp)。
干粉吸入器(DPI)DPI装置通常采用一种机制例如气体喷出来在容器内形成干粉的雾状物，其随后可由患者吸入。DPI装置也是本领域熟知的并且可从许多出售者购买到，包括，例如来自先灵公司(Schering Corporation)的Foradil aerolizer，(例如，www.spfiles.com/piforadil.pdf)、来自葛兰素-威尔康的Advair Diskus(例如，www.us.gsk.com/products/assets/us_advair.pdf-)。最受欢迎的变体是多剂量DPI(″MDDPI″)系统，其使得能递送多于一个的治疗剂量。MDDPI装置可从多个公司获得，例如来自阿斯捷利康(AstraZeneca)的Plumicort Turbuhaler(例如，www.twistclickinhale.com/)、葛兰素威尔康(例如，www.us.gsk.com/products/assets/us_advair.pdf-)以及先灵保尔，例如，www.schering-plough.com/schering_plough/pc/allergy_respiratory.jsp)。进一步考虑可改变这类装置，或在此论述的任何其它装置用于单剂量施用。
电流体力学(Electrohydrodynamic)(EHD)气溶胶递送EHD气溶胶装置利用电能使液体药物溶液剂或混悬剂气雾化(参见例如Noakes等，美国专利No.4,765,539、Coffee，美国专利No.4,962,885、Coffee，PCT申请，WO 94/12285、Coffee，PCT申请，WO 94/14543、Coffee，PCT申请，WO 95/26234、Coffee，PCT申请，WO 95/26235、Coffee，PCT申请，WO 95/32807)。EHD气溶胶装置可比现有的肺部递送技术更有效地递送药物至肺部 雾化器雾化器通过利用，例如超声能形成可容易吸入的细微粒子，从液体药物制剂中产生气溶胶。雾化器的实例包括由Sheffield/Systemic Pulmonary Delivery Ltd.提供的装置(参见Armer等，美国专利No.5,954,047；van der Linden等，美国专利No.5,950,619；van der Linden等，美国专利No.5,970,974)、由阿凡斯提供的吸入雾化器方案(Intal nebulizer solution)(例如，www.fda.gov/medwatch/SAFETY/2004/feb_PI/Intal_Nebulizer_PI.pdf)。
为了通过吸入直接施用气体至肺部，可采用目前可从市场上获得的用于递送氧的多种递送方法。例如，可采用复苏器，例如急救袋(参见，美国专利Nos.5,988,162和4,790,327)。急救袋由连接至面罩的柔性的挤压袋组成，其由医师使用来将空气/气体引入进受害者肺中。
便携式的、手提式药物递送装置能够通过雾化器产生适合患有呼吸道疾病的患者吸入的雾化剂。此外，这种递送装置提供了一种手段，其中吸入剂的剂量可由医师或医生远程监测和根据需要来改变。参见美国专利No.7,013,894。本发明的化合物的递送可通过用于递送补充气体给人，结合监测人的换气的方法来完成，两者都未使用密封的面罩(例如在美国专利No.6,938,619中描述的)完成。在呼吸疗法过程中使用了用于有效分配氧或其它气体的气动氧保存装置，这样只有患者呼吸的最初一部分含有氧或其它治疗气体(参见美国专利No.6,484,721)。使用在患者开始吸入时启动的气体递送装置。将尾气流在初始的吸入定时期间后递送给患者，以防止气体脉冲递送至患者。以这种方式，气体仅在吸入的开始部分期间递送给患者，防止气体递送只会填充患者肺部的气道。通过有效地利用氧，在患者是流动的时候使用的圆柱瓶的氧将会持续更长时间，并且可以更小且更容易运送。通过气动式递送气体给患者，不用电池或电子设备。
在此描述的所有装置可具有排气系统来结合或中和本发明的化合物。
本发明化合物的经皮肤施用可通过固定在患者皮肤上的含药装置或药贴实现。药贴允许包含于药贴内的药用化合物通过皮肤层吸收并进入患者的血流中。这类药贴是可商业获得的，如来自GlaxoSmithkline的Nicoderm CQ药贴(www.nicodermcq.com/NicodermCQ.aspx)以及例如来自Ortho-McNeil Pharmaceuticals的Ortho Evra(www.ortho-mcneilpharmaceutical.com/healthinfo/womenshealth/products/orthoevra.html)。透皮药物递送减小了与药物注射和静脉内药物施用相关的疼痛，以及与这些技术相关的感染风险。透皮药物递送还避免了施用药物的胃肠道代谢，减小了肝脏对药物的消除，并提供了施用药物的持续释放。透皮药物递送也由于施用的相对容易性和药物的持续释放而增强了患者对用药法的顺应性。
药贴的其它改变形式包括超声药贴，其用材料设计而使得能传送超声通过药贴，实现了存储于药贴中的药物的递送，并可与超声药物递送方法结合使用(见美国专利No.6,908,448)。瓶中的药贴(美国专利No.6,958,154)包括一种流体组合物，例如在一些实施方案中的喷雾剂，其可作为流体施用至表面上，但随后干燥而在宿主的表面形成覆盖元件，例如药贴。如此形成的覆盖元件具有无粘性的外表面覆盖物和在下面的帮助药贴粘着在基质上的粘性表面。
另一种药物递送系统包含一个或多个球状半导体聚集体(aggregation)并促进储存在贮器中的药物的释放。第一个聚集体用于感知和记忆，而第二个聚集体用于控制方面，例如用于泵送和分配药物。该系统可以长期与远程控制系统通讯，或以本地动力独立地操作，用于基于患者的需求、在系统控制下定时释放，或依照测量标记的递送来递送药物。参见美国专利No.6,464,687。
泵和输注装置输注泵或灌注器(perfusor)将流体、药物或营养物输注入患者的循环系统中。输注泵可以非常可靠且便宜的方式施用流体。例如，它们每小时可施用少至0.1mL的注射液(对滴注来说太少)，每分钟注射液，患者要求的重复的一次性剂量注射，直到每小时的最大数量(例如在患者控制的镇痛中)，或其容量随一天的时间变化的流体。不同类型的输注装置已在美国专利和商标局受理的下面专利申请中有描述。这些包括但不限于美国专利No.7,029,455、美国专利No.6,805,693、美国专利No.6,800,096、美国专利No.6,764,472、美国专利No.6,742,992、美国专利No.6,589,229、美国专利No.6,626,329、美国专利No.6,355,019、美国专利No.6,328,712、美国专利No.6,213,738、美国专利No.6,213,723、美国专利No.6,195,887、美国专利No.6,123,524和美国专利No.7,022,107。此外，输注泵还可从Baxter International公司(www.baxter.com/products/medication_management/infusion_pumps/)、Alaris Medical Systems(www.alarismed.com/products/infusion.shtml)以及从B BraunMedical公司(www.bbraunusa.com/index.cfm？uuid＝001AA837D0B759A1E34666434FF604ED)获得。
氧/气体一次性剂量递送(bolus delivery)装置这种用于递送气体给慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的装置可从Tyco Healthcare(www.tycohealth-ece.com/files/d0004/ty_zt7ph2.pdf)获得。它也可用于递送本发明的化合物。上述装置是成本有效的、重量轻的、不显眼的和可携带的。
瓶中的药贴(美国专利No.6,958,154)包括一种流体组合物，例如在一些实施方案中的喷雾剂，其可作为流体施加至表面，但随后干燥而在宿主的表面形成覆盖元件，例如药贴。如此形成的覆盖元件具有无粘性的外表面覆盖物和在下面的帮助药贴粘着在基质上的粘性表面。
可植入的药物递送系统另一种药物递送系统包含一个或多个球状半导体集合体并促进储存在贮器中的药物的释放。第一个聚集体用于感知和记忆，而第二个聚集体用于控制方面，例如用于泵送和分配药物。该系统可以长期与远程控制系统通讯，或以本地动力独立地操作，用于基于患者的需求、在系统控制下定时释放，或依照测量标记递送来递送药物。参见美国专利No.6,464,687。
在该部分中讨论的每个引用的专利和网址的内容在此通过引入作为参考。
VIII.联合治疗 本发明的化合物和方法可用于许多治疗和诊断应用领域。为了增加用本发明的组分(例如氧拮抗剂或其它活性化合物)治疗的有效性，将这些组分与在治疗那些疾病和病症中有效的其它药剂(第二治疗)组合是理想的。例如，治疗中风(抗中风治疗)通常包括抗血小板剂(阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫、噻氯匹啶)、抗凝血剂(肝素、华法林)或血栓溶解剂(组织纤维蛋白溶酶原激活剂)。
可采用不同的组合，例如活性化合物如H2S是“A”而第二治疗是“B”。
A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/B B/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/A B/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A 施用本发明的氧拮抗剂和/或其它活性化合物给生物物质将会按照用于施用那些特殊的第二治疗的一般方案，若有毒性，则考虑氧拮抗剂(或其它活性化合物)治疗的毒性。预期将根据需重复治疗周期。还考虑，可将多种标准的疗法，以及外科手术干预与所描述的疗法联合应用。
IX.实施例 包括下列实施例用以说明本发明的优选实施方案。本领域的那些技术人员应该理解，在接下来的实施例中公开的技术代表由本发明者发现的技术在本发明实践中很好的发挥作用，并因此可认为构成了用于其实践的优选方式。然而，本领域的那些技术人员根据本公开内容应该理解，在所公开的特殊实施方案中可进行许多改变并且其仍然获得类似或相似的结果而不会背离本发明的精神和范围。实施例1 线虫在一氧化碳中的保藏 大气含有210,000ppm的氧气。暴露于低水平的氧，或低氧中导致人的细胞损害和死亡。在线虫(秀丽隐杆线虫)中，在100ppm和1000ppm之间的氧浓度也是致命的。通过严格地研究线虫对一系列的氧张力的反应，发现低于10ppm和高于5000ppm的氧浓度是不会致命的。在用氮气平衡的10ppm氧气中，线虫进入可逆的滞生状态，其中在光学显微镜下可观察到生存状态的所有方面都停止(Padilla等，2002)。在5000ppm(用氮气平衡)和更高的氧浓度中，线虫正常地进展通过它们的生活周期。在寻找保护线虫免受低氧性损害的药物中，试验了一氧化碳。
为了获得特定的气氛条件，使用了下列装置尖端具有锁紧装置(locking device)例如LUER-LOK的玻璃注射器管，注射器管的大的开口用定制的钢(custom-machined steel)和橡胶配件密封产生气密性密封，将该注射器管通过锁紧装置锁至环境室的进气口上，所述的环境室具有一个进气口和一个出气口，每个口装有锁紧装置例如LUER-LOK配件。将确定的气体通过首先让气体从压缩罐(ByrneSpecialty Gas，Seattle，WA)内排出通过充满双蒸馏水的洗气瓶(500ml Kimex)来增湿并提供给环境室。洗气瓶经过一个气体流量计与环境室连接。气体流量计用于在整个24小时孵育期间提供调节的70cc/分钟的流量通过人工环境室。
为了检测诱导的、可逆的停滞是否能在秀丽隐杆线虫中实现，收集2-细胞秀丽隐杆线虫胚、L3幼虫或成体线虫并将其在室温下暴露于有效的100％CO环境中、100％N2环境中、含有用一氧化碳平衡的500ppm氧气的环境中，或暴露于含有用氮气平衡的100、500或1000ppm氧气的环境中。将线虫用微分干涉相差显微镜观察术(也称为Nomarski光学器件)显像。采集图像并用NIH image和AdobePhotoshop 5.5分析。胚长约50μm。
这些试验的结果显示，100％一氧化碳是不致命的且诱导了可逆的滞生。线虫不能幸存于用氮气平衡的500ppm氧气中，可是，用一氧化碳平衡的500ppm氧气处理的那些线虫进入了滞生并得以存活。参见下文 实施例2 人皮肤在一氧化碳中的保藏 一氧化碳是对人是非常有毒的，因为其强烈地与氧气竞争结合至血红蛋白，血红蛋白是分配氧至组织的主要分子。无血红蛋白的线虫对一氧化碳有抵抗力并且甚至也通过该药物防止低氧损害，这个事实提示了这样的可能性一氧化碳将在其中不存在血液的情况中的人组织中，例如在组织移植物或无血的外科手术区，防止低氧损害。为了检验这种假设，使用了人皮肤。
获取三块人包皮用于该目的。将包皮组织保存于含有胰岛素、EGF(0.1ng/ml)、氢化可的松(0.5mg/ml)和牛垂体萃取物(约50微克/ml蛋白质)的角质形成细胞生长培养基(KGM)中。将包皮在PBS中漂洗，并去除过量的脂肪组织。将每块包皮样品分成2等块。将每块置于分开的容器中，所述容器装有具有24mg/ml分散酶II(来自Bacillus Polymyxa EC 3.4.24.4Roche Diagnostics Corp.，Indianapolis，IN)的PBS溶液。将一个容器(装有在含有分散酶II的PBS中的包皮块)置于通风橱中的一个潮湿的室内。将另一个容器(具有在含有分散酶II的PBS中的另一半包皮块)置于相同通风橱中的充满湿润的100％CO的环境室内。这两个样品都在室温下维持24小时。用于建立确定的气氛条件的方法与实施例1中使用的那些一致。
在暴露于常氧(normoxia)或100％CO中24小时后，按照Boyce等(1983；1985；每个在这里通过全文引入作为参考)描述的方法从包皮中分离出角质形成细胞。简而言之，将来自每块包皮样品的表皮移到含有PBS的新鲜器皿中。将表皮在室温下于3ml 0.05％胰蛋白酶、1mM EDTA中孵育5分钟之前切碎和均化，以使基底细胞与表皮分离。孵育后，加入6ml 400μg/ml(微克/ml)的大豆胰蛋白酶抑制剂、1mg/ml的BSA，并将样品以900RPM离心。弃去每个样品的上清液并将样品沉淀颗粒再悬浮于10ml的KGM中。将每个样品分入两个10cm的平板中，每个平板含有5ml KGM和100μl的HEPES pH 7.3(N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸)。将平板在37℃的充满95％室内空气、5％二氧化碳的恒温箱中孵育5天。
采用倒置相差显微镜肉眼检查细胞。暴露于常氧中的所有三个角质形成细胞群显示很小生长或未生长。暴露于100％CO中的所有三个角质形成细胞群显示显著生长。量化三块包皮中的两块的活角质形成细胞数的定量(通过集落形成判断)。见图1。 表1-集落形成的定量 实施例3 用线虫进一步保藏试验 下面实施例含有的信息重叠和扩充了实施例1中公开的信息。
A.材料和方法 环境室和装置。缺氧试验用由W.Van Voorhies设计的定制气氛室(Van Voorhies等，2000)进行。该室是一个安装有定制的钢塞子的30mL玻璃注射器(Fisher#14-825-10B)，所述钢塞衬套有两个合成橡胶(viton)o型环以确保密封。该钢塞是钻通的，并在外部面上具有一个钢引诱锁(lure lock)，以便能连接上运载压缩气体的软管。确定的气体混合物以恒定的压力和流速从压缩罐递送至该室中，气体首先通过旋转流量计(Aalborg，流量管号032-41ST)或质流控制器(Sierra Instruments#810)以监测流速，然后通过装有250ml水的500ml洗气瓶(Fisher#K28220-5001)以使气体水合。采用1/4”OD尼龙(Cole-Parmer#P-06489-06)或FEP(Cole-Parmer#A-06450-05)管，并且管和调节器之间以及管和旋转流量计之间的连接用黄铜John-Guest-型接头(Byrne Gas)实现。所有的其它连接用微流快速连接接头(Cole-Parmer#A-06363-57，#A-06363-52)或标准的引诱接头(Cole-Parmer#A-06359-37，#A-06359-17)完成。
线虫在低氧下的存活力。将Bristol株N2持续维持在20℃下，注意确保该群体不会饿死。选择对数期的成体秀丽隐杆线虫放入玻璃平板上的一滴含有100μg/ml氨苄西林、15μg/ml四环素和200μg/ml链霉素的无菌水中。将成体用保险刀片剁碎并用细口吸量管(mouthpipet)拣选2-细胞胚胎。将30-60个2-细胞胚胎转移至填充3ml M9中的1％琼脂糖的小型玻璃舟皿(定制以适合气氛室，Avalon GlassWorks，Seattle WA)中。随后将该玻璃舟皿置于潮湿的室中2小时以使胚胎成熟，然后置于环境室中。将环境室在室温下以70cc/分钟持续灌注纯的N2(等级为4.5)、100ppm O2/N2、500ppm O2/N2、1000ppm O2/N2或5000ppm O2/N224小时。在暴露后，将含有胚胎的琼脂糖块从舟皿中切出，并让胚胎面朝上置于用大肠杆菌(OP50)接种的中等大小的NGM平板上。在暴露后将胚胎评估孵化24小时，并将孵化的L1’s转移至NGM平板的表面，并随后进入成年期。将不能解释的动物从总体中除去。所有气体由Byrne Gas(Seattle，WA)提供。保证纯N2含有少于10ppm的杂质，并证明所有O2/N2混合物为±2％的氧气含量(例如，证明100ppm的O2/N2含有98ppm和102ppm之间的O2)。百万分之份数与kPa转化是基于在1个大气压下一百万份＝101kPa。
线虫在基于一氧化碳的气氛中的存活力。从如上描述的持续维持的Bristol N2和hif-2(ia04)株收获30-60个胚胎。将环境室在室温下以70cc/分钟持续灌注纯的CO(CP级)或500ppm O2/CO 24小时。为了达到2500ppm O2/CO或2500ppm O2/N2，将5000ppm O2/N2以1∶1的比例与纯的CO或与纯的N2混合，用两个质流控制器(SierraInstruments 810)来精确监测流量。在整个24小时的暴露过程中，将每种气体以50cc/分钟递入三通阀(Cole-Parmer#A-30600-23)，然后将得到的混合物通过洗气瓶并进入环境室中。所有气体由ByrneGas(Seattle，WA)提供。证明500ppm O2/CO混合物为±2％的氧含量并含有7000ppm N2以确保在压缩罐的使用过程中为一致的O2/CO比例。
细胞生物学分析。为了测定在基于氮气的气氛中的发育进展的程度(表2)，让2-细胞胚胎暴露于如上描述的多种程度的低氧，并立即拍照，或在潮湿的室中的12小时恢复阶段后拍照。为了测定胚胎是否在基于一氧化碳的气氛中停止，将2-细胞胚胎在室内空气中成熟2小时，并立即拍照或将其置于100％一氧化碳或0.05kPa O2/CO中24小时并在暴露后立即拍照。在所有情形中，通过将胚胎置于薄的1％琼脂糖垫上的盖玻片下并在Zeiss axioscope上观察来进行DIC显微镜检查。然后用RS Image和Adobe Photoshop软件获取照片。
B.结果 以前已报道HIF-1是在轻度低氧(0.5kPa O2(Padilla等，2002)和1kPa O2(Jiang等，2001))中的秀丽隐杆线虫中所需的，并且已知滞生在缺氧(＞0.001kPa O2)中是可能的(Padilla等，2002)。为了精确地确定这些反应每种活跃的范围，在暴露于轻度低氧和缺氧之间的多种氧张力24小时后测定野生型秀丽隐杆线虫胚胎的存活力。暴露于缺氧的胚胎进入了如以前报道的滞生，并从而在暴露中幸存，具有高的存活力。在0.5kPa O2中的胚胎在整个暴露过程中保持生机，并也得以幸存，具有高的存活力。然而，暴露于轻度低氧和缺氧之间的中间范围的氧张力(0.1kPa O2至0.01kPa O2)的胚胎令人惊讶地是未得以幸存(图2)。
胚胎在暴露于这种中等范围的低氧过程中没有孵化，表明它们没有成功地完成HIF-1介导的反应。为了确定它们是否出现停滞，检测了在该中间范围内胚胎是否在暴露过程中停止了胚形成。在致死性氧张力中的胚胎没有停止胚形成，并且氧气量增加与胚胎的发育进展程度增加相关(表2)。再氧合后，这些胚胎大多数未能孵化并且孵化了的那些胚胎中许多作为异常的L1s停止。这些数据显示，这种中间范围的低氧是一种独特的应激，其中氧水平既不足够高来促进持续的活力也不足够低来诱导滞生。
基于这些发现，假定如果一氧化碳(一种氧结合的竞争性抑制剂)能够在存在低水平氧时诱导滞生，则它将会提供保护对抗这种致死范围的低氧。为了检验这种可能性，首先测定了秀丽隐杆线虫胚胎在多种浓度的一氧化碳中的存活力。尽管高水平的一氧化碳在一些系统中可以具有毒性作用，人们发现秀丽隐杆线虫胚胎显著地耐受广范围的一氧化碳张力。实际上，秀丽隐杆线虫胚胎可经受住持续暴露于101kPa CO(100％CO)中24小时还具有高的存活力(81.5％的幸存到成年期，图3。)值得注意的是，在101kPa CO中，胚胎在暴露过程中没有进展通过胚形成，表明它们进入了滞生。为了检验一氧化碳是否能在存在致死性氧张力时保护胚胎，测定了暴露于用一氧化碳平衡的0.05kPa O2中的胚胎的存活力。与暴露于用N2平衡的0.05kPa O2中的胚胎(其中大多数未存活)比较，这些胚胎以96.2％的存活力恢复到成年期(图3)。而且，类似于用101kPa CO处理的胚胎，用一氧化碳平衡的0.05kPa O2中的胚胎停止了胚形成，表明它们进入了滞生。因此，一氧化碳可通过诱导滞生来在存在致死性氧张力时保护免受低氧损害。
为了进一步研究可通过过量一氧化碳保护的氧张力范围，将缺乏HIF-1功能的胚胎(hif-1(ia04)株)用于解决免受低氧损害的保护在轻度低氧中是否也是可能的。在检测用氮气平衡的0.1kPa O2和1kPaO2之间的多种氧张力后，发现对HIF-1的最大需求是在下地用氮气平衡的0.25kPa O2中。在该气氛下，野生型胚胎正常进展完成了发育并显示出高的存活力，但hif-1(ia04)胚胎未能完成胚形成并显示100％的致死率(表3)。因此，检验了一氧化碳是否能保护0.25kPa O2中的hif-1(ia04)胚胎。在用一氧化碳平衡的0.25kPa O2中，野生型和hif-1(ia04)胚胎进入了滞生并在该暴露中以高的存活力幸存(分别为78.7％和84.0％幸存到成年期)(表3)。因此，通过一氧化碳诱导滞生在高达0.25kPa O2的氧张力时是可能的，并且甚至在缺乏HIF-1功能时一氧化碳也能保护对抗轻度低氧。表2-低氧中发育进展的定量 将野生型2-细胞胚胎置于多种程度的低氧中24小时，并对它们发展完成胚形成的程度打分。暴露于含有增加量的氧气的气氛中导致进展完成胚形成的增加。测定了在给定的20-40分钟范围内胚形成中停止的胚胎的百分数。数据是3个独立试验的结果。表3-一氧化碳保护hif-1胚胎对抗轻度低氧 在野生型和hif-1(ia04)胚胎中，在暴露于24小时的0.25kPa O2/N2或0.25kPa O2/CO后检测了到达成年期的存活力。所有数据点都是至少3个独立试验的结果并将不能解释的蠕虫从总体中除去。
线虫响应低体温的存活力。
线虫的存活力也是温度敏感性的，在暴露于低温(4℃；图15)24小时后群体100％死亡。然而，如果线虫在温度降低之前通过平衡进入缺氧状况(＜10ppm氧)下1小时来诱导停滞，则大比例的线虫在暴露于4℃下24小时后幸存(图15)。在该实验中，线虫在低体温期间保持停滞，并在它们已恢复到室温后保持停滞1小时。无氧条件(纯N2)、生长状况和存活力测量在下面描述。实施例4小鼠中核心体温和呼吸的降低 A.材料和方法 遥测装置的植入。根据厂商提供的标准方法，给雌性C57BL/6J小鼠(Jackson Laboratories-Bar Harbor，Maine)植入遥测装置(PDT-4000HR E-Mitter-MiniMitter Inc.-Bend，OR)。让小鼠恢复数周以使得体温和心率信号稳定。小鼠的核心体温、心率和运动由遥测装置持续监测并用VitalView软件(由MiniMitter提供)记录。环境温度用HOBO(Onset Computer Corp.-Pocasset，MA)监测，并且数据用BoxCar软件(由Onset Computer Corp.提供)分析。
小鼠暴露于受调节的气氛下。将每只小鼠暴露于1L/分钟的(a)含500ppm H2S平衡的氮气(Byrne Specialty Gas-Seattle，Washington)与室内空气混合(使用来自Aalborg-Orangeburg，NewYork的3通道气体分配(proportioner)计)而达到终浓度为80ppm的H2S和17％的O2的气氛，或(b)氮气与室内空气混合而达到终浓度为17％的O2的气氛。H2S和O2的测量用Innova GasTech GT系列的手提式气体监测器(Thermo Gas Tech-Newark，California)进行。
在暴露于受调节的和未受调节的气氛中试验之前和该过程中，将小鼠置于包含一个玻璃笼(具有饮用水，没有食物)的充气室内，所述玻璃笼安装有来自Cole-Parmer(Vernon Hills，Illinois)的FEP管的输入管和输出管，用于导入和排出气氛。用Dow Corning硅酮真空油酯(Sigma-St.Louis，Missouri.)将该笼用盖密封。来自每个笼的气体通过排出管排出进入化学通风橱。为了确保该系统是气密性的，将GasTech GT手提式监测器用于检测泄漏。
呼吸测量法。在一些实验中，氧的消耗通过使用按照厂商说明书使用的PA-10a O2分析器(Sable Systems)测量。类似地，动物产生的二氧化碳采用按照厂商说明书使用的LI-7000 CO2/H2O分析器(Li-Cor公司)监测。将这些设备放置与环境室放置在一条直线上，这样它们从气体输入管和输出管中取样检验。
环境温度的调节。将小鼠在Shel Lab低温按昼夜进行光照的恒温箱(Sheldon Manufacturing公司-Cornelius，Oregon)中圈养，为小鼠调节温度和光周期(8AM开灯，8PM关灯)。将小鼠暴露于如上描述的受调节的气氛中。当小鼠暴露于受调节的气氛中时，将恒温箱内部温度降低至期望的温度，例如至10℃或15℃。将小鼠维持在受调节的气氛中并处于降低的温度下6小时。将充气室中的气氛替换成室内空气，并让小鼠回到正常的室温(22℃)并让其恢复。
B.结果 基线数据。为了测定小鼠对亚致死剂量的硫化氢的反应，本发明者首先通过在一周期间记录来自恒温箱中的四只植入有无线电收发机的小鼠的数据来确定核心温度、心率和运动的基线，所述恒温箱保持在环境温度下并充满室内空气。基线数据证明，小鼠具有昼夜节律，活动高峰在灯刚熄灭后的晚间，以及在灯刚亮之前的清晨。核心温度从它们活动期间高的37℃到它们不活动期间低的33.5℃之间变化。心率从它们活动期间的750bpm(每分钟搏动)到它们不活动期间的250bpm之间变化。心率可能与核心温度相关联(温度更高则心率更高)。同样，总的运动活动在晚间和黎明前不久最高。
小鼠暴露于室温下的受调节的气氛。将小鼠暴露于硫化氢的第一次试验包括首先将小鼠置于恒温箱中保持于27℃下的充气室内1小时。1小时后，将该室充满如上一般性描述的80ppm，并将恒温箱的温度在实验过程中降低至18℃。虽然没有检测到心率和总的运动活动的立即改变，但观察到核心温度显著降低。让实验进行90分钟，在这段时间内，核心温度降低至28.6℃-比在上面描述的基线研究中记录的四只小鼠的任意一只的最低温度低5度。在该室充满室内空气后的恢复期间，本发明者注意到，动物最初是相对不动的(容易捕捉)；然而在60分钟内，它已恢复到正常范围的核心温度和活动。将第二只小鼠暴露于相同的试验方案中；然而这一次80ppm的充气操作3小时。在这段时间内，本发明者注意到，心率明显地从600bpm降低为250bpm，总的运动活动显示为几乎无活动，并且核心温度降到18.6℃。
呼吸变化伴随核心温度降低。将小鼠暴露于80ppm H2S也导致代谢率降低，代谢率是通过测量氧消耗和二氧化碳产生测定的。例如，已同时测量了核心温度和二氧化碳产生的小鼠证明，二氧化碳产生的迅速减少先于动物的核心温度降低(图4A)。二氧化碳产生减少大约3倍在暴露于H2S后约5分钟确定了一个新的基线。
表4显示了来自同时测量暴露于室内空气下的小鼠的O2和CO2浓度的实验的结果，所述室内空气中的CO2已被净化(因此对照为0值)，含有或不含H2S(80ppm)。该测量在15分钟的期间进行，小鼠处于0.5L密封的环境室中，气氛流速为500cc/分钟。氧的消耗通过用当小鼠不存在时的对照中减去当小鼠存在时的氧浓度获得。同样，二氧化碳的产生通过用当小鼠不存在时的对照中减去当小鼠存在时的二氧化碳浓度获得。RQ代表呼吸商，并且等于产生的二氧化碳和产生的氧的比率。该结果证明，在存在H2S的情况下氧消耗降低2-3倍，以及二氧化碳的产生也降低3-4倍。呼吸商的变化反映了在存在或没有H2S的情况下，小鼠的氧消耗和二氧化碳产生的不同。
表4-H2S暴露抑制了小鼠的呼吸 停滞的不同参数(氧消耗减少、二氧化碳产生减少或活动性减少)可通过多种多样的测定法和技术评价。例如，测量施用了H2S的小鼠中诱导停滞的可能最容易的方法是通过观察它们的呼吸。的确，这包含了所有三个参数，因为其表示了减少的氧消耗、二氧化碳产生和活动性。在标准条件下的室内空气中的正常小鼠将会每分钟约呼吸200次。如果施用了80ppm的H2S给小鼠，并将核心温度降低至15℃，则呼吸降低至少每分钟约1-10次呼吸之间的数量级。实际上，在这些条件下观察到小鼠在长于1小时的时期内没有呼吸，表明深水平的停滞是可达到的。因此，这代表了细胞呼吸(即，氧消耗和二氧化碳产生)至少约1-20倍的减少。
小鼠在降低的环境温度下暴露于受调节的气氛中。为了开始确定硫化氢减少小鼠活动的能力的极限，本发明者进行了几个试验，试验中使用无遥测装置的小鼠，之后通过暴露携带遥测装置的小鼠来获得数据。第一个试验是让无遥测装置的小鼠在10℃的降低的箱内温度下接受80ppm H2S的受调节的气氛，基本上是如上文在材料和方法中描述的，除了在暴露于气体和降低环境温度之前将小鼠于27℃下置于充气室中1小时以外。无遥测装置的小鼠在该处理中表现良好，并在从充气室移出后约90分钟内恢复活动。接受相同条件的有遥测装置的小鼠也表现良好，并显示减少核心温度至约12.5℃。本发明者不能准确测定该温度，因为该电子设备在15.3℃时不工作。因此，温度降至12.5℃是基于不工作之前的下降斜率和在电子设备不工作后动物呆在室内的时间的估计值。
由于仪器的限制，本发明者接下来基本上如上描述的，在具有含有约80ppm硫化氢的受调节的气氛，或具有室内空气的充气室中，检测了4只具有遥测装置的小鼠每只6小时。恒温箱的温度在试验起始时(暴露于受调节的气氛中，或小鼠暴露于室内空气的时间0时)减少至恒定的15℃。在6小时的周期结尾时，如上文中一般性描述的，将小鼠恢复至室内空气的气氛和22℃的环境温度。在依赖于利用80ppm硫化氢的所有4只小鼠中核心体温明显下降(图4B)。也存在与体温降低相关的心率和总的运动活动的明显降低。将小鼠供养4周，动物的行为没有明显的改变。实施例5 关于减少辐射损伤的鼠研究 A.科学基本原理 虽然辐射损伤模型方面可以并已经在细胞培养物中得以评价，但检测试验药物影响损伤和愈合过程的能力需要包括受影响的所有反应系统。在目前，实现它的唯一途径是在完整动物中。本发明者提出将小鼠用于这种研究作为最合适的模型。已选择C57BL/6小鼠用于研究，因为这种品系的小鼠容易对辐射肺部损伤敏感，该品系耐受的辐射水平已确定，并且本发明者近来已显示H2S降低了该小鼠品系的核心温度。
按照该方案设计了两个一致的试验。每个试验将会研究H2S-诱导的低体温对辐射诱发的肺部损伤的发展的效力。每组10只小鼠将会暴露于四个实验条件(H2S/17.5Gy胸部照射、H2S/无胸部照射、无H2S/17.5Gy胸部照射，或者无H2S/无胸部照射)之一，然后持续13周。每组12只动物将会类似地暴露并持续26周(增加的n是抵偿在病程后期出现的死亡率增加所需的。) 对于这些试验，方差分析(ANOVA)将会用作用于数据分析的统计模型。4组完全交叉和随机化的二因素ANOVA(接受H2S或没有接受H2S的受照射小鼠或未受照射的小鼠)和两个时间间隔(13或26周)将会用于分析支气管肺泡灌洗炎症细胞数和总的蛋白质浓度以及肺的羟脯氨酸水平的暂时性变化。假定80％的检验效能、5％的显著性和双尾检验，每个损伤组、干预组和时间点的组合的5只存活小鼠将允许组平均值之间的可检测差异大于或等于潜在的组内标准差的1.7倍。预期组内标准差等于约25％。因此，在这些试验中对照值的35-50％炎症细胞数或肺部胶原含量的改变应该是可辨别的。
H2S的暴露和胸部照射将在线性加速器装置中的SLU AHR中进行。在尸体剖检时支气管肺泡灌洗和肺的获得将会在AHR小鼠尸体剖检室中进行。支气管肺泡灌洗细胞计数和蛋白质浓度以及肺的羟脯氨酸含量的测量将会在另一个实验室(D3-255)中进行。野生基因型C57BL/6小鼠将会接受17.5Gy的胸部照射。小鼠将用阿佛丁(Avertin)腹膜内麻醉，将其置于单独的布质小鼠约束装置(restrains)中，并通过线性加速器以3Gy/分钟的剂量率用8.5Gy照射通过经校准仅靶向胸部的两个侧面区域(总的胸部剂量为17.5Gy)。
B.方案 麻醉。野生基因型C57BL/6小鼠将会因气管内施用异氟烷而麻醉。麻醉深度将通过对触觉刺激的反应的呼吸速率监测。阿佛丁的腹膜内注射(0.4-0.7ml/小鼠i.p.)将用于麻醉用于胸部照射步骤的动物。麻醉深度将通过呼吸速率和对触觉刺激的反应监测。
暴露于硫化氢。将小鼠置于与先前用于小鼠的充气室类似的密封的有机玻璃充气室(IR1606)中。该室将具有两个口(输入口和输出口)。将含有用室内空气平衡的H2S(80ppm)的气体以每分钟1升的速率通入该室内。采用具有从输出通风口延伸到房间的排气通风口的软管的室内通风系统将气体从室内排出。
危险试剂的施用。用线性加速器，以17.5戈瑞的总剂量在小鼠处于充气室内时照射小鼠。该照射剂量将会在小鼠中诱导亚急性肺部损伤，其进展成纤维变性。小鼠不会是放射性的，否则会使工作人员或其它动物遭受损伤。由于该照射，不需要特殊监测、抑制或处理。
预定的安乐死。在胸部照射后约13和26周后，让动物通过深度麻醉(采用阿佛丁0.4-0.7ml i.p.)安乐死，之后通过下腔静脉刺破放血。实施支气管肺泡灌洗用于测定炎症细胞数、分类计数和洗出液蛋白质浓度。移出肺和食道组织用于组织学评价和胶原含量分析。
垂死的动物。胸部照射与小鼠的有限死亡率相关，15％的小鼠在照射后10周死亡而50％的小鼠在照射后22周死亡。研究者将每天监测动物的不良作用(起初每天2-3次，直到它们表现稳定，然后每天一次直到疾病开始进展，在该时间点发明者将会恢复到每天观察多次)。如果动物体重减轻、不再整饰、表现出严重的呼吸性窘迫，和/或笨拙的或明显减少的活动，则将它用阿佛丁过量进行安乐死。当实践时，将会对这些不定期安乐死的动物实施支气管肺泡灌洗和组织收集用于组织学。
胸部照射应该会产生肺部损伤，其本身是不疼痛的但其本身可表现为呼吸速率增加、轻度食欲丧失、轻度体重减轻和/或不再整饰(第10周)。研究者和动物设施工作人员将每天监测动物的这种不良作用。如果动物看起来不摄食，则会提供柔软的食物和流体支持。如果察觉到动物处于疼痛中，则根据需要施用布托啡诺(0.2mg/kg i.p.)或丁丙诺啡(1.0mg/kg bid s.q.)止痛。如果动物表现出痛苦并且治标性措施没有导致改善，则立即使其安乐死。在预定的尸体剖检时收集肺和食道组织用于组织病理学评价和胶原含量分析。
照射后的管理。为了使转播任何病原体给所述设施的其余部分的风险最小化，并且为了在它们某种程度上无免疫应答时保护这些动物，对这些动物的所有管理工作每天将会最先进行(在实验室中的任何其它动物之前)并将会在生物安全室中进行。为了使外来感染的风险最小化，小鼠将使用高压消毒的笼子和床具。而且，它们将喂养已经经照射杀死病原体的标准啮齿动物食物。
野生基因型C57BL/6小鼠将会接受17.5Gy的胸部照射。小鼠将通过腹膜内使用阿佛丁麻醉，置于独立的布质小鼠约束装置中并移进与先前用于小鼠的充气室类似的密封的有机玻璃充气室(IR1606)中。该室将具有两个口(输入口和输出口)。将含有用室内空气平衡的H2S(80ppm)的气体以每分钟1升的速率通入该室内。采用具有从输出通风口延伸到房间的排气通风口的软管的室内通风系统将气体从室内排出。一旦进入充气室，通过线性加速器以3Gy/分钟的剂量速率用8.5Gy照射小鼠通过经校准仅靶向胸部的两个侧面区域(总的胸部放射剂量为17.5Gy)。在完成胸部照射后，将动物放回它们受监测的微隔离笼中直到从麻醉状态中恢复。
预定的尸体剖检。在照射后第13周将对一组动物进行尸体剖检，以评估损伤的炎性阶段。在第26周将对第二组动物进行安乐死，以评估损伤的纤维变性阶段。将动物用阿佛丁麻醉，然后放血。将肺用1000μl PBS灌洗并将洗出液保持在冰上用于总细胞计数和分类细胞计数。然后采集右肺用于羟脯氨酸含量分析，并将左肺在25-30cm压力下通过气管灌注10％的NBF。将食道、气管、左肺和心脏浸入10％的NBF中并送到FHCRC组织学共享资源实验室(FHCRC)用于加工和病理学评价。
胸部照射应该会产生肺部损伤，其本身是不疼痛的但本身可表现为呼吸速率增加、轻度食欲丧失、轻度体重减轻和/或不再整饰(第10周)。研究者和动物设施工作人员将每天监测动物的这种不良作用。如果动物看起来不摄食，则会提供柔软的食物和流体支持。如果察觉到动物处于疼痛中，则根据需要施用布托啡诺(0.2mg/kg i.p.)或丁丙诺啡(1.0mg/kg bid s.q.)止痛。如果动物表现出痛苦并且治标性措施没有导致改善，则立即通过CO2窒息使其安乐死。
主要的问题可能是食道炎(导致食物和水的摄取减少)和呼吸功能不全(减少氧摄取)。本发明者将会每天检查这些动物2-3次直到确信它们是稳定的且表现良好，在这时本发明者可降低检查频率至每天一次，直到疾病开始进展，在该时间点恢复到每天检查多次。支持性护理将以多种方式提供。如果动物动物不能很好地摄食或饮水(表现为体重减轻和理毛行为问题)，本发明者将会提供柔软的食物并试用流体补充物(乳酸林格氏溶液，1-2ml/小鼠，采用小孔针(＞20G)皮下注射，每天1-2次)。如果察觉到动物处于疼痛中，则根据需要施用布托啡诺(0.2mg/kg i.p.)或丁丙诺啡(1.0mg/kg bid s.q.)止痛。如果动物表现出痛苦并且治标性措施没有导致改善，则立即通过CO2窒息使其安乐死。如果动物在胸部照射时经历显著疼痛或痛苦，将通过CO2窒息使动物安乐死。
第三个实验是基本上如上描述的，让有遥测装置的小鼠在10.5℃的降低的室内温度下遭受80ppm H2S的受调节的气氛。在该实验过程中，用肉眼观察小鼠并通过网络摄像机纪录它的活动，并如上描述的纪录遥测测量结果。将小鼠暴露于80ppm H2S的受调节的气氛中，并将室内的温度降低至恒定的10.5℃。在约6小时的周期结尾时，通过将室内温度设定为25℃来给室内施加热量。让小鼠在受调节的H2S气氛中升温直到小鼠的核心温度处于17℃和18℃之间，在该时间点后，将受调节的气氛替换成室内空气。在受调节的气氛中小鼠的核心体温明显降低至10.5℃，伴随总的运动活动明显降低。呼吸率降低至通过肉眼观察不可检测到的速率约1小时15分钟。在室升温后，在小鼠的核心体温达到14℃时观察到弱的呼吸。在升温阶段，当核心体温升高至17℃和18℃之间，并且小鼠显示有呼吸和活动时，将受调节的气氛替换成室内空气。正常的活动和呼吸在核心体温恢复到25℃时完全明显。与未经处理的动物比较，小鼠没有显示出行为上的明显变化。
实施例6 细胞和哺乳动物研究 A.犬科动物研究 犬科动物研究将用狗进行，所述的狗经手术植入了遥测装置以监测它们的核心体温。将在存在或缺少亚致死剂量的硫化氢时研究动物10小时。在该期间，将通过遥测技术持续监测它们的生命体征。环境温度也将降低至15℃30分钟，用以确定这对动物的核心体温是否具有任何影响。
该程序将用2组狗，每组2只(总共4只)进行。由于遥测装置的花费，本发明者将连续地进行这些试验。如果来自第一组的结果表明假设是错误的，则将用第二组的两只狗重复该研究。如果来自第二组的结果不支持假设，则将放弃该项目。
毒理学研究表明，当H2S水平高于人的OSHA极限(10ppm)时，以前已证明，大鼠和小鼠在90天内每天6小时、每周5天暴露于80ppm的H2S中显示未观察到不利作用。这包括在处理结束时对肠、肺、心、肝、肾或其它器官进行肉眼检查和组织病理学检查。根据本发明者的知识，没有有关将狗暴露于硫化氢中的信息可利用。
用H2S操作的关键问题是不要超过已公开了关于将啮齿类动物暴露于硫化氢中并未发现有害作用的研究的其它人所描述的剂量(80ppm)。在气体科学中存在相当多的经验可以利用，并且本发明者能够递送处方剂量的气体给小鼠。采取了许多预防措施用以确保动物和研究人员都不会受到伤害。这些预防措施包括持续监测气体混合物，警报设置为OSHA极限并且灵敏度为1ppm，以及能够按照说明书混合和递送气体而不会泄漏进或出系统的多种装置。
该方案的时间线在表5中给出。表5-试验的时间线 B.人的血小板 为了检验使用氧化磷酸化抑制剂可用于使人受益这一想法，本发明者在人组织中诱导滞生状态以保护它们免于致死性暴露于氧。在中试试验中，本发明者将人皮肤置于100％的CO环境中。本发明者观察到，24小时后在CO中的皮肤细胞的存活比室内空气中的那些皮肤细胞好100倍。这些结果是非常令人兴奋的它们证明了氧化磷酸化抑制剂可能在人组织中有效。
另一组试验证明了诱导滞生对血小板的保护效应。将一单位的血小板分成两半。将第一半保存于标准储藏条件下，标准储藏条件包括将血小板恒定摇动地保存在室温下(22-25℃)。将另一半置于用标准方法除去了氧的缺氧环境(＜10ppm氧气)中。在第0天、第5天和第8天比较这两组血小板。在一组5个不同的体外检测中，在无氧条件下保存的血小板表现与标准条件下保存的那些一样好或更好，所述的表现包括集聚能力、细胞形态学、膜联蛋白-V染色(磷脂酰丝氨酸翻转至外膜上作为早期细胞调亡标记)等。这表明，控制代谢活动，特别是氧化磷酸化作用可通过除去氧完成，并在长时期的停滞过程中对细胞功能具有保护效应。
硫化氢能和CO一样结合细胞色素C氧化酶，并在需要时终止氧化磷酸化。它在阻碍氧化磷酸化中如此有效，以至于人如果在含有0.1％硫化氢的气氛中吸了一口气，他们应不要吸另一口。否则，他们会立即跌倒在地-在工业背景中通常称为“击倒”的事件。这似乎也是可逆的，因为如果迅速移到新鲜空气中(并且跌倒未受损伤)，这些个体有时可复苏并继续生活而不会有神经学上的问题。这是一种这样的物质，其不仅在我们的世界中是普通的，实际上，甚至在我们自身的细胞中产生，而且是不实现氧递送的有效的可逆的氧化磷酸化抑制剂。
C.鼠研究 用H2S诱导类似冬眠的状态。根据定义，恒温动物维持核心体温高于环境温度10-30℃。对于这些动物做到这一点，它们必须从通过氧化磷酸化产生的能量产生热量。氧化磷酸化中末端的酶复合体是细胞色素c氧化酶。由于硫化氢抑制该复合体(Petersen，1977；Khan等，1990)，本发明者预测将恒温动物暴露于硫化氢将防止这类动物维持其核心体温高于环境温度。
为了检验这个假设，本发明者要持续监测恒温动物(小鼠)的核心体温和活动水平。植入小鼠腹膜内的遥测装置可完成这两种事情，并且具有不会由于处理小鼠而给读数引入偏差的优势(Briese，1998)。另外，它们可在暴露于硫化氢气体过程中远程监测小鼠。先前已显示，对于暴露持续达到10周，百万分之80份(ppm)的硫化氢剂量对是小鼠无害的(CIIT 1983；Hays，1972)。因此，对于这些试验，本发明者采用80ppm的硫化氢剂量来检验我们的假设。产生含有80ppm硫化氢的气氛不是小事。随着时间过去，存在氧时，硫化氢将被氧化成硫酸盐。为此，为了使本发明者能持续将小鼠暴露于含有80ppm硫化氢的气氛中，本发明者不断地将室内空气与一罐用氮气平衡的500ppm的硫化氢混合。
核心温度控制的表征 将小鼠暴露于80ppm H2S使其核心温度降低至高于环境温度约2摄氏度(图5)。该作用是高度可重复的，因为暴露于80ppm硫化氢6小时的7只小鼠的平均核心体温遵循类似的模式(图5)。在13℃的环境温度中，这7只小鼠的最低平均核心体温是15℃。在气氛被转换成只含有室内空气的气氛时，所有这些小鼠在复温后成功地恢复。作为对照，本发明者用氮气代替硫化氢并发现核心体温没有实质降低。
虽然这些小鼠表面上看起来正常(尽管核心体温和呼吸率暂时降低)，本发明者进行了一组行为试验来排除这样的可能性暴露于硫化氢气体、核心体温急剧下降、呼吸率降低，或这些效应的组合引起了神经学上的损伤。所有试验在暴露于硫化氢之前和之后对小鼠实施。这些行为试验选自由Mouse Models for Human Diseaseconsortium发展的SHIRPA方法(Rogers等，1997)。在暴露于气体后，在小鼠中不存在可检测到的行为差异。据此，本发明者做出结论，进入类似冬眠的状态不是有害的。
H2S剂量的初步优化。上面的试验描述了80ppm硫化氢对小鼠核心体温的影响。为了确定足以丧失体温调节的硫化氢浓度，本发明者将小鼠暴露于一系列的硫化氢浓度(20ppm、40ppm、60ppm和80ppm)(图6)。虽然20ppm和40ppm的硫化氢足以导致小鼠的核心体温下降，但这与使用60ppm和80ppm的硫化氢所观察到的下降比较是较小的。根据该试验，本发明者得出结论产热作用的丧失直接取决于提供给小鼠的硫化氢的浓度。对剂量范围和硫化氢的药物动力学的这一初步研究强调了需要更全面的分析。
低核心温度界限的初步确定。本发明者还有兴趣建立对核心体温范围和小鼠在该状态下允许的时间长短两者的耐受的更完全理解。上述试验显示，本发明者可在需要时重复地降低小鼠的核心体温至13-15℃。此外，小鼠似乎可耐受该处理数小时。采用相同的方案，在降低环境温度时，本发明者成功地使小鼠的核心体温达到10.7℃(图7)。进一步尝试将核心体温降至更低，以及更长的时间将在将来进行。尽管是初步的，这些结果证明，存在显著范围的小鼠生物学容许的核心体温，并且该范围可通过因暴露于硫化氢中而丧失体温调节来探究。
内源性H2S水平的调节。众所周知哺乳动物细胞内源性地产生硫化氢(Wang 2002)。由于这种化学物质在细胞中动态地产生，理解在不同条件下的基础水平是极其重要的，因为这可显著地影响外部施用的硫化氢的药物动力学。为了解决我们的研究的这一重要方面，本发明者已开始检测小鼠中的内源性硫化氢水平。本发明者采用与气相色谱法和质量特异性检测联合的萃取烷化技术来定量硫化氢(Hyspler等，2002)。用该方法，本发明者观察了未受干扰的小鼠中的硫化氢水平。图8A显示该小鼠体内存在显著量的硫化氢。另外，硫化氢水平似乎取决于小鼠的环境温度。具体而言，当小鼠在冷的环境中时，它们减少了内源性硫化物水平并且，在小鼠位于暖和的环境温度下时，它们增加了内源性硫化物水平。据此，本发明者得出结论小鼠响应环境温度而调节它们的硫化物水平。
内源性水平的变化影响H2S的效力。因为环境温度改变小鼠体内硫化物的内源性水平，本发明者假定，一旦暴露于外来的硫化氢，环境温度可能影响核心体温的改变。让小鼠适应低温～12℃，产生了持久的稳定水平，本发明者在核心温度开始下降后观察到这一稳定水平(图8B)。因此，这表明这种对寒冷的适应使得小鼠更耐受硫化氢气体的作用引起的核心躯体冷却。然而，让小鼠在暴露于气体之前适应暖和的热中性(thermoneutral)温度消除了该稳定水平。事实上，常温小鼠在暴露于硫化氢时比适应寒冷的小鼠更迅速得多的冷却(图8B)。这些数据表明，小鼠体内硫化氢的内源性水平对外来的硫化氢的效力有直接影响。
H2S保护小鼠免受低氧影响。正常室内空气含有约21％的氧。在小鼠模型中研究停滞对低氧的保护效应的初步试验中，暴露于80ppm硫化氢的小鼠幸存于11分钟5.2％的氧中，并且3周后，小鼠依然表现良好。以前公开的工作显示，90％的以这种方式暴露而没有硫化氢的这些动物(C57Bl)不能存活(Zhang等，2004)。该试验包括将小鼠预平衡于80ppm H2S中3小时，然后如上面实验中描述的使腔室中的氧张力降低。如上描述的使用相同的流速(即0.5L腔室中为500cc/mL)。熟悉该领域的那些人已很好地确定，如果一组小鼠暴露于4％的氧中，则100％将在15分钟内死亡。然而，其中在氧张力减少至4％过程中施用了H2S的小鼠在这些低氧条件下仍保持有活力，甚至持续延长时间(直到1小时)。小鼠在恢复后似乎未受这些条件的影响，并且在24小时后试验时有活力并能正常反应。该试验与上面的实验不同，不同之处是小鼠在低氧暴露结束时仍保持在H2S中直到氧张力恢复到正常水平(21％O2)。
实施例7 另外的动物研究 A.保护以免受不利条件影响 进行该试验用以检测在‘类似冬眠’状态中小鼠在其中它通常会死亡的条件下存活的能力。不利条件是低氧，对其有文献声称小鼠(C57BL6/J雄性)可在5％的氧气中最多存活20分钟(Zhang等，2004)。
如表6中显示的，试验包括将小鼠暴露于80ppm(除非另外说明)的H2S中持续所示时间，之后减少室中的氧张力，然而依然在H2S下。记录暴露于低氧的时间(如下说明的)并测定小鼠的存活力。
将小鼠短时间暴露于H2S(至少为80ppm)中较不成功地保护小鼠免于低氧，但有至少一只小鼠在H2S中仅8分钟后就可幸存于50分钟的低氧暴露下。此外，观察到暴露于90ppm H2S中仅10分钟的小鼠在5％的氧气条件下可存活更长时间，尽管它最后会死亡。
将小鼠暴露于80ppm H2S中更长时间对保护小鼠免于低氧直到1小时有强烈的效果。
表6 B.增强缺氧耐受性 1.背景 研究了将二氧化碳(CO2)和硫化氢(H2S)增强复杂的后生动物果蝇(Drosophila melanogaster)在缺氧下存活的用途。这些试验表明，这些物质，尤其是H2S可增加成体果蝇的缺氧耐受性。
秀丽隐杆线虫胚胎通过进入滞生来在缺氧(＜10ppm O2)下幸存，并且发育可在0.5％的O2中进行。然而，存在10倍范围的致死性氧气浓度(0.01-0.1％O2)。此外，用一氧化碳阻止氧利用可防止胚胎的低氧损害。因此，如果不存在足够的氧为有效的生物活动所利用，则更好是不具有(或使用)任何氧。
在更复杂的后生动物中，细胞氧浓度不一定与环境的氧水平相同。在秀丽隐杆线虫中，氧通过扩散递送给组织。然而，在高等生物中存在结合氧以便运输氧至组织的蛋白质，例如血红蛋白。因此，当环境的氧水平下降时，在细胞中可能存有残留的氧。
大多数生物不能幸免于暴露于环境缺氧。一种可能性是细胞水平上的残留的氧是有毒性的，相当于在秀丽隐杆线虫胚胎中观察到的致死性的氧范围。在该情况中，如果残留的氧被去除或变得不可利用，则缺氧下的存活应该会增加。CO2促进O2从血红蛋白中释放并且H2S是一种有效的氧化磷酸化抑制剂。
2.材料和方法 基本的实验方案。将成体蝇引入35mL带有气密性橡皮塞的由玻璃制成的管(Balsh管)中。这通常通过这样完成用CO2将蝇麻醉，将果蝇组移入有食物的瓶中恢复至少2小时，然后将它们转移进Balsh管中。为了交换Balsh管中的气体环境，将2个18号针插入橡皮塞中，并让气体以100mL/分钟吹入一个注射针中。为了防止干燥，气体在通过Balsh管之前通过使之通过10mL水鼓泡来增湿。在试验开始前将起泡器中的水用气体平衡至少20分钟。
对于“停止-流动(stopped-flow)”试验，气体交换在密封试管之前进行60分钟。对于“慢-流(low-flow)”试验，气流在整个实验过程中是持续的。CO2来自室内来源(100％)，并且缺氧环境通过用100％氮气(N2)吹出室内空气建立。在将气氛从CO2转换成N2时，注意防止将室内空气引入该系统中。
在缺氧处理后，通过充入室内空气20分钟将氧气再次引入Balsh管中。然后除去橡胶塞并用石蜡膜将一个食物瓶倒置于Balsh管顶部。如果果蝇恢复活动则将其评价为活的。在缺氧处理结束后至少18小时时对存活力进行评价。在2周后，如果食物瓶中含有幼虫和/或蛹，则认为蝇是能育的。
3.结果 在暴露于缺氧前用CO2处理。如果成体蝇首先用CO2预处理，则它们表现出更高的缺氧存活率。在停止-流动试验中缺氧暴露19小时后，用CO2预处理30或90分钟的成体果蝇分别显示54％或28％的存活。在暴露于缺氧而未经CO2预处理或暴露于CO2而接下来没有暴露于缺氧的对照中没有观察到幸存者。此外，如果果蝇在缺氧暴露20分钟后还立刻暴露于CO2，则用CO2预处理没有蝇幸存于缺氧暴露。
短时间暴露于CO2中足以增强缺氧的存活。在22小时缺氧暴露的停止-流动试验中，如果在转换成氮气气氛前施用CO20.5-5分钟，则存活的蝇的比例最高(图16)。因此，对于随后的实验，标准方案是在暴露于缺氧之前用CO2处理10分钟。在使用该方案的慢-流试验中，6％的成体果蝇在20小时的缺氧暴露中幸存，并且这种存活需要CO2预处理。
试验表明，在CO2处理和建立N2环境之间防止重新引入O2是重要的。当用于湿润气体的起泡器中的水在吹出CO2之前不用N2平衡时，在这些试验中没有果蝇幸存于13小时的缺氧暴露，无论N2是以10、50或100mL/分钟引入。在这些条件下，CO2气氛用N2/O2混合物吹洗出来，其中N2/O2混合物是由O2溶解于水中产生的。
进行一系列的慢-流试验用以确定与未经预处理的比较，CO2暴露进行的缺氧暴露的时间，每种条件一式两份进行检测(图17)。在这些数据中，倾向是CO2预处理导致更大的存活。一个重要说明是，这些试验偏离了标准方案，不同之处是将果蝇用CO2麻醉并转移至Balsh管中，并在开始CO2处理前仅允许恢复10-20分钟(除了试验2的第18小时的时间点)。
实施了几个其它试验，其没有为用CO2预处理是否是有利的提供信息。例如，在一个试验中，在具有10分钟CO2预处理阶段的慢-流试验中在缺氧17、22和24小时后未观察到存活者。然而，在其它试验中，许多果蝇在17小时后幸存。这可以说明，在某些案例中其它因素影响了结果，例如成体的年龄、昼夜节律或室温的改变。在另一个比较停止-流动方案和慢-流方案的试验中，没有蝇幸存于17或19.5小时的缺氧暴露；然而，在这种情况下，霉菌污染可能促进了果蝇的死亡。
在缺氧暴露前用H2S处理。在预处理方案中包括H2S更显著地增强了成体蝇在缺氧下幸存的能力。在一系列类似于图17中显示的那些的试验中，加入50ppm H2S至CO2预处理中(H2S/CO2)增加了在处理中幸存的果蝇的比例(图18)。这些蝇看起来是健康的，并且在暴露后产生了后代。然而，在类似的试验中，在H2S/CO2中10分钟后没有蝇幸存于18、20、25或30小时的缺氧中。这种差异的原因不清楚。与H2S处理的有利影响相符，在15小时的缺氧暴露后，50％的用H2S预处理的果蝇幸存，而未暴露于H2S的对照果蝇没有恢复。在该试验中，将果蝇用CO2处理10分钟，然后用H2S/CO2处理10分钟，随后用N2/H2S处理10分钟，最后用N2处理持续慢-流试验的持续时间。
H2S-依赖性的缺氧存活增加不要求CO2处理。25％的在造成缺氧18.5小时前用室内空气中的50ppm H2S处理的果蝇得以幸存。如果在建立缺氧环境之前增加暴露于H2S/CO210分钟，则存活的果蝇的比例不受影响。在其中果蝇在缺氧暴露前仅用CO处理的对照实试中，只有11％的果蝇恢复。
施用H2S的时间似乎对增加缺氧存活是重要的。如果H2S在整个缺氧暴露过程中(20小时)存在，则没有果蝇复原，无论H2S在CO2预处理过程中存在与否。然而，如果50ppm H2S存在于CO2预处理中，并随后在建立缺氧环境时除去，则35％的果蝇存活。在平行试验中，在用CO2(无H2S)预处理10分钟后6％的暴露于缺氧的果蝇幸存。
用幼虫和胚胎的初步试验。在用CO和含有HS的CO处理后，增加的缺氧的存活也在胚胎和幼虫中观察到。在暴露于缺氧24小时后，7个蛹由一组0-19小时大的胚胎形成。然而，在用CO2预处理10分钟的配对的池中观察到20个蛹。类似地，暴露于24.5小时缺氧中的幼虫只有在它们经CO2或H2S/CO2预处理时才可在再氧合时恢复活动。0-24小时大的胚胎在18.5小时的缺氧暴露中幸存并发育至成虫期，无论用CO2或H2S/CO2预处理与否。
缺氧过程中的冷处理。降低环境温度可延长成体果蝇可幸存于缺氧暴露的时间长度。在室温下，在停止-流动方案中没有果蝇幸存于15.5小时的缺氧暴露中，但20％的保持4℃下同时保持缺氧的那些果蝇得以恢复。类似地，转换至4℃下的缺氧并随后移至室温下16.5小时的果蝇没有存活。然而，在16.5小时并甚至在40小时后，在整个暴露过程中保持在4℃的果蝇得以恢复并且是可育的。在建立缺氧环境之前用CO2预处理在这些试验中没有显著的差异。 实施例8 核心体温的下降 在大鼠和小鼠两者中，研究显示利用H2S和CO2，可减少代谢输出量，表现为核心体温降低。图20A-B显示，在时间0当首先施加H2S或CO2时，动物的核心体温开始下降。6小时后，当除去H2S或CO2时，体温开始恢复正常。显然更大的哺乳动物需要更多的H2S来影响新陈代谢。
预示性的实施例9 气体矩阵 为了测定提供控制哺乳动物中代谢柔性的最大能力的定制的混合气氛中每种成分气体的浓度，可实施下列试验。气体包括氧气(O2)、氮气(N2)、二氧化碳(CO2)、硫化氢(H2S)和氦(He)。在H2S可能会减少线粒体中的需氧量的同时，CO2可进一步减少需氧量。另外，已发现核心体温的降低对减少新陈代谢来说是必需的。因此，氦气以其高的热容量，可提供简单且非侵入性的冷却方法。此外，用100％的O2，常氧的20.95％的氧气可维持于其中其它成分组成少于总量的79.05％的任何气体混合物中。并且最后，将氮气用于平衡该混合物至100％。
这些试验描述了一种渐进的方法来首先在小鼠然后在大鼠，随后在狗中单一和组合检测气体。该气体矩阵的目标是发展一个在其上以逻辑次序用多个变量研究的基础。该实验设计在图21中描述。
该气体矩阵的特征之一是它表明试验将只会在前面的试验(通过箭头连接)完成时才进行。混合试验在没有首先优化成分气体时将不会在任何动物模型中实施。此外，气体或气体混合物在未首先在小鼠中优化剂量时将不在大鼠中使用，并且未首先在大鼠中优化前将不在狗中使用。因此，它显示了用单一气体到多种气体混合物(从顶部右边到底部左边阅读)以及从小鼠到大鼠到狗(从顶部左边到底部右边阅读)的实验进展。小鼠将总是首先用于测定提供对代谢柔性的最佳控制的成分气体的浓度。一旦用小鼠测定了气体的最有效剂量，相同的试验将在大鼠中进行。同时，将用小鼠测定下一种气体或气体混合物。一旦浓度在大鼠中确定，将在狗中检验该气体。下表提供了稍微不同的方式来观察气体矩阵并确定试验顺序 程序1.二氧化碳(CO2) 小鼠研究发现15％的CO2在小鼠中提供了对代谢柔性的控制。然而，鉴于我们混合能力的局限性，我们不能够检验更高的浓度。这一观念不再正确，并且我们可检验直到80％的CO2浓度。因此，我们将从15％的CO2开始并以5％的增量增加至40％，然后以10％的增量增加至80％。动物将暴露6小时。小鼠将用375ml的玻璃室来暴露，在其中将给动物提供水并且预混合气体气氛将以每分钟500毫升的速率流入其中。这些玻璃室将包含于一个恒温箱内以便可控制环境温度。该表提供了我们的高-浓度CO2试验的框架，但可能需要另外的实验来更好地理解效应。小鼠可在多个实验中使用，但我们将不会比每周一次还要频繁地使用一个动物。此外，动物可在随后的试验中用作它们自身的对照。
将监测新陈代谢(O2消耗和核心体温)和活动。在15％的CO2下，潮气量增加但呼吸率保持不变。小鼠未表现出“气喘”。增加CO2浓度应该增强麻醉效应。
这些试验将在恒温箱中进行，以便我们可随后降低环境温度至10℃用以检测核心体温和代谢输出量之间的关系。
大鼠大鼠中的实验将用3％的CO2和21％的O2平衡的氮气环境开始。这被认为是血碳酸正常，因为它是CO2的呼出浓度。从3％开始，我们将以2％的增量增加至15％。该增加可在单个的基线试验中进行，在所述基线试验中我们增加CO2浓度直到我们观察到新陈代谢的改变。新陈代谢将通过测量O2消耗和核心体温监测。一个试验中的单个大鼠可用于测定这种最小CO2剂量。在随后的试验中，其中将检测6小时的CO2暴露的效应，单个大鼠将用于仅一种CO2剂量(即，在试验过程中水平将不会改变)。大鼠可用于多个实验；它们每周使用将不多于一次。将用2,800ml玻璃容器来使动物暴露，玻璃容器中将提供水并且预混合气体将以每分钟3升的速率流入其中。该表显示了利用大鼠的最初的CO2试验的结构，但需要其它试验来充分研究效应。
从15％到80％，试验将如用小鼠实施的进展(15％-40％为5％的增量，40％-80％为10％的增量)。将监测新陈代谢和行为。一旦确定用于大鼠的CO2的有效剂量，将降低环境温度以研究新陈代谢是否如用H2S进行的通过核心温度降低来进一步减少。这些试验将在恒温箱中进行，该恒温箱将在试验开始和实验过程中提供冷却以及在试验结束时加热。
在完成大鼠的CO2研究后，将知道大鼠是否需要比小鼠更多的CO2(对H2S来说是正确的)，或相同的，或更少的CO2用于减少它们的新陈代谢。了解这一关键的异速增长(allometric)趋势将为狗中的有效CO2剂量提供更好的假定。
小鼠和大鼠中这些程序的中止点将是O2消耗减少99％或CO2产生减少99％。
狗用于狗的实验设计将与用于大鼠和小鼠的相同(采用10升/分钟的流速)。试验将用3％的CO2开始并增加直到观察到生理反应。用麻醉面罩将狗暴露于混合气体，在暴露前这些狗已预先适应该麻醉面罩。将监测O2消耗和核心体温。相同的一只或两只狗可用于这些试验。
程序2.硫化氢和二氧化碳(H2S+CO2) 通过混合H2S和CO2，我们将寻求这两种气体的协同效应。即，H2S和CO2能否一起使用来与更高浓度的单种气体一样深度地减少新陈代谢。在最初的试验中，使用小鼠，将使用20ppm的H2S并且滴定入CO2达到15％(或在程序1中确定的其它浓度)。一只动物可用于改变CO2的浓度而同时保持H2S恒定。其次，我们将使用40ppmH2S并加入CO2达到15％。第三，我们将使用80ppm H2S并让CO2达到15％。这些试验中的每一个可使用一只动物。将监测O2消耗、核心体温，以及行为。在表中列出的试验为研究H2S+CO2混合物的效应提供了基础，并且将需要其它试验来理解效应。
一旦测定了有效的混合物，将降低环境温度用以研究优化的气体混合物是否可与低的核心体温起协同剂作用来进一步降低代谢率。在这些温度依赖性试验中，混合物中的气体的浓度将不改变。再一次，一只动物可用于多个实验，每周每只动物不多于一个试验程序。
使用大鼠和狗的试验将采用相同的方法实施。用于大鼠和狗的CO2浓度将在程序1中优化，但假定它们将在5％和15％之间。对于狗，高的H2S浓度大于400ppm但尚未测定。
程序3氦(He) 氦是一种有效的热消散器；它的热传导比氮气大6倍。它已在许多哺乳动物包括大鼠、狗和人中使用以促进冷却。它是无毒的、便宜的，并且易于处理。期望将氦与其它气体一样，用于与氧气的80％/20％混合物(He-O2)中，用来通过呼吸作用增强导热性。提出了5个预备试验来分析He-O2对新陈代谢和行为的影响。将采用广泛使用的标准的80％-20％混合物。也将检测含有60％He的混合物，用以更好地反映我们将在方案5中使用的最小量的He-O2混合物，在方案5中我们混合了H2S、CO2和He。
将监测氧消耗、二氧化碳产生、核心体温和行为用以了解用He-O2是否可诱导其它气体具有的相同效应。
程序4氧气(O2) 减少氧浓度可降低核心体温已由Gellhorn和Janus在1936年用豚鼠显示。期望首先在小鼠中，然后在大鼠中，并最后在狗中重现这些试验，用以研究降低的O2浓度是否减少新陈代谢。
小鼠提出了其中小鼠将暴露于低至6％的减少的O2浓度的实验。试验将以5％的增量进展。将测定O2消耗、CO2产量、核心体温，以及行为。如果观察到指示极度低氧的惊厥行为，则将O2恢复至21％。下表提供了该O2试验的概要。暴露时间是在预混合气体流入其中的控制室(有水)中进行6小时。由于存在低氧预处理的证据，四只单独的动物用于这四个实验。
一旦已确定O2分压和新陈代谢之间的关系，可能重要的是在冷的环境中重复该实验。这些试验将完全如前面的试验实施，只是恒温箱的温度将降低至10℃。
大鼠期望采用大鼠实施先前用小鼠实施的相同的实验。如果观察到表示极度低氧的惊厥行为，将O2浓度恢复至21％。
狗如果在小鼠和/或大鼠中观察到氧张力减少和代谢率减少之间正相关，则期望用狗来实施相同的一系列试验。
程序5硫化氢、二氧化碳、氦和氧气(H2S+CO2+He+O2) 这些试验是该气体矩阵的目标；以确定提供对新陈代谢最强(robust)和可逆的控制的、与优化的环境温度组合的O2、CO2、H2S和He的混合物。因此，将在前面程序中确定的单种气体的浓度用作基础，测定这四种气体的混合物以找到对代谢柔性提供最佳控制的混合物。O2、CO2和H2S将相对于彼此改变，同时氦将用于平衡该混合物。在下面显示的小鼠试验中，在O2和H2S保持恒定的同时改变CO2；将改变氦用以维持恒定的流量。我们将采用相同的包括氧消耗和核心体温的代谢测定法。一只动物可用于多个实验。小鼠将暴露6小时。然后采用更低的环境温度重复这些试验，用以了解采用该气体混合物降低的核心体温会影响新陈代谢多少。
小鼠 大鼠在了解了用于小鼠的最佳气体混合物是什么后，将用大鼠进行与用小鼠实施的那些一样的实验，除了H2S浓度是100、200和300ppm以外。将处理大鼠6小时。
狗使用狗的试验将与使用小鼠和大鼠的那些试验一致。浓度将开始于300ppm并转到要测定的浓度。一个动物可用于多个实验但每周不多于一次。小鼠和大鼠将处理6小时，狗将处理2小时。 预示性实施例10 人中硫化氢剂量的选择 可通过多种剂型和施用途径的任意一种，包括但不限于吸入气体形式或静脉内施用硫化氢溶液，施用硫化氢给动物或人来诱导停滞。描述了用于确定足以在需要停滞的整个生物中诱导停滞的硫化氢的剂型和施用途径的方法。将试验生物(例如大鼠、狗、猪、猴)暴露于增加浓度的作为一次性剂量间歇性或连续性施用的硫化氢，并且在多个时间点移出血液样品(0.5mL)的同时监测生理状态，包括但不限于核心体温、氧消耗、二氧化碳产生、心率、血压、呼吸率、血液PH值、运动和觉醒状态。将存在于源自试验动物血液的血浆中的硫化氢浓度用本领域已知的方法测量，包括，但不限于X衍生、Y萃取，以及使用气相色谱法和质谱测定法的定量。
在试验动物中通过特殊给药方案产生的硫化氢的稳态血浆水平与试验动物中在不同程度上实现停滞的相关性，确定了足以在试验动物中诱导停滞的硫化氢的有效剂量。用于在需要停滞的人中诱导停滞的有效剂量通过确定在其中诱导停滞的条件下，在人中获得与在试验动物中获得的相同的硫化氢的稳定血浆浓度的硫化氢的剂量、施用途径和给药方案测定。硫化氢在人体内实现停滞的有效浓度取决于剂型和施用途径。对于吸入法，在一些实施方案中，有效浓度在连续递送50ppm至500ppm的范围内。对于静脉内施用，在一些实施方案中，有效浓度在连续递送每千克体重0.5至50毫克的范围内。
在每种情形中的范围表征为用增加的硫化氢的剂量获得的增加的停滞程度。足以导致在医院外遭受心搏停止以及心博复苏和恢复时无意识的人的核心体温持续的、12-24小时降低3-5摄氏度至32-34摄氏度的硫化氢的剂量，预计相对于未暴露于硫化氢的类似的人具有显著的生存优势，如Bernard等2002中描述的。实施例11动物的预处理研究 实施例7中显示的研究证明，用H2S预先且持续的处理雄性C57Bl/6小鼠可增强它们在5％的氧气或4％的氧气的低氧条件下存活的能力。
为了测定在低氧条件下单独用H2S预处理对存活力的影响(在低氧过程中没有持续暴露于H2S)，将小鼠在暴露于5％O2(5％)、4％O2(4％)、1小时5％的O2后为4％的O2(4％+1小时5％)或1小时5％的O2后为3％的O2(3％+1小时5％)之前，暴露于30分钟的室内空气下(未经预处理)，或者暴露于10分钟的室内空气下之后暴露于20分钟室内空气中的150ppm硫化氢(预处理)，并测定它们的存活时间。试验在60分钟时终止，并将仍然活着的动物放回到它们的笼中。如图23中显示的，在预暴露于室内空气中的150ppm H2S 20分钟的一组动物中的所有小鼠都幸存于随后5％O2的暴露，而只暴露于室内空气的所有对照动物都在暴露于5％O215分钟内死亡。因此，将小鼠预暴露于H2S在该小鼠中建立了使得能长时间幸存于其它情况下为致死性低氧的生理状态。在H2S预处理的小鼠中观察到的保护作用远远超过了已知的已在文献中报道的全身低氧预处理的保护效应，在所述的文献中在5％O2中的存活力只延长了2倍(Zhang等，2004)。虽然在图23中未显示，一些H2S预处理的小鼠能够在5％O2中存活长于4小时，并能够恢复而没有显著的运动或行为缺陷。
为了确定H2S预处理是否增强对甚至更低的氧张力的存活力，将小鼠暴露于更低的O2浓度。如图24中显示的，H2S预处理大大地增强了在存在5％的O2的情况下的存活。比较而言，在存在4％O2时，H2S预处理仅较小地增加了存活。然而，如果将H2S预处理的小鼠暴露于逐步减少的O2水平，这样它们首先经预处理然后暴露于5％的O21小时，随后暴露于4％的O2或3％的O2，它们的存活时间增强至与它们在H2S预处理后暴露于5％的O2时观察到的相同的水平(图28)。因此，预暴露于H2S建立了一种其中小鼠可幸存于超过80％的氧张力的逐级减少(21％的常氧减少为3％的O2)生理状态。而且，在一些试验中，在H2S预处理后逐级减少氧张力显示，小鼠可在低至2.5％的氧张力中存活1小时。
这些数据和在实施例7中描述的那些证明，暴露于H2S具有药理学效应，其中在其它情况下为致死性低氧中的存活率得以很大提高。关于这一点，H2S的药理学效应取决于暴露于H2S的剂量水平和持续时间、本领域的技术人员可改变以获得最佳的对致死性低氧的存活力的参数。本领域的技术人员将理解，也可改变施用途径(例如，吸入对肠胃外施用)来在哺乳动物中获得期望的致死性低氧耐受的效果。另外，所述的药理学效应可在H2S暴露局限于预处理或扩展到低氧期间时观察到。同样，可改变暴露于H2S相对于致死性低氧开始的时间选择，用以使提高的存活力最大化。这些数据符合这样的假设由用活性化合物(如氧拮抗剂)预处理导致的需氧量减少使得能幸存于在其它情况下对动物是致死性的供氧减少。
为了表征在通过H2S处理产生的增强的对致死性低氧的存活力的环境中存在的新陈代谢变化，在暴露于H2S过程中并然后H2S处理终止以及随后暴露于5％的O2的过程中，测量小鼠的CO2产生。CO2产生的变化在图25中显示。测量暴露于室内空气30分钟(未经预处理)或室内空气10分钟后暴露于150ppm H2S 20分钟(预处理)的小鼠中在转换为5％O2或4％O2时CO2产生的变化。此外，测量了在逐步过渡至5％的O21小时，之后转换为4％的O2时CO2产生的变化。这些试验的结果在图29中提供。
CO2产生在H2S预处理的最初5-10分钟内减少了约2至3倍，表明在用室内空气中的150ppm H2S预处理20分钟期间，在小鼠中诱导了停滞。然而，动物的O2消耗和核心体温在H2S预处理过程中没有显著改变(数据未显示)，表明在暴露于H2S过程中，小鼠中建立了使得对致死性低氧的存活力提高的生理状态而不是停滞。这种状态可表征为生物材料内的新陈代谢减少的大小低于定义为停滞的大小。为了用活性化合物获得停滞，生物物质有必要必须过渡通过其中生物物质中的氧消耗和CO2产生减少低于2倍的逐级代谢减退状态。这种其中新陈代谢或细胞呼吸通过活性化合物减少至低于两倍的程度的连续状态被描述为“预-停滞”状态。在图25中显示的、在H2S预处理终止和诱导致死性低氧后对CO2产生的连续监测证明，CO2产生减少约50倍，说明停滞是在暴露于致死性低氧过程中获得的。在暴露于致死性低氧过程中，伴随的小鼠中O2消耗的减少以及活动性的强烈衰减进一步支持这样的观测结果随后在暴露于致死性低氧过程中获得停滞。
测量了与在H2S预处理后或未经预处理后转换为5％O2或4％O2的低氧条件相关的CO2产生的变化。如在图28中显示的，在没有H2S预处理时暴露于5％的O2的小鼠或在存在H2S预处理的情况下暴露于4％的O2的小鼠表现出CO2产生大量减少。相比而言，与在H2S预处理后的新基线水平比较，随后暴露于5％O2或者在5％O2之后暴露于4％O2的经H2S预处理的小鼠在CO2产生方面未显示出任何明显改变。这些结果证明了代谢活动减少与死亡之间的相关性，所述死亡与在没有H2S预处理时暴露于5％O2，或者有H2S预处理时暴露于4％O2相关。此外，这些数据证明，在H2S预处理后暴露于5％的O2，或从5％的O2逐步减少为4％的O2没有导致代谢活动的额外减少。为了总结这些结果，在从常氧转变为致死性低氧时发生的CO2放出的减少在用H2S预处理过的小鼠中是迟缓的。从常氧转变为致死性低氧导致CO2放出减少40％，但用H2S预处理，它本身导致CO2放出减少50-60％而达到一个新的，更低的基线，防止了在转变成致死性低氧时CO2放出的任何进一步减少。这些数据证明，单独用H2S预处理防止了通常与转变为致死性低氧相关的代谢活动的额外减少，从而提高了在低氧条件下的存活。此外，这些数据支持了这样一个模型，其中将生物物质预先暴露于活性化合物足以增强存活力和/或减少来自损伤或疾病损害的伤害。
实施例12 硒化氢在降低的浓度下降低小鼠的核心体温 以前已在文献中报道，大于1ppm的H2Se对动物是致命的。试验按照实施例4中描述的材料和方法进行，除了使用甚至比H2S更低浓度的H2Se。使用的H2Se具有来自来源罐的氮气中20ppm的初始浓度，然后将其用室内空气稀释成约十亿分之10份或100份(ppb)。然后将动物暴露于该混合物。
两只小鼠暴露于100ppb H2Se少于10分钟。图26显示了由一只小鼠中的呼吸表明的，核心体温降低以及代谢活动减少3倍。
H2Se的浓度甚至进一步减少至10ppb。暴露于10ppb H2Se的小鼠也经历了核心体温和呼吸的减少(图27)。
此外，基于用于评估使用H2S的可逆性的实验(Blackstone等，2005，因此将其通过引入作为参考)，H2Se的效果表现为完全可逆的。
实施例13 硫化氢保护对抗致死性出血 实施例7和11中显示的研究证明，用硫化氢(H2S)处理小鼠增强了它们在5％的氧或4％的氧的低氧条件下生存的能力。为了确定H2S处理是否也可用于减少与更加在临床上有关的缺血性低氧急性损伤模型相关的死亡率和/或组织损伤，在受控制的致死性出血过程中用H2S处理大鼠，所述的致死性出血减少了提供给组织的氧并导致死亡(Blackstone等，2005)。在该研究中，用H2S处理的大鼠幸存于致死性失血并完全恢复。
将大鼠在受控制的致死性出血(失血60％)过程中用H2S处理。在手术植入导管和恢复后，将血液在40分钟内从有意识的动物体内移出。将与室内空气混合的少量(300ppm)H2S在开始放血后20分钟(即在失血30％后)施用给受处理的动物。在放血结束时将动物放回到没有H2S的室内空气中。在放血结束后3小时，将存活的动物静脉内施用流出的血液体积的乳酸林格氏溶液。
大多数(6/7)H2S处理的大鼠幸存于出血和3小时的休克期并完全恢复(表7)。这些存活的大鼠没有一只在恢复后表现出行为或功能缺陷。一只H2S处理的大鼠在出血结束后174分钟死亡。所有未经处理的动物在出血结束后82分钟内死亡；未经处理的动物的平均存活时间是35+/-26分钟。采用双尾费歇尔(Fishers)精确T-检验，p值是0.0047。
在最初的20分钟出血(在失血30％之前)中，大鼠增加了呼吸率和潮气量用以补偿由于失血而减少的携氧能力。这种通气的增加导致了呼吸的二氧化碳产生(VCO2)的减少(表7)。在失血60％后，H2S处理的和未经处理的动物都表现出VCO2减少。动脉血乳酸增加而pCO2、碳酸氢盐([HCO3-])、pH和碱过剩减少(表7)。因此出血导致具有呼吸性代偿的代谢性酸中毒。然而，在H2S处理的大鼠中，这些变化在大小上是较小的，表示代谢性酸中毒的降低。此外，在H2S处理的动物中，VCO2在出血后没有继续减少。在未经处理的动物中，VCO2稳定地减少直到动物停止呼吸。H2S施用显示防止了休克反应发展至死亡。
表7.使用H2S的大鼠出血模型的存活和生理学 实施例14 在出血过程中短期暴露于硫化氢的益处 重275-350克的雄性斯普拉-道来氏大鼠在每个试验前一周购自Charles River Laboratories并让其适应。在试验当天，将导管手术植入右股动脉和静脉中。导管在肩胛骨后面引出。给大鼠在手术后施用丁丙诺啡并让其恢复。
将抗凝血药物肝素(80-100单位)以一次性剂量静脉内施用，用以降低血液的凝固能力并增强出血。在施用肝素后，将意识不受限制的大鼠单独地置于带有玻璃盖的2.75升结晶皿中。将导管、温度探针和气体采样管通过在盖中央的钻孔。温度保持大致恒温(27+/-2℃)。
出血模型定义为在40分钟流血过程中移出60％的总的体内血液。血液用蠕动泵移出。为了确定构成60％的总的体内血液的量，将大鼠称重并且血量用下列方程计算(0.06X体重)+0.77(Lee等，(1985))。
让处理组接受暴露于含有硫化氢的室内空气(试验动物)，或含有氮气的室内空气(对照动物)，所述空气通过热质流控制器(SierraInstruments)以每分钟3升的速率施用。
将硫化氢(H2S)(20,000ppm，用氮气平衡)(Byrne SpecialtyGas)稀释进室内空气中达到用于处理的2000ppm浓度。将血液以计算出的速率经由股动脉导管移出。将血液在它移出时称重。在20分钟(或在40分钟放血的50％时)后，将试验动物暴露于含有2000ppm硫化氢的室内空气中。该暴露在动物显示呼吸暂停和张力障碍时终止。暴露于硫化氢(H2S)的平均时间长一般为1和2分钟之间。室内的最大H2S浓度估计为在1000和1500ppm之间。当观察到呼吸暂停和张力障碍时，让动物接受暴露于室内空气中。试验动物在暴露后20至30秒内恢复有规律的呼吸模式。将对照动物以与试验动物一样的速率放血，但不接受用硫化氢处理。对照动物在试验过程中未显示呼吸暂停或张力障碍。
代谢率通过测量CO2产生测定(Licor Li7000)。收集温度和CO2数据(ADI PowerLab)。测量动脉血值(I-Stat血液化学分析仪)。在放血后，将动物置于笼中3小时并观察。在3小时结束时，随意提供乳酸盐林格溶液给幸存的大鼠。对于未幸存的动物，在动物停止呼吸和CO2产生停止时宣布死亡时间。在复苏后，将大鼠转移至具有食物和水的干净的笼中，并在30℃下圈养约16小时。手术移出导管，并允许动物在转移回到群体中之前于30℃下恢复数小时。行为和功能试验选自SHIRPA方案中描述的一组试验(Rogers等，1997)。
在这些试验中，在出血过程中经硫化氢(H2S)处理的动物8只中有7只(88％)幸存于出血。未接受处理的两只对照动物在3小时的观察期间死亡。 实施例15 来自实施例2的额外结果 如上面实施例2中论述的，将人包皮用于评估细胞和组织在一氧化碳中的保藏。最终评估了总共8块人包皮(实施例2报道了3块)。有活力的角质形成细胞数用台盼蓝评估(表8和图30)。这显示一氧化碳暴露增加了活细胞的数目。
表8.采用台盼蓝(tb)染色法检测从暴露于室内空气(RA)或CO 24小时的包皮中分离的角质形成细胞的存活力。
实施例16 低水平长期H2S暴露增加存活力 使用实施例1中描述的方法和仪器，将秀丽隐杆线虫线虫暴露于低水平的H2S(＜100ppm)。适应于这种处理的线虫显示出增加的寿命和对热应激的抗性，然而，不存在如诱导停滞具有的代谢活动可辨别的减少。
在线虫中，不能进行有氧代谢(通过减少周围的氧浓度或加入CO)导致诱导滞生或停滞(参见实施例1)。然而，滞生不能通过将它们暴露于室内空气中＜100ppm的H2S诱导。在大于100ppm剂量时，H2S可导致暴露的线虫群体相当大的致死率。有趣地是，即使在其中大多数蠕虫被H2S杀死的情况中，幸存的那些表现正常并且显然没有受该物质伤害。在约50ppm H2S中生长的蠕虫完成胚形成，发展至性成熟并以与在没有H2S的环境中饲养的同胞相同的速率生产后代。比较而言，在其中代谢率降低的氧浓度(低于3.5％O2)中，所有这些过程都减慢了。此外，在H2S中饲养的蠕虫产生了与室内空气中的对照相同的数量的后代，表明不存在来自这些条件的有害作用。这些数据表明，H2S没有减少秀丽隐杆线虫在这些条件下的代谢活动。
在H2S中生长的线虫比在单独的室内空气中的年龄匹配的对照更抗热应激。在该测定法中，将在50ppm H2S中饲养的蠕虫在H2S中暴露于高温，并且将在室内空气中饲养的蠕虫暴露于室内空气。因此，H2S-诱导的对应激的抵抗力与代谢活动减少不相关。然而，这种对热-应激的抵抗力需要线虫适应H2S环境。在室内空气中饲养并在H2S中暴露于热-应激的蠕虫比如果它们在室内空气中暴露更快速地死亡。在H2S中饲养的蠕虫并在室内空气中暴露于热应激的蠕虫比在室内空气中饲养的对照存活得更好的范围内，对H2S的适应是持续的。另外，适应无毒的低浓度H2S(例如50ppm)的蠕虫可对抗对未适应的蠕虫是致死性的更高浓度的H2S。
这些数据与如下数据一致短暂暴露于H2S的果蝇随后能比未经处理的对照更好地幸存于缺氧(参见，实施例7和实施例11)。保护免受热应激(在蠕虫中)和缺氧应激(在果蝇中)表明，H2S能够增强在可能在临床上遇到的多种不利的或应激状态下的存活力。
适应50ppm H2S的蠕虫与等基因的未经处理的对照比较具有增加的寿命(图32)。这与如下想法一致它们处于通常更耐受与衰老相关的多种应激的状态下。实际上，在H2S中生长的老年蠕虫比未经H2S处理的相似年龄的那些蠕虫看起来更强健和健康。此外，在比较来自处于寿命中期的每种群体的蠕虫时，这也是正确的(即，室内空气对照和H2S-处理的蠕虫在时间上不是年龄相匹配的，但其中每个群体的50％已死亡这一点是相匹配的)。因此，适应于H2S可减慢秀丽隐杆线虫中与衰老相关的慢性细胞损害。
实施例17 气体矩阵试验的实施 采用改变的气体环境在小鼠、大鼠和狗中评估代谢柔性。三个参数用于定义新陈代谢的这种减少，包括通过呼吸测量法测量的二氧化碳产生、氧消耗的改变，以及如用遥测术测量的核心温度的改变。在用小鼠和大鼠的试验中，将动物置于具有一个气体输入口和一个气体出口的密封室中。对于狗，将面罩置于动物的口鼻部，该面罩连接有两根软管(输入口和输出口)。用于每种动物的气体流速小鼠-每分钟500cc，大鼠—每分钟2升，以及狗为每分钟40升。每种气氛通过稀释入室内空气而从压缩气体构建，除非另外注明。对于大鼠和小鼠试验，在暴露于试验气体过程中环境温度是7-10℃。对于狗，环境温度是室温(22℃)。
表9构建用于检测小鼠、大鼠和狗中的代谢柔性 的气体环境的描述。
表9显示了每种气体的量，其作为室内空气气氛的百分比给出，除非另外说明。在6小时处理过程中，如通过二氧化碳产生或氧消耗判断的，代谢率大于5倍的抑制迹象通过“有”描述；“无”(这些值减少或低于5倍的减少像这样描述)；“N/D”表示试验未进行。在狗试验(二氧化碳+低的氧+氦)中温度在30分钟的暴露过程中下降约1.5℃。这样的温度降低认为是明显的，因为狗为12kg并且在室内空气中的动物的广泛的基线记录过程中未观察到这样的温度下降。
暴露于多种构建的气氛的动物显示出代谢柔性，所述的代谢柔性由接近环境温度的核心体温(CBT)的改变来证明(图33-40)。图33证明了暴露于含有15％CO2、8％O2和77％He的气氛的大鼠与在类似条件下暴露于300ppm H2S的大鼠比较具有加速的代谢抑制。图34证明在暴露于1.2ppm H2Se的小鼠中CBT显著降低。在10℃的环境温度下暴露于室内空气的大鼠未显示CBT的显著降低(图35)。在7℃下暴露于80％He、20％O2的大鼠也未显示CBT显著降低(图36)。在7℃的环境温度下暴露于15％CO2、20％O2、65％He的气氛的大鼠显示CBT显著降低(图37)。同样，图38显示在7℃下暴露于15％CO2、8％O2、77％He的气氛的大鼠中CBT显著降低。CBT的显著降低也在暴露于9％CO2、20％O2、71％He的气氛的狗中得到证明(图39)。该降低的幅度较低，可能是因为该动物较大尺寸和对热扩散的限制。在暴露于不同浓度的CO2的狗中观察到类似的降低。
实施例18化合物的筛选 实施了化合物筛选来鉴定能够导致小鼠中皮下温度可逆的降低的试验化合物。随后检测了所鉴定的试验化合物它们提供保护免受致死性低氧(与21％的O2平衡的氮气环境的典型环境相对比，在4％的O2时测量的)的能力。整个筛选程序包括3个步骤 1)第一步(1°)筛选以测定将引起试验小鼠的皮下温度可测降低的试验化合物的最小有效剂量； 2)第二步(2°)筛选以测定温度降低的可逆性，如通过在处理后24小时具有正常行为且在24小时或更少时间内恢复到正常皮下温度的试验小鼠定义；以及 3)第三步(3°)筛选以与在相同的低氧条件下未经处理的对照受试者相比，评估试验小鼠幸存于致死性低氧(4％O2)的能力。
这些研究中使用的小鼠是5-6周大的、颈静脉插管(JVC)的雄性C57BL/6小鼠(Taconic)，其背部植有皮下RFID温度传感器(IPTT-300，Bio Medic Data Systems，Inc.(BMDS))并允许其恢复至少24小时。用1或5ml的Luer-Lok注射器(Becton Dickinson)和输注泵(Harvard Apparatus)，通过留置导管输注试验化合物来给小鼠给药。来自BMDS的DAS-6008数据采集模块通过发射应答器(transponder)记录小鼠的皮下温度，并且将该数据输入计算机的电子表格并绘制相对于时间的图。
第一步(1°)筛选 对于第一步筛选，试验化合物的输注液以被认为是最大优化的浓度的浓度制备。用NaOH或HCl将pH调节至6-8，用氯化钠将渗透性调节至250-350mOsm，并且施用的试验化合物的总剂量(mg)除以试验受试者的体重(kg)不会超过它公开的在小鼠中的mg/kg LD50的400％。
将小鼠置于具有不透明壁的高的玻璃底容器中，并通过颈静脉输注。试验化合物用分步方案输注，输注速率在2小时过程中增加(表10)。表10.试验化合物的输注分步方案 在输注过程中，每3-5分钟读取小鼠的皮下温度，并记录小鼠行为的任何改变。第一步筛选的结果显示了试验化合物是否具有降低皮下温度至33℃或更低的能力，并表明了降低皮下温度所需的有效剂量，所述的所需有效剂量是通过第一次观察到稳定的温度降低时试验化合物的输注速率测量的。
第二步(2°)筛选 引起小鼠的皮下温度降低至33℃或更低的试验化合物在第二步筛选中进行检测。在第二步筛选中，将小鼠以第一步筛选中测定的有效输注速率的50％的速率，输注试验化合物60分钟。在输注过程中，通过每3-5分钟进行测量来监测小鼠的皮下温度。如果皮下温度在最初的60分钟内没有降低，则将输注速率加倍并继续输注另外的60分钟。当小鼠的皮下温度降低至33℃或更低时，立刻停止输注，并通过测量皮下温度和观察小鼠的行为来评估小鼠的恢复。在处理后24小时观察和记录小鼠的温度和行为。第二步筛选的结果确定试验化合物是否导致了皮下温度的可逆降低而没有致死现象。
第三步/致死性低氧(3°)筛选在第三步筛选中，将小鼠以第二步筛选中确定的速率输注试验化合物。每3-5分钟测量小鼠的皮下温度直到它减少至33℃，如在第二步筛选中。停止输注并将小鼠与对照小鼠一起立即转移至含氧量低(4％O2)的室内，所述对照小鼠输注载体(盐溶液，148mM，渗透性＝300)或未经处理。将该密闭的玻璃室以连续流动的空气和氮气灌注，以达到期望的4％O2的低氧气氛。如果小鼠在低氧气氛中存活了60分钟，将其转移回室内空气下，并通过记录皮下温度和通过行为观察来监测它的恢复24小时。
对照小鼠通常在6-15分钟内死亡。
用硫化钠(有效剂量为0.79mmol/kg)、硫代甲醇钠(有效剂量为4.61mmol/kg)或硫氰酸钠(有效剂量为4.67mmol/kg)输注的小鼠幸存于暴露于致死性低氧60分钟。用巯乙胺(有效剂量7.58mmol/kg)输注的小鼠在致死性低氧中存活了45分钟；用巯乙胺-S-磷酸钠盐输注的小鼠在致死性低氧中存活了31分钟；并且用四氢噻喃-4-醇输注的小鼠在致死性低氧中存活了15分钟。将这些存活率与对照小鼠的存活率比较，所述对照小鼠通常在低氧环境下于6-15分钟内死亡。
比较而言，在第一步筛选中确定为具有降低体温能力的一些其它试验化合物没有保护动物对抗致死性低氧。硫代乙酸、硒脲和硫代磷酸S-(2-((3-氨丙基)氨基)乙基)酯都降低了体温，但没有提高在低氧下的存活。2-巯基-乙醇、巯基乙和2-巯基乙醚都降低了体温，但在有效降低温度的剂量下是有毒性的。硫脲、二甲硫醚、硒化钠、甲亚磺酸钠、N-乙酰基-L-半胱氨酸在该研究中给出的最高剂量下没有降低皮下温度。排除了二甲基亚砜，因为有效剂量(10％DMSO)太高而被认为不能用于药用目的。
这些研究确定，发展的筛选程序可成功地用于鉴定能够保护遭受致死性低氧的动物的化合物。另外，该研究的结果表明，鉴定的化合物，以及将用本程序鉴定的其它化合物可用于保护患者免受低氧导致的损伤以及缺血性损伤。
实施例19 每天暴露于活性化合物 生理学上适应用硫化氢(H2S)长期处理的能力以及适应需要的时间已在小鼠中得以检测。适应定义为，在动物暴露于室内空气中的80ppm硫化氢进行长期处理时，没有显示核心体温的降低(大于4℃)。长期处理定义为在六周内每周4天，每天4小时暴露于室内空气中的80ppm硫化氢。
在这些研究中使用的小鼠是5-6周大的雄性C57BL/6小鼠或雄性C129小鼠。将遥测装置在试验前植入小鼠的体腔用以记录核心温度。
将小鼠(每次处理8只)在具有分开的用于每只小鼠的室的树脂玻璃盒中，暴露于流速为每分钟10升的硫化氢。检测500cc玻璃碗中的动物的二氧化碳产生和氧消耗具有每分钟0-5升的流速。
在一周期间，平均起来小鼠适应了硫化氢暴露。适应定义为当动物暴露于室内空气中的80ppm硫化氢4小时时，没有显示核心温度的降低(大于4℃)。没有显示核心温度降低的小鼠被认为具有对硫化氢的生理适应。产生了适应的用硫化氢处理的小鼠在与未经处理的对照小鼠比较时，显示了相比于二氧化碳产生(vCO2)，氧消耗(vO2)增加(图42)。适应H2S的小鼠显示较低的呼吸商(RQ比率)，呼吸商被定义为vCO2/vO2的比率或产生的二氧化碳与消耗的氧的比(图43)。
实施例20对地中海贫血的应用 基于在这里介绍的其它模型体系中的当前结果，预期具有血液学障碍(地中海贫血)的动物的红细胞，当用硫化物处理它们时，将具有增加的抵抗氧化损害的能力，导致延长的红细胞存活。将进行下面的试验来确认用活性化合物的处理可以保护患有地中海贫血的动物免于氧化损害。
在第一系列试验中，患有地中海贫血的动物将通过长期暴露于活性化物来治疗。在确定基线的初始试验后，将按照下面总结的方案开始治疗。如果红细胞生成或红细胞存活得以改善，可能早在1-2周内观察到效果，因为地中海贫血红细胞的半衰期估计为4-7天。我们将在两周时观察涂片并获得网织红细胞计数，并在另外两周后开始更广泛的研究。如果在小鼠中检测到红细胞的改善(通过提高的网织红细胞计数和血涂片鉴定)，该研究将继续直到观察到用于每月一次的研究中的metrics中的稳态。该研究具有预计的一年的最终终点。在一年时，将完成红细胞存活研究，并且将处死动物。如果没有观察到改善，暴露将继续一直到另外一年，那时将完成存活研究并处死动物。
方案1 1)动物将进行初始试验。
2)在初始研究后1周内，同样地圈养动物，并且 A)暴露于80ppm H2S 8小时/天； B)不暴露；或者 C)给予具有0.25％二甲硫醚(DMSO)的水，并允许随意饮用(来自先前研究的估计值暗示小鼠将消耗5-10cc/天/小鼠，具有2.5-25微克/天DMSO含量，使用每只小鼠18g的平均体重，消耗估计为700-1,400ug/kg/天)。
在第二系列试验中，将按照下面总结的方案，测定用活性化合物处理的子宫内(in utero)效果。
方案2 1)受孕后3天，怀孕的母鼠(Plugged dam)将在下面组之一中接受处理 A)暴露于80ppm H2S 8小时/天； B)不暴露；或者 C)给予具有0.25％二甲硫醚(DMSO)的水，并允许随意饮用(来自先前研究估计值暗示小鼠将消耗5-10cc/天/小鼠，具有2.5-25微克/天DMSO含量。使用每只小鼠18g的平均体重，消耗估计为700-1,400ug/kg/天)。
2)将允许怀孕的母鼠自然生产，并在生产后不久鉴定幼崽的基因型并且将其处死用于详细的分析。
将在这些试验的整个过程中监测试验动物，如下面指出的。
监测 1)初始研究 1.网织红细胞计数； 2.血涂片； 3.脾和骨骼的计算机断层摄影(CT)； 4.O2消耗和CO2产生； 5.体重； 6.硫化物代谢产物和 7.血细胞比容(60μl血液总量)。
2)在两周时网织红细胞计数和血涂片(5μl血液)。
3)每月一次的研究 1.网织红细胞计数； 2.脾和骨骼的计算机断层摄影； 3.O2消耗和CO2产生； 4.体重；和 5.硫化物代谢产物(抽取的血液少于30μl)。
4)在处死前一个月红细胞存活研究。
5)处死和详细的体外分析。
实施例21 对于镰状细胞性贫血的应用 为了检验这种假设，将使用镰状细胞性贫血(SCD)的小鼠模型，在该小鼠模型中品系经改造而使得其不再表达小鼠Hba和Hbb，但表达人HBA和HBB(Patsy，等，1997)。其模拟在患有镰状细胞性贫血的人中发现的基因、血液学和组织病理学特征，包括不可逆的镰状化的红细胞、贫血和多器官病理学。显著百分比的镰状细胞小鼠不会存活到成年期。
使用该小鼠模型，将检测多种试剂和含有硫化物的化合物对抗SCD的效力。暴露将是急性的和慢性的，并且动物将在出生时或在子宫内暴露。对于子宫内暴露的幼崽存活到出生或存活到成年期将是测量效力的一个终点。表型效果将通过网织红细胞计数、血细胞比容和红细胞(RBC)半衰期测量(与野生型对照比较，其对于SCD通常少20倍)来评价。
实施例21 氰化物暴露试验 该实施例显示，当小鼠暴露于室内空气中的80ppm氰化物时，它们逐渐减少它们的核心体温至约34℃。
这些代谢柔性研究的一个目标是鉴定可以减少氧消耗和保护动物免受低氧损伤的化合物。先前，已经证明硫化氢(H2S)，一种有效的氧消耗的抑制剂，可以减少代谢和保护小鼠和大鼠免于低氧损伤。氰化氢(HCN)在许多方面类似于H2S，并且我们想用我们的代谢输出量的测定法来了解其是否可以用于调节代谢。像H2S，HCN广泛用于工业化学合成并且在许多生物系统(包括人)中发现了它。不知道HCN是否仅仅是碳-氮代谢的副产物或者其是否具有特殊的生物学活性。像H2S，HCN被认为通过与含有过渡金属的蛋白质例如氧化酶和脱氢酶反应来起作用。HCN不与血红蛋白的成分强烈反应。
在人中，NIOSH IDLH(立即危害生命和健康的)值是50ppm。OSHA PEL(可允许的暴露极限)TWA(8小时的时间加权平均值)是10ppm。对于大鼠的LC50是143ppm 60分钟。
为了测量HCN对代谢的影响，将小鼠暴露于增加浓度的HCN(开始为1ppm)。测量或评估氧气(O2)消耗、二氧化碳(CO2)产生、核心体温(BCT)和行为。HCN的浓度以10ppm的增量增加直到观察到对代谢的影响或动物看起来显示出痛苦的迹象。将对代谢的影响定义为上面描述的任何测定值在少于10分钟内10％的变化。
发现当小鼠在室温下暴露于室内空气中的80ppm的氰化物时，它们逐渐降低它们的核心温度至大约34℃。这不同于使用80ppm硫化氢所见的降低，在使用80ppm硫化氢时核心温度降低至大约28℃。而且，与暴露于硫化氢(大约2小时)比较，在暴露于氰化物的小鼠中核心温度的恢复十分缓慢(大约14小时)。
检验了这样的假设在氰化物中，缓慢的恢复(通过核心温度判断)可以通过短暂的暴露于80ppm的硫化氢来救援。这是基于这样的想法一种保守的酶即硫氰酸生成酶(以及其它类似的酶)可能使用硫化氢和氰化物来产生相对低毒性的物质硫氰酸。已经显示了硫氰酸生成酶可以使用氰化物和硫代硫酸盐来产生硫氰酸。(Chen 1933)此外，静脉内施用硫代硫酸盐是美国用于治疗氰化物中毒的护理标准。发现在暴露于氰化物后恢复核心体温的时间通过用硫化氢短暂处理而减少。这些结果提示，硫化氢暴露可被用于治疗其中患者遭受氰化物中毒的状况。
************* 根据本公开内容，可以制备和执行所有在此公开和要求保护的组合物和方法而不需要过度试验。虽然本发明的组合物和方法是根据优选的实施方案来描述，对本发明的那些技术人员来说明显的是，可以对所述的组合物和方法进行改变，以及在在此描述的方法的步骤或步骤的顺序中进行改变而不背离本发明的概念、精神和范围。更特别地是，将明显的是可以用在化学和生理学两者上都相关的某些物质替代在此描述的物质，同时将获得相同或类似的结果。对本领域技术人员明显的所有该类似的取代和修饰被认为在由附带的权利要求定义的本发明的精神、范围和概念内。
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通过引用特别将下面的参考文献(在它们提供对在此列出的那些的示例性的过程或其它细节的补充的程度上)并入本文中。
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权利要求
1.用于增强生物物质的存活力的方法，该方法包括给所述生物物质提供有效量的至少一种活性化合物。
2.权利要求1的方法，其中所述活性化合物是氧拮抗剂。
3.权利要求1的方法，其中将所述物质暴露于活性化合物。
4.权利要求1的方法，其中所述活性化合物是硫属化物。
5.权利要求1的方法，其中所述活性化合物具有式I或式IV的化学结构。
6.权利要求5的方法，其中将所述物质暴露于式I或式IV的化学结构的前体。
7.权利要求1的方法，其中给所述物质提供活性化合物的组合。
8.权利要求1的方法，其中在所述物质中的损伤、疾病发作或进展、或出血之前、期间或之后，给所述物质提供所述活性化合物。
9.权利要求8的方法，其中所述损伤包括出血。
10.权利要求9的方法，其中所述损伤来自外部的物理源。
11.权利要求8的方法，其中在损伤之前或者在疾病的发作或进展之前提供所述活性化合物。
12.权利要求8的方法，其中所述损伤或疾病与所述物质的代谢或温度的降低相关。
13.权利要求12的方法，其中所述损伤是外科手术。
14.权利要求11的方法，其中在损伤或者疾病的发作或进展期间或之后不提供所述活性化合物。
14.2.权利要求的方法，其中在疾病的进展期间提供所述活性化合物。
14.3.权利要求14.2的方法，其中所述疾病是地中海贫血、镰状细胞病或囊性纤维化。
15.权利要求11的方法，其中给所述物质提供所述活性化合物，该化合物的量和所述提供的持续时间足以减少CO2放出的至少25％。
16.权利要求11的方法，其中给所述物质提供所述活性化合物，该化合物的量和所述提供的持续时间不会引起该物质进入停滞。
17.权利要求11的方法，其中给所述物质提供所述活性化合物，该化合物的量和所述提供的持续时间保护该物质免于损害或死亡，其中所述损害或死亡是由损伤或疾病的发作或进展引起的。
18.权利要求11的方法，其中给所述物质提供所述活性化合物，该化合物的量和所述提供的持续时间足以增加该物质在损伤或疾病的发作或进展之后进入停滞的速率。
19.权利要求11的方法，其中给所述物质提供所述活性化合物，该化合物的量和所述提供的持续时间足以在损伤或疾病的发作或进展之后防止CO2放出的进一步降低。
20.权利要求11的方法，其中给所述物质提供所述活性化合物，该化合物的量和所述提供的持续时间足以引起该物质进入停滞。
21.权利要求1的方法，其中在低氧或缺氧条件下或在暴露于低氧或缺氧条件之前，给所述物质提供所述活性化合物。
22.权利要求21的方法，其中在无所述活性化合物时，所述的低氧或缺氧条件将损害所述物质。
22.4.权利要求22的方法，其中在暴露于低氧或缺氧条件期间，不将所述物质暴露于所述活性化合物。
23.权利要求21的方法，其中给所述物质提供气体、半固态液体、液体或固体形式的所述活性化合物。
24.权利要求23的方法，其中给所述物质提供至少一种气体形式的所述活性化合物。
25.权利要求23的方法，其中给所述物质提供至少一种半固态液体形式的所述活性化合物。
26.权利要求23的方法，其中给所述物质提供至少一种液体形式的所述活性化合物。
27.权利要求26的方法，其中将所述活性化合物在所述液体中起泡。
28.权利要求26的方法，其中将所述活性化合物溶解于所述液体中。
29.权利要求1的方法，其中依次提供至少两种活性化合物。
30.权利要求1的方法，其中一起提供至少两种氧拮抗剂。
31.权利要求1的方法，其中将所述物质暴露于所述氧拮抗剂之一持续约30秒至30天的一段时间。
32.权利要求7的方法，其中所述组合包括氧拮抗剂，该氧拮抗剂具有选自以下组的至少一种的化学式
a)具有式I的化合物；
b)具有式II的化合物；
c)具有式III的化合物；
d)具有式IV的化合物；
或其盐或前体。
33.权利要求32的方法，其中所述组合包含多于一种的来自相同组的活性化合物。
34.权利要求32的方法，其中至少一种活性化合物来自组a)。
35.权利要求32的方法，其中至少一种活性化合物是硫属化物或硫属化物盐。
36.权利要求35的方法，其中至少一种活性化合物包含硫。
37.权利要求35的方法，其中至少一种活性化合物包含硒。
38.权利要求35的方法，其中至少一种活性化合物是硫属化物盐。
39.权利要求38的方法，其中所述硫属化物盐选自由Na2S、NaHS、K2S、KHS、Rb2S、Cs2S、(NH4)2S、(NH4)HS、BeS、MgS、CaS、SrS和BaS组成的组。
40.权利要求33的方法，其中所述组合包含多于一种来自组a)的活性化合物。
41.权利要求40的方法，其中所述氧拮抗剂的组合包含CO2。
42.权利要求32的方法，其中至少一种活性化合物来自组b)。
43.权利要求42的方法，其中所述活性化合物具有式II(a)、式II(b)或式II(c)的化学式。
44.权利要求32的方法，其中至少一种活性化合物来自组c)。
45.权利要求44的方法，其中所述活性化合物具有式III(a)、式III(b)、式III(c)、式III(d)、式III(e)、式III(f)、式III(g)或式III(h)的化学式。
46.权利要求1的方法，其中通过吸入、注射、导管插入、浸渍、灌洗、灌注、局部应用、吸收、吸附或经口施用，给所述生物物质提供所述活性化合物。
47.权利要求1的方法，其中通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、鞘内、玻璃体内、阴道内、直肠内、表面、瘤内、肌内、腹膜内、眼内、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、经口、表面、局部、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注、经由导管或经由灌洗施用至所述生物物质，给所述生物物质提供所述活性化合物。
48.权利要求1的方法，该方法包括将所述生物物质暴露于受控制的温度和/或压力环境。
49.权利要求48的方法，其中将所述生物物质暴露于受控制的温度环境。
50.权利要求49的方法，其中所述生物物质达到非-生理学的核心温度。
51.权利要求50的方法，其中将所述生物物质暴露于低于约20℃的受控制的温度环境。
52.权利要求49的方法，其中在提供一种或多种活性化合物之前和/或同时，将所述生物物质暴露于受控制的温度环境。
53.权利要求1的方法，其中一种或多种活性化合物包含能将一种或多种活性化合物靶向至线粒体的阳离子结构。
54.权利要求1的方法，其中所述生物物质要被保藏。
55.权利要求54的方法，其中所述生物物质包括血小板。
56.权利要求54的方法，其中所述生物物质要被移植。
57.权利要求1的方法，其中所述生物物质有缺血-再灌注损伤的风险。
58.权利要求57的方法，其中在所述生物物质内诱导了心麻痹。
59.权利要求1的方法，其中所述生物物质是有出血性休克风险的生物。
60.权利要求1的方法，该方法进一步包括鉴定需要处理的生物物质。
61.权利要求1的方法，该方法进一步包括监测所述生物物质的来自所述活性化合物的毒性。
62.权利要求1的方法，其中以药物组合物的形式将所述活性化合物提供给所述生物物质。
63.用于增强生物物质的存活力的方法，该方法包括给所述物质提供有效量的i)活性化合物或活性化合物的组合和ii)低氧条件。
64.用于增强生物物质的存活力的方法，该方法包括给所述物质提供有效量的组合物，该组合物具有一种或多种具有式II的化合物、或其盐或前体。
65.用于增强生物物质的存活力的方法，该方法包括给所述物质提供有效量的组合物，该组合物具有一种或多种具有式III的化合物、或其盐或前体。
66.用于增强生物物质的存活力的方法，该方法包括给所述物质提供有效量的组合物，该组合物具有一种或多种具有式IV的化合物、或其盐或前体。
67.用于增强生物物质的存活力的方法，该方法包括给所述物质施用有效量的具有式I、式II、式III和/或式IV的化合物、或其盐或前药。
68.用于防止或减少在不利条件下对生物物质的损害的方法，该方法包括给所述生物物质提供有效量的活性化合物，其中防止或减少了损害。
69.用于产生生物的保藏的原种的方法，该方法包括将所述生物暴露于有效量的选自以下组的一个或多个化合物
a)具有式I的化合物；
b)具有式II的化合物；
c)具有式III的化合物；
d)具有式IV的化合物；
或其盐或前药。
70.用于可逆地抑制生物中的代谢的方法，该方法包括给所述生物物质提供有效量的活性化合物，该活性化合物不是鱼藤酮。
71.权利要求69的方法，该方法进一步包括将所述生物暴露于低氧条件。
72.权利要求69的方法，其中所述生物是蝇类、鱼类、蛙类或其胚胎。
73.用于在生物中诱导睡眠的方法，该方法包括给所述生物提供有效量的活性化合物，其中该有效量小于可在该生物中诱导停滞的量。
74.用于麻醉生物物质的方法，该方法包括给所述物质提供有效量的活性化合物，其中该有效量小于可在该生物中诱导停滞的量。
75.保护生物物质免受损伤、疾病的发作或进展、或死亡的方法，该方法包括在所述损伤、疾病的发作或进展、或死亡之前，给所述物质提供有效量的活性化合物，其中该有效量小于可在该生物物质中诱导停滞的量。
76.权利要求75的方法，其中所述生物物质正在出血。
77.防止生物流血至死的方法，该方法包括给所述流血的生物提供有效量的活性化合物来防止死亡。
78.权利要求77的方法，其中所述生物进入出血性休克。
79.用于在生物物质中诱导停滞的方法，该方法包括
a)鉴定其中期望停滞的生物物质；以及
b)给该生物物质提供有效量的至少一种有效量的活性化合物来诱导体内生物物质的停滞。
80.权利要求79的方法，其中给所述的生物物质提供有效量的不同活性化合物的组合。
81.药学上可接受的制剂中的药物组合物，它包含至少一种含有活性化合物的混合物。
82.权利要求81的药物组合物，其中所述活性化合物是氧拮抗剂。
83.权利要求82的药物组合物，其中所述氧拮抗剂是直接的氧拮抗剂。
84.权利要求82的药物组合物，其中所述氧拮抗剂是H2S。
85.权利要求84的药物组合物，该药物组合物包含有效剂量的H2S，当施用给患者时，提供10μM至10mM的Cmax或稳态血浆浓度。
86.权利要求81的药物组合物，其中所述活性化合物具有式I、式II、式III、式IV的结构、或其盐或前体。
87.权利要求81的药物组合物，其中所述活性化合物是硫属化物。
88.权利要求72的药物组合物，其中所述硫属化物是H2S或者其盐或前体。
89.权利要求66的药物组合物，其中所述组合物是液体。
90.一种制造品，它包含包装材料和包含在该包装材料中的活性化合物，其中所述包装材料包含显示所述活性化合物可以用于在体内生物物质中诱导停滞的标签。
91.权利要求90的制造品，它包含药学上可接受的稀释剂。
92.权利要求91的制造品，其中所述活性化合物在第一个密封的容器中提供，并且所述药学上可接受的稀释剂在第二个密封的容器中提供。
93.权利要求92的制造品，它进一步包含用于混合所述活性化合物和所述稀释剂的说明书。
94.权利要求91的制造品，其中所述活性化合物被重构用于在体内的生物物质中诱导停滞。
95.权利要求90的制造品，它进一步包含缓冲剂。
96.权利要求90的制造品，其中所述活性化合物具有式I、式II、式III、式IV的化学结构、或其盐或前药。
97.权利要求90的制造品，其中所述活性化合物是氧拮抗剂。
98.权利要求90的制造品，其中所述活性化合物是硫属化物。
99.权利要求98的制造品，其中所述硫属化物是H2S或者其盐或前体。
100.权利要求90的制造品，其中所述标签显示所述氧拮抗剂可以用于在需要这种处理的患者中诱导停滞。
101.一种制造品，它包含包装在一起的以下物质活性化合物、关于使用该活性化合物的说明书，其包括(a)鉴别需要停滞处理的体内组织；和(b)给所述的体内生物物质施用有效量的所述活性化合物。
102.一种制造品，它包含含有活性化合物的医用气体和标签，该标签包含关于在生物物质中诱导停滞的细节或用法和施用。
103.用于将活性化合物递送至需要停滞处理的组织位点的试剂盒，包含
适合于形成针对组织位点的密封包裹物的覆盖物；
含有氧拮抗剂的容器；以及
在所述伤口覆盖物中的进口；
其中所述含有活性化合物的容器与所述进口连通。
104.权利要求103的试剂盒，它进一步包含位于所述覆盖物中的出口，其中该出口与负压源连通。
105.权利要求104的试剂盒，其中安置所述出口，使之与负压源流体连通。
106.权利要求105的试剂盒，它进一步包含柔性导管，该导管连通所述出口和负压源。
107.权利要求106的试剂盒，它进一步包含一个罐，该罐与所述出口和负压源之间流体连通。
108.权利要求107的试剂盒，其中所述罐是可拆卸的罐。
109.权利要求106的试剂盒，其中含有活性化合物的所述容器与所述入口气体连通。
110.权利要求104的试剂盒，其中所述容器含有气态活性化合物。
111.权利要求106的试剂盒，其中所述容器含有液化气体活性化合物。
112.权利要求111的试剂盒，它进一步包含气化器，该气化器与含有活性化合物的所述容器和入口之间连通。
113.权利要求106的试剂盒，它包含返回出口，该出口与含有所述活性化合物的容器连通。
114.权利要求103的试剂盒，其中所述活性化合物是一氧化碳、二氧化碳或硫化氢。
115.权利要求103的试剂盒，其中所述组织包括伤口位点。
116.权利要求103的试剂盒，其中所述覆盖物包括弹性材料。
117.权利要求116的试剂盒，它进一步包含覆盖所述覆盖物边缘的压敏粘合剂。
118.权利要求103的试剂盒，其中所述负压源是真空泵。
119.用于将氧拮抗剂递送至生物物质的方法，该方法包括使用权利要求103的试剂盒。
120.用于筛选候选活性化合物的方法，该方法包括
a)将斑马鱼胚胎暴露于物质；
b)测量所述胚胎的心率；
c)将存在所述物质时胚胎的心率与没有该物质时的心率比较，其中心率的降低鉴定该物质为候选活性化合物。
121.权利要求120的方法，其中通过计算心跳的次数测量所述胚胎的心率。
122.权利要求120的方法，其中在测量心率的同时，在解剖显微镜下观察所述斑马鱼胚胎。
123.权利要求120的方法，它进一步包括
d)将小鼠暴露于所述候选活性化合物并测定以下参数中的一种或多种
i)核心体温；
ii)氧消耗；
iii)运动力；或
iv)二氧化碳产生。
124.权利要求120的方法，其中所述化合物具有式I或式IV的结构。
125.用于筛选候选活性化合物的方法，该方法包括
a)将线虫暴露于物质；
b)测定以下细胞呼吸因素中的一种或多种
i)核心体温；
ii)氧消耗；
iii)运动力；或
iv)二氧化碳产生；
c)将存在所述物质时线虫的细胞呼吸因素与没有该物质时的细胞呼吸因素比较，其中所述特征的减少鉴定该物质为候选活性化合物。
126.权利要求125的方法，其中测定运动力。
127.权利要求125的方法，该方法进一步包括鉴定所述物质。
128.权利要求124的方法，其中所述化合物具有式I或式IV的结构。
129.保护哺乳动物免于遭受由外科手术引起的细胞损害的方法，该方法包括在外科手术之前给所述哺乳动物提供足以诱导该哺乳动物进入预停滞的量的硫化氢。
130.权利要求129的方法，其中所述外科手术选自选择性外科手术、计划的外科手术或急救外科手术。
131.权利要求129的方法，其中静脉内施用硫化氢。
132.权利要求129的方法，其中通过吸入施用硫化氢。
133.权利要求129的方法，其中所述外科手术是心肺外科手术。
134.保护哺乳动物免于遭受由疾病或不利医学状况引起的细胞损害的方法，该方法包括在所述疾病发作或进展之前给所述哺乳动物提供足以诱导该哺乳动物进入预停滞的量的硫化氢。
135.权利要求134的方法，其中所述疾病或不利的医学状况选自出血性休克、心肌梗塞、急性冠状动脉综合征、心搏停止、新生儿低氧/局部缺血、缺血性再灌注损伤、不稳定型心绞痛、血管成形术后、动脉瘤、外伤和失血。
136.用于在受试者中诱导呼吸暂停的方法，该方法包括给所述受试者施用有效量的硫化氢。
137.权利要求136的方法，其中所述受试者在流血或有流血的风险。
138.权利要求137的方法，该方法进一步包括从所述受试者中获得血液样品。
139.权利要求138的方法，该方法进一步包括评价所述血液样品的硫化氢暴露。
140.权利要求136的方法，该方法进一步包括鉴定需要处理的受试者。
140.3.权利要求136的方法，其中给所述患者提供超过3,000ppm的硫化氢。
140.4.权利要求136的方法，其中给所述患者提供硫化氢持续大约5分钟或更短时间。
140.5.权利要求140.4的方法，其中给所述患者提供超过3,000ppm的硫化氢持续大约5分钟或更短时间。
140.6.权利要求140.5的方法，其中给所述患者提供硫化氢持续大约3分钟或更短时间。
141.用于治疗患者中出血性休克的方法，该方法包括提供有效量的硫化氢。
142.权利要求141的方法，其中使用喷雾器给所述患者提供硫化氢。
143.权利要求141的方法，其中给所述患者提供超过3,000ppm的硫化氢。
144.权利要求141的方法，其中给所述患者提供硫化氢持续大约5分钟或更短时间。
145.权利要求144的方法，其中给所述患者提供超过3,000ppm的硫化氢持续大约5分钟或更短时间。
146.权利要求145的方法，其中给所述患者提供硫化氢持续大约3分钟或更短时间。
147.权利要求141的方法，其中连续地给所述患者提供硫化氢。
148.权利要求141的方法，其中给所述患者提供单剂量的硫化氢。
149.权利要求141的方法，其中给所述患者提供多剂量的硫化氢。
全文摘要
本发明涉及氧拮抗剂和其它活性化合物用于在体内细胞、组织和/或器官或在整个生物中诱导停滞或预停滞，以及用于增强它们的存活力的用途。本发明包括用于在任意这些生物材料中增强存活力和获得停滞或预停滞，以便保藏和/或保护它们的组合物、方法、制造品和仪器。在特定的实施方案中，还存在使用所述的活性化合物用于器官移植、高体温、伤口愈合、出血性休克、旁路外科手术的心麻痹、神经变性、低体温和癌症的治疗方法和仪器。
文档编号A61K33/04GK101203231SQ200680022196
公开日2008年6月18日 申请日期2006年4月20日 优先权日2005年4月20日
发明者M·B·洛斯, M·莫里森, E·布莱克斯通, D·米勒 申请人:弗雷德哈钦森癌症研究中心