疫苗的制作方法

专利名称：：疫苗的制作方法疫苗本发明涉及人乳头瘤病毒(HPV)疫苗发明背景乳头瘤病毒为高度种属特异性的小DNA肿瘤病毒。目前为止，已经发现了100多种人乳头瘤病毒(HPV)基因型。HPV通常而言对皮肤(例如HPV-1和-2)或粘膜表面(例如HPV-6和-ll)具有特异性，并经常引起良性肿瘤(疣)，持续数月或数年。这种良性胂瘤对相关的个体而言，是痛苦的，但除少数例外，不会有生命危险。一些HPV还与胂瘤有关，称为致癌型HPV。HPV和人肿瘤之间最强的阳性相关，是存在于HPV-16和HPV-18与宫颈癌之间的阳性相关。宫颈癌是发展中国家最为常见的肿瘤，全世界每年出现约500,000新病例。其它可引起癌症的HPV型为型31、33、35、39、45、51、52、56、58、.59、66和68。型16和18与宫颈癌相关度最高。型31和45与癌症风险的相关性在其次(MunozN,BoschFX，deSanjoseS等.InternationalAgencyforResearchonCancerMulticenterCervicalCancerStudyGroup(国际癌症研究所多中心子宫颈癌研究小组).NEng画ed2003;348:518-27.)。已有提议用HPV病毒样颗粒(VLP)作为有潜力的疫苗治疗HPV。动物研究表明VLP并不产生针对其它HPV型感染的交叉保护作用一例如见Suzich,J.A.等的ProcNatlAcadSci,92:11553-11557,1995和Breitburd的SeminarsinCancerBiology,vol9,1999,pp431-445。WO2004/056389中公开了HPV16、HPV18VLP疫苗可提供针对除16和18型之外HPV型的交叉保护作用。在某几组HPV型中观察到具有统计学意义的保护作用。仍需要能防御多种HPV型的疫苗。发明简述本发明涉及防御HPV感染和/或疾病的接种程序，所述程序包括递送包含至少来自HPV16和18的LI蛋白或其免疫原片段的第一HPV疫苗，和不含第一疫苗HPV16和18LI组分的，而含有至少一种其它致癌性HPV型的LI蛋白或其免疫原片段的第二HPV疫苗，其中所述的第一和第二疫苗可以任何顺序递送，并且间隔适合的时间递送。本发明进一步涉及防御HPV感染或疾病的接种程序，所述程序包括递送包含至少来自HPV16和18的LI蛋白或其免疫原片段的第一HPV疫苗，在适合的间隔后，递送不含第一疫苗HPV16和18LI组分的，而含有至少一种其它致癌性HPV型的LI蛋白或其免疫原片段的第二HPV疫苗。本发明进一步涉及防御HPV感染和/或疾病的方法，所述方法包括递送包含至少来自HPV16和18的LI蛋白或其免疫原片段的第一HPV疫苗，和不含第一疫苗HPV16和18LI组分的，而含有至少一种其它致癌性HPV型的LI蛋白或其免疫原片段的第二HPV疫苗，其中的第一和第二疫苗可以任何顺序递送，并且间隔适合的时间递送。本发明还进一步涉及防御HPV感染和/或疾病的方法，所述方法包括递送包含至少来自HPV16和18的LI蛋白或其免疫原片段的第一HPV疫苗，在适合的间隔后，递送另一种不含第一疫苗HPV16和18LI组分的，而含有至少一种其它致癌性HPV型的LI蛋白或其免疫原片段的第二HPV疫苗。本发明还涉及发明的疫苗组合物本身。本发明还涉及包含本发明第一和第二疫苗组合物的试剂盒。本发明一方面涉及来自一种第一HPV型的HPVLI蛋白或其免疫原片段在制备用以加强由来自第二种不同HPV型的HPVLl蛋白或其免疫原片段引发的免疫响应的药物中的用途。一方面，第二HPV型Ll蛋白或其片段以病毒样颗粒形式存在，并用来加强由病毒样颗粒形式存在的第一HPV型Ll蛋白或其片段引发的免疫响应。本发明还涉及来自非HPV16林HPVLl蛋白，优选以VLP形式存在的Ll蛋白在加强HPV16免疫响应中的用途。本发明还涉及来自非HPV18林HPVLl蛋白，优选以VLP形式存在的Ll蛋白在加强HPV18免疫响应中的用途。一方面，用以加强免疫响应的病毒林为在实施例1中发现的对其具有一定交叉保护作用的病毒林，例如HPV31、HPV45和HPV52。图1和图5图示了不同的初始免疫和加强免疫方案产生的抗HPV16的抗体。图2和图6图示了不同的初始免疫和加强免疫方案产生的抗HPV18的抗体。图3和图7图示了不同的初始免疫和加强免疫方案产生的抗HPV31的抗体。图4和图8图示了不同的初始免疫和加强免疫方案产生的抗HPV45的抗体。图9为图1-8中抗体响应的总结。图10和图14图示了不同的初始免疫和加强免疫方案后CD4+细胞群中HPV16Ll特异性T细胞百分数。图11和图15图示了不同的初始免疫和加强免疫方案后CD4+细胞群中HPV18Ll特异性T细胞百分数。图12和图16图示了不同的初始免疫和加强免疫方案后CD4+细胞群中HPV31Ll特异性T细胞百分数。图13和图17图示了不同的初始免疫和加强免疫方案后CD4+细胞群中HPV45Ll特异性T细胞百分数。图18为图10-13中CMI数椐的总结。发明详述按与之相关的某些组的HPV型的情况进行评价，结果表明由HPV16和HPV18提供的防御突发性和持续性感染的交叉保护是普遍存在的，WO2004/056389对此做了公开。我们惊讶的发现，针对某种(非HPV16、HPVl8)HPV型(正如通过HPV16和HPV18疫苗抗该类型的有效性评定)的交叉保护高于针对某种其它(非HPV16、HPV18)HPV型。交叉保护可被认为由含有一种HPV类型的疫苗提供的防御不同HPV型引起的感染(突发性或持续性)和/或疾病的保护。交叉保护可通过考虑疫苗的效果(V.E.)进行评价，其中的V.E.为对特定的HPV型而言，疫苗组比安慰剂组在防御感染或疾病方面提高的百分数。感染可以为突发性或持续性感染。疾病可以为细胞学异常、ASCUS、CIN1、CIN2、CIN3或与HPV感染有关的宫颈癌。例如感染可以通过PCR进行评价。疾病以可以通过组织学检查或生化标志物分析例如pi6进行评价。当交叉保护统计学意义高于安慰剂时，可以认为存在一定水平的交叉保护作用。比较适宜的是，交叉保护水平高于0%，达到20%,达到40%，达到60%,达到70%,达到80%，甚至80%以上。这可通过HPV疫苗与安慰剂组比较，对预防该疫苗中不存在的HPV型引起的感染或疾病的疫苗效力进行测量。该发现对疫苗设计和疫苗接种程序的设计有潜在意义。例如，观察到交叉保护的HPV型可用做另一HPV型的初始免疫或加强免疫剂，在适合的间隔后，可提供同源性保护，而且可降低对特定HPV型的接种次数。本发明涉及防御HPV感染或疾病的接种程序，所述程序包括递送包含至少来自HPV16和18的L1蛋白或其免疫原片段的第一HPV疫苗，和不含第一疫苗HPV16和18LI组分的，而含有至少一种其它致癌性HPV型的LI蛋白或其免疫原片段的第二HPV疫苗。其中，第一疫苗和第二疫苗可以任何次序递送，且在适当的间隔后递送。适当的间隔可以为7天、2周、4周、6周、8周、3月、4月、5月、6月、1年。接种疫苗的程序可以例如为0月、1月，或0月、2月，或0月、4月，或0月、6月。一般而言，适当的间隔是指该间隔内第二次递送疫苗时可以观察到加强效应的间隔，例如通过检测抗体滴度或细胞介导的免疫。一般而言，适合的间隔是指该间隔内已通过递送一种疫苗引发初次免疫响应，这可例如通过在递送第二疫苗前检测血清中抗体滴度进4亍测量。一方面，适当的间隔为初次响应，典型的是抗体响应达峰后的很短时间。一方面，该间隔为初次接种后2-26周，比较适合的间隔为2-22周、2-18周、2-14周、2-12周、2-10周、2-8周、2-6周，在一方面为初次接种后1个月。致癌性HPV型包括HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68。比较适宜的是，在第一疫苗的至少一个组分与第二疫苗的一个组分间可以观察到交叉保护。例如，比较适宜的是，第一疫苗包含来自HPV16和HPV18的Ll蛋白及其免疫原片段，而第二疫苗包含来自HPV31或HPV45或HPV52的Ll蛋白或其免疫原片段。一方面，第一疫苗包含来自HPV16和18的Ll蛋白或其免疫原片段。另一方面，第一疫苗包含来自其它HPV型的Ll蛋白或其免疫原片羊殳，例如HPV型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68中的一种或多种。在一方面，该HPV型为HPV33。在另一方面，第二疫苗至少不包含来自第一疫苗的HPV16和18的抗原，而包含来自已证明具有与本文HPV16和/或HPV18交叉保护作用的HPV型的Ll蛋白或其免疫原片段，比较适宜的为HPV31和/或45和/或52。第二疫苗可包含其它HPV型，例如HPV型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68中的一种或多种。一方面，第二疫苗包括来自HPV31和/或HPV45的Ll蛋白或其免疫原片段。在另一方面，第二疫苗包括来自HPV52型的Ll蛋白或其免疫原片段。另一方面，第二疫苗包括来自HPV58的Ll蛋白或其免疫原片段。本发明涉及一种疫苗组合物，所述组合物包含来自HPV31的L1蛋白或其免疫原片段，但不包含来自至少HPV16和18的Ll蛋白或其免疫原片段。本发明还涉及一种疫苗的组合物，所述组合物包含来自HPV45的Ll蛋白或其免疫原片段，但不包括来自至少HPV16和18的Ll蛋白或其免疫原片段。本发明还涉及一种疫苗的组合物，所述组合物包含来自HPV52的Ll蛋白或其免疫原片段，但不包括来自至少HPV16和18的L1蛋白或其免疫原片段。在另一方面，第二疫苗不包含所有含有第一疫苗抗原的HPVLl。比较适宜的是，第一疫苗和第二疫苗没有相同的Ll蛋白或相同的完整蛋白片段。为避免疑义，用于第一和第二疫苗的Ll蛋白或Ll片段中的区域可以相似或相同。但使用相同的抗原(抗原或为整个L1或其片段)，在这方面，在第一和第二疫苗中都不做为首选。在一方面，第一疫苗和第二疫苗并不具有来自同一HPV型的Ll蛋白或其免疫原片段。在一方面，第一疫苗的组分包含在系统发生学上并不亲近的HPV型，例如HPV16和HPV18。在另一方面，第二疫苗的组分包含在系统发生学上并不近缘的HPV型，例如HPV31和HPV45。据deVilliers等所评定的(Virology.2004Jim20;324(1):17-27)，系统发生学上不近缘的HPV型属于不同的种群。比较适宜的是，第一疫苗中的HPV16和/或HPV18组分可预防第二疫苗中的至少一种HPV型引起的感染和/或疾病。比较适宜的是，本发明中第一和第二疫苗包含来自以下HPV型的HPVLlVLP:第一疫苗HPV16、HPV18和HPV33的组合。第一疫苗可包含另外的HPV58。第二疫苗HPV31、HPV45和任选HPV52和/或HPV58的组合。比较适宜的是，第二次递送疫苗加强了针对第一次递送疫苗中至少一种组分的免疫响应。加强效果优选用本领域标准方法例如ELISA测定抗体滴度进行评价。一方面，HPVLl蛋白或其免疫原片段用于增强先前激发的针对不同的HPV型的交叉反应抗体。一方面本发明涉及来自一种HPV型的Ll蛋白或其免疫原片段在加强针对第二不同HPV型免疫响应中的用途。一方面本发明涉及来自一种HPV型的Ll蛋白或其免疫原片段在加强针对同源HPV型免疫响应中的用途。一方面本发明涉及来自一种HPV型的Ll蛋白或其免疫原片段在加强针对第二不同HPV型免疫响应中的用途，其中第二HPV型与第二HPV型系统发生学相关。两种HPV型之间的系统发生学关系对本领域技术人员而言是公知的(例如见deVillers等.Virology.2004Jun20;324(1):17-27)。在该出版物中，可见乳头瘤病毒被分成系统发生学相关的不同种类。例如，在种16中，有型16、31、33。在种7中，有型18和45。在另一方面，本发明涉及HPV31Ll蛋白或其免疫原片段在制备用以加强针对(或由其引起)包含L1蛋白或其片段的HPV16疫苗的免疫响应的药物中的用途。在另一方面，本发明涉及HPV52Ll蛋白或其免疫原片段在制备用以加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV16疫苗的免疫响应的药物中的用途。在另一方面，本发明涉及HPV45Ll蛋白或其免疫原片段在制备用以加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV18疫苗的免疫响应的药物中的用途。在另一方面，本发明涉及HPV18Ll蛋白或其免疫原片段在制备用以加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV45疫苗的免疫响应的药物中的用途。在另一方面，本发明涉及HPV16Ll蛋白或其免疫原片段在制备用以加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV31疫苗的免疫响应的药物中的用途。在另一方面，本发明涉及HPV16Ll蛋白或其免疫原片段在制备用以加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV52疫苗的免疫响应的药物中的用途。一方面，本发明涉及防御HPV感染或疾病的接种程序，所述程序包括递送包含至少来自HPV16和18的Ll蛋白或其免疫原片段的第一HPV疫苗，在适合的间隔后，递送不含第一疫苗HPV16和18Ll组分的，而含有至少一种其它致癌性HPV型的Ll蛋白或其免疫原片段的第二HPV疫苗。本发明的这一方面，上述限定的第一和第二疫苗的组分可以相反的顺序递送。例如，递送的第一HPV可包含HPV31和HPV45抗原，而递送的第二疫苗包含HPV16和HPV18抗原。本发明的疫苗另外包含本发明限制范围内的来自其它HPV型的抗原，例如其它致癌型抗原(例如HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68),皮肤型(例如型5,8)和生殖祝型(型6,11)。比较适宜的是，每种疫苗能够预防该疫苗中存在的HPV型引起的持续性感染。比较适宜的是，每种疫苗能够预防该疫苗中存在的HPV型引起的突发性感染。突发性和持续性宫颈感染在实施例1中有详细说明。比较适宜的是，每种疫苗可防御与HPV感染(例如ASCUS、CIN1、CIN2、M3、宫颈癌)相关的细胞学异常，优选由本发明中不含有的HPV引起的感染，例如HPV31、45或52。来自其它HPV型的Ll蛋白或蛋白片段可包含在本发明的疫苗中，例如皮肤型(特别是HPV5和8)及与生殖疣相关的类型例如HPV6和11，型6和11本文中^f皮认为非致癌型。在一方面，疫苗可包含不同量的HPVLl蛋白组分，优选病毒样颗粒。一方面，HPV16和HPV18VLP的剂量可以比其它致癌型HPV例如HPV33或58更高。在另一方面，仅HPV16和HPV18VLP人用每剂量为20pg,而其它HPVVLP可以更低剂量用途，例如人用每剂量15或10吗。在本发明一个方面中，该疫苗可包含一种HPV早期抗原，例如选自由HPVE1、E2、E3、E4、E5、E6、E7或E8组成的列表中的一种抗原。在一可替代方面中，该疫苗可不含一种HPV早期抗原，例如选自由HPVEl、E2、E3、E4、E5、E6、E7或E8组成的列表中的一种抗原。一方面，本发明的疫苗组分为三价(包含一种来自3种不同致癌性HPV型的HPVLl蛋白或其片段)。在另一方面，该疫苗可以为四价，在另一方面该疫苗为五价，在另一方面该疫苗为六价，在另一方面该疫苗为七价，在另一方面该疫苗为八价。更高价也是本文所预料到的。在另一方面，就致癌性HPV型而言，所述疫苗至少为四价或至少为五价，或至少为六价，或至少七价，或至少八价。在另一方面，本发明的组合疫苗包含的片段中有来自4、5、6、7、8、9或IO种不同HPV型的Ll蛋白或免疫原片段。优选的是，疫苗中HPV组分的组合并不明显影响任何一种HPV组分的免疫原性。在本发明疫苗纽合中，特别优选HPV抗原之间不存在生物学相关的干扰，以使本发明的组合疫苗能够提供针对疫苗中存有的每个HPV基因型引起的感染的有效防御。比较适合的是，针对疫苗组合中的特定HPV型的免疫响应至少为该相同HPV型单独测定时的免疫响应的50%,4尤选100%或大约100%。对于针对HPV16和HPV18的响应，本发明中的组合疫苗优选激发的免疫响应至少为HPV16/HPV18组合疫苗激发的免疫响应的50%。比较适宜的是，在本发明疫苗引起的免疫响应所处于的水平下仍可见对每种HPV型的保护效应。免疫响应可以用适当方法的一企测，例如通过在临床前或人体试验中测定抗体响应。在本
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内，抗体响应的检测是公知的技术，例如在WO03/077942中有公开说明。本发明的疫苗或组合物包含Ll蛋白的免疫原片段，适合的HPVLl免疫原片段包括在Ll的截断、缺失、替代或插入突变体。这种免疫原片段能够提高免疫响应(如需要，当有佐剂辅助时)，所述免疫响应能够识别一种Ll蛋白，例如产生该Ll蛋白的HPV型的病毒样颗粒。一方面，一种适合的HPV16免疫原片段能够针对HPV31和HPV52中的至少一种提供交叉j呆护。本发明一方面能够对针对两者提供交叉保护。另一方面，一种适合的HPV18免疫原片段能够针对HPV45提供交叉保护。HPV16和/或HPV18免疫原片段获得的交叉保护可在人体试验中进行评价，例如在实施例1中所概述的。同样，可用如实施例1中的标准技术或标准临床前模型检验不同的疫苗，以确定疫苗具有免疫原性。适合的Ll免疫原片段包括截短的Ll蛋白。在一方面，截短是去除核定位信号(肽)。另一方面，截短为C末端截短。另一方面，C末端截去少于50个的氨基酸，例如少于40个氨基酸。当L1来自HPV16时，在另一方面，C末端截短是从HPV16Ll去除34个氨基酸。当L1来自HPV18时，在另一方面，C末端截短是从HPV18Ll去除35个氨基酸。在一方面，HPV16序列为如下序列(SEQIDNO:1)MSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNNKJ60LVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRG(JPLGVG1SGH120PLLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYK(3TgLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAV180NPGDCPPLELINTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSE240PYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGENVPDDLYIKGSGSTANLASSNYFPTPSGSMV300TSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNG，CWGNQLFVTVVDTTRSTNMSLCAA1STSETTYKNTNF360KEYLRHGEEYDLQF1FQLOCITLTADVMTYIHSMNSTUEDWNFGLCJPPPGGTLBDTYRF420VTSQAIACQKHTPPAPKEDPLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQ471在另一方面，本发明涉及仅由具有上述氨基酸序列的HPV16L1组成的病毒样颗粒，和涉及包含这种VLP的组合物。HPV16序列也可为WO9405792或US6649167中公开的，例如适当被截短的序列。适当的截短的序列是根据序列比对评价，在与如上所示相当的位点上进行截短。在一方面，HPV18的序列为如下序列(SEQIDNO:2)MALWRPSDNTVYLPPPSVARWNTDDYVTRTS1FYHAGSSRLLTVGNPYFRVPAGGGNKQ60DIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDNS1YNPETQRLVWACVGVEIGRGQPLGVGLSGH120PFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPL180SCJGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDlCQSICKYPDyLQMSAD240PYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPPSLY1KGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIV300TSDSQLFNKPYWLHKAQOHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVPGQYDATK360FKQYSRHVEEYDLQFlFQLCTITLTADVMSYlHSMNSSILEDWNFGVPPfTTTSLVDTYR420FVQSVA1TCQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVCJ472在另一方面，本发明涉及仅由具有上述氨基酸序列的HPV18L1组成的病毒样颗粒，和涉及包含这种VLP的组合物。HPV18序列也可为W09629413中公开的序列，该序列可被适当截短。适当的截短是根据序列比对评价，在与如上所示相当的位点上进行截短。在本
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内，其它的HPV16和HPV18序列是公知的，也可以适用于本发明。如果Ll蛋白来自另一HPV型，可以根据DNA或蛋白序列比对，对其实施相对应于HPV16和HPV18进行过的C端截短。适当的截短，例如HPV31、HPV45、HPV52、HPV58、HPV33的截短也可以一方面根据序列比对评价，通过去除与以上描述的那些相当的Ll蛋白C端部分而实iE见。来自血清型31的截短的Ll核苦酸(Nucleotidic)序列(SEOIDNO:5):ATGTCTCTGTGGCGGCCTAGCGAGGCTACTGTCTACTTACCACCTGTCCCAGTGTCTAAAGTTGTAAGCA70CGGATGAATATGTAACACGAACCAACATATATTATCACGCAGGCAGTGCTAGGCTGCTTACAGTAGGCCA140TCCATATTATTCCATACCTAAATCTGACAATCCTAAAAAAATAGTTGTACCAAAGGTGTCAGGATTACAA210TATA咖TATTTAGGGTTCGTTTACCAGATCCAAACAAATTTGGATTTCCTGATACATCTTTTTATAATC280CTGAAACTCAACGCTTAGTTTGGGCCTGTGTTGGTTTAGAGGTAGGTCGCGGGCAGCCATTAGGTGTA(3G3S0TATTAGTGGTCATCCATTATTAAATAAATTTGATGACACTGAAAACTCTAATAGATATGCCGGTG(3TCCT"0GCCACTOATAATAG(3GAATGTATATCAATGC3ATT;vTW^CAAACACAACTGTOTTTACTTGGXTCJCAWvC430CACCTATTGGAGAGCATTGG加TAAAGGTAGTCCTT(3TAGTAACAAT(3CWrTACCCCTGGTGATTGTCC560TCCAITAGAATTAAAAAATTCAGTTATACAAGATGGGGATATGGTTGATACAGGCTTTGGAGCTATGGATS30TTTACTGCTTTACAAGACACTAAAAGTAATGTTCCTTTGGACATTTGTAATTCTATTTGTAAATATCCAG700ATTATCTTAAAATGGTTOCTGAGCCATATGGCGATACATTATTTTTTTATTTACGTAG(3(3AACAAATGTT770TGTAAGGCATTTTTTTAATAGATCAGGCACGGTTGGTGlhATCGGTCCCTACTGACTTATATATTAAAGGC840TCCGeTTCAACAGCTACTTTAGCTAACAGTACATACTTTCCTACACCTAGCGGCTCCATGGTTACTTCAG310ATGCACAAATTTTTAATAAACCATATTGGATCCAACGT3CTCAGGGACACAATAATGGTATTTGTTGGGG9B0CAATCAGTTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGTAGTACCAATJITGTCTGTTTGTGCTGCAATTGCA10S0AACAGTGATACTACATTTAAAAGTAGTAATTTTAAAGAGTATTTAAGACATGGTGAGGAATTTGATTTAC1120AATTTATATTTCAGTTATaCAAAATAACATTATCT(3CAaACATAATGACATATATTCACAGTATGAATCC1130TGCTATTTTGGAAGATTGGAATTTTGGATTGACCACACCrCCCTCAGGTTCrTTGGAGGATACCTATAGG1260TTTGTCACCTCACAGGCCATTACATGTCAAAAAACTGCCCCCCAAAACJCCCAAGGAAGATCCATTTAAAG1330ATTATGTATTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTGCAGATTTAGATCAGTTTCCACTGGGTCG1400CAAATTTTTATTACAGTAA1419在另一方面，本发明涉及仅由具有上述氨基酸序列的HPV31Ll组成的病毒样颗粒，和涉及包含这种VLP的组合物。来.自血清型45的截短的Ll核苷酸序列(SEOIDNO:6):atcgctttgtggcggcctagtgacagtacggtatatcttccaccaccttct。t加cc織gtrgtcaaca70ctgatgattatgtgtctcgcacaagcatattttaccatgcaggcagttcccgattmtaactgtaggcaa140tccatattttagggttgtacctagtggtgcaggtaataaacaggctgttcctaaggt;atccgcatatcag210tatagggtgtttagagtagctttacccgwcctaataaatttgcattacctgattctactatatataatc280ctgaaacacaacgtttggtttgggcatgtgtaggtatggaaattggtcgtgggcagcctttaggtattgg350cctaagtggccatccattttataataaattggatgatacw3aaagtgctcatgcggctacggctgttgtt420acgcacjgatgttagggataatgtgtcagttgattataagcaaacacagctgtgtattttaggttgtgtac490ctgctattggtgagcactgggccaagggcacactttgtaaacctgcacaattgcagcctggtgactgtcc560tcctttggaacttaaaaacaccattattgaggatggtgatatggtggatacaggttatggggcaatggat630rmgtacattgcaggatacaaagt(3cgacottccattagacatttgtcaatccatctgtaaatatccag700attatttgcaaatgtctgctgatcccwtggggattctatgtttttttgcctacgccgtgaacaactgtt770tgcaagacatttttggaatw3ggcaggtgttatgcjgtgacacagtacctacagacctatatattaaaggc840actagcgctaatatgcgtgaaacccctggcagttc!tgtc5tattccccttctcccagtgt3ctctattatta310cttctgattctcaattatttaataagccatattgcttacataagc5cccagggccataacaatggtatttg380ttggcataatcagttgtttgttactgtw5tggacactacccgcagtactaatttaacattatgtgcctct1050acacaawvtcctgtgccaggtacatatgatcctactaagtttaagcactatagtagacatgtggaggaat1120atgatttacagtttatttttcw3ttgtgcactattactttaactgcagaggttatgtcatatatccatag1190tatgaatagtagtatattcgaaaattggaattttggtgtacctccaccacctactacaagtttagtggat1260acatatcgttttgtgcaatcagttgctgttacctgtcaaaaggatactacacctccagaaaagca卿tc1330CATATGWrAAATTAAAGTTTTGGACTGTTGACCTAAAGGAAAAATTTTCCTCCOATTTGGATCAATATCC"00ccttggtcgaaagtttttagttcagtaa在另一方面，本发明涉及仅由具有上述氨基酸序列的HPV45Ll组成的病毒样颗粒，和涉及包含这种VLP的组合物。本发明的Ll蛋白或片段可任选以融合蛋白形式存在，例如Ll蛋白与L2蛋白或一种早期蛋白融合。HPVLl蛋白优选以一种衣壳蛋白亚单位或病毒样颗粒(VLP)形式存在。一方面，HPVVLP可用于本发明。在本
技术领域：
内，HPVVLP和VLP的制备方法是公知的。VLP通常是由病毒的结构蛋白Ll和任选的L2构建的，例如见WO9420137、US5985610、W09611272、US6599508B1、US6361778B1、EP595935。任何适合的HPVVLP可用于本发明，以提供交叉保护，例如L1或L1+L2VLP。比较适宜的是，该VLP为只含有Ll蛋白的VLP。VLP的形成可通过标准技术进行评价，例如电子显微镜法和动态激光光散射技术。VLP可以包括全长Ll蛋白。一方面用于形成VLP的Ll蛋白为如上述的截短的Ll蛋白。可在任何合适的细胞基质中制备VLP，例如酵母细胞或昆虫细胞，例如杆状病毒。VLP制备技术为本领域公知技术，例如WO9913056、US6416945B1、US6261765B1和US6245568及其参考文献，其全部内容通过引用结合到本文中。通过解体和重新组装技术可以制备VLP，该技术可提供更稳定和/或更均质的人乳头瘤病毒VLP。例如，McCarthy等，1998"QuantitativeDisassemblyandReassemblyofHumanPapillomavirusType11VirusLikeParticlesinVitro(体外定量解体和组装人乳头瘤病毒II型病毒样颗粒)"J.Virology72(1):33-41,描述了纯化自昆虫细胞的重组LIHPVIIVLP的解体和再组装以获得VLP's的均质制备。W09913056和US6245568还描述了解体/再组装过程以制备HPVVLP。一方面，用例如WO9913056或US6245568描述的方法制备HPVVLP。本发明的HPVLI可与一种佐剂或免疫刺激物组合，但并不限于任何来源的脱毒脂质A和脂质A无毒衍生物、皂素和能够刺激THl型响应的其它试剂。众所周知，肠道细菌脂多糖(LPS)是一种有效的免疫系统刺激物，尽管由于其毒性效应已减少了其在佐剂中的用途。通过从还原末端葡萄糖胺去除核心糖基和磷酸根制备了无毒的LPS衍生物-单磷酰脂质A(MPL)，该脂质A在Ribi等(1986,ImmunologyandImmimopharmacologyofbacterialendotoxins,PlenumPubl.Corp.,NY,p407-419)中有所描述，具有例如下结构IK将二糖骨架上3位的酰基链去除，结果得到进一步脱毒的MPL，被称为3-0-脱酰基-单磷酰脂质A(3D-MPL)。它可以通过GB2122204B中所授的方法纯化和制备，GB2122204B在参考文献中还公开了二磷酰脂质A及其3-0-脱酰基突变体的制备方法。3D-MPL的一种适合的剂型为乳剂，其具有小的颗粒，直径尺寸小于0.2jnm，其制备方法公开于WO94/21292中。WO9843670A2中描述了包含单磷酰脂质A和表面活性剂的水溶性制剂。用来制成本发明组合物的细菌脂多糖源佐剂可从细菌中纯化和处理得到，也可通过合成得到。例如，Ribi等1986(supra)描述了纯化的单磷酰脂质A，专利GB2220211和US4912094中，描迷了沙门氏菌源的3-0-脱酰基-单磷酰脂质A或二磷酰脂质A。其它纯化和合成的脂多糖已被描述(Hilgersetal.,1986,Int.Arch.Allergy.Immunol,79(4):392-6;Hilgers等，1987,Immunology,60(1):141-6;和EPO549074Bl)。在一方面，细菌脂多糖佐剂为3D-MPL。因此，可用于本发明的LPS衍生物为那些与LPS或MPL或3D-MPL结构相似的免疫刺激物。本发明另一方面，LPS衍生物为酰基化的单糖，为上述MPL结构一部分。急素在Lacaille-Dubois,M禾口WagnerH.(1996.Areviewofthebiologicalandpharmacologicalactivitiesofsaponins.急素生物学和药理学活性的综述和Phytomedicinevol2卯363-386)中有描述(taught)。皂素为甾体类或三辟糖苦类化合物，在植物和海洋动物界有广泛分布。值得注意的是，皂素在水中形成胶体溶液，震荡时发泡，可用于沉淀胆固醇。当皂素靠近细胞膜时，它们在膜上制造孔状结构，引起膜破裂。这种现象的一个范例就是红细胞溶解，这是某种而不是全部皂素的特性。众所周知，皂素可在疫苗全身给药中用做佐剂。各皂素的佐剂活性和红细胞溶解活性已在本
技术领域：
被广泛研究(Lacaille-DuboisandWagner,supra)。例钕口QuilA(derivedfromthebarkoftheSouthAmericantreeQuillajaSaponariaMoLlna来源自南美洲树QuillajaSaponanaMolina及其组分在US5，O57,540和"皂素作为疫苗佐剂"，Kensil,C.R.,CritRevTherDrugCarrierSyst,1996,12(l-2):l-55;和专利EP0362279Bl中有所描述。微粒结构，被称为免疫刺激复合物(ISCOMS),包含QuilA的组分，具有溶血活性，被用于制备疫苗(Morein,B.,EP0109942Bl;WO96/11711;WO96/33739)。具有溶血活性的皂素QS21和QS17(QuilA的HPLC纯化组分)被描述为有效的全身性佐剂，其生产方法公开于美国专利No.5,057,540和EP0362279Bl中。被用于全身免疫研究的其它皂素包括那些来源自其它植物种属的皂素，例如石头花属(Gypsophila)和肥皂草属(Saponaria)(Bomfordetal.,Vaccine,10(9):572-577,1992)。例如WO94/00153所公开的，一个增强的系统包括一种无毒脂质衍生物和一种皂素衍生物的组合物，特别是例如WO96/33739所公开的QS21和3D-MPL的组合物，或一种例如WO95/17210所公开的具有较低反应原性的组合物，其中的QS21用胆固醇使其灭活。在WO95/17210中，描述了一种特别有效的包含QS21和3D-MPL水包油乳剂的制剂，本发明的一个方面应用了该佐剂。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了一种以脱毒脂质A为佐剂的疫苗，更适合的是，以单磷酰脂质A及其衍生物为佐剂。一方面该疫苗另外包含一种皂素，例如QS21。一方面该剂型还附加包含一种水包油乳剂。本发明也提供一种制备疫苗制剂的方法，包括将一种本发明的L2肽与中药学上可接受的赋形剂混合，例如3D-MPL。根据本发明，包含在该疫苗制剂中的其它成分包括非离子去污剂，例如本文中描述的辛苯昔醇(octoxynol)和聚氧乙烯酯，特别是聚乙二醇辛基苯基醚(t-octylphenoxypolyethoxyethanol)(TritonX-100)和聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(polyoxyethylenesorbitanmonooleate)(Tween80);本文描述的胆汁盐或胆汁酸盐衍生物，特别是脱氧胆酸钠或牛磺脱氧胆酸钠。这样，本发明一个方面，一种制剂包含了3D-MPL、TritonX-IOO、Tween80和脱氧胆酸钠，该制剂可与L2抗原制备物组合以提供一种适合的疫苗。本发明的一个实施方案中，该疫苗包括一种由胆固醇、皂素和LPS衍生物组成的多孔佐剂制剂。在这点上，该佐剂制剂包含一种内含胆固醇的单层液泡，该液泡具有由二油酰磷脂酰胆碱组成的脂质双层，其中皂素和LPS衍生物与脂质双层连接，或嵌入其中。一方面，这些包含急素(QS21)和3D-MPL例如LPS衍生物的佐剂制剂中，其中的QS21与胆固醇的比率1:1至1:100(重量/重量)，在一方面，比率为1:5(重量/重量)。这种佐剂制剂在EP0822831B中有描述，其公开内容通过引用结合到本文中。比较适宜的是，本发明的疫苗可以和铝合并使用，并优选被铝佐剂吸收或者部分吸收。比较适宜的是，佐剂为一种铝盐，它可以和3DMPL混合，例如磷酸铝和3DMPL。氢氧化铝任选与3DMPL混合也是适合的。另一方面，本发明的疫苗包括HPVVLP和一种铝盐或者一种铝盐+3DMPL的组合物。氢氧化铝是比较适合的铝盐。该疫苗也可以包括铝或一种铝化合物作为稳定剂。在另一方面，这种佐剂可以是一种水包油的乳剂佐剂和3DMPL的组合物。同时这种水包油乳剂包括一种可代谢的油、一种甾体和一种乳化剂。本发明的疫苗可以不同途径给药，例如口服(例如见专利WO9961052A2)，局部、皮下、黏膜(通常为阴道)、静脉、肌肉、鼻内、舌下、经皮和栓剂。作为选择，该疫苗可以与其它HPV抗原或非HPV抗原一起被做成制剂或联合用药。比较适宜的是，这些非HPV抗原能提供针对抗其它疾病的保护，例如性传播疾病，如单纯疱瘆病毒、EBV、衣原体和HFV。我们特别倾向于该疫苗包含来自HSV的gD或其截短型。这样该疫苗可针对HPV和HSV二者提供保护。疫苗组分的剂量可根据个体健康状况、性别、年龄和体重、给药途径和疫苗的HPV型而改变。服用量也可根据VLP型的种类数而变化。比较适宜的是，递送一定剂量的疫苗能够产生免疫保护反应。适合的单次疫苗剂量含有每种VLPl-100吗，一方面每种VLP5-80昭，另一方面5-30貼，另一方面，每种含有VLP5-20吗，另一方面为5貼、6jxg、10jig、15ixg或20pg。对于本发明的所有疫苗，一方面，该疫苗可用于10-15岁的青春期少女接种，例如10-13岁。但是，超过15岁的女孩和成年妇女也可以接种该疫苗。该疫苗也可适用于Pap涂片异常的妇女，或术后消除HPV引起的损伤的妇女，或致癌性HPV型血清反应阴性和DNA阴性的妇女。一方面，本发明中的疫苗用于接种男性。一方面，该疫苗按2剂量方案递送，例如可分别按第0、l月方案或第0、6月方案递送。该疫苗接种方案可包含5至10年后进行一剂加强针，例如10年。一方面，本发明涉及一种3剂量的疫苗，其中(例如)包括递送第一剂和第二剂HPV疫苗，第一剂和第二剂疫苗不同，然后递送含有一种或多种第一剂和第二剂疫苗中所有HPV组分的第三剂疫苗。一方面，第一剂疫苗和第二剂疫苗完全与HPVLl成分完全不同。例如，第一剂疫苗可以包含或由HPV16和HPV18Ll蛋白组成。第二剂疫苗由HPV31和HPV45Ll蛋白组成。第三剂疫苗可以包含来自四种HPV型的Ll蛋白，即HPV16、18、31和45。另一方面，本发明涉及一种3剂量的疫苗，其中(例如)包括递送第一剂和第二剂HPV疫苗，第一剂和第二剂疫苗不同，然后递送不含有第一剂和第二剂疫苗中HPVL1组分的第三剂疫苗。一方面，该疫苗为液体疫苗制剂，尽管该疫苗可以被冻干和在给药前重悬。在本申请中所有参考文献的教授，包括专利申请或已授权的专利，均通过引用结合到本文中。本发明的疫苗包含如上所列的某些HPV组分。本发明另一方面，该疫苗基本上由上述的组分构成。本发明中所用的术语"疫苗"，是指一种含有免疫原性成分的组合物，可选择做成制剂或与辅助以佐剂，能在个体中，例如人中，激发免疫响应。比较适宜的是，疫苗可针对突发性感染或者持续性感染、或细胞学异常如ASCUS、CIM、CIN2、CIN3，或由一种或多种HPV型引起的子宫癌诱发保护性免疫响应。现用下面的用来举例说明本发明的实施例描迷本发明。实施例1Harper等在theLancet.2004Nov13;364(9447):1757-65中，提供了已开展实验的精确的细节。总之，用HPV16和HPV18LlVLP的混合物免疫15至25岁健康妇女。录入标准是1)HPV-16和HPV-18血清反应阴性；2)宫颈高危性HPV感染阴性(用HPVPCR检测)；3)有6个或少于6个终身性伴侣；4)PAP涂片正常。每0.5ml给药剂量的混合物包含20吗HPV-16LIVLP和20昭HPV-18LIVLP,釆用500昭氢氧化铝和50|tig3DMPL为佐剂。安慰剂组仅注射500的氢氧化铝。评价了该疫苗针对某种致癌HPV型的疫苗效力(V.E.)，其中V.E.为疫苗组较安慰剂组在防御感染或疾病方面的提高百分数。通过检测疫苗组和对照组中各种致癌HPV型特异的核酸的存在评价疫苗的交叉保护作用。用例如WO03014402及其参考文献描述的方法进行检测，特别是例如WO99/14377和Kleter等[JournalofCLlnicalMicrobiology(1999),37(8):2508-2517]所描述的，用LiPA系统进行HPVDNA非特异性扩增和后继的HPVDNA型冲企测，上述的全部内容通过引用结合到本文中。但，任何适合的方法可用于冲企测样品中的HPVDNA，例如用每种感兴趣的HPV型的特异性引物进行型特异性PCR。对本领域技术人员而言，适合的引物是公知的，或如果致癌HPV型的序列已知，可被简单的构建。详细地，本文将完整的重复Lancet论文中的方法部分本研究的主要目的是在ELISA法检测HPV-16/18血清反应阴性和PCR法检测HPV-16/18阴性的受试者中评价疫苗在6~18个月期间预防HPV-16、HPV-18或HPV-16/18感染的效果。第二个目的包括评价疫苗在6-18月和6~27月期间预防HPV-16/18持续性感染的效果，评价疫苗预防细胞学确认的低度鳞状上皮内病变(LSIL),高度鳞状上皮内病变(HSIL)和组织学确认的LSIL(CIN1)、HSIL(CIN2或CIN3)鳞状细胞癌或HPV-16/18感染相关的腺癌的效果。预防HPV-16/18感染相关的细胞学诊断意义未明的不典型鳞状细胞(ASCUS)的效果也事后加入到结果分析中。我们也进行了一项探索性分析，通过对受损组织PCR检测HPV-16/18DNA相关的CIN1和CIN2的组织病理学终点。其它目的包括对疫苗的免疫原性、安全性和耐受性的评价。-北美(加拿大和美国)和巴西的研究者通过广告和从先前的2000年7月至12月进行的HPV横断面流行病学研究的参加者中招募妇女。对于32个研究地点中的每一个，伦理审查委员会批准了流程、同意表(知情同意书)和修改书。妇女单独签署书面同意书，同意参加研究和阴道镜检查。对于未满18岁者，必须得到父母和本人的同意。研究包括两个阶段初始阶段是接种疫苗，并进行随访至18个月做出结论；一延长的盲法研究阶段于27个月时做出结论。符合初始阶段(0到18个月)条件的妇女包括15-25岁的健康妇女，她们的性伴估不超过6个，无Pap检验异常或子宫颈消融或切除治疗历史，无正在治疗的外部尖锐湿疣，并且通过ELISA检测细胞学呈阴性，对HPV-16和HPV-18抗体呈血清反应阴性，并且录入研究前不超过90天内通过PCR检测14种高险性HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)的HPV-DNA呈阴性。最先完成研究初始阶段的妇女，录入后未进行子宫颈消融或切除治疗，或子宫切除的，符合参加研究延伸阶段(18-27月)的条件。程序每剂量二价体HPV-16/18病毒样颗粒疫苗(GlaxoSmithKLlneBiologicals,Rixensart,Belgium)含有20|ugHPV-16Ll病毒样颗粒和20MgHPV-18Ll病毒样颗粒。每一型的病毒样颗粒在草地贪夜蛾(S/0(ioptera/ragz》erafa)sf-9牙口4分纟文夜虫我(rn'c/o//ww'am')Hi-5纟田月包基质中产生，疫苗以含有500pg的氢氧化铝和50Mg的3-脱酰基-单磷酰脂质A(MPL,Corixa,Montana,USA)的AS04为佐剂，以单剂量小瓶形式提供。安慰剂每剂量含有500ng氢氧化铝，外观与HPV-16/18疫苗相同。每一研究参加者于O月、1月和6月接受0.5ml疫苗或安慰剂。卫生保健提供者用宫颈刷和刮勺(在PreservCyt中洗涤，Cytyc公司，Boxborough,MA,美国)获得子宫颈样品，以在筛查中、6月和12时进行细胞学和HPVDNA检验。在0月、6月和随后的每3个月，妇女自己用2支有序的药签(放置于PreservCyt中)获得子宫颈样品，以进行HPVDNA检验[DMHarper,WWNoll,DRBelloniandBF.Cole,RandomizedclinicaltrialofPCR-determinedhumanpapillomavirusdetectionmethods:self-samplingversusclinician-directed—biologicconcordanceandwomen'spreferences,人乳头瘤病毒PCR检测方法的随机临床试验自助取样与临床医师指导取样的比较一生物学和谐性(biologicconcordance)和妇女偏好.AmJObstetGynecol186(2002),pp.365-373]。中心实验室(QuestDiagnostics,Teterboro,NJ,USA)釆用1991Bethesda分类系统报告细胞学结果(ThinPrep,CytycCorporation)。流程指南建议在2次ASCUS报告或1次诊断意义未明的不典型腺体细胞、LSIL或HSIL、鳞状细胞癌、原位腺癌或腺癌报告后进行阴道镜检查。该流程指南还建议对可疑的损伤进行活组织检查。中心组织学实验室根据福尔马林固定的组织样品为临床管理做出初步的诊断。3名病理学家组成的小组采用CIN系统完成后续的对HPV-16和HPV-18相关损伤的共识诊断。该共识诊断还包括对为进行PCR检查皮损HPVDNA时显微解剖而取的切片进行检查。HPVDNA分离自细胞学样品(MagNa纯化总核酸系统，罗氏诊断，Almere,荷兰)和子宫颈活组织检查样品(蛋白酶K提取)，用广谱引物SPF10从一等份纯化的总DNA中扩增得到一段65bp大小LI基因。[BKleter,LJvanDoom,JterSchegget等，Novelshort-fragmentPCRassayforhighlysensitivebroad-spectrumdetectionofanogenitalhumanpapillomaviruses(可高灵每文广i普检查胆门-生殖器人乳头瘤病毒的新颖的短片段PCR分析).AmJPathol153(1998),pp.1731-1739:LJvanDoom,WQuint,BKleter等，GenotypingofhumanpapillomavirusinLiquidcytologycervicalspecimensbythePGMYLineblotassayandtheSPF(IO)Lineprobeassay(通过PGMY线性杂交分析法和SPF(10)线性探针分析法对液体细胞子宫颈样品中的人乳头瘤病毒进行基因分型).JClinMicrobiol40(2002),pp.979-983和WGQuint,GScholte,LJvanDoom,BKleter,PHSmitsandJ.Llndeman,ComparativeanalysisofhumanpapillomavirusinfectionsincervicalscrapesandbiopsyspecimensbygeneralSPF(IO)PCRandHPVgenotyping(通过常规SPF(IO)PCR和HPV分型比较分析子宫颈刮片和活组织检验样品中的人乳头瘤病毒感染).JPathol194(2001),pp.51-58]。扩增的产物用DNA酶免疫分析法进行检测。采用线性探针分析法(LiPAKitHPVDSfNOLiPAHPV基因型分析，SPF-10系统片反本1,Innogenetics,Gent,比利时，由LaboBio-medicalProducts生产，Rijswijk,荷兰)检测25种HPV基因型(6,11、16、18、31、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70和74)。[BKleter，LJvanDoom,LSchrauwen等，DevelopmentandclinicalevaluationofahighlysensitivePCR誦reversehybridizationLineprobeassayfordetectionandidentificationofanogenitalhumanpapillomavirus开发和临床评价一种高灵敏的用以检测和鉴定肛门和生殖器人乳头瘤病毒的PCR-反向杂交线性探针分析法.JClinMicrobiol37(1999),pp.2508_2517]。任何通过DNA酶免分析法检测为阳性的样品再用型特异性HPV-16和HPV-18PCR进行检验。HPV-16型特异性PCR引物扩增E6/E7基因的92bp的片段，而HPV-18型特异性PCR引物扩增LI基因的126bp的片段。[MFBaay,WGQmnt，JKoudstaal等，Comprehensivestudyofseveralgeneralandtype-specificprimerpairsfordetectionofhumanpapillomavirusDNAbyPCRinparaffin-embeddedcervicalcarcinomas(t匕寿交分才斤几种通过只于石蜡包埋子宫颈癌PCR以检测人乳头瘤病毒DNA的通用引物对和型特异性引物对).JClinMicrobiol34(1996),pp.745-747]在试验过程中，当出现至少一次阳性HPV-16或HPV-18PCR结果时，我们定义为突发性子宫颈HPV-16/18感染，而间隔至少6个月同一病毒基因型有至少2次HPV-DNAPCR阳性分析结果，我们定义为持续性子宫颈HPV-16/18感染。[HRichardson,GKelsall,PTelLler等，Thenaturalhistoryoftype-specifichumanpapillomavirusinfectionsinfemaleuniversitystudents(女性大学生中型特异性人乳头瘤感染的自然史).CancerEpidemiolBiomarkersPrev12(2003),pp.485-90和ABMoscicki,JHEllenberg,SFarhat和J.Xu,PersistenceofhumanpapillomavirusinfectioninHIV-infectedand-uninfectedadolescentgirls:riskfactorsanddifferences,byphylogenetictype,HIV(感染和未感染青春期少女中人乳头瘤病毒的持续存在不同系统发育类型的风险系数和差异).JInfectDis190(2004)，pp.37-45]。研究过程中HPV-DNA测试结杲对研究者保密，细胞学和组织学诊断结果仅为临床管理目的而公开。分析包括子宫颈样品和合并的子宫颈和自助获得的子宫颈样品的HPV-16/18DNA的结果。我们在0、1、6、7、12和18月从试验参加者采集血浆，以进行免疫原性评价。通过EL1SA进行HPV-16和HPV-18病毒样颗粒抗体的血清学检验。用重组HPV-16或HPV-18病毒样颗粒作为包被抗原以进行抗体冲全测(见webappendixVittp:〃image.1:helancet.com/extTa.s/04artl0103webappe:ndix..pdf)。当滴度大于或等于检测截值滴度(对HPV-16为8EL1SA单位/毫升，对HPV-18为7ELlSA单位/毫升)时，被定义为血清阳性。代表性的正常滴度是通过测定先前流行病学研究中ELISA法诊断为HPV-16或HPV-18血清阳性的妇女中的血清而确定的。妇女接种疫苗接种后最初7天在日记卡上记录经历的症状，症状有3级强度标准。另外，她们通过会面向研究人员报告疫苗接种后最初30天内所有的不良事件。整个研究过程中的严重不良事件都;故收集。统计方法假设在12个月中，HPV-16和HPV-18型感染的累计发病率为6%,我们估计每处理组500名妇女可获得80%的把握度以评价疫苗效率的95%置信区间的低限高于0。我们假设在18个月内患者的保有率为80%。中期进行的对效果，安全性和免疫原性的分析仅为了未来研究计划。当中期分析发生后，用O'BrienandFleming方法校正a值以服务于最终分析(全部为双侧检验)。[PCO'BrienandTR.Fleming,Amultiple,testingprocedureforclinicaltrials用于临床i式3企的多重检验法.Biometrics35(1979),pp.549-556]。根据确证的算法，采用因特网随机系统集中进行分层的区组随机化。根据年龄(15-17、18-21和22-25岁)和地区(北美和巴西)进行分层。每一剂疫苗标记一个基于研究人员输入到计算机化随机系统中的特定的参加者信息的随机选择的数字。处理分配对研究者和参加长期随访研究的妇女保密。"意向治疗组群"和"根据流程组群"如图所示，其中排除于分析的理由按等级顺序列出；根据最高分级标准，符合多于一条排除标准的妇女，只被计算一次。我们将进入"意向治疗，，和"根据流程分析，，的一批参加者称为组群，尽管用以限制受试者入组"根据流程组群"的信息是通过随访后得知的。我们对疫苗效果同时进行"根据流程分析"和"意向治疗分析"。在"根据流程18个月分析"中，疫苗效果的计算是基于接种组与安慰剂组比较患HPV-16/18感染的比例。疫苗效果定义为1减去两组感染比例的比率；95%置信区间衡量了效率估算的精密度，p值用双侧Fisher's精确检验进行计算。相应的比率表示为以结果的病例数除以有危险的参加者的人数。"根据流程18个月组群"包括那些录入的接受3剂计划疫苗和遵守如图所描述的流程的妇女。在"意向治疗分析，，和"根据流程27个月分析，，中，疫苗效果的计算基于Cox比例风险模型，比较接种组和安慰剂组时间与HPV-16/18感染病例发生率的关系。这使得能够控制每组中治愈者人次数据。疫苗效果的计算为1减去风险率，p值用logrank检验计算。相应的比率表示为病例数除以总人次。所有入组的妇女，接受至少一剂疫苗或安慰剂，在0月时高风险HPV-DNA为阴性，而且提供用以结果评价的任何数据，这样的妇女包含在"意向治疗组群"中。"根据流程27个月组群"包含来自"根据流程18个月组群"的结果和在延长期间发生的结果(从18个月到27个月)。用Fisher's精确检验比较法计算安全性分析的P值。安全性分析的组群包括接受至少一剂疫苗或安慰剂，并且遵守指定的最低流程要求的所有入组妇女(见下图)评价4939名受试者的适用性1113名随机入组560名随机入組疫苗组5S3名随机入组安慰剂组',丄560名包含在ITT组群中553名包含在ITT组群中1120名被排除IO名由于眷换丢失/损坏的药瓶而伴随给予了安慰剂l名随机编码当场被破坏366名包含在在6-18,27月的ATP组群中(疫苗效果分'析)主要目的是分析突发性HPV-16/18感染174名排除在6-18个月分析之外2名不符合合格标准79名初始为HPV-16/18血清学阳性高风险HPV-16/18阳性或细胞学异常O名用药程序破坏流程41名不遵守疫苗接种程序9名丢失筛查的HPVDNA结果或血清学结果7名6月时为HPV-16/18DNA阳性36名18个月前退出316名完成21月随访209名完成24月随访81名完成27月随访384名包含在6-18月ATP组群中次要目的是分析免疫原性156名被剔出2名不符合合格标准23名初始血清学阳性或未知抗体情况0药物服用破坏流程40名在研究期间HPV-16/18DNA阳性结果52名不遵守疫苗程序35名不遵守采样程序4名血清学数据丢失12名被排除ll名合并给予疫苗1名随机编码当场被破坏355名包舍在在6-18，27月的Aff组群中(疫苗效果分析)主要目的是分析突发性HPV-16/18感染186名排除在6-18个月分析之外6名不符合合格标准73名初始为HPV-16/18血清学阳性，高风险HPV-16/18阳性或细胞学异f1名给药破坏了血液制品给药流程45名不遵守疫苗程序12名丢失筛查的HPVDNA结果或血清学结果18名6月时HPV-16/18DNA阳性36名18个月前退出291名完成21月随访188名完成24月随访59名完成27月随访344名包含在6-18月ATP组群中次要目的是分析免疫原性197名被排除6名不符合合格标准20名初始血清学阳性或未知抗体情况1药物服用破坏流程85名在研究期间HPV-16/18DNA阳性结果51名不遵守疫苗程序29名不遵守采样程序S名血清学数据丢失在一"根据流程安全性组群"的亚群中，评价了疫苗的免疫原性，该亚群包含有0、7和18个月的血清学结果的妇女，这些妇女根据计划接受全部3剂研究疫苗或安慰剂，遵守样品采集程序，在试验过程中没有变成HPV-16/18-DNA阳性。用Fisher's精确检验法(p<0.001判定为有意义)比较疫苗组和安慰剂组血清阳性率。用ANOVA和Kruskal-Wallis检验比较两组几何平均滴度。用SAS8.2版本(SASInstitute,Cary,NorthCarolina)进行区组随机化和统计分析。初步分析和结果对交叉保护的初步分析的结果见专利申请WO2004/056389,其全部内容通过引用结合到本文中。在"ITT"("(IntentionIoIreat)意向治疗组群"，是指所有至少接受一剂疫苗的受试者)中进4亍初步分析，数据见于表A。如表B和表C所示的结果涉及"ATP"((AccordingIoprotocol)根据流程)组，其中的患者遵守试验的标准。表B是对所有患者的数据的中值分析，采样时组群中至少50%患者第一次疫苗接种后满l8个月。表C为最终结果，所有数据得自第一次接种(0月)后18个月的受试者。在ATP组中，所有患者接受于0、l和6月接受3剂疫苗，并且在6月时为血清学阴性。正如表A数据所证明的，用HPV16和HPV18VLP混合物免疫获得了明显的针对其它HPV型的交叉保护。在这点上，样本数太小不足以提供精确的统计分析，但数据表明了一种阳性趋势，并提示用HPV16和HPV18VLP免疫可有效防御其它HPV型的感染。随着研究进展，这一点被证实。表B表明HPV16和HPV18提供了针对一组高风险致癌HPV型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68的具有统计学意义的交叉保护。表C表明，除了HPV-18相关型(该型表现出非常强的趋势)，对以下所评价的组HPV31、35、58;HPV31、33、35、52、58;和12种高风险型(非HPV-16/18)的交叉保护作用具有统计学意义。对特定型的特异的交叉保护进行了进一步分析。评价了预防12种高风险致癌型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68,HPV-16系统发生学相关型(组31,35和58;31,33,35,52和58)和1^丫-18系统发生学相关型(45和59)相关的感染和疾病的疫苗凌文果。对遵守所有临床试验标准的"ATP"("根据流程组")组患者进行了一项分析。在"ATP"组，所有患者于0、1和6个月接受了3剂疫苗，并且在6个月时，血清学呈阴性。结果如表1所示数据所证明的，用HPV16和HPV18VLP的混合物免疫可获得较对照组具有统计学意义的针对HPV31、52和45的交叉保护作用。也观察到针对所有HPV16相关型(HPV-31、33、35、52和58)的组和所有不包括型16和18的高风险型(HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)的组的具有统计学意义的交叉保护作用。还观察到针对型31和52的具有统计学意义的抗持续性感染的交叉保护作用，还观察到针对所有的HPV16相关型的组引起的持续性感染的具有统计学意义的交叉保护作用(见表2)还观察到针对与型HPV52相关的细胞学异常的具有统计学意义的交叉保护作用，还观察到针对与所有的HPV16型相关(HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-52和HPV-58)的组和不包括型HPV-16和HPV-18的所有高风险型(HPV31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV誦52、HPV陽56、HPV-58、HPV-59、HPV-66和HPV-68)的组相关的细胞学异常的具有统计学意义的交叉保护作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表B—3剂给药后在预防突发性异源感染的疫苗效果。:预防HPV-16系统发生相关型，HPV-18系统发生相关型，HPV-16和/或HPV-18系统发生相关型和不包括HPV-16和/或HPV-18-ATP的所有高风险型组群引起感染的疫苗效果(6-18月)<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>N=指定组群的受试者数目n=患有突发性HPV感染的受试者数目AR=攻击率=n/N95%CI=95%置信区间低限=l-exp(log(arv/arp)+1.96*sqrt(l/nv-l/Nv+l/np-l/Np))高限=l-exp(log(arv/arp)-1.96*sqrt(l/nv-l/Nv+l/np-l/Np))当疫苗组的病例*=0低限=l-exp(log(arv*/arp)+1.96*sqrt(l/(nv+0.5)-l/(Nv+0.5)+l/(np+0.5)-l/(Np+0.5)))高限=l-exp(log(arv*/arp)-1.96*sqrt(l/(nv+0.5)-l/(Nv+0.5)+l/(np+0.5)-l/(Np+0.5)))200680023032.7势溢1被32/43:a;其中arv^疫苗接受组的攻击率arp二安慰剂接受组的攻击率nF疫苗接受组的病例凄tN^疫苗接受组病例lt和非病例凄史np-安慰剂接受组的病例数Np-安慰剂接受组病例数和非病例数HPV-16相关HPV-16系统发生相关型35、31、58,不考虑其它型HPV-16相关HPV-16系统发生相关型35、31、58、33、52,不考虑其它型HPV-18相关HPV-16系统发生相关型45,49，不考虑其它型HPV-16和/或HPV-18相关HPV-16和/或HPV-18系统发生相关型35、31、58、45、59，不考虑其它型HPV-16和/或HPV-18相关*:HPV-16和/或HPV-18系统发生相关型35、31、58、33、52、45、59,不考虑其它型**=不包括HPV-16和HPV-18的高风险型CO~<1200680023032.7势溢1被33/43到表c<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>转溢表3<image>imageseeoriginaldocumentpage41</image>在表1，2和3中200680023032.7势滞齿被37/43:KN=指定组群中受试者的数目AR=攻击率=11(患有或突发性，持续性或细胞学异常的HPV(如表中所示)的受试者的数目)/N%疫苗效果百分数为l-(A/B)x100,根据疫苗组和安慰剂组样本数进行调整。其中，A=%疫苗组妇女患有或突发性，持续性或细胞学异常的HPV(如表中所示)B=%安慰剂组妇女患有或突发性，持续性或细胞学异常的HPV(如表中所示)页实施例2研究使用10组C57B1/6小鼠，每组24只。根据以下信息按O天和第28天2剂量方案肌肉给药接种小鼠(1组小鼠用NaCl进行初始免疫和加强免疫，下面未列出)。用不同的HPV病毒样颗粒组合物进行接种，使用的4种不同VLP为仅HPV16L1的VLP、仅HPV18Ll的VLP、仅HPV31U的VLP和仅HPV45Ll的VLP。VLP是根据WO2003077942A2中公开内容制备和纯化的，在此通过引用结合到本文中。更具体的讲，HPV16VLP按以下顺序步骤纯化阴离子交换色语法(二曱基氨基乙基-DMAE),阴离子交换色镨法(三曱基氨基乙基-TMAE)，羟基磷灰石色谱法，过滤和另一阴离子交换步骤，这次用二曱基氨基乙基-DMAE，随后是最后过滤。HPV31VLP以同样的顺序步骤制备。HPV18VLP按以下顺序步骤纯化阴离子交换色谱法(二甲基氨基乙基-DMAE),阴离交换子色谱法(三甲基氨基乙基-TMAE)，羟基磷灰石色谱法，过滤和辛基琼脂糖凝胶柱(疏水作用色语法)，随后是最后过滤。HPV45VLP以同样的顺序步骤制备。下面Ll序列用于制造本实-险的VLP:来自血清型16的截短的Ll的核普酸序列(SEQIDNO:3):ATOTCTCTTTGGCTGCCTAOTOAGGCCACTGTCTACTT(3CCTCCTOTCCOOTATOTAAGGTT(3TAACCA70CCiGATGftATATaTTGCACGCACAAACATATATWTCAT"CW3GAACATCCAOACTACTT(3CAC;TT(3C3AC;i"0TCCCTATTTTCCTATTAAAAWVCCTWVCAATMCAAAATATTAGTTCCTAAAGTATCAGGATTACMTAC21DAGGGTATTTAGAATACATTTACCTGACCCCMTAAGTTJ'GGTTTTCCTGACACCTCATTTTATMTCCAG280ATACACAGCGGCTG(5TTTGGGCCTGTGTA0GT0TTQAGClTA00TCGT卯TCAGCCATTA郎TGT咖c:AT350TAGTGGCCATCCTTTATTAAATAAATTGGATO織CAGMAATGCT柳GCmTGCA(5C:AAAT。CAGGT4Z0CJTGCATAATAOAGAATGTATATCTATGGATTACAAACAAACACAATTGTGTTTAATTGGTTGCAAACCAC49DCTATAGGGCIAACACTGGGGCAMGOATCCCCATGTACCAATGTTGCAGTAAATCCAGGTGATTGTCCACCS"ATTAGAGTTAATAAACACAOTTMTCAGOATGGTGATAWTTGATACTGGCTTTG(3TGCTATGGACTTT"0ACTACATTACAGGCTAACAAAAGTGWiGTTCCACTGGAWmGTACWCWnTGCMATATCCAGATT700ATATTAAAATGGTGTCAGAACCATATGGCGACAGCTTATTTTTTTATTTACGAAGQOAACAAATGTTTGT7*70TAGACATTTATTTAATAGGGCTGGTGCTGTTCGTGAAAATGTACCAGACGATTTATACATTAAAGGCTCT8*J0咖TCTACT0CAAATTT柳CW3TTCAAATWrTTTCCT、acacctagtggttctatggttacctctgatg910CCCAAATATTCAATAAACCTTATTGOTTACAACGACJCACIAGGGCCACAATAATGGCATTTGTTGGGGTAA9B0CCAACTATTTGTTACTGTT(3TT(5ATACTACAC(JCAG"rAClAAATATGTCATT则T(JCTGCCATATC;TACT10S0TCAGAAACT織TATAAAAATACTAACTTTAAG讽aTA(:CTAO3織T(3G00W3GAATATGATmCAGT1120TTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCA讽CC(TT咖ACAT織TACATTCTATGftATTCCAC1130TAmTGGAGQACTGGWVTTTTGGTCTACAACCTCCCCCAOGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTT1260GTAACATCCCAGGCAATTGCTTGTCAAMACATACACCrCCAGCACCTAAAGAAGATCCCCTTAAAAAAT1330ACKCTTTTTGGGWVGTAAATTTWAGGWAW3TmCTe'caoaccta。ATCW5TTTCCTTTAOGACGCWV"00ATTTTTACTACAATAA14"来自血清型18的截短型Ll的核普酸序列(SEQIDNO:4)CCGATGATWTGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCAT(;CTO0CA6CTCTA0ATWTTAACTGnWTAA140TCrATATTTTAGGGTTCCTGCAQGTGGTGGCAATAAGCAGGATATTCCTAAGOTTTCTGCATACCAATAT210AOAGTATTTAGGGTGCAGTTACCTaACCCAAATAAATTTGOTTTACCTGATAATAGTATTTATAATCCTC2b0AAACACAAC3TTTW3TQt卿CCTGTGTTGGAGTGGAAATTGGCCOTGGTCW3CCTTTAGGTGTTGGCCT3S0TWIGGGCATCCATTTWrAATAAATTW3ATQACACT(3AAAOTTCCCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCT420CTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGOCACTGCTTGTAAATCGCGTCCTTTATCACAGGGCGMTCCCCCCC560rmOAACTTAAAWVCACAGTTTTGQAWSATGGTGATATGGTAGATACTGGATATGGTGCCATGGACTTT630AOTACATTGCWVCCTAAATQTaAGOTACCATTGGA'CATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATT700ATTTACAAATaTCTGCAGATCCTTATO卿ATTCCATGTTTTm(3CTTAC加CQTOAOCAGCTT2TTGC770TAGGCATTTTTOGAATAGGQCAGGTACTWT卿TGACACTOTCCCTCCATCCTTATATATTAAAGGCACA640GC5TATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATWmcCTCTGACTmCCCAGTTOTTTAATAAACCATATTCGTTACATAAGGCACAGGGTCATWVCAATGGTGTTTGCTGGCATAA380tcaattatttgttactgtggtagataccactcgcagtaccaatttaacaatatgtgcttctacacagtct10S0CCTGTACCTGI3(5CAATATOATGCTACCAAATTTAA(3CW3WrW3CAGACWGTTGAGOAATATGATTTGC1120agtttatttttcw3Ttgtgtactattactttaactgca幼tcttatgtcctatattcat;vgtatgwvtagmoCAGTATTTT脇GGATTGGMCTTTGGTCTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGG;VT/VCATATCGT1260TTTOTACWTCTGTTGCTATTACCTGTCAAAAGCJATGCTGCACCGGCTGMAATAAGGATCCCTATGATA1"0W3TTAAAGTTTTCGAATGTCGATTTAAAt3GAAAW3TTTTCTTrAGACTTAGATCWVTATCCC:CTTGGAC:G"00TAAATTTTTGGTTCAGTAA1419来自血清型31的截短型Ll的核苷酸序列(SEQIDNO:5)ATGTCTCTGTGGCGGCCTAGCGAGGCTACTGTCTACTTACCACCTOTCCCACTGTCTAAACJTTOTAAGCA70CGGAT(3AATATGTAACACGAACCAACATATATTATCACGCW3GCAGTGCTA6GCTGCTTACAGTAGCCCA"0TCCATATTATTCCATACCTAAATCTt3ACMTCCTAAAMWTW3TTGTACCAMGGTGTCAGGATTACAA210TATAGGGTArmGGGTTeGrmCCAOATCCAAACAAAmr(JGATTTCCTGATACATCTTTTTATAATC2bdCTGAAACrCAACGCmGTTTO(3gcctgtcttc5c;ttta(5柳taootcoc卿ca3ccattaoctota(;(;3s0TATTAGTGGTCATCCATTATTAAATAAATTTGATOACACTGAAAACTCTAATWJATATGCCGGTGGTCCT420。ocactc3ataatagggaatgtatatcaat(5gatt;iTAAACAAACACAACTGTGTmCTTGGTTGCAAAC"0CACCTATTGGAGAGCATTG卿tam3gtagtccttgtm5taacamgct;OTACCCCTGGTGArrGTCC"0tccattagaattaaaaaattcagttatacaagatogooatatoottdatacaggctttggagctatgcjats30TmCTGCTTTACAAGACACTAAAAGTAATGTTCCTTTGCfacatttotaattctatttgtaaatatcca(3700ATTATCTTAAAATGGTTGCTGW3CCATATGGCGATACATWmTTTTATTTACGTAGCGAACMATGTT770TGTAAOGCATTTmTAATAGATCAGGCACGGTTGGTGAATCGGTCCCTACTGACTTATATMTAAAGGC840tccggttcaacagctactttagctaacagtacatactttcctacacctagcggctccatogttacttcag910atgcacaaatttttaatmaccatattocatgcaacotgctcaoggacacaataatggtatttgttgggg$80CAATCAGTTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGTAGTACCAATATGrCTOTTTGTGCTGCAATTOCA1050AACAGTGATACTACATTTAAAAGTAGTAATTTTAAAGAGTATTTAAGACATGGTGAGGAATTTGATTTAC1120aatttatatttcagttatgcaaaataacatwtctgcagacataat(3acatatattcacagtatgmtcc1130TGCTATTTT卯AAGATTOGAATTTTOaATTG!ACGACACCTCCCTCAGGTTCTTTGCAGGATACCTWAGG1260TTTGrCACCTCACAW5CCATTACATGTCAAAAAACTGCCCCCCAAAXGCCCAAGGAAGATCCATTTAAAGm。ATTATGTATTrr咖A。gttmtttaamgaaaagttttctocagatttw3atcagtttccactoggtcg1400来自血清型45的截短型LI的核酸序列(SEQIDNO:6)atggctttgtggcggcctagtgacagtacggtatarcttccaccaccttctotggccagagttgtcaaca70ctcfatoattmotcitctcgcacwvgcatatrmccatgcagccagttcccgattattaactgtaogcaa"0tccjvrattttagogttotacctagtgctgcagctavtmjvcaggctgttcctaaggtatccgcata/rcag210tatagogtgttt&owstagctttacccgatcctaataaatttggattacctgattctactmratataatc280ctgaaacacaacgtttqctttgogcatototaocwtgciwattgotcgtgcgcagccttt^gotattgg350cctaagtggccatccattttataataaattgoatoatac;aoaaagtc;ctcatgcggctacggctgttgtt420acgcaggatgttagggataatgtgtcagttgattwaagcwyvcacagctotgtatmaoottcjtgtac"0ctgctattgotCcactgg(3ccaaoggcacactttgt7aacctgc;vcaattgcagcct(;(3tgact(3tcc560tcctttggaacttaaaaacaccattattgacgatggtgj、tatggtgowacxogttatggggcaatggat"0TTTAGTACATTGCw5qatacaaagtgcgaggttccattagacattt(3tcaatccatctgtaaatatccag700ArTATTTGCAAATGTCTGCTOATCCCTATGGGGATTCTATGTTTTTTTQCCnTVCGCCOTGAACAACTGTT770tgcaagacatttttggaatagcgcaggtgttatgggtgacacwjtacctacaoacctatatattaaaggc"0ACTAGCGCTAATArGCGTGAAACCCCTGGCAGTTGTGTGTATTCCCCTTCTCCCAGTGGCTCTATTATTA910CTTCTCTTCTCAATTATTTAATAAGCCcTTGGTTACATAAGGCCCAOGGCCATAACAATGGTATTTG3B0rXGGOyTAATCAOTTGTTTGTTACTGTAGTWACACTACCCGCAGTACTAATTTAACATTATGTGCCTCT1050ACACAAAATCCTGTGCCAcTACATATCTCCTACTAA(;TTTAA(3cactCGTAGACATGTGGAGOAAT1120ATGATTTACAGTTTATrTTTCAGTTGTGCACTATTACrrrAACTtSCAQACJOTTATGTCATATATCCATAG1190WTGAATAGTAGWWlTTGGAAAATTGGAATTTTGGTGTACCTCCACCACCTACTACAAGTTTAGTQGAT1250acatatcgttttgtgcaatcagttgctgttacctgtcaaaaggatactacacctccagaaaagcaggatc1330CATATlSATMATTAAWSTTTTGGACTGTTG/vCCTAAAGiSAWlAATTTTCCTCCGATTTGGATCAATATCC"00每种抗原使用剂量为2pg。HPV16、18和45VLP是吸附到佐剂上的。所用佐剂为AS04D，为人用量的1/10，即每支疫苗中总共含有5jug3DMPL和50ng的氢氧化铝。WO00/23105中公开了HPV病毒样颗粒与氢氧化铝、3DMPL结合。例如，在四价16、18、31、45疫苗中，2pg每种HPV16VLP被5pg氢氧化铝所吸附。对于HPV18和HPV45情况相同。对于HPV31VLP,则是2jugVLP被2.5jug的氢氧化铝所吸附。5昭3D-MPL是单独被17.5|tig氢氧化铝所吸附。然后3D-MPL和VLP混合，加入补充的氢氧化铝，结果每支疫苗剂量为50吗。疫苗接种程序笫一组合物第二组合物VLP16/18AS04DVLP16/18AS04DVLP16/18/31/45AS04DVLP16/18/31/45AS04DNaClVLP31/45AS04D读出结果(readout)于初始免疫和二次免疫14天后(分别为postI和post11)，用本
技术领域：
所公知的经典的ELISA技术测定抗体滴度。于14天的postII进行细胞内染色(ICS,Roedereretal.2004CLln.Immunol.110:199)评价CMI响应。结果见图1-18。在这些图中，postI和postII数据是在免疫剂量I和II后分别测定的。被称为"postI加强剂(booster)"的棒反映了首先给予NaCl,然后在28天时给予二价或四价疫苗剂量的组群。图1-9说明了由不同疫苗接种方案引起的抗体响应。图10-18说明了由不同疫苗接种方案S1起的CMI响应。结论1-一种由HPV31和45LIVLP组成的异源加强剂可有效加强由HPV16和18LIVLP初免诱导的同源HPV16和18LIVLP响应。2-—种由HPV31和45LIVLP组成的异源加强剂可有效加强由HPV16和18LIVLP初免i秀导的异源HPV31和45LIVLP响应。权利要求1.来自一种第一HPV型的人乳头瘤病毒L1蛋白或其免疫原片段在制备用以加强先前由来自不同HPV型的人乳头瘤病毒L1蛋白或其免疫原片段引发的免疫响应的药物中的用途。2.根据权利要求l的用途，其中第二型在系统发生学上与第一型相关。3.根据权利要求1或2的HPV31或HPV52LI蛋白或其免疫原片段在制备加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV16疫苗的免疫响应的药物中的用途。4.根据权利要求3的HPV31蛋白或其免疫原片段在制备加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV16疫苗的免疫响应的药物中的用途。5.根据权利要求3的用HPV52蛋白或其免疫原片段在制备加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV16疫苗的免疫响应的药物中的用途。6.根据权利要求1或2的HPV16LI蛋白或其免疫原片段在制备加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV31或HPV52疫苗的免疫响应的药物中的用途。7.根据权利要求6的HPV16LI蛋白或其免疫原片段在制备加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV31疫苗的免疫响应的药物中的用途。8.根据权利要求6的HPV16LI蛋白或其免疫原片段在制备加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV52疫苗的免疫响应的药物中的用途。9.根据权利要求1或2的HPV45LI蛋白或其免疫原片段在制备加强针对包含L1蛋白或其免疫原片段的HPV18疫苗的免疫响应的药物中的用途。10.根据权利要求1或2的HPV18Ll蛋白或其免疫原片段在制备加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV45疫苗的免疫响应的药物中的用途。11.一种防御HPV感染和/或疾病的疫苗"f妄种程序，所述程序包括递送包含来自至少HPV16和HPV18的L1蛋白或其免疫原片段的第一HPV疫苗，和不含来自第一疫苗的HPV16和HPV18Ll组分的第二HPV疫苗，其中第二HPV疫苗含有来自至少一种其它致癌性HPV型的Ll蛋白或其免疫原片段，其中第一和第二疫苗可以任何顺序递送，并且间隔适合的时间递送。12.—种预防HPV感染和/或疾病的方法，所述方法包括递送包含来自至少HPV16和HPV18的Ll蛋白或其免疫原片段的第一HPV疫苗，和不含第一疫苗HPV16和HPV18Ll组分的第二HPV疫苗，其中第二HPV疫苗含有至少一种其它致癌性HPV型的Ll蛋白或其免疫原片段，其中的第一和第二疫苗可以任何顺序递送，并且间隔适合的时间递送。13.根据权利要求11或12的方法或程序，其中所述的第一疫苗包含来自HPV16、HPV18和任选的HPV33的Ll蛋白或其免疫原片段。14.根据权利要求13的方法或程序，其中所述的第一疫苗另外包含来自HPV58的Ll蛋白或其免疫原片段。15.根据权利要求11-13中任何一项的方法或程序，其中所述的第二疫苗包含来自HPV31和/或HPV45和/或HPV52的Ll蛋白或其免疫原片段。16.根据权利要求15的方法或程序，其中所述的第二疫苗包含来自HPV31和HPV45的Ll蛋白或其免疫原片段。17.根据权利要求16的方法或程序，其中所述的第二疫苗包含来自HPV31、HPV45和HPV52的Ll蛋白或其免疫原片段。18.根据权利要求11-17中任何一项的方法或程序，其中所述的第一和第二疫苗没有共有的相同的Ll蛋白或蛋白片段。19.根据权利要求11-18中任何一项的方法或程序，其中第一疫苗的HPV16或HPV18组分可防御由第二疫苗中至少一种HPV型引起的感染和/或疾病。20.—种疫苗组合物，包含HPV31Ll蛋白或其免疫原片段与HPV45Ll蛋白或其免疫原片段的组合，该疫苗不包含HPV16或HPV18Ll蛋白或其免疫原片段。21.根据权利要求20的疫苗组合物，包括HPV52Ll蛋白或其免疫原片段。22.—种试剂盒，包含权利要求11的第一和第二疫苗组合物。23.根据权利要求22的试剂盒，其中所述的第一疫苗组分包含HPV16和HPV18Ll蛋白或其免疫原片段，并且第二疫苗组分包含HPV31和HPV45蛋白或其免疫原片段。24.根据前述权利要求中任何一项的用途、方法、程序、疫苗或试剂盒，其中所述的HPVL1蛋白为病毒样颗粒形式。25.根据前述权利要求中任何一项的用途、方法、程序、疫苗或试剂盒，其中所述第一或第二疫苗都包含佐剂。26.根据权利要求25的用途、方法、程序、疫苗或试剂盒，其中所述的佐剂包含3D-MPL。27.根据权利要求25的用途、方法、程序、疫苗或试剂盒，其中所述的佐剂包含铝盐。28.根据权利要求26或27的用途、方法、程序、疫苗或试剂盒，其中所述的佐剂包含铝盐和3DMPL。29.根据权利要求26的用途、方法、程序、疫苗或试剂盒，其中所述的佐剂包含水包油乳剂佐剂和和3DMPL。30.根据权利要求29的用途、方法、程序、疫苗或试剂盒，其中所述的水包油乳剂包含可代谢油、固醇和乳化剂。全文摘要本发明公开了一种预防HPV感染和/或疾病的方法，所述方法包括递送包含来自至少HPV16和HPV18的L1蛋白或其免疫原片段的第一HPV疫苗，和不含来自第一疫苗的HPV16和HPV18L1组分的第二HPV疫苗，其中第二HPV疫苗含有来自至少一种其它致癌性HPV型的L1蛋白或其免疫原片段，其中第一和第二疫苗可以任何顺序递送，并且间隔适合的时间递送。文档编号A61K39/12GK101217976SQ200680023032公开日2008年7月9日申请日期2006年4月24日优先权日2005年4月26日发明者B·D·A·科劳申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司