葡萄糖可诱导的胰岛素表达和治疗糖尿病的方法

专利名称：：葡萄糖可诱导的胰岛素表达和治疗糖尿病的方法葡萄糖可诱导的胰岛素表达和治疗糖尿病的方法
背景技术：
本发明主要涉及治疗和预防糖尿病的方法，更具体的涉及为了治疗糖尿病而受调控地表达胰岛素。在具有正常血液葡萄糖调控的个体中，胰腺激素胰岛素响应于升高的血糖水平而分泌。通常在饭后出现血液葡萄糖增加，其是由于胰岛素作用在外周组织比如骨骼肌和脂肪上而产生的。胰岛素刺激这些外周组织的细胞活跃地从血液中摄取葡萄糖并将其转化成储藏的形式。这一过程也被称为葡萄糖弃量(glucosedisposal)。个体在一天中的血液葡萄糖水平从低到正常再到高发生变化，其取决于此人是处于禁食状态、中间状态、还是才聂食状态。这些水平也分别被称为低血糖、正常血糖、和高血糖。在糖尿病患者个体中，由于胰岛素分泌的缺陷或者作用的缺陷，这些葡萄糖动态平衡方面的变化失调，导致了慢性的高血糖症。糖尿病是一种常见疾病，其发病率约为4-5%。糖尿病发生的风险随体重的增加而增加，多达卯。/。的成年型糖尿病患者;U巴胖的。因此，由于肥胖成年人的高出现率，成年型糖尿病患者的发病率在世界范围内正在升高。糖尿病分为三个主要类型。II型糖尿病是一种类型，也被称为非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)或者成年型糖尿病。I型糖尿病是第二种类型，其被称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)。第三种糖尿病是遗传性的，其是由于控制胰岛p细胞功能的基因发生突变造成的。尽管胰岛素的诊断基于葡萄糖检测，对所有患者进行准确分类却不总是可行的。II型糖尿病在成人中更加普遍，而I型糖尿病在儿童和十几岁的青少年中占主要。I型和II型糖尿病都与预期寿命的缩短相关，并且与其它并发症比如心血管疾病和动脉石更化相关。为预防后期并发症，糖尿病的长期处置通常包括胰岛素治疗，而无论患者分类是I型还是II型。I型糖尿病是自身免疫性疾病，其与产生胰岛素的胰腺P细胞的几乎完全丧失有关。p细胞的这种丧失导致终生的胰岛素依赖。I型糖尿病可发生在任何年龄，并且据估计在所有剖宫产新生儿中有约0.3-1%在他们的一生中会发生此疾病。治疗I型糖尿病和在一定程度上治疗II型糖尿病的普遍使用的方法在传统上由胰岛素维持疗法组成。此疗法的最筒单的形式需要在々反后或者一天中以有规律的间隔时间，将纯化的或重组的胰岛素注射到患者体内，以维持正常的血液葡萄糖水平。这些注射最好需要以每天4次的频率进行。尽管上述治疗方法给患者提供了一些益处，但是胰岛素治疗的这种方法仍然受到对血液葡萄糖控制不足的困扰，并且需要患者极大的M。I型糖尿病的另一个治疗方法包括使用比如胰岛素泵的装置，其使得可以定期递送胰岛素。此方法对于上文描述的方法是优选的，因为不需要经常的注射。但是，胰岛素泵疗法的使用也有缺陷，因为其仍需^隔三天替换一次针头。类似于胰岛素维持疗法，胰岛素泵方法也不能达到最优的葡萄糖调控，因为胰岛素的递送不是根据血液葡萄糖水平的变化来调控的。因此这些治疗糖尿病的方法是繁瑣且不足的。另外，这些方法对于平均成人寿命的时间而言也不是完全有效的，或者显示出对于预防此疾病是有效的。已经尝试了用于代替生物活性胰岛素i^糖尿病患者个体的多种细胞治疗方法。这些包括基因疗法、免疫疗法和应用人工p细胞。用于胰岛素或其它多肽表达的体内基因疗法包括在动物模型中肝脏靶向的病毒介导的转导。但是，这些方法不提供葡萄糖调控的胰岛素以治疗有效量的递送，它们也不能恢复或再生产生胰岛素的P细胞，并且在患者中的应用是有限的。例如，对于I型糖尿病的胰岛素基因疗法优选包括合适的调控系统，使得胰岛素将响应血液葡萄糖水平的升高而产生，并且随着血液葡萄糖的降低而抑制。为达到使用自然中存在的葡萄糖调控启动子产生葡萄糖应答胰岛素，已经做出了多种努力。但是，所使用的启动子不能达到足够高的转录活性，并且在非禁食条件下所治疗的动物中显示出至少中等的高血糖。因此，需要具有有效葡萄糖应答的细胞特异性表达元件，和能够以恢复生成胰岛素的(5细胞的生理能力的方式在糖尿病个体中调控葡萄糖动态平衡的方法。本发明满足了这一需求，同时也提供了相关的优点。
发明内容本发明提供分离的组织特异性葡萄糖应答启动子，其具有位于至少一个三联转录因子结合顺式元件3，侧的聚合酶结合结构域，所述转录因子结合顺式元件具有肝细胞核因子-1(HNF-1)元件、CAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)应答元件和葡萄糖应答元件(GRE)。所述启动子可包含第二个或第三个三联转录因子结合顺式元件。本发明也提供包含了本发明组织特异性葡萄糖应答启动子的宿主细胞。还提供了治疗或预防糖尿病的方法。所述方法包括将有效量的具有包含了组织特异性葡萄糖应答启动子的载体的病毒颗粒施用给个体，所述组织特异性葡萄糖应答启动子包含在至少一个三联转录因子结合顺式元件3，侧的聚合酶结合结构域，所述转录因子结合顺式元件具有肝细胞核因子-1(HNF-1)元件、CAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)应答元件和葡萄糖应答元件(GRE)，所述元件可操纵地连接到编码胰岛素的核酸上，其中编码胰岛素的核酸的表达是组织特异性的及葡萄糖应答的。图1显示顺式调控元件的三拷贝组件的生成，用以构建合成启动子文库。(A)pcDNA3.1载体中的原始多克隆位点(MCS)被新的MCS所替换，产生pcDNA3-NewMCS。(B)用于构建三拷贝组件的3个不同顺式调控元件的可能组合。将葡萄糖应答元件(G)、C/EBP结合元件(C)和HNF-1结合元件(H)相混合并按顺序地连接至pcDNA3-NewMCS中的f/ml/S"柳m^c^V和五"iV/EcoiI位点，产生三拷贝SP-D3。图2显示合成启动子文库的产生。(A)pGL3-Enhancer载体中的原始MCS被新的MCS所替换，产生pGL3E-NewMCS。(B)含有三、六和九拷贝的顺式调控元件的合成启动子的示意图。LPK启动子(-96/十12，相对于转录起始位点而言)的邻近区域被用作产生合成启动子-报告子构建物的基本启动子。来自三拷贝SP-D3的三拷贝组件被转移到pLPK(-96/+12)丄1^的1/7"1/五《^1位点，产生三拷贝的SP-Luc报告质粒。另外的三拷贝组件以相同(五"RI/Y/^1)或相反方向(X/^I/7V/^1)被插入三拷贝SP-Luc,产生六拷贝SPXE-Luc和六拷贝SPXN-Luc质粒。通it^六拷贝SPXE-Luc的X/^I/7V/^I位点导入另外三拷贝组件产生九拷贝SP-Luc质粒。箭头指示三拷贝组件的方向。具有3个顺式元件的盒表示含有单一元件的三拷贝组件的单个位置。图3显示在体外，合成启动子相比于CMV启动子的比较性萤光素酶活性。(A)三拷贝合成启动子的萤光素酶活性。(B)六拷贝合成启动子的萤光素酶活性，其具有CMV启动子活性的8%以上。每种合成启动子萤光素酶构建体被转染入H4IIE细胞并且在转染后一天检测萤光素酶活性。按照CMV启动子活性的百分率来计算合成启动子构建体的萤光素酶活性。LPK表示pLPK-Luc质粒。萤光素酶测定在至少两轮不同的转染中重复实施四次。所有值为平均值士S.D.。图4显示了在合成启动子构建体中顺式调控元件的组成。(A)六拷贝SPXI-Luc质粒显示CMV启动子活性的8%以上和(B)九拷贝SP-Luc质粒显示CMV启动子活性的25%以上，显示了上述情形下顺式元件的排布。研究了超过300个克隆的六拷贝SPXN-Luc和六拷贝SPXE-Luc的转录活性。其中，选择17个显示活性超过CMV启动子活性8。/。的质粒，用于产生九拷贝SP-Luc质粒，其是通过插入另外三个顺式元件拷贝完成的。所选择的九拷贝合成启动子用于产生腺病毒以确定它们的体内作用。六拷贝SPXN的组成没有显示。图5显示(A)六拷贝SPXE-Luc、(B)六拷贝SPXN-Luc和(C)九拷贝SPXN-Luc的转录活性的分布图样。来自六拷贝SPXE、六拷贝SPXN、和九拷贝SP-Luc的每个DNA被转染ii^H4IIE细胞，然后进行萤光素酶测定。合成启动子构建物的萤光素酶活性4艮据CMV启动子活性的百分比计算。该图显示了具有所指示萤光素酶活性％的构建体的数量。图6显示rAd-CMV-rINSfur在STZ谦导的糖尿病NOD.scid小鼠中降低血液葡萄糖水平的作用。rAd-CMV-rINSfur病毒以不同的剂量(5xl010、10xl01Q、5xl(f和10xl(^个病毒颗粒)施用给糖尿病动物。该图显示来自每个剂量组的代表性数据。#代表在该天接受治疗动物的死亡。，5xl010个病毒颗粒；o，101()个病毒颗粒；T，5xi()9个病毒颗粒；△，109个病毒颗粒。图7显示rAd-23142-rlNSfur在STZ诱导的糖尿病NOD.scid小鼠中降低血液葡萄糖水平的作用。rAd-23142-rlNSfur病毒以不同的剂量((A)5xl010(n=4)、(B)10xl010(n=7)和(C)5xl09(n=6)病毒颗丰立)施用给糖尿病小鼠。所有值均为平均值士S.D.。图8显示rAd-23137-rlNSfur在STZ谦导的糖尿病NOD.scid小鼠中降低血液葡萄糖水平的作用。(A)rAd-23137-rlNSfur在糖尿病动物中降低血液葡萄糖水平的作用。rAd-23137-rlNSfur和rAd-CMV-rINSfur病毒被施用给STZ诱导的糖尿病NOD.scid小鼠，并且监控血液葡萄糖7JC平。使用没有用病毒治疗的糖尿病NOD.scid小鼠作为阴性对照。，rAd國23137-rlNSfur(n=7);o，糖尿病NOD.scid小鼠(n=4);T，rAd-CMV-rINSfur(n=8)。所有值均为平均值士S.D.。(B)在接受治疗的动物肝脏中重组腺病毒基因组的情况。在病毒施用后的不同时间点，从用rAd-CMV-rINSfur(5xl09)或rAd-23137-rlNSfur病毒(IO1。个病毒颗粒)治疗过的小鼠获得肝脏。从肝脏中提取全DNA，然后使用大鼠胰岛素基因的引物进4亍PCR以检测腺病毒基因组。1道，第5天的rAd-CMV-rINSfur;2道，第10天的rAd-23137-rINSfur;3道，第25天的rAd-23137-rINSfur;4道，第50天的rAd-23137-rlNSfur;5道，作为阳性对照的pAd國23137-rlNSfur质粒。图9显示在经rAd-23137-rlNSfur治疗的NOD.scid小鼠中的葡萄糖耐受检验。正常血糖的动物在接受rAd-23137-rlNSfur治疗之后禁食16小时，并且通过^M内注射来施用葡萄糖(每kg体重2g)。在葡萄糖负荷之后1、15、30、60、卯、120、180、240和270分钟时，测量血液葡萄糖水平。，经rAd-23137-rlNSfur治疗的NOD.scid小鼠；o，正常对照小鼠；T，糖尿病对照小鼠。所有值均为平均值土S.D.。图10显示在经rAd-23137-rlNSfur治疗的细胞系中，肝细胞特异性胰岛素基因的表达。rAd-23137-rlNSfur或rAd-CMV-rINSfur病毒经感染进入如下一些细胞系(A)H4IIE(大鼠肝细胞瘤细胞系)，(b)L929(小鼠成纤维细胞细胞系)，(C)L6(小鼠肌肉细胞系)，(C)HeLa(人宫颈癌细胞系)，(D)NRK(正常大鼠肾细胞系)，(E)3T3-L1(小鼠成纤维细胞细胞系)。使用抗大鼠胰岛素的特异性抗体对细胞进行染色。用没有被病毒感染的细胞作为阴性对照。图11显示在经rAd-23137-rlNSfur治疗的NOD.scid小鼠中，肝特异性胰岛素基因的表达。rAd-CMV-rINSfur和rAd-23137-rlNSfur病毒被施用给STZ诱导的糖尿病NOD.scid小鼠。在受治疗动物显示出正常葡萄糖水平之后，处死它们并取出多个器官，其包含肾脏(K)、脾脏(S)、肝脏(L)、肺(Lu)、和心脏(H)。分离总RNA，并使用大鼠胰岛素或HPRT的引物进4亍RT-PCR。(A)rAd-CMV-rINSfur，HPRT，(B)rAd-CMV-rINSfur，大鼠胰岛素，(C)rAd-23137-rlNSfur，HPRT和(D)rAd-23137-rlNSfur，大鼠胰岛素。图12显示rAd-23137-rlNSfur在自发性糖尿病NOD小鼠中降低血液葡萄糖水平的作用。将rAd-23137-rlNSfur病毒(3xl0^个病毒颗粒，n=4)通过尾静脉经静脉内注射施用给糖尿病NOD小鼠。在施用后几天，使用rAd-23137-rlNSfur治疗的动物显示出正常血液葡萄糖水平，并且正常的血液葡萄糖水平保持长达十天。所有值均为平均值士S.D.。具体实施方式本发明涉及用于体内胰岛素受控表达的组织特异性、葡萄糖应答启动子的构建和应用。本发明的合成启动子显示出响应葡萄糖的体内胰岛素表达受严格调控的肝脏特异性活性。这些功能性特征表明本发明受调控的启动子可用于在人体内通过胰岛素基因疗法治疗或治愈糖尿病。另外，本发明的葡萄糖应答启动子表现出多个优点，其可有益于体内调控胰岛素表达。例如，本发明合成启动子相比于天然葡萄糖应答启动子，转录活性较高，使得体内血液葡萄糖水平保持在正常范围内。所述合成启动子也诱导胰岛素基因的肝脏特异性表达，其可帮助减轻由于体内基因治疗期间胰岛素的普#达带来的不希望的副作用。另外，相比于天然葡萄糖应答启动子，本发明合成启动子也表现出更有效的葡萄糖应答能力，从而快速清除外源导入的葡萄糖，然后使胰岛素表达快速下降。在一个实施方案中，生成由3个不同的转录因子结合元件随机组合构成的合成启动子。肝脏富含的转录因子结合元件用于所述合成启动子的构建。肝细胞核因子-1(HNF-1)元件和CAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)应答元件用于增强肝脏特异性转录活性。葡萄糖应答元件(GRE)用于赋予葡萄糖应答性。合成各个元件并组装产生三拷贝组件，其包括三拷贝的各个顺式元件的所有可能组合。将由三个三拷贝组件组成的合成启动子克隆到报告质粒上以鉴定具有高体外转录活性的合成启动子。在非禁食状态的免疫缺陷STZ豫导NOD.scid小鼠和免疫活性糖尿病NOD小鼠中，所得的启动子驱动响应葡萄糖变化的肝脏特异性胰岛素基因表达，并且有效地维持血液葡萄糖水平在正常范围内。在另一个实施方案中，体内肝脏靶向的胰岛素表达对于胰岛素基因治疗具有益处，因为它是胰岛素作用的主要靶器官，并在葡萄糖动态平衡中起重要作用(Taylor,R.&Agius，L.(1988).Thebiochemistryofdiabetes.肌oc/^附./.，250:625-640)。另外，肝脏具有必需的葡萄糖匪感受组分，例如葡萄糖转运蛋白(Rencurel，F.,Waeber,G.，Antoine,B.,Rocchiccioli,F"Maulard,P"Girard,J.等(1996).Requirementofglucosemetabolismforregulationofglucosetransportertype2(GLUT2)geneexpressioninliver.所oc/ie柳./"314(Pt3),903-909)和葡萄糖激酶(Bonini，C.，Ferrari,G"Verzeletti,S.,Servida,P"Zappone,E.，Ruggieri，L.等(1997)HSV誦TKgenetransferintodonorlymphocytesforcontrolofallogeneicgraft-versus-leukemia.5We"ce276:1719-1724)(Rencurel,F"Waeber，G"Antoine，B.,Rocchiccioli，F.，Maulard，P"Girard,J.等(1996).Requirementofglucosemetabolismforregulationofglucosetransportertype2(GLUT2)geneexpressioninliver.所ocAe附./.，314(Pt3),卯3-卯9)。因此，像胰腺p细胞一样，肝脏具有内在的响应血液葡萄糖浓度变化的能力。从这一点看，肝脏是I型糖尿病的胰岛素基因疗法的适合靶器官。如本文所使用的，术语"糖尿病(diabetes)"意指已知为糖尿病(diabetesmellitus)的糖尿病病症。糖尿病是慢性疾病，其特征为胰岛素的相对或者绝对缺乏，这导致了葡萄糖不耐性。该术语的意思包含所有类型的糖尿病，包括例如I型、II型以及遗传性糖尿病。I型糖尿病也被称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)，其还包含例如青少年型糖尿病。I型糖尿病主要是由于胰腺P细胞遭到破坏所致。II型糖尿病也被称为非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)，其特征部分地在于餐后的胰岛素释放减少。胰岛素抵抗也可能是导致II型糖尿病发生的因素。遗传性糖尿病是由于突变造成的，该突变扰乱了(3细胞的功能和调控。糖尿病的特征在于禁食时血液葡萄糖的水平大于或等于约140mg/dl或者血浆葡萄糖7JC平大约或等于约200mg/dl，此评定是在口服约75g的葡萄糖负载量之后约2个小时作出的。术语"糖尿病，，也意指包括具有高血糖的那些个体，包舍艮性高血糖和削弱的葡萄糖耐受性。高血糖个体中的血浆葡萄糖水平包括例如葡萄糖浓度高于正常值，如通过可靠的诊断指示剂所确定的。这些高血糖个体具有发展出明显糖尿病临床症状的风险，或倾向于此。如本文所使用的，术语"治疗"意为改善糖尿病的指示性临床症状。临床症状的改善包括，例如，在所治疗的个体中，相对于治疗之前的水平或者相对于患有糖尿病的个体，其血液葡萄糖水平下降或者葡萄糖从血液中清除的速率上升。术语"治疗"也包括在患有失调性高血糖的个体中诱导出正常血糖应答。正常血糖指临床上确立为正常的，或者在低血糖范围以上而在高血糖范围以下的血液葡萄糖水平范围。因此，正常血糖应答指刺激葡萄糖摄取以降低血浆葡萄糖浓度到正常水平。对于大多数成年人，这一水平对应的浓度范围是约60-105mg/dL血液葡萄糖，优选约70-100mg/dL之间，但是取决于例如个体的性别、年龄、体重、饮食以及整体健康状况而可以在个体间有所变化。例如，对糖尿病个体的有效治疗将是降低所述个体的高血糖或升高的血液葡萄糖水平到标准或正常血糖水平，此降低的直接原因是由于胰岛素的分泌。作为替代的，有效治疗应该是将禁食时血液葡萄糖降低到低于或等于约140mg/dL的水平。术语"治疗"也意指包括降低与糖尿病相关的病理状况或慢性并发症的严重程度。这些病理状况或慢性并发症被列于表1，包括例如肌肉萎缩、酮酸中毒、糖尿、多尿症、多饮、糖尿病微血管病或者小血管病、动脉粥样硬化血管病或者大血管病、神经病和白内障。表l.与糖尿病有关的病理状况肾脏肾小球ait營病弥漫性肾小球政化症结节性肾小球^更化症(基-威病(Kimmel-stiel-Wilsondisease))尿路感染急性肾盂肾炎肾衰竭坏死性乳头炎气性肾盂肾炎糖原性肾病(阿-埃损伤)眼视网膜病非增殖性视网膜病毛细血營微动脉瘤、视网膜水肿渗出、和出血增殖性视网膜病小血管增生视力丧失出血性纤维化、视网膜脱落白内障晶状体渗透压改变造成的暂时性屈光不正虹膜中血管增生导致的音光眼感染神经系统脑血管动脉粥样硬化病中风、死亡外周神经病外周感觉神经和运动神经、颅神经、自主神经皮肢感染毛囊炎导致痈糖尿病性脂性渐进性坏死由于微血管病昔瘤继发千高脂血症心血管系统冠状动脉粥样硬化心l使死、死亡外周动脉粥样硬化肢体缺血、坏疽生殖系统增高的胎儿死亡率(胎盘病、新生儿呼吸窘迫综合征、感染)全身对感染的敏感性增高延緩创伤愈合另外的并发症也包含，例如，对感染和创伤愈合的敏感性的普遍增高。术语"治疗"也意指包括糖尿病个体相比于未治疗个体而言平均预期寿命的增加。其它病理状况、慢性并发症或者疾病表型显现是本领域技术人员已知的，它们可类似的用作对糖尿病治疗的衡量，只要与所述疾病有关的这些状况、并发症或者显现的严重程度有所减轻即可。如本文所使用的，术语"预防"意指阻止指示糖尿病的临床症状。此阻止包括例如在所述疾病明显症状出现之前或者诊断出所述疾病之前，维持具有发生糖尿病风险的个体体内血液葡萄糖的正常水平。因此，术语"预防，，包含对个体的预防性治疗以避免他们出现糖尿病。在个体中预防糖尿病也意指包括抑制或阻止所述疾病的t艮。抑制或阻止所述疾病的发展包括例如抑制或阻止异常葡萄糖代谢的发生，例如葡萄糖从血浆到细胞转运的障碍。因此，有效的预防糖尿病包括维持葡萄糖动态平衡，其是由于在易患糖尿病的个体，例如肥胖个体或者具有糖尿病家族史的个体内葡萄糖调控的胰岛素表达所致。抑制或阻止所述疾病的发展也包括例如抑制或阻止与糖尿病有关的一种或多种病理状况或者慢性并发症的t艮。与糖尿病有关的这些病理状况的例子在表1中列出。如本文所使用的，术语"葡萄糖应答"意指通过葡萄糖水平的改变调控核酸序列的表达。例如，葡萄糖应答表达包括通过升高的葡萄糖水平诱导启动子活性。这样的葡萄糖应答启动子包含三联转录因子结合顺式元件(例如HNF-1、C/EBP结合元件和GRE)。这样的葡萄糖应答启动子也包括多于一个的三联转录因子结合顺式元件，其包括2、3或4个或更多的三联转录因子结合顺式元件。含有一个或多个三联转录因子结合顺式元件的葡萄糖应答启动子的具体实例被显示在例如图3和4中。葡萄糖应答启动子也可含有无组织特异性或增强子元件的GRE。在其它启动子中存在的葡萄糖应答元件的具体实例包括例如具有序列CATGTGAAAACGTCGTG(SEQIDNO:ll)的大鼠ACC(-122);具有序列CACGTGGTGGCCCTGTG(SEQIDN0:12)的大鼠S14(-1439);具有序列CACGCTGGAGTCAGCCC(SEQIDNO:13)的小鼠S14(-1439);具有序歹'JCACGGGGCACTCCCGTG(SEQIDNO:14)的大鼠L-PK(-166);具有序列CATGTGCCACAGGCGTG(SEQIDNO:15)的大鼠FAS(-7210)。当针对调控基因表达使用时，术语"葡萄糖"意为包含葡萄糖和葡萄糖代谢物，只要这样的代谢物可造成葡萄糖应答启动子表达的升高即可。葡萄糖代谢物包括葡萄糖代谢的中间产物，例如葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、3-裤酸甘油醛、2-磷酸甘油酸和丙酮酸。如本文所使用的，当针对一个或多个转录因子结合顺式元件的接近度而使用时，术语"基本上"或"基本上相同"意指元件足够接近以允许结合的转录因子与另一反式结合因子(包含聚合酶)之间相互作用。在转录因子顺式元件之间足够实施反式结合因子功能的距离是本领域^^P的，例如可在BolouriandDavidson,7VW/.5W.USA100:9371-9376(2003)和Davidsonetal,5We/i",295:1669-78(2002)中找到描述。如本文所使用的，术语"可操纵性的连接"或者语法上的等同物，意指核酸组件根据7>知的遗传学和细胞学原理相连接，其允许每个组件的必需功能在它的耙核酸上实施。因此，形成三联转录因子结合顺式元件的顺式元件组可操纵性连地连在一起，从而引起相关编码区域序列的转录和调控。相似的，可操纵性连接的胰岛素编码核酸的编码区被连接到它的启动子和三联转录因子结合顺式元件，使得所述启动子将引起胰岛素编码核酸的转录和调控。如本文所使用的，术语"表达"或者语法上的等同物，意指通过细胞转录、翻译和加工核酸。表达可以是例如组成型或调控型的，例如通过可i秀导型启动子或者组织或细胞特异性启动子。两个或更多个核酸序列也可同时表达，或者作为替代的，与其它所需核酸各自进行表达。表达两个或更多个核酸序列的具体实例包括胰岛素A链和B链的共表达。取决于氨基酸或待表达核酸序列的数量和功能，可使用其它共表达模式的多种组合。本领域技术人员了解或可确定何种共表达模式可用于达到特定目的或满足预期的需要。使用三联转录因子结合顺式元件的组织特异性和可诱导表达的实例都在下文实施例1中进一步描述。如本文所使用的，术语"胰岛素，，用于指能够响应升高的葡萄糖水平从而刺激细胞摄取葡萄糖的多肽。胰岛素可对应于来自多种脊推动物(例如人、猪、马、大鼠或牛)的JIJ^酸序列或其任意部分，只要所得的表达分子保持至少一种生物活性功能，例如刺激葡萄糖摄取、糖原合成、氨基酸摄取或者蛋白质合成。该术语也包含具有氨基酸取代的胰岛素的修饰形式，其增强或不显著减小所述多肽刺激细胞葡萄糖摄取的生物活性。胰岛素也可包含氨基酸残基的添加或缺失，只要它保持胰岛素生物活性即可。因此，生物活性的胰岛素可具有与野生型胰岛素相似或者相比于野生型胰岛素较高或较低的活性，只要所述生物活性的胰岛素刺激细胞的葡萄糖摄取即可。一般地，人胰岛素分子量约5.8kDa。提供人胰岛素A链和B链序列怍为本发明胰岛素多肽的典型序列。人胰岛素A链对应于核苷酸2496-2591(SEQIDNO:7)并且具有SEQIDNO:8所示的^J^断列，人胰岛素B链对应于核苷酸3477-3542(SEQIDNO:9)并且具有SEQIDNO:IO所示的M酸序列。人胰岛素基因序列储存于GenBank序列号J00265下。人胰岛素#^酸序列储存于GenBank序列号AAA59172下。人胰岛素cDNA序列可在GenBank序列号X70508处找到。来自除人之外物种的胰岛素多肽的核苷酸和M酸序列是本领域技术人员已知的。所有这些序列和能够保持胰岛素生物活性的基本等同物以及其功能性片段包含在本文使用的术语"胰岛素"内。大致上，胰岛素由经二硫键连接的B链区和A链区组成。胰岛素A链和B链可来源于胰岛素原，其是胰岛素的前体形式。本发明的胰岛素原多肽可以是M酸序列或其一部分，其对应于多种脊推动物物种(例如人、猪、马、大鼠或牛)，只要它含有胰岛素的A链或B链区或者其功能性片段即可。本发明的胰岛素原包括胰岛素原的修饰形式，只要前体多肽或者修饰形式可被加工成胰岛素的生物活性形式或者能够组装成胰岛素生物活性形式的胰岛素A链或B链区即可。胰岛素原多肽的前体区可以基本上是任何氨基酸序列，只要它不对将胰岛素原加工成胰岛素、其A链、其B链、或其功能性片^负面影响即可。因此，前体区序列可以是例如胰岛素前肽(例如介于A链和B链序列之间的胰岛素原序列)。作为替代，这样的前体区可以是例如任何多种氨基酸序列，例如接头序列，、其通常不出现在,推动物胰岛素，、分子中。上文给出了，为本发人员已知的。所有这些序列和k基本等^]物以及其^能性片段包含在本文说明书第12/50页胰岛素生物活性形式的胰岛素A链或B链区域的能力。胰岛素原可以由例如连接至B链和A链序列的C链组成。如本文所使用的，术语"宿主细胞"指用根据本发明的核酸、载体或病毒颗粒所转化或转导的细胞。该术语也指能够被包含了本发明的组织特异性葡萄糖应答启动子作为其基因组的病毒颗粒感染的细胞。如本文所使用的，当针对施用病毒颗粒使用时(所述病毒颗粒含有以组织特异性葡萄糖应答形式表达胰岛素的载体)，术语"有效量，，意指施用的病毒颗粒数量足够感染靶组织，并且在葡萄糖诱导下以降低一种或多种糖尿病症状的水平从病毒颗粒的基因组表达胰岛素。例如，表达胰岛素的有效量的病毒颗粒由造成血液葡萄糖水平降低或导致葡萄糖动态平衡或两者皆有的病毒颗粒的数量组成。另外，如上文表l中所述的糖尿病的临床表现也可用作病毒颗粒有效量的量度。相似的，病毒颗粒的有效量也意指可被施用并导致胰岛素在葡萄糖调控下表达的病毒颗粒的数量，其表#表达胰岛素的有效量的病毒颗粒将导致在摄取食物情况下的正常血糖。根据本文提供的教导和指导以及本领域技术人员熟知的知识，对于人类个体来说有效量的病毒颗粒可以例如从可靠的糖尿病动物模型中外推出来。对于小鼠动物模型，病毒颗粒的有效量例如包括在约lxl()S-lxlO"之间，优选在约lxl0、8xl0"之间，更优选在约lxlO"-lxlO"之间。一个特别有用的有效量是约3xl0"个病毒颗粒。如本文所使用的，术语"药用可接受载体"意指适于施用给个体的溶液或介质。这些溶液或介质可维持化合物与多肽的稳定性，以及细胞的存活力。药用可接受载体是本领域公知的，其包括水溶液比如磷酸盐緩冲溶液或者介质。药用可接受载体也包括其它的部分、化合物和/或制剂，其增强或增加病毒颗粒乾向、附着或感染它们的体内宿主细胞或组织的能力和/或用于定时释放递送或者出于免疫保护目的的作用。这些部分、化合物和/或制剂是本领域技术人员公知的，并且可包含，例如，受体配体、细胞外基质分子或其组分，以及化学递送制剂。如本文所使用的，术语"分离的"意指基本上不含有如自然中通常所存在的污染物或材料的核酸。因此，术语"分离的"包含基本上纯的核酸以及导入到异源细胞或组织的核酸。设计并生产用于治疗糖尿病的本发明的合成启动子。根据本文提供的教导和指导，应理解本文所描述的方法可应用于大范围的人病理学方法的设计和治疗。这样的病理学方法包括基因替换治疗和可通过导入一种或多种基因产物调控生理系统的疗法。因此，本发明描述了有关用于治疗糖尿病的胰岛素基因替换治疗，但是本领域技术人员将理解可4吏用本发明的组合物和方法产生用于除糖尿病之外多种疾病的合成启动子和基因的受调控表达。简言之，用于胰岛素基因替换治疗的一组标准包M择合适的靶细胞，其具有类似于(3细胞的生化特征但是没有自身免疫攻击。所述耙细胞也应该含有将胰岛素原加工成为成熟的活性胰岛素必需的生化机制。可响应葡萄糖水平表达和释放胰岛素的调控系统也有益于保持葡萄糖动态平衡。对于靶细胞，肝脏可用作合适的胰岛素生产替代器官，因为它是胰岛素作用的主要位置，在葡萄糖动态平衡中起重要作用(Nguyen,T.H.&Ferry，N.(2004).Livergenetherapy:advancesandhurdles.G^we77^.11S叩pl:S76-84.S76-S84)。另夕卜，肝脏中的干细胞具有类似于胰腺p细胞中所发现的葡萄糖感受系统，其涉及葡萄糖转运蛋白2(Rencurel，F.,Waeber，G"Antoine,B.,Rocchiccioli,F"Maulard，P"Girard，J.etal.(1996).Requirementofglucosemetabolismforregulationofglucosetransportertype2(GLUT2)geneexpressioninliver,fi"c/ie附./"314(Pt3),903醒卯9)和葡萄糖激酶(Gould,GW.&Holman,CiD.(1993).Theglucosetransporterfamily:structurefunctionandtissue-specificexpression,g&c/^附./295(Pt2)，329-341;Iynedjian，P.B.(1993).Mammalianglucokinaseanditsgene,fi/oc/ie附./293(Pt1),1-13)。因此，类4以于胰腺P细胞，肝脏具有内在的响应血液葡萄糖浓度变化的能力。肝细胞还含有已充分表征过的弗林蛋白内切酶，其具有已充分研表征过的切割i口、别序列(Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg(Van,d"V，Roebroek,A.J.,&VanDuijnhoven,H丄.(1993).Structureandfunctionofeukaryoticproproteinprocessingenzmesofthesubtilisinfamilyofserineproteases.CW说ev.Owa7g.,4:115-136)。切割识别序列可掺入胰岛素原作为其天然切割位点的异源取代，以使得加工成为胰岛素A链和B链。弗林蛋白酶切割位点的掺入可包括改变碱性氨基酸残基，将B/C(Arg-Arg)和C/A(Lys-Arg)连接改变为四碱性序列(Arg-X-Lys-Arg;SEQIDNO:16)，其被弗林蛋白酶识别。或者，胰岛素A链和B链可作为成熟的可分泌多肽共表达，并允许自组装成异源二聚体胰岛素。另外，将正常P细胞的调控赋予所述胰岛素基因也是有益的，其使得将响应血液葡萄糖水平升高而产生和释放胰岛素，并随着血液葡萄糖浓度的下降而受到抑制。葡萄糖调控包括除了转录调控和分泌之外的一些因素，其包括需要的葡萄糖转运蛋白功能(Rencurel，F.,Waeber，G,Antoine，B.，Rocchiccioli,F"Maulard，P"Girard，J.etal.(1996).Requirementofglucosemetabolismforregulationofglucosetransportertype2(GLUT2)geneexpressioninliver.所。c/^附./"314(Pt3)，卯3國909)、葡萄糖激酶功能和钾/钓通道，其用于响应细胞外葡萄糖浓度改变而分泌胰岛素。已经作出了一些使用肝脏特异性和葡萄糖应答启动子重建肝脏中胰岛素的葡萄糖应答生物合成的尝试。但是，转录调控系统在上调和下调胰岛素生物合成上都具有相对慢的动力学，因此分别表现出高血糖状态的延长或者导致低血糖。本发明提供非天然启动子，其严格响应葡萄糖调控胰岛素产生，以规避这些慢的动力学。本发明提供分离的组织特异性葡萄糖应答启动子。所述启动子包含与至少一个三联转录因子结合顺式元件的3，相连的聚合酶结合结构域，所述转录因子结合顺式元件具有肝细胞核因子-1(HNF-1)元件、CAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)应答元件和葡萄糖应答元件(GRE)。本发明的组织特异性葡萄糖应答启动子将具有聚合酶结合位点或结构域，其足以被聚合酶识别并起动转录。所述聚合酶结合结构域可由，例如，II型聚合酶结合结构域组成。这样的聚合酶与多种本发明的转录因子相互作用，以增加或调控mRNA转录。但是，也可应用其它的聚合酶结合结构域，其中对顺式结合元件作出相应修饰以使得适应于所选择的聚合酶结合结构域。聚合酶结合结构域的具体例子是肝脏丙酮酸激酶(LPK)启动子片段，其具有相对于如下文实施例1中所述转录起始位点的从-96位到+12位核苷酸。根据本文提供的教导和指导，本领域技术人员应当知启动子和方法。本发明的组织特异性葡萄糖应答启动子包含至少一个三联转录因子结合顺式元件。所述三联元件含有一个或多个增加转录的转录因子顺式结合元件。如下文进一步描述的，基于在肝脏中增强转录来选择顺式结合元件。但是，为了将本发明应用到肝脏之外的组织，本领域技术人员应当知道当其它靶组织用于基因替换治疗时，在肝脏中有活性的顺式结合元件可被在其它靶组织中有活性的顺式结合元件所替代。这样的对于非肝脏组织有活性的或特异性的其它转录因子顺式结合元件是本领域中公知的。因此，下文关于肝脏中有活性的顺式元件的描述是举例性的。产生并选择肝脏特异性葡萄糖应^成启动子，以包含一个或多个增加例如肝脏中转录的转录因子顺式结合元件。多种具有3，连接到LPK启动子的转录因子顺式结合元件的启动子示例在实施例1中描述并在图3和4中显示。为达到以肝脏特异性形式的快速转录激活，本发明启动子将肝细胞富含的转录因子结合元件导入到葡萄糖应答系统中。肝脏特异性启动子和增强子以及顺式作用调控元件的相对位置和它们与肝调控因子的相互作用是本领域公知的。任何已知的或鉴定的增加转录或控制的转录因子可用于本发明启动子。参与肝脏特异性基因表达正调控的示例性肝脏特异性转录因子顺式元件包含肝细胞核因子1(HNF-1)、CAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)、和肝细胞核因子4(HNF-4)(Cereghini，S.(1996).Liver-enrichedtranscriptionfactorsandhepatocytedifferentiation,/^y五fi/,10:267-282)。两个或更多个这些因子以不同的组合协同作用以在成体肝细胞中刺激给定基因的细胞特异性转录和增强转录看起来需要这些顺式元件的特定组合(De,S.,V&Cortese,R.(1992).Transcriptionfactorsandliver-specificgenes.S/0cA/附.5/o/7^j^.y4"fl.，1132:119-126)。对于本发明肝脏特异性启动子的具体实例，三联序列可包含这些因子中的一个或多个以增加肝脏中胰岛素的转录。为了转录活性和胰岛素调控，也可包含协同作用的两个或更多个的组合。协同作用的组合包含，例如，图1-4中所示的显示出高活性的那些组合其。任何这样的组合可包含在本发明启动子的三联转录因子结合顺式元件中。本发明组织特异性葡萄糖应答启动子的葡萄糖应答可通过，例如，包含葡萄糖/碳水化合物应答元件(G1RE或ChoRE)来达到。也可使用除G1RE之外的转录因子顺式结合位点作为本发明的葡萄糖应答元件。G1RE元件可在一些响应葡萄糖的基因的3'调控区域中找到，所述基因包括，例如，LPK和Spot14(Doiron，B.,Cuif，M.H.,Kahn,A.,&az-Guerra，M.J.(1994).Respectiverolesofglucose,fructose,andinsulinintheregulationoftheliver-specificpyruvatekinasegenepromoter.丄5/oAC7^附.，269:10213-10216;Shih,H.M.,Liu,Z.,&Towle，H.C.(1995).TwoCACGTGmotifswithproperspacingdictatethecarbohydrateregulationofhepaticgenetranscription.丄丑/o/.C/re附.270:21991-21997;Shih,H.M.&Towle，H.C.(1992).Definitionof仇ecarbohydrateresponseelementoftheratS14gene.Evidenceforacommonfactorrequiredforcarbohydrateregulationofhepaticgenes./.忍/o/.C/ie附.,267:13222-13228)并且含有两个拷贝的与c-myc家族转录因子的共有结合位点CCTGTG相关的基序。此结合位点对葡萄糖应答调控是足够的。但是，GIRE需要辅助位点，例如对于LPK是HNF-4以及对于S14的未知转录结合位点，以支持对葡萄糖的完整应答(Shih，H.M.，Liu，Z.，&Towle,H.C.(1995).TwoCACGTGmotifswithproperspacingdictatethecarbohydrateregulationofhepaticgenetranscription./.jB/o/.C/re附.270:21991-21997)。本发明的组织斗异性葡萄糖应答启动子与HNF-4结合元件和LPK启动子组合产生杂交元件，称为GRE，其实现了葡萄糖应答活性的增强。基于所得组织特异性葡萄糖应答启动子的活性来选择转录因子结合顺式元件的顺序。简言之，启动子和增强子的调控区域由一些顺式调控元件的组合组成，并且所述元件的组成和排列通过转录调控子之间的组合相互作用确定调控区域的特性(Carey,M.(1998).Theenhanceosomeandtranscriptionalsynergy.CW/，92:5-8)。可通过与同类顺式元件结合的多个活化子与许多不同的能够有转录协同作用的转录因子组合的组合作用和协同作用增加转录效率和活性水平。这些相互作用的一个好处在于有限数量的活化子可布置成多个可能的组合，其每个在生物学上可以是不同的(Struhl,K.(2001).Generegulation.Aparadigmforprecision.5W^i"293:1054-1055)。基于这些特性，建立文库并筛选特别有用的组织特异性葡萄糖应答启动子，其含有随机顺序的三顺式调控元件用于肝脏特异性增强转录活性的HNF-l和C/EBP;以及用于葡萄糖应答的合成启动子的与HNF-4结合的葡萄糖应答元件(GRE)。在所述合成启动子文库中使用培养的大鼠肝细胞瘤细胞系筛选表现出高转录活性的启动子，接着使用动物模型进行体内确认。用于构建本发明组织特异性葡萄糖应答启动子文库的HNF-l转录因子结合顺式元件长约27个威基，如SEQIDNO:l所示。但是，用于本发明启动子的HNF-l顺式元件可包含较大和较小的片段，只要保持HNF-l转录活性即可。例如，HNF-l转录因子结合顺式元件可在约15-100个核苷酸的范围内，优选约20-50个核香酸，更优选约25-30个核苦酸。用于构建本发明组织特异性葡萄糖应答启动子文库的C/EBP转录因子结合顺式元件长约22个核苷酸，如SEQIDNO:2所示。但是，用于本发明启动子的C/EBP顺式元件可包含较大和较小的片段，只要保持C/EBP转录活性即可。例如，C/EBP转录因子结合顺式元件可在约12-100个核苷酸的范围内，优选约16-50个核苷酸，更优选约20-25个核香酸。用于构建本发明组织特异性葡萄糖应答启动子文库的GRE转录因子结合顺式元件长约48个核苷酸，如SEQIDNO:3所示。但是，用于本发明启动子的GRE顺式元件可包含较大和较小的片段，只要保持GRE转录活性即可。例如，GRE转录因子结合顺式元件可在约15-100个核苦酸的范围内，优选约25-75个核苷酸，更优选约45-50个核苷酸。在本发明三联转录因子结合顺式元件中的顺式元件如下文实施例1所述可被并入多种不同组合。所述组合可包含不同顺序的各个元件，其包含所有可能的组合和排列以及各个顺式元件之间和三联元件和启动子元件之间的空间变化。空间变化可包括，例如，顺式元件基本上邻近另一元件或与另一元件直接不间断的相连。另外，转录因子也可在多种空间位置操纵，其中在间隔区域中具有足够的弹性，以使得，当两个因子发生物理相互作用而它们的同类顺式结合区域彼此间具有实质距离时，核酸可形成环。因此，可调整间隔，以在本发明转录因子结合顺式元件之间包含宽范围的间插序列。本发明启动子可包括其它修饰，其包括，例如，如上所述的三联转录因子结合顺式元件的大小。本发明启动子的具体组合和序列在实施例1和图1-4中进一步举例说明。本发明的组织特异性葡萄糖应答启动子含有至少一个三联转录因子结合顺式元件。三联顺式元件在下文举例说明，其具有HNF-1、C/EBP和GRE的多种组合。上文和下文所述的其它元件也可取代或包括在此三联元件中以达到提高组织特异性表达或葡萄糖应答。另外，对于三联转录因子结合顺式元件的顺式元件组分的多种组合和排列而言，多种组合、排列和更高重复次数的三联转录因子结合顺式元件可包括在本发明的启动子中，以进一步增加它们的转录和调控控制。例如，两个或更多个三联转录因子结合顺式元件可基本邻近地、连续地或者含有间插序列地进行组合，以产生具有六个或更多顺式元件组分的启动子。两个或更多个三联元件可以相同方向或头对脚方向组合或连接。或者，两个或更多个三联元件可以相反或头对头方向组合。如在实施例中进一步举例说明的，任一种方向都将实现可用于本发明方法的转录活性和控制。在实施例中例举的是单个三联元件以及以基本邻近方式结合的两个和三个三联转录因子结合顺式元件组合，在每个三联元件之间只有限制性识别序列。这些组织特异性葡萄糖应答启动子的活性在实施例中描述并且在图l-12的一些测定中举例说明。除了单个、两个或三个三联元件之外，其它更高的重复次数可包括在本发明的启动子中。添加的多于3个的三联顺式元件类似，彼此之间可以是相同或相反方向的相同、相反或任意组合。因此，本发明提供组织特异性葡萄糖应答启动子，其具有l、2、3、4或5个或更多的三联转录因子结合顺式元件。组成三串联重复转录因子结合顺式元件的转录因子顺式元件可以包括HNF-1、C/EBP或GRE。上文和下文所述的其它元件也可取代或包含在此三联元件中，以达到组织特异性表达或葡萄糖应答的提高。除了在培养的细胞中构建、筛选和鉴定全部有活性的组织特异性葡萄糖应答启动子之外(本文也称为体外)，本发明启动子的转录活性调控控制也在体内进行确认。筒言之，使用腺病毒载体用于递送在本发明启动子控制下的编码异源基因的核酸，相比于培养物中的测量，其确认了含有本发明启动子的多种三联体的的类似体内转录和调控活性。因此，本发明也提供了宿主细胞和具有含本发明组织特异性葡萄糖应答启动子的细胞的宿主，所述启动子能够表达乾核酸。如下文进一步描述的，所述耙核酸可以是胰岛素、胰岛素原、胰岛素A链、胰岛素B链或者胰岛素A链和B链。在本发明的另一个实施方案中，提供了宿主细胞或者表达胰岛素原的细胞群体，所述胰岛素原可以以组织特异性葡萄糖应答的方式被加工成胰岛素。本发明的宿主细胞基本上可来源于4壬何组织或器官。一个特别可应用于治疗的细胞类型是在本发明肝脏特异性葡萄糖应答启动子控制下表达胰岛素原的肝细胞，所述胰岛素原可被加工成胰岛素。但是，任何细胞类型都可用作本发明的宿主细胞，并且可基于其预期的应用进行选择，所述应用包括，例如，治疗、诊断或研究目的。对于宿主原代细胞，应该选择易得的且含有表现出所需生长和表达特性的细胞的组织。当选择组织来源时，其它的考虑包括对组织的选择，所述组织含有可被分离、培养和修饰以表达生物活性胰岛素的细胞。除了肝脏之外，组织来源的例子包括胰腺、肌肉、脂肪、肠、神经内分泌细胞或皮肤组织，以及造血细胞来源的。因此，在这些组织之中的细胞类型可以被^f务饰以组织特异性和葡萄糖调控的形式表达耙基因，并且可以被分离并用于包括例如实验研究、载体保持和传代的目的，以及用于细胞治疗方案。这样的细胞类型包括，例如，肝细胞、P胰岛细胞、肌肉(平滑肌、骨骼肌或心肌)细胞、成纤维细胞、肝脏细胞、脂肪细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞、内分泌细胞、外分泌细胞、肾细胞、膀胱细胞、脾脏细胞、干细胞和生殖细胞。特别有用的宿主细胞是肝细胞，包括能够分化成肝细胞的祖细胞和干细胞。类似的其它细胞类型是本领域已知的，其能够被修饰以表达葡萄糖应答的胰岛素，并且可如上文所述类似的从组织来源中获得或分离到。尽管对于治疗目的来讲，人组织来源是有益的，但是细胞来源的物种基本上可以是任何哺乳动物，只要所述细胞表现出允许将胰岛素原表达加工成生物活性的胰岛素并分泌的特性即可。本发明也提供治疗或预防糖尿病的方法。所述方法包括将有效量的具有包含了组织特异性葡萄糖应答启动子的载体的病毒颗粒施用给个体，所述启动子包含与至少一个三联转录因子结合顺式元件的3，相连的聚合酶结合结构域，所述转录因子结合顺式元件具有肝细胞核因子-1(HNF-1)元件、CAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)应答元件和葡萄糖应答元件(GRE)，所述元件可操纵的连接到编码胰岛素的核酸上，其中编码胰岛素核酸的表达是组织特异性的及葡萄糖应答的。在另一个实施方案中，任何本发明的组织特异性葡萄糖应答启动子可以可操纵的连接到胰岛素编码核酸(例如胰岛素原)并用于基因替换治疗。如下文进一步描述的，可以应用本领域公知的多种方法中的任意方法将组织特异性葡萄糖应答胰岛素编码核酸导入到靶细胞或组织中，用于体内产生胰岛素和治疗糖尿病。用于靶向和掺入在本发明启动子控制下的胰岛素编码基因的一个特别有用的方法是将基因构建体掺入到病毒载体以产生病毒颗粒。施用这样的含有本发明载体的病毒颗粒能够在感染后以组织特异性和葡萄糖应答的方式表达生物活性胰岛素用于治疗和预防糖尿病。在这一点上，如在下文实施例1中进一步举例的，可产生重组腺病毒，其在本文所述组织特异性葡萄糖应答启动子的控制下表达胰岛素编码核酸(例如胰岛素原基因)，所述病毒可被注射进入个体用于感染并将本发明的编码核酸和启动子掺入受体宿主细胞。取决于所述病毒载体，表达可以是，例如，附加体型的或者是通过整合进宿主细胞基因组的。编码胰岛素的核酸可以是人的，并被修饰以导入弗林蛋白酶识别位点，其用于在肝脏中将胰岛素原加工成成熟胰岛素。腺病毒载体在基因替换治疗中是特别有用的，因为它们已经被充分的研究过并容易用于人类基因治疗。因此，在本发明方法中典型的病毒颗粒是腺病毒载体颗粒。但是，如之前和下文对所述载体进一步描述的，根据本文提供的教导和指导，本领域技术人员将理解，宽范围的病毒颗粒可用于组织特异性葡萄糖应答胰岛素基因递送、生物活性胰岛素的表达和分泌。不论是腺病毒、其它基于DNA病毒的、逆转录病毒或其它的病毒，带有含本发明组织特异性葡萄糖应答启动子控制下的治疗基因的栽体作为其基因组的病毒颗粒可用于本发明方法以治疗或预防糖尿病。本发明的病毒颗粒可以例如使用本领域公知的多种方法中任意方法产生，用于包装病毒基因组。这样的方法在下文关于带有本发明载体的腺病毒颗粒的实施例1中有举例。可通过多种施用途径和方法使用上文所述病毒颗粒治疗缺少葡萄糖动态平衡的糖尿病个体。使用本领域公知的临床标准和糖尿病预后指标选择适于使用本发明方法治疗的个体。根据至少一种糖尿病症状或与糖尿病相关的病理状况(如本文之前所述)确定的临床诊断准许施用本发明的细胞。在表l中列举了典型的病理状况。根据已知的预后指标比如家族史、禁食血液葡萄糖水平或降低的葡萄以葡萄糖调控的方式表达胰岛素原和蛋白酶的细胞。本领域技术人员应当认识到或知道如何诊断患有糖尿病或葡萄糖摄取失调的个体，并且，根据疾病的程度或严重性，可对何时施用本发明的病毒颗粒作出合适的判断，并且也可选择最适当的施用模式。例如，尽管患有长期I型糖尿病的人可能需要即刻施用病毒颗粒以便感染和分泌在组织特异性葡萄糖应答启动子控制下的胰岛素编码核酸，而患有长期II型糖尿病的人可推迟治疗，直至有迹象表明指定的其它治疗缺少有效性。可将含有载体的病毒颗粒施用给已经确定为需要治疗糖尿病以緩解他们的疾病或者可以从中受益的个体，所述载体包含可操纵性连接着组织特异性葡萄糖应答启动子的胰岛素编码核酸(例如胰岛素原)。可施用所述病毒颗粒以改善糖尿病的一种或多种体征或症状。例如，可在作出疾病诊断之后对糖尿病个体施用具有包含本发明组织特异性葡萄糖应答启动子的基因组的病毒颗粒，所述启动子被可操纵地连接到胰岛素编码核酸用于葡萄糖调控表达、加工和分泌生物活性胰岛素。所述病毒颗粒将感染靶组织和细胞，并且通过在体内表达其载体基因组而以葡萄糖调控的方式表达生物活性胰岛素。胰岛素的产生将导致例如葡萄糖动态平衡的恢复。糖尿病得到有效治疗的个体在产生了异源生成的胰岛素后，将显示出指示该疾病的至少一种症状严重程度的降低。症状严重程度的降低是可被检测的，且对于本领域技术人员是显而易见的。也可以向患有轻度糖尿病的个体施用本发明的病毒颗粒。对这些个体是否需要治疗的判断可由本领域技术人员作出。例如，对标准治疗方法没有反应或反应不佳的糖尿病个体可使用本发明的方法进行治疗。例如，II型糖尿病患者，其已经尽力但未能成功地维持长期的体重降低或坚持锻炼方案，这样的患者可通过移植本发明的细胞群体来治疗它们的胰岛素抵抗。本发明的方法也可用于提高其它糖尿病疗法的疗效。本发明的方法可与先前存在的或其它的治疗方法联合使用以提高其它方法的疗效或使用简便性。例如，在对接受每天注射胰岛素的患者或使用胰岛素泵的患者施用本发明的病毒颗粒后，可产生生产胰岛素的肝脏细胞。施用和感染含有可操纵连接到胰岛素编码核酸的本发明组织特异性葡萄糖应答启动子的病毒颗粒以及之后生物活性胰岛素的受调控产生可降低此类患者注射胰岛素的频率。也可对未接受胰岛素治疗但接受了行为矫治治疗(例如节食和运动以减轻体重)的糖尿病个体施用本发明的病毒颗粒。在这些个体中施用含有可操纵连接到胰岛素编码核酸的本发明组织特异性葡萄糖应答启动子的病毒颗粒，并联合减轻体重和锻炼方案，可以降低疾病复发的可能性或者可改善疾病的体征或症状。也可应用本发明含有可操纵连接到胰岛素编码核酸的本发明组织特异性葡萄糖应答启动子的病毒颗粒治疗针对内源胰岛素分泌细胞具有自身免^应的糖尿病患者。这些糖尿病个体经常通过针对自身免M应的免疫治疗性介入进行治疗。这些个体可另外通过生物活性胰岛素的肝脏特异性葡萄糖应答产生来治疗，以达到相比于单独使用免疫疗法时更好的疗效。可以将本发明的含有可操纵连接到胰岛素编码核酸的组织特异性葡萄糖应答启动子的本发明病毒颗粒施用给个体，以使葡萄糖动态平衡增加。病毒颗粒基因组的整^f吏得葡萄糖动态平衡延长，其是由于胰岛素功能的表达性恢复所致。可向患有糖尿病的个体施用有效量的病毒颗粒以减轻或预防糖尿病。这些个体可具有约140mg/dl或更高的禁食血液葡萄糖水平。适于感染的病毒颗粒有效量由在范围内的颗粒大小或颗粒数目组成，所述范围对于含有可操纵地与胰岛素编码核酸连接的本发明组织特异性葡萄糖应答启动子的颗粒是可获得的或可被修改的，所述病毒颗粒的有效量足以在病毒感染i^体内受益于治疗的靶细胞或组织(例如肝脏)之后表达大量葡萄糖调控的生物活性胰島素。对于人类个体来说，病毒颗粒的有效量可以是例如根据本文提供的教导和指导以及本领域技术人员公知的知识，从可靠的糖尿病动物模型中推导出来。对于小鼠动物模型而言，病毒颗粒的有效量例如包括在约lxloS-lxlO"之间，优选在约lxl0、8xl011之间，更优选在约lxlO"-lxlO"之间。特别有用的有效量是约3xl0"个病毒颗粒。对病毒颗粒数量的选择可取决于颗粒的来源、接受个体的状况、以及所需的胰岛素分泌水平。本领域技术人员应当知道如何使用本领域公知的方法确定产生治疗效果的病毒颗粒的合适数量。可以采用多种途径施用本发明病毒颗粒用于递送在本发明肝脏特异性葡萄糖应答启动子控制下的胰岛素编码核酸。除静脉内注射(i.v.)之外，有效量的病毒颗粒也可通过例如肌肉内注射、皮下注射、腹膜内注射、或者注射到组织或器官位置而施用给个体。用以施用的病毒颗粒可通过本领域公知的方法获得和制备，并混悬在合适的生理载体中。例如，病毒颗粒可通过连接在含有所述颗粒的装置上的导管(所述导管插入静脉)而直接注入，或者可直接注射进入组织。所述病毒颗粒在药用可接受栽体中被注入，该载体在上文定义并在下文进一步讨论。所述病毒颗粒也可与其它促进递送、靶向和/或疗效的分子一起施用。病毒颗粒可以根据需要单次或多次施用，以使得葡萄糖调控的生物活性胰岛素实现治疗水平的足够表达。然后可通过检测进食后的胰岛素分泌水平来监测使用病毒颗粒治疗的个体，以观察其疗效。这一检测可由例如对胰岛素血液水平的放射性免疫法检测或ELISA组成。作为替代的，对施用病毒颗粒后个体中禁食葡萄糖水平的测量可用来确定治疗效力。根据葡萄糖耐受测试所确定的葡萄糖消除速率的降低也可被用来验证治疗效力。另外，至少一种与糖尿病有关的症状的减轻也可用来确定治疗效力。本领域技术人员应当知道评价和诊断治疗效力的合适方法。本发明也可用于预防糖尿病。例如，含有可操纵连接着胰岛素编码核酸的本发明组织特异性葡萄糖应答启动子的病毒颗粒可作为预防药施用给具有发生糖尿病风险或患有高血糖的个体。本发明也可用于比如遗传上易发生糖尿病的个体或具有发生胰岛素抵抗或高血糖失调风险的肥胖个体。这些个体在临床上明显的高血糖发作之前或期间，可接受有效量的含有可操纵性连接着胰岛素编码核酸的本发明组织特异性葡萄糖应答启动子的病毒颗粒，用于感染靶细胞并且随后分泌葡萄糖调控的胰岛素。后一种情况可视为预防该疾病，但是也可视为治疗该疾病，因为在慢性高血液葡萄糖水平显示出来以前，获得了正常的葡萄糖动态平衡。除了施用含有可操纵性连接着胰岛素编码核酸的本发明组织特异性葡萄糖应答启动子的病毒颗粒以在个体中感染和产生葡萄糖调控的生物活性胰岛素之外，本发明的载体也可直接施用到个体用于遗传修饰，例如用于离体或体内治疗。本发明的含有可操纵性连接着胰岛素编码核酸的本发明组织特异性葡萄糖应答启动子的病毒颗粒或载体可直接导入到人体或配制成为药用组合物，其包含药用可接受载体。药用可接受载体是本领域公知的，包含水溶液比如水、生理緩冲盐水、或其它溶剂，或者载体比如二元醇类、甘油、油类比如橄榄油或可注射有机酯。药用可接受载体可包含生理可接受化合物，其用于例如稳定或增加病毒颗粒的感染、载体核酸序列的吸收、或两者皆有。本领域技术人员应当知道对药用可接受载体包括生理可接受化合物的选择取决于例如施用含有可操纵连接到胰岛素编码核酸的本发明组织特异性葡萄糖应答启动子的病毒颗粒的途径以及病毒颗粒的具体特征，例如，病毒颗粒是基于DNA病毒还是逆转录病毒。如果需要的话，药用组合物也可被掺入水包油型乳剂、微乳、胶束、混合胶束、脂质体、孩i球或其它多聚物基质中(Gregoriadis，Z^pso附eT^/mo/柳，Vols.ItoIII，2nded.,CRCPress,BocaRaton,FL(1993);Fraleyetal.,Trends历oc/^附6:77(1981))。例如，由磷脂或其它脂质组成的脂质体是无毒的、生理可接受并可代谢的载体，它们的制备和施用相对简单。另外，脂质体是特别有用的，因为它们可高效率包封本发明的含有可操纵连接到胰岛素编码核酸的本发明组织特异性葡萄糖应答启动子的载体，而不损害试剂的生物学活性，优先地并充分地结合于耙细胞，并高效的将嚢泡中的水性内容物递送到靼细胞中(见Mannimoetal.,所otec/m/,s6:682(1988))。用于递送本发明载体到个体的脂质体靶向可以是被动的或主动的。被动靶向例如利用了脂质体在网状内皮系统(RES)细胞中和在器官比如肝脏中累积的趋势，肝脏中含有窦状毛细血管。这些配制为脂质体的载体可直接输注入肝脏的门静脉，并且将有效修饰肝脏细胞以表达胰島素，这是由于肝脏中RES细胞浓度和肝脏中循环系统的窦状特性所致。含有载体的脂质体的主动靶向可通过将特异性配体与脂质体相偶联来实现。这些配体包含单克隆抗体、糖、糖脂或蛋白质比如由靶细胞所表达受体的配体。选择哪一种靶向方法取决于待修饰以用于胰岛素表达的细胞类型或组织的位置。给个体施用含有可操纵连接到胰岛素编码核酸的本发明组织特异性葡萄糖应答启动子的病毒颗粒或载体，可以是单次治疗或者多次治疗，其取决于所需产生胰岛素的水平或待修饰细胞的数量。用于递送编码多肽的核酸序列的方法是本领域已知的，例如，如Feigneretal.，美国专利No.5,580,859(1996年12月3日颁证)所述。也可实施多次施用以增加修饰细胞的比例，增加每细胞的可操纵连接到本发明组织特异性葡萄糖应答启动子的胰岛素编码核酸的拷贝数，或者在所需时期内维持修饰细胞的有效数量。如果至少一种糖尿病症状緩解或减轻，则达到了体内治疗的疗效。在所治疗的个体中，糖尿病症状严重程度的减轻可由本领域技术人员根据前文所述进行测定。用于导入和表达在组织特异性葡萄糖应答启动子控制下的胰岛素编码核酸的基因替换疗法的典型模式在下文例举。这样的模式包括应用腺病毒载体，以及组织特异性例如肝脏。在设计和优化用于治疗疾病的基因替换疗法时，要考虑三个通常的部分。这些部分包含传递基因的载体、用于将所述载体递送到合适组织或器官的装置和方法、以及治疗性基因。可基于本领域公知的标准选择或调整每个部分，其取决于感兴趣的特定疾病的具体特征。已经开发了许多基因转移载体，其中任一都可用于与本发明的组织特异性葡萄糖应答启动子的联合，以递送受调控的治疗基因。基因转移载体可大致分为病毒型和非病毒型基因递送系统。病毒递送系统基于能够将遗传信息递送iiyV宿主细胞的复制病毒。通常，复制病毒的基因组含有编码区和顺式作用调控元件。所述编码序列负责产生病毒结构和调控蛋白，其对于感染性病毒的复制是必需的，而顺式作用序列是病毒基因组包装和整合进宿主细胞所必需的。所述病毒的编码区被治疗性基因所替换，留下完整的顺式作用序列以产生复制缺陷型病毒时，含有治疗性基因遗传信息的复制缺陷型病毒颗粒在这些细胞中产生。目前可用于基因治疗的病毒载体基于不同的病毒。基于腺相关病毒(AAV)和逆转录病毒的载体具有将它们的基因组整合到宿主细胞染色体DNA中的能力，其将有可能实现终生的基因表达。基于腺病毒和I型单纯疱瘆病毒(HSV-1)的载体代表了非整合型载体。这些载体将它们的基因组递送进靼细胞的细胞核内，在其中它们仍然是附加体。逆转录病毒是有包膜RNA病毒的一个大家族，其在所有脊推动物中都有发现并且可分为致癌逆转录病毒、慢病毒和泡沫病毒。他们具有两拷贝的7-llkb的线性、正义、单链RNA基因组。在进入耙细胞之后，通过病毒逆转录酶将所述RNA基因组转变成线性双链DNA并整合进细胞染色质(Goff，S.P.(2004).Retrovirusrestrictionfactors.AfoAO//,16:849-859.)。所有逆转录病毒基因组在它们的末端具有两个长末端重复(LTR)序列(Wilhelm，M.&Wilhelm,F.X.(2001).ReversetranscriptionofretrovirusesandLTRretrotransposons.CW/Mo/.!^5W"58:246-1262)。在病毒基因表达、和包装、逆转录以及基因组整合的过程中，LTR和邻近序列以顺式起作用。位于LTR旁侧的gag、pol和env基因分别编码结构核心蛋白质、核酸聚合酶/整合酶和表面糖蛋白。慢病毒在它们的基因组中具有另外两个基因，例如tat和rev，其对于所述基因组表达是必需的，以及一组可变的辅助性基因(Roebuck,K.A.&Saifuddin，M.(1999).RegulationofHIV-Itranscription.GWie^/w:8:67-84)。由于大部分顺式作用序列的位置在终止区，通常产生逆转录病毒作为病毒基因传递载体。最高8kb的替代病毒基因的治疗性基因可被插入并表达。为了包装逆转录载体，在包装细胞系中以反式提供了结构蛋白(Marni，R.，Mulligan,R.C.,&Baltimore,D.(1983).Constructionofaretroviruspackagingmutantanditsusetoproducehelper-freedefectiveretrovirus.CW/，33:153-159)。为避免同源重组，已经开发了表达来自独立构建体的结构蛋白的包装细胞(Danos，O.&Mulligan,R.C.(1988).Safeandefficientgenerationofrecombinantretroviruseswithamphotropicandecotropichostranges.iVoc.7V(^L4cflrf.iS^/.t/.51.^4,85:6460-6464.)。病毒衣壳糖蛋白通过其与靶细胞上受体的相互作用决定了逆转录病毒的宿主范围。所述细胞趋性可通过名为假分型的过程将特定病毒Env替换成来自不同病毒的另一种Env来进行调對Naldini，L.,Blomer，U.,Gage，F.H.,Trono,D.,&Verma,I.M.(1996).Efficienttransfer,integration,andsustainedlong-termexpressionofthetransgeneinadultratbrainsinjectedwithalentiviralvector.P/w.iV,L4aw/.iSW.U.S.A.,93:11382-11388;Zufferey,R.,Nagy,D.，Mandel,RJ.,Naldini,L.,&Trono，D.(1997).Multiplyattenuatedlentiviralvectorachievesefficientgenedeliveryinvivo.TV^AV^c/mo/.,15:871-875)。该方法可通过掺入来自无关病毒的A列扩展逆转录载体的宿主范围。例如，使用疱渗性口炎病毒(VSV-G)的G糖蛋白假型的逆转录病毒可感染大部分细胞并且可被浓缩到超过lxlO"转导单位/ml的效价(Burns,J.C.,Friedma叫T.,Driever,W.,Burrascano，M.,&Yee,J.K.(1993).VesicularstomatitisvirusGglycoproteinpseudotypedretroviralvectors:concentrationtoveryhightiterandefficientgenetransferintomammalianandnonmammaliancells.iVoc.iVflf/.ylcflrf.iSc/.t/.5^.，卯:8033誦8037)。逆转录载体整合进靶细胞基因组的能力是对基因治疗应用有用的特性。核膜的破坏对于前整合复合体是必需的，以整合i^染色质(Roe,T.,Reynolds,T.C.,Yu,G，&Brown,P.O.(1993).IntegrationofmurineleukemiavirusDNAd印endsonmitosis./,12:2099-2108.)，逆转录载体的生产性转导取决于进入后不久靶细胞的有丝分裂(Miller,D.G.，Adam,M.A.，&Miller,A.D.(1990).Genetransferbyretrovirusvectorsoccursonlyincellsthatareactivelyreplicatingatthetimeofinfection-Mo/.CW/10:4239-4242.)。因此，逆转录载体可应用于增殖性乾标，例如淋巴细胞和造血祖细胞(Halene,S.&Kohn，D.B.(2000).Genetherapyusinghematopoieticstemcells:Sisyphusapproachesthecrest.H誕G麼77^"11:1259-1267)。有超过50种不同的人腺病毒血清型。其中，目前的载体主要来源于已知为血清型2和5的那些载体。另外，使用不同血清型衣壳的次级载体递送已经被证明可在动物才莫型中用于载体的重施用(Morral,N.，O'Neal,W.，Rice,K.,Leland,M.，Kaplan,J.，Piedra，P.A.etal.(1999).Administrationofhelper-dependentadenoviralvectorsandsequentialdeliveryofdifferentvectorserotypeforlong-termliver-directedgenetransferinbaboons.户n^.A^L4cfl^.SdU.S.A.,96:12816-12821;Parks,R.,Evdegh，C.,&Graham,F.(1999).Useofhelper-dependentadenoviralvectorsofalternativeserotypespermitsrepeatvectoradministration,7%^:,6:1565-1573)。细胞趋向或免疫应答的改变已导致来自不同血清型的病毒纤维蛋白的改变，其负责主要的病毒-细胞受体结合(Curiel,D.T.(1999).Strategiestoadaptadenoviralvectorsfortargeteddelivery.Jw/i.A^IL4cflrf.5W.，886:158-171.;Wickham，T.J.(2000).Targetingadenovirus.(7ewerAer"7:110-114)。i^细胞后，所述病毒颗粒含有允许有效内涵体裂解和脱离的蛋白，其允许所述基因组进入细胞核(Kasamatsu,H.&Nakanishi，A.(1998).HowdoanimalDNAvirusesgettothenucleus爿/f/i".Jev.Af/cro办/o/"52:627-686.)。一个细胞可产生多达10,000个病毒颗粒，并且通常可达到纯化浓度为lxl013个载体颗粒/ml(Vorburger,S.A.&Hunt,K.K.(2002).Adenoviralgenetherapy.Owa/og/st，7:46-59.)。已知E3基因在免iO^见中起作用；但是，它们对于病毒的生命周期却不是必要的(Woid，w.s.&Gooding,L.R.(1991).RegionE3ofadenovirus:acassetteofgenesinvolvedinhostimmunosurveillanceandvirus-cellinteractions.Ww/。^，184:1-8.)。移去这一区域提供了用于插入最高8kb的较大外源DNA的额外空间。有用的载体含有El和E2和/或E4基因的缺失(Lusky,M.，Christ,M.,Rittner,K.,Dieterle,A.,Dreyer,D.，Mourot,B.etal.(1998).InvitroandinvivobiologyofrecombinantadenovirusvectorswithEl,E1/E2AorE1/E4deleted.丄Wra/.，72:2022-2032;Armentano，D.,Smith,M.P.,Sookdeo，C.C.,Zabner,J.,Perricone，M.A.，StGeorge,J.A.etal.(1999).E40RF3requirementforachievinglong-termtransgeneexpressionfromthecytomegaloviruspromoterinadenovirusvectors./Wro/.73:7031-7034;Gorziglia，M.I.，Lapcevich,C,Roy,S.，Kang，Q.,Kadan,M.，Wu，V.et.al.(1999).GenerationofanadenovirusvectorlackingEl，e2a,E3,andallofE4exceptopenreadingframe3./Wra/.73:6048-6055;Christ,M.,Louis,B.,Stoeckel,F"Dieterle,A.，Grave,L.，Dreyer,D.etal.(2000).ModulationoftheinflammatorypropertiesandhepatotoxicityofrecombinantadenovirusvectorsbytheviralE4geneproducts.//"柳.(7erte7%^;11:415-427)。为降低可能的病毒毒性，辅助病絲赖型载体系统是可利用的，其中辅助病*^有所有复制所需的病毒基因同时在包装结构域中带有条件性缺陷，防止它被包装进病毒衣壳(Morsy,M.A.&Caskey，C.T.(1999).Expanded-capacityadenoviralvectors—thehelper-dependentvectors.MCM^f.Tirfflj;,5:18-24)。第二个载体只含有病毒倒置末端重复序列(ITR)、治疗性基因序列和正常的包装识别信号，其允许该基因组被选择性包装并从细胞释放。由于缺乏除包装区域之外的病毒基因组，这些栽体具有降低的毒性(Balague，C"Zhou，J"Dai,Y"Alemany，R.，Josephs,S.F"Andreason,Getal.(2000).Sustainedhigh-levelexpressionoffull-lengthhumanfactorVIIandrestorationofclottingactivityinhemophilicmiceusingaminimaladenovirusvector.95:820-828;Morral，N.，Parks,R.J.，Zhou,H.,Langston，C.,Schiedner,G,Quinones，J.etal.(1998).Highdosesofahelper-dependentadenoviralvectoryieldsupraphysiologicallevelsofalpha1-antitrypsinwithnegligibletoxicity.Fw附.GWieT7r^:,9:2709-2716)。所述载体DNA基因组以附加体形式存在，并且不在转导的细胞中复制。因此，由于在复制细胞中的稀释或者在非分裂的细胞中附加体基因组的降解，转基因表达可随时间丧失。通过另外施用所述治疗载体可恢复表达。尽管大多数腺病毒栽体通过静脉内施用主要转导肝脏，直接注射腺病毒载体也可转导大部分组织(VranckenPeeters,M.J.,Perkins,A丄.，&Kay,M.A.(1996).Methodformultipleportalveininfusionsinmice:quantitationofadenovirus-mediatedhepaticgenetransfer.所oto^w/《wes,20:278-285)。这些载体已经用于临床前动物研究以转导肝脏、骨骼肌、心脏、脑、肺、胰腺和肿瘤(Bramson,J丄.，Graham,F.L.,&Gauldie,J.(1995).Theuseofadenoviralvectorsforgenetherapyandgenetransferinvivo.Cw/T力/7/rt.5/她c/r助/.6:590-595)。AAV是依赖型病毒的成员，细小病毒的亚家族。所述病毒是非病原性的并且不能自我复制。因此，它需要辅助病毒，例如腺病毒，以介导生产性感染(Muzyczka,N.(1992).Useofadeno-associatedvirusasageneraltransductionvectorformammaliancells.CVifr.Tb/.M/cn^/o/./附附《</.158:97-129)。有六种已知的血清型，每种可有不同的细胞趋向。因为AAV的非病原性特性，它可作为特别有用的基因治疗的载体。所述病毒基因组由两个基因组成rep和cap。所述cap基因编码形成病毒衣壳的结构蛋白，而调控蛋白则由rep基因产生(Muzyczka,N.(1992).Useofadeno-associatedvirusasageneraltransductionvectorformammaliancells.C"fr.7b/7.M/cn^/o/./柳柳"/!/.158:97-129;Russdl,D,W.&Kay，M.A.(1999).Adeno-associatedvirusvectorsandematology.j5/ood,94:-874.;Monahan，P.E.&Samulski，R.J.(2000).AAVvectors:isclinicalsuccessonthehorizonGcrterAer"7:24國30;Tal,J.(2000).Adeno-associatedvirus-basedvectorsingenetherapy.7:279-291)。这两个基因侧翼是长145个核苷酸的病毒ITR。每个病毒颗粒含有单一双链基因组。AAV的包装容量约为5.0kb,其是此载体系统的主要限制(Monahan,P.E.&Samulski，R.J.(2000).Adeno-associatedvirusvectorsforgenetherapy:moreprosthanconsMo/JVf^/.7i^w，6:433-440)。存在rep的野生型病毒具有整合^人19号染色体特定区域的倾向。但是，由于缺少rep基因，此倾向在载体中丧失(McCarty,D.M.,Young,S.M.,Jr.,&SamulskiR.J.(2004).Integrationofadeno-associatedvirus(AAV)andrecombinantAAVvectors.^4www.Jev.G"ewC38:819-845)。AAV载体可通过用启动子和转基因序列替换rep和cap基因来产生。在重组AAV产生过程中，cap和rep序列由辅助质粒提供，以及通过腺病毒共感染来简单地援助传染性病毒(Matsushita,T.，Elliger,S.,Elliger,C"Podsakoff,G，Vilarreal,L.,Kurtzman,GLJ.etal.(1998).Adeno-associatedvirusvectorscanbeefficientlyproducedwithouthelpervirus.GeneTher"5:938-945;Xiao,X.，Li，J.,&Samulski,R.J.(1998).Productionofhigh-titerrecombinantadeno-associatedvirusvectorsintheabsenceofhelperadenovirus.Mra/.,72:2224-2232)。已经开发了其它载体产生系统，其不需要复制型腺病毒(Xiao,X"Li，J"&Samulski,R.J.(1998).Productionofhigh-titerrecombinantadeno-associatedvirusvectorsintheabsenceofhelperadenovirus.丄Wra/.，72:2224-2232)，降低了野生型腺病毒污染的可能。AAV载体已经显示了既通过附加体转基因表达又通过随机的染色体整合来转导细胞(Nakai,H.，Iwaki，Y"Kay,M.A"&Couto，L.B.(1999).Isolationofrecombinantadeno-associatedvirusvector-cellularDNAjunctionsfrommouseliver./Wra/,73:5438-5447;Miao,C.H.，Snyder,R.O.,Schowalter,D.B.，Patijn,GA.,Donahue,B.，Win仇er,B.etal.(1998).ThekineticsofrAAVintegrationintheliver.TV"t(7^iC"19:13-15)。AAV载体也允许将基因或表达盒分成两个载体并且同时施用给肌肉组织或肝脏(Yan，Z.,Zhang,Y"Duan,D.,&Engelhardt，J.F.(2000).Trans-splicingvectorsexpandtheutilityofadeno-associatedvirusforgenetherapy.Pnc.7V"fL4o^Sc/.U.S.A,97:6716-6721;Sun,L.，Li,J.，&Xiao,X.(2000).Overcomingadeno-associatedvirusvectorsizelimitationthroughviralDNAheterodimerization.6:599-602;Nakai，H.，Storm,T.A.，&Kay，M.A.(2000》IncreasingthesizeofrAAV-mediatedexpressioncassettesinvivobyintermolecularjoiningoftwocomplementaryvectors.TVfl^B/otec/m^/.,18:527-532)。另外，因为AAV载体基因组缺少病毒编码序列，所以除了通过载体ssDNA退火或者在载体基因组连接形成串联体之后合成第二链产生dsDNA之外，载体自身与毒性或任何炎症应答无关(Nakai，H.,Storm,T.A.，&Kay,M.A.(2000).Recruitmentofsingle-strandedrecombinantadeno-associatedvirusvectorgenomesandintermolecularrecombinationareresponsibleforstabletransductionofliverinvivo./Mra/"74:9451-9463;Vincent-Lacaze,N.,Snyder,R.O.,Gluzman，R.,Bohl,D.,Lagarde,C，&DanosO.(1999).Structureofadeno-associatedvirusvectorDNAfollowingtransductionoftheskeletalmuscle./Ww/"73:1949-1955;Duan,D.,Yan，Z.,Yue，Y"&Engelhardt，丄F.(1999).Structualanalysisofadeno-associatedvirustransductioncircularintermediates.FZra/ogy,261:8-14;Yang，J.,Zhou,W"Zhang,Y.,Zidon,T.,Ritchie,T.,&Engelhardt,J.F.(1999).Concatamerizationofadeno-associatedviruscirculargenomesoccursthroughintermolecularrecombination.肠/"73:9468-9477;Ferrari,F.K.,Samulski,T"Shenk,T"&Samulski,R.J.(1996).Second-strandsynthesisisarate-limitingstepforefficienttransductionbyrecombinantadeno-associatedvirusvectors./Wra/.,70:3227-3234;Fisher,K.J.,GaoGP.,Weitzman，M.D.,DeMatteo,R.，Burda,J.F"&WilsonJ.M.(1996).Transductionwithrecombinantadeno-associatedvirusforgenetherapyislimitedbyleading-strandsynthesis./.Mra/.,70:520-532)。所述载体颗粒通过体内施用可被递送进许i不同的器官，例如中枢神经系统(CNS)、肝脏、肺和肌肉(Monahan,P.E.&Samulski,R.J.(2000).AAVvectors:isclinicalsuccessonthehorizonGWieTT^r.7:24-30)，并且已发现AAV载体有效地转导非分裂细胞(Miao，C.H.,Nakai，H.，Thompson,A.R.,Storm,T.A.,Chiu，W"Snyder,R.O.etal.(2000).Nonrandomtransductionofrecombinantadeno-associatedvirusvectorsinmousehepatocytesinvivo:cellcyclingdoesnotinfluencehepatocytetransduction./Wra/.74:3793-3803)。I型单纯疱渗病毒(HSV-1)是为了基因转移目的而改造的疱渗病毒。所述载体表现出用于插入至少30kb非HSV序列的外源基因的大容量，其容许大的单基因或协同表达或同时表达的多转基因(Krisky,D.M.,Marconi,P.C.，Oligino,T.J.,Rouse,R.J.，Fink,D.J.，Cohen,J.B.etal.(1998).Developmentofherpessimplexvirusreplication-defectivemultigenevectorsforcombinationgenetherapyapplications.G^/ie.7^f:5:1517-1530)。HSV扩增子载体系统基于HSV-1包装含有顺式作用序列、ori(病毒DNA复制起始位点)和pac(包装和切割信号)的缺陷型基因组的能力。HSV扩增子载体不含除顺式作用元件之外的病毒基因(Spaete，R.R.&Frenkel,N.(1982).TheherpessimplexvirusampHcon:aneweucaryoticdefective-viruscloning-amplifyingvector.0〃，30:295-304)。它们通常约15kb长。为了产生颗粒并包装基因组长度的串联体化载体DNA,标准扩增子系统需要辅助HSV的功能。通过使用缺失包装信号的辅助病毒基因组质粒提高了扩增子载体的产生；辅助病毒基因组作为细菌人工染色体在细菌中增殖(Saeki,Y.,Ichikawa,T"Saeki，A"Chiocca,E.A"Tobler,K"Ackermann，M.etal.(1998).Herpessimplexvirustype1DNAamplifledasbacterialartificialchromosomeinEscherichiacoli:rescueofreplication-competentvirusprogenyandpackagingofampliconvectors.(^"e77^:,9:2787-2794)。此包装系统显著的降低了可复制病毒的产生与细胞毒性。非病毒载体也表现出某些优点，其包括(1)它们易于制备和放大，(2)它们对于待转移的DNA大小而言更加灵活，(3)它们在体内通常是安全的，和(4)它们使特定免疫应答的诱发最小化，并且因此可重复施用。已经有许多使用棵DNA、DNA-阳离子-月旨质体复合物、DNA聚合物复合物及它们的组合的研究才艮道(Lollo，C.P.，Banaszczyk,M.G,&Chiou，H.C.(2000).Obstaclesandadvancesinnon-viralgenedelivery.C"frewZMo/ecw/flf*T^ra/ew^s1,2:136-142;Feigner,P.L.,Barenholz,Y"Behr,J.P.,Cheng,S.H.,Cullis,P"Huang,Letal.(1997).Nomenclatureforsyntheticgenedeliverysystems,^fw附fl/1G^rte7^m/7y,8:511-512;Zauner,W"Ogris,M.，&Wagner,E.(1998).Polylysine-basedtransfectionsystemsutilizingreceptor-mediateddelivery,y^v"wc^/"rwgDCV^viw'ovs1,30:97-113;Ledley，F.D.(1995).Nonviralgenetherapy:Thepromiseofgenesaspharmaceuticalproducts.J^m挑朋GeweT7rmi/7j;,6:1129-1144)。多种用于人体治疗的基因的非病毒药用制剂也是可用的，特别是具有配体引导靶向的DNA-阳离子-月旨质体复合物(Lipoplexes)。与配体(例如叶酸、转铁蛋白或抗转铁蛋白受体抗体)结合的Lipoplexes已经在人乳腺、前列腺、头和颈癌中实现了靶向基因递送和表达(Rolland,A.P.(1998).Fromgenestogenemedicines:recentadvancesinnonviralgenedelivery.O/ft'oi/iev/^s7/i77imi/7^/cDragCVimVriS^ste柳s,15:143-198;Audouy,S.A丄.，deLeij,L.F.M.H.，Hoekstra，D.，&Molema，G(2002).Invivocharacteristicsofcationicliposomesasdeliveryvectorsforgenetherapy.PAfl簡flc^/cfl/^s^fl/rA，19:1599-1605)。合成的化学载体也可用作递送的载体，这是由于它们的稳定性和潜在的化学修饰的简便性。另外，低成本的稳定的生产标准，较高的安全性和高灵活性也4吏得这些化合物特别有用(Lollo,C.P.,Banaszczyk，M.G.，&Chiou，H.C.(2000).Obstaclesandadvancesinnon-viralgenedelivery.CMfTdif(7/7/"/。w/"77^ra/ewf/cs,2:136-142)。另夕卜,非病毒制剂可用于不同的组合，以提供为达到特定治疗目的的灵活性。使用物理基因递送方法，将棵DNA直接递送到细胞质中，避开了内涵体和溶酶体，并且因此避免了酶降解。例如，皮肤基因治疗通常与直接递送方法相结合，其包括基因枪(biolistic)或微发射(microprojectile)i秀导、局部施用、直接注射和电穿孔(Vogel，J.C.(2000).Nonviralskingenetherapy.//柳《(7erte7%m^，11:2253-2259)。目前用于基因治疗的一种非病毒基因转移系统是将棵质粒DNA(pDNA)注射A^部组织或全身循环(Horn,N.A.,Meek,J.A.，Budahazi,G,&Marquet,M.(1995).CancergenetherapyusingplasmidDNA:PurificationofDNAforhumanclinicaltrials./TwwiflwG^weT^ra/^,6:565-573)。例如，已有报道，以棵DNA分子形式注射入肌肉组织或肝脏组织的转基因构建体可,皮肌肉和肝脏细胞吸收并表达(Herwdjer,H.&Wolff,J.A.(2003).Progressandprospects:nakedDNAgenetransferandtherapy.77^f:，10:453-458)。棵DNA基因转移系统由质粒组成，所述质粒含有处于多种真核调控元件的转录控制下的治疗性基因cDNA(Hartikka,J.,Sawdey，M.，Cornefert-Jensen,F.,Margalith，M.,Barnart,Nolasco，M.etal.(1996).AnimprovedplasmidDNAexpressionvectorfordirectinjectionintoskeletalmuscle.^Tm附朋G^weT^era/^,7:1205-1217;Lui,V.W"Falo,L.D.，Jr.,&Huang,L.SystemicproductionofIL-12bynakedDNAmediatedgenetransfer:toxicityandattenuationoftransgeneexpressioninvivo.77^JowfTifl/0/G^weM^//"Vie，7:384-393)。可使用大体积注射来避免棵DNA的降解(Christianson,S.W.,Shultz，L.D.,&Leiter,E.H.(1993).AdoptivetransferofdiabetesintoimmunodeficientNOD-scid/scidmice.RelativecontributionsofCD4+andCD8+T-cellsfromdiabeticversusprediabeticNOD.NON-Thy-ladonors.Z)/fl&tes,42:44-55)，其诱导了在内部器官中(例如肝脏)有效的基因转移。由大体积的含质粒溶液造成的物理压力直接将pDNA递送进细胞，导致了转基因在靼细胞中的表达(Schultz,J.,Pavlovic,J.，Strack，B.,Nawrath，M.，&Moelling,K.(1999).Long-lastinganti-metastaticefficiencyofinterleukin12-encodingplasmidDNA.//w附aw(7ewer力m/昆10:407-417;Blezinger,P"Wang,J.,Gondo,M.,Quezada，A.，Mehrens,D.,French,M.etal.(1999).Systemicinhibitionoftumorgrowthandtumormetastasesbyintramuscularadministrationoftheendostatingene.7V"似re^B/她cAwo/o^j，17:343-348)。电转移也可用作递送载体或核酸的才莫式，所述载体或核酸含有与胰岛素编码核酸可操纵连接的本发明组织特异性葡萄糖应答启动子。简言之，对在大体积生理溶液中的pDNA进行肌肉内注射，使得DNA通it^t流在组织中分布。接着施加电脉冲，通常4吏用外部电极。体内pDNA电转移的参lblL本领域已知的，并且可用于本发明的方法。另夕卜，含DNA溶液的喷射注射也可用于转移基因到皮肤、肌肉、脂肪和乳腺组织。已开发了一些喷射注射器，其通常被用来应用空气推进系统递送皮质类固醇和麻醉溶液到人皮肤中。另一个基因递送模式包括超声。治疗性超声诱导细胞膜变为可通透的，以增加棵pDNA进入骨骼肌和其它组织的转染效率。例如，超声造影剂，Optison(MolecularBiosystems,SanDiego,USA),含有充满气体的人白蛋白微球，其通过与质粒^目混合可加载DNA。Optison可增强棵pDNA的体内和体外转染效率(tTaniyama,Y.，Tachibana，K.,Hiraoka,K.，Aoki，M.，Yamamoto，S.,MatsumotoK.etal.。002).Developmentofsafeandefficientnovelnonviralgenetransferusingultrasound:EnhancementoftransfectionefficiencyofnakedplasmidDNAinskeletalmuscle.(7eweT7^y^;,9:372-380)。另外，与微泡增强的超声联合的子宫内注射棵DNA已显示出在胎小鼠中产生高水平的蛋白质表达(Endoh,M.，Koibuchi,N.，Sato,M.,Morishita,R.，Kanzaki,T"Murata,Y.etal.(2002).FetalGeneTransferbyIntrauterineInjectionwithMicrobubble-EnhancedUltrasound.Mo/eo//^77^ni/^,5:501-508)。通过联合位点特异性配体，超声造影剂微泡能够增强基因靶向到特定组织。另外，通过共注射载有基因的载体(例如脂质体)和所述孩t泡，有可能增加有效载荷(Priee，R.J.&Kaul，S.(2002》Contrastultrasoundtargeteddrugandgenedelivery:Anupdateonanewtherapeuticmodality.Jowmfl/6>/C^nZ/omscM/flf*jPAfl環flco/6^vflwrf7^m/7^/cs,7:171-180)。当全身施用时，使用pDNA的体内基因转移可利用递送系统(例如脂质体或阳离子聚合物)以保护其免受降解。加入聚阳离子导致对pDNA分子的阴离子电荷的静电中和，并且浓缩多核苷酸结构，由此保护其免受核酸酶消化。pDNA和阳离子两性分子可以按不同的比例配制，以产生不同大小和表面电荷性质的复合物。另外，所带净电荷为正的复合物显示出与带负电细胞膜的结合增强，导致细胞摄取增加(Rolland,A.P.(1998).Fromgenestogenemedicines:recentadvancesinnonviralgenedelivery.OWcfl/Wev/eH^T/iT^m^M^/cZ)rwgCVzmVriSy他柳s1，15:143-198)。使用DNA-P日离子-月旨质体复合物(lipoplexes)的基因转移也已经作为递送治疗性基因的方法净皮成功应用。阳离子lipoplexes的生产通常是简便且不昂贵的。它们由非毒性和非免疫原性材料制成，并可递送大的多核苷酸到体细胞中。另外，这些试剂易于在实验室中进行改造以加入新的生物学功能，或者产生新的可筛选其体内活性的制剂。而且，脂质体介导的基因转移不产生任何抗病毒免疫应答，并具有较低的产生致癌突变的风险，因为所递送的基因具有低整合频率并且通常不在所转染的细胞中复制。颗粒或脂质体的稳定性通常增加生物相容性，降低免疫应答，增加体内稳定性并延^c循环中的清除。使用胶原蛋白、乳酸或羟基乙酸、或聚酸酐的基于聚合物的系统是用于体内递送治疗性基因的另外的模式。首先，聚合物中的pDNA分子可得到保护免于在循环系统中被降解，直至它们被释放进入靶细胞。第二，注射或移植聚合物^体内可简单的操作以靶向特定的细胞类型或组织。例如，通过使用细胞耙向配体(例如对于T细胞的抗CD3和抗CD5抗体，或对于一些肿瘤细胞的转铁蛋白)修饰基因载体可达到基因转移的靶向(Gijsens,A.,Derycke,A.,Missiaen,L,DeVos，D.,Huwyler,J.,Eberle,A.etal.(2002》TargetingofthepliotocytotoxiccompoundAIPcS4toHelacellsbytransferringconjugatedPEG-liposomes./"te附flrtVmfl//冊r冊/6>/C騰w,101:78-85;Hofland,H.E.J.，Masson，C,Iginla,S.，Osetinsky,J.，Reddy,J.A.,Leamon,C.P.etal.(2002).Folate-TargetedGeneTransferinVivo.7to卿，5:739-744;Bohl,K.E.,Bergstrand,N.,Carlsson，J.,Edwards,K.，Johnsson,M.,Sjoberg,S.etal.(2002).DevelopmentofEGF-conjugatedliposomesfortargeteddeliveryofboronatedDNA-bindingagents.5,Wwy"g.C7ie附"13:737-743)。另外，已显示与叶酸缀合的基于阳离子-脂质体的转染复合物特异地转染叶酸-受体-表达细胞和肿瘤，提示它A^M内癌症的潜在疗法(Reddy,J.A.，Abburi，C，Hofland，H.,Howard,S.J.，Vlahov,L,Wils,P.etal.(2002).Folate-targeted,cationicliposome-mediatedgenetransferintodisseminatedperitonealtumors.G"騰T7^ra/7j;,9:1542-1550)。转导靶向是一种递送模式，其可用于体内治疗性基因替换疗法。例如，可应用病毒栽体特异地靶向组织或细胞类型或者可应用它们广泛地导入基因到大范围的细胞类型中，其取决于所使用的病毒和其宿主细胞特异性。在这一点上，重组AAV载体在基因治疗应用上是有益的，因为它们允许转移转基因进入宽范围的靶细胞。增加病毒载体对特定细胞群体的效率和特异性将由于允许较低的待施用病毒装载来增强基因治疗的安全性。修饰所述载体的衣壳以实现组织靶向(转导靶向)也可用于本发明的方法，所述衣壳在确定细胞趋向上起重要作用。有许多调整基因转移载体细胞趋向的方法，例如假分型、使用具有特定受体结合性质的分子接头缀合衣壳和趋向的遗传耙向。一种转导重靶向的形式是假分型，其不需要多少特异性病毒相互作用的现有技术。假分型包括将来自一个病毒血清型的衣壳替换成来自另一个病毒血清型的衣壳。假分型已经用于产生选择性逆转录病毒和选择性嵌合腺病毒载体(Somia,N.&Verma，J.M.(2000).Genetherapy:trialsandtribulations.Ato.Wev.(7^iW.，1:91-99)。另外，侧翼是AAV2倒置末端重复序列的AAV载体基因组也被成功地交叉包装在不同血清型的衣壳中，建立了一组具有不同特异性的假型(Rabinowitz,J.E"Rolling,F.,Li,C,Conrath,H.,Xiao,W"Xiao,X.etal.(2002).Cross-packagingofasingleadeno-associatedvirus(AAV)type2vectorgenomeintomultipleAAVserotypesenablestransductionwithbroadspecificity./Wro/.,76:791-801.;Grimm,D.&Kay,M.A.(2003).Fromvirusevolutiontovectorrevolution:useofnaturallyoccurringserotypesofadeno-associatedvirus(AAV)asnovelvectorsforhumangenetherapy.C"fr.G^weT7ref:3:281-304;Gao,GP"Alvira,M.R.,Wang,L，Calcedo,R.，Johnston,J.，&Wilson,J.M.(2002).Noveladeno-associatedvirusesfromrhesusmonkeysasvectorsforhumangene仇erapy.iVoc.TVarf.爿cflrf.Sd.USA,99:11854-11859)。与具有特定受体结合性质的分子接头缀合的病毒衣壳也可用于递送含有与胰岛素编码核酸可操纵连接的本发明组织特异性葡萄糖应答启动子的载体。用于将载体衣壳靶向到不同细胞群的第二种方法已使用含特定受体结合性质的分子接头缀合衣壳。此方法已经用于增强多种培养细胞类型的转导，其使用了腺病毒(Douglas,J.T.,Miller,C.R.,Kim,M.,Dmitriev，J.,Mikheeva,G，Krasnykh，V.etal.(1999).Asystemforthepropagationofadenoviralvectorswithgeneticallymodifiedreceptorspecificities.N虹5/W^7mo/"17:470-475)、逆转录病毒(Snitkovsky,S.&Young,J.A.(2002).TargetingretroviralvectorinfectiontocellsthatexpressheregulinreceptorsusingaTVA-heregulinbridgeprotein.Mra/ogj;,292:150-155)和AAV载体(Ponnazhagan,S.,Mahendra,G,Kumar,S.，Thompson,J.A.，&Castilas，M.,Jr.(2002).Conjugate-basedtargetingofrecombinantadeno-associatedvirustype2vectorsbyusingavidin-linkedligands./,/.,76:12900-12卯7)。施用可操纵连接了胰岛素编码核酸的本发明启动子的第三种方法是遗传改造衣壳基因以破坏重组载体的正常受体结合能力或者将用于可选择受体结合的小肽配体加入到衣壳结构中。此转导重靶向的遗传方法已经在一些研究中成功的重导向了腺病毒载体的趋向(Hidaka,C，Milano,E.，Leopold,P丄.，Bergelson,J.M.，Hackett，N.R.,Finberg,R.W.etal.(1999).CAR-dependentandCAR隱independentpathwaysofadenovirusvector-mediatedgenetransferandexpressioninhumanfibroblasts./C7/w.J羅W，103:579-587)。转录靶向是另一个选择性递送治疗性基因的模式。本发明的组织特异性葡萄糖应答启动子作为表达的转录靶向肝脏的例子。例如，相比于强病毒启动子，可应用强真核启动子(例如本文所描述的那些)来实现体内的长期表达(Verma，M.(2003).Viralgenesandmethylation.爿"".7V.i:爿c"rf,5W.,983:170-180)。应用细胞选择性真核启动子提供了另外的特异性表达转基因的益处。关于启动子结构和设计考虑的指导在下文进一步描述，其包括，例如，核心启动子结构、转录因子和启动子的合理设计。此指导可用于设计和使用本发明的组织特异性葡萄糖应答启动子。简言之，真核基因表达通常通过RNA聚合酶II(RNAPII)的活性和基本转录因子进行控制，所i^本转录因子与在每个真核基因中存在的核心启动子元件相结合(Orphanides,G&Reinberg，D.(2002).Aunifiedtheoryofgeneexpression.CW/，108:439-451)。所述RNAPII和它的基本转录因子(例如TFIIB和TFIID)根据一些调控元件被组装到跨越了相对于转录起始位点从-35到+35bp区域的核心启动子(Roeder,R.G(1996).TheroleofgeneralinitiationfactorsintranscriptionbyRNApolymeraseII.7>^iA所m/^柳.5W.，21:327-335)。在含有TATA盒的启动子中，所述调控元件含有TATA盒和TFIIB识别元件(BRE);而在不含TATA的启动子中，有起始子(initiator)和下游结合元件(DBE)。在许多真核基因的调控区域中TATA盒通常位于-25bp，但是在许多看家基因的启动子中明显缺少(Smale，S.T.(1997).TranscriptioninitiationfromTATA-lesspromoterswithineukaryoticprotein-codinggenes.所oc/w'附.折o/7/i".v4"fl.,1351:73-88)。所述起始子(Inr)通常位于转录起始位点的-3到+5bp，并且能够支持没有TATA盒情况下的转录，或者在两者都存在时与其协同作用(Martinez,E.,Zhou,Q.，L'Etoile,N.D.，Oelgeschlager,T.,Berk,AJ.,&RoederR.G(1995).Corepromoter-specificfuctionofamutanttranscriptionfactorTFIIDdefectiveinTATA隱boxbinding./Voc.A^L4c"rf.5W.U.S.A.,92:11864-11868)。所述DPE也净嫂现用。在提供启动子相连的TFIID和RNAPII之间桥接中起作用的BRE位于TATA盒的上游(Littlefield,0.，Korkhhi,Y"&Sigler,P.B.(1999).ThestructuralbasisfortheorientedassemblyofaTBP/TFB/promotercomplex.iVW/.5W.U.S.A.，96:13668-13673)。许多参与转录的基本转录因子被用来通过这些基序将RNAPII动员至启动子，因此形成前起始复合体(PIC)以在起始位点开始转录(Cornetta,K.,Morgan,R.A.，Gillio，A.，Sturm,S.，Baltrcki,L.,O'Rdly,R.etal.(1991).Noretroviremiaorpathologyinlong-termfollow-upofmonkeysexposedtoamurineamphotropicretrovirus,^w柳.(7eweT^r.,2:215-219)。PIC中的转录因子包含基本转录机制中的细胞类型特异性组分(Albright,S.R.&Tjian，R.(2000).TAFsrevisited:moredatarevealnewtwistsandconfirmoldideas.G匿,242:1-13;Freiman,R.N.,Albright,S.R.，Zheng,S.，Sha,W.C.,Hammer,R.E.,&Tjian，R.(2001).Requirementoftissue-selectiveTBP-associatedfactorTAFII105inovariandevelopment.5W^ice,293:2084-2087)。另外，还可以应用组织特异性基本组分通过联合转录因子/基本因子相互作用进一步增加组织特异性(Holmes,M.C.&Tjian，R.(2000).Promoter-selectivepropertiesoftheTBP-relatedfactorTRT1.288:867-870;Rabenstein,M.D.，Zhou,S.，Lis,J.T.,&Tjian,R.(1999).TATAbox-bindingprotein(TBP)画rdatedfactor2(TRF2),athirdmemberoftheTBPfamily.户rac.7V",L4c"rf.5W.U.S.A,96:4791-4796;Yamit-Hezi,A.&Dikstein,R.(1998).TAFII105mediatesactivationofantiapoptoticgenesbyNF-kappaB.皿BO/"17:5161-5169)。基;^制是体外产生基础水平的转录所必需的，它与其它顺式作用调控因子的相互作用提供了另外的控制水平。这些顺式元件被基因-、刺激-或组织-特异性转录因子所识别，其作为基因表达的反式-激活子或-抑制子起作用，其取决于背景。转录因子通常通过共调控子(coregulator)控制基本机制的活性，所述共调控子作为基本因子和转录因子之间中介体起作用(Glass,CK.&Rosenfeld,M.G(2000).Thecoregulatorexchangeintranscriptionalfunctionsofnuclearreceptors.G^/jMi)ev"14:121-141;Lemon,B.&Tjian，R.(2000).Orchestratedresponse:asymphonyoftranscriptionfactorsforgenecontrol,(^rt^l^v.,14:2551-2569)。这些共调控子在>生启动子-和组织-特异性基因表达上起重要作用并且可用于进一步增加本发明启动子的组织特异性。它们也是细胞能够影响整个转录网络所凭借的手段，并且响应多种刺激和在多种发育阶段协调基因表达(Lemon,B.&Tjian,R.(2000).Orchestratedresponse:asymphonyoftranscriptionfactorsforgenecontrol.G^i^i)ev.,14:2551-2569)。因此，结合于这些因子的短顺式元件提供了用于靶向和控制根据葡萄糖应答元件的异源转基因表达的启动子选择和设计的范围，并且对于调整表达以实现特异性靶向或应答尤其有用。转录因子结合位点位于转录起始位点的上游或下游。结合于这些元件的转录因子通过激活过程中间插DNA的成环与所述启动子接近。也可利用对用于转录靶向的启动子的合理设计来产生本发明的组织特异性葡萄糖应答启动子。在这一点上，对转录机制的深入理解不是生成新合成启动子的前提。可以应用对如实施例1所述启动子构建体的功能性筛选来鉴定含有所需活性的不同元件的最优組合，其可在短的长度上随机合成或者通过将不同顺式元件随机组合成合成启动子来产生(Edelman，GM.，Meech，R.，Owens，GC.，&Jones，F.S.(2000).Syntheticpromoterelementsobtainedbynucleotidesequencevariationandselectionforactivity.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97:3038-3043;Li,X.,Eastman,E.M.,Schwartz,R.J.，&Draghia-Akli,R.(1999).Syntheticmusclepromoters:activitiesexceedingnatuallyoccurrngregulatorysequences.Nat.Biotechnol.,17:241-245.)。应当理解的是，不在实质上影响本发明多种实施方案功能的修改也包括在本文所提供的对本发明的定义中。因此，以下实施例意在举例说明而不限制本发明。实施例1用于治疗I型糖尿病的胰岛素基因疗法此实施例显示了多联葡萄糖应答启动子的产生和选择以及它们在给糖尿病动物提供受调控的胰岛素水平上的应用。通过首先产生3拷贝顺式元件组件来构建合成启动子文库。所述组件含有3拷贝的转录因子结合顺式元件，所述转录因子结合顺式元件为肝细胞核因子-l(HNF-1)元件、CAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)应答元件和葡萄糖应答元件(GRE)的所有可能的组合。如下文所述，通过在如图IB中所示的3个限制性酶位点顺序插入各个顺式元件产生所述组合。这些3拷贝组件被转移到pLPK(-96/十12)-Luc质粒以产生如图2所示的3拷贝的SP-Luc。另外，通过插入3拷贝模块到3拷贝SP-Luc质粒中产生6拷贝的SP-Luc质粒。简言之，为构建带有启动子的质粒，pGL3-增强子载体(PromegaMadison，WI,USA)的原始多克隆位点(MCS)净皮新的依次含有Xhol、Kpnl、BamHI、EcoRV、EcoRI和Nhel位点的MCS所替换，产生pGL3E-NewMCS质粒(图1A)。通过将PCR扩增的LPK启动子区域(相对于转录起始位点的-3200bp/+12bp)直接插入到TA克隆载体(Invitrogen,Burlington,ON,Canada)中来构建pLPK画TA质粒。2.5kbp的LPK启动子的Sacl/Hindlll消化片段被从pLPK-TA质粒上移去并克隆进pGL3-增强子的相同位点，产生pLPK-luc质粒，其用作启动子测定的阳性对照。108bp的LPK启动子的Nhel/Hindlll消化片段(相对于转录起始位点的-96bp/+12bp)被从pLPK-TA上移去并被插入pGL3E-NewMCS质粒的相同位点，以产生pLPK(-96/+12)-luc质粒，其用作本研究中所生成的所有合成启动子的基本启动子，并在图1B中显示。通过转移pGE3-增强子的HindlII/Xbal位点的萤光素酶基因到pcDNA3.1/Hygro质粒的相同位点来生成pCMV-Luc质粒，pcDNA3.1/Hygro质粒从Invitrogen(Burlington,ON,Canada)购买。为产生随机排列的各个顺式元件，所有27个不同的3拷贝SP-Luc质粒以10pg的量混合。另外，从3拷贝SP-D3质粒上切下的3拷贝模块一起混合并与使用相同酶切处理过的3拷贝SP-Luc的混合物连接，产生6拷贝SP-Luc。为了覆盖6顺式元件(3)可能组合的数目，我们从6拷贝SPXE-和SPXN-luc质粒分离了大于300个克隆。为了生成合成启动子文库，为每个控制元件合成两个互补的寡核苷酸，磷酸化并退火产生短DNA片段。所述寡聚核苷酸序列如下HNF-1(正义)，5'-CTAGCTGGTTAATGATTAACCAGGACT-3'(SEQIDNO:l);匪F画1(反义),5'-CTAGCTGGTTAATGATTAACCAGGACT-3'(SEQIDNO:4);C/EBP(正义),5'-TCGCAAGTTGCGCAATATCGCG-3'(SEQIDNO:2);C/EBP(反义),5'-TCGCAAGTTGCGCAATATCGCG-3'(SEQIDNO:5);葡萄糖应答元件(正义)，5,_GGGCGCACGGGGCACTCCCGTGGTTCCTGGACTCTGGCCCCCAGTGTA-3'(SEQIDNO:3);葡萄糖应答元件(反义)，5，画TACACTGGGGGCCAGAGTCCAGGAACCACGGGAGTGCCCCGTGCGCCC-3'(SEQIDNO:6)。合成的所有合成片段在寡核苷酸两端带有特定的限制性酶粘末端，用于产生所述合成启动子文库。导入的限制性酶位点如下Kpnl/BamHI、BamHI/EcoRV和EcoRV/EcoRI。两个互补的寡核苷酸(每个100pmol)在20nl的退火溶液(10mMTris画HClpH7.9,2mMMgCl2,50mMNaCl，和lmMEDTA)中相互混合，然后在卯。C孵育5分钟，并让其在室温緩慢冷却。使用T4聚核苷酸激酶(NEB，Beverly,MA,USA)在50pl的反应混合物中(70mMTris-HClpH7.6,10mMMgCl2,5mMDTT)37。C下对退火的寡聚核苷酸片段磷酸化30分钟，接着在70'C下热失活10分钟。通过苯酚/氯仿/异戊醇萃取来纯化退火/磷酸化的DNA片段，接着其被用于合成启动子文库的生成。首先，每个含有Kpnl/BamHI粘末端的三顺式元件被克隆进用同样酶消化的pcDNA3-NewMCS质粒，产生1拷贝的SP-D3质粒，其中另一个三顺式元件片段被顺序地克隆进BamHI/EcoRV和EcoRV/EcoRI位点以产生3拷贝的SP-D3质粒(图1)。为产生合成的启动子-报告子质粒，来自3拷贝SP-D3质粒的Kpnl/EcoRI消化的DNA片段(3拷贝组件)被亚克隆进pGL3E-NewMCS的相同位点，产生3拷贝的SP-Luc质粒(图2B)。为产生6拷贝的SP-Luc质粒，10照的每个3拷贝SP-D3相混合并使用XhoI/EcoRI或XhoI/Nhel消化，接着^M提取3拷贝组件。同时，所有的3拷贝SP-Luc质粒以相同方式混合并JU吏用相同酶组消化。洗脱的3拷贝组件被亚克隆进XhoI/EcoRI或XhoI/Nhel消化的3拷贝SP-Luc库，产生与之前插入的3拷贝组件相同方向(6拷贝SPXN-Luc)或相反方向(6拷贝XPXE-Luc)的6拷贝的合成启动子文库(图2B)。培养含有6拷贝SPXN-Luc或6拷贝SPXE-Luc质粒的转化体，并收获，用于使用miniprep试剂盒(Qiagen，Mississauga，ON，Canada)的质净立制备。在对高转录活性的合成启动子进行筛选之后，来自3拷贝SP-D3的另外3拷贝合成启动子片段被插入所选择的6拷贝SPXE-Luc的XhoI/Nhel位点以产生9拷贝SP-Luc质粒。对合成启动子文库的筛选如下文所述进行。首先，待筛选高转录活性的大量克隆对评估有代表性数量的不同启动子组合来说提出了实际难题。为解决这一问题，使用了低质量质粒以取代需要耗时和耗力进行纯化步骤的高质量质粒。尽管低质量质粒表现出高质量质粒约10%的转染效率，但是t现低质量和高质量质粒的启动子活性是相似的，这表示从低质量质粒得到的结果可代表从高质量质粒得到的结果。因此，所有转染实验都使用了低质量质粒。使用Qiagen的miniprep试剂盒，根据制造商的说明制备所有用于最初筛选合成启动子转染实验的质粒。应用Midiprep试剂盒(Qiagen,Mississauga,ON,Canada)分离质粒以{更与来自miniprep试剂盒的〈^^"量质粒比较转染效率。如下文所述培养H4IIE细胞。转染前一天，将细胞以5000个细胞/孔的量接种到96孔板中。根据制造商的说明使用lipofectamineplus试剂(Invitrogen，Burlington,ON,Canada),用150ng/孔的质粒转染细胞，并在转染后24小时收集。使用Glo裂解緩冲液(Promega,Madison,WI,USA)裂解细胞，并使用Steady-Glo萤光素酶测定系统(Promega，Madison,WI，USA)检测萤光素酶活性。在至少两轮不同的转染中，进行四次重复测定。按照合成启动子筛选的第一步骤使用大鼠肝细胞瘤细胞系检测3拷贝SP-Luc质粒的转录活性。结果在图3A中显示。应用CMV启动子作为对照，该启动子驱动乾基因的强普i44达。另外，应用LPK启动子(天然的肝脏特异性葡萄糖应答启动子)作为天然启动子对照。大部分3拷贝SP-Luc质粒具有的活性在CMV启动子活性的2-5%之间，并且与LPK启动子活性相仿。仅由单元件多聚化组成的启动子具有低于LPK启动子的活性(图3A)，其与之前的净艮道一致(Li,X.，Eastman,E.M.,Schwartz,R.J.,&Draghia-Akli,R.(1999).Syntheticmusclepromoters:activitiesexceedingnaturallyoccurringregulatorysequence.NatBiotechnol"17:241-245)。另一个3拷贝组件以与之前构建的3拷贝组件相同的或相反的方向被掺入到3拷贝SP-Luc中，以检测6拷贝SP-Luc的转录活性和元件方向的影响(图2B)。检测来自XE和XN的多于300个克隆的转录活性。没有发现在图5A和B中所示的两组中转录活性的分布存在显著差异。这些结果表明元件组合中的方向对于合成启动子的转录活性是不太重要的。在两组中，大多数转录活性低于CMV启动子活性的6%。但是，一些来自两组的合成启动子显示出高于LPK启动子两倍的活性及超过CMV启动子活性8%。为确定是否有何种才莫式与强转录活性有关，对所选择的显示出高于来自6拷贝SP(XE)-Luc组的CMV启动子活性8%的6拷贝SP-Luc质粒进行测序。结果在图4A中显示并表明在各个合成启动子之间的元件顺序没有相似之处，并且在顺式元件的组成上没有发现共同的模式。也研究了通过加入3拷贝组件造成的合成启动子转录活性的增强。加入的组件被插入所选择的6拷贝SPXE-Luc质粒的XhoI/Nhel位点。选择了总共17个来自6拷贝SPXE-Luc质粒的具有大于CMV启动子活性8。/。的合成启动子以进一步延长顺式元件，产生如图4B所示的9拷贝SP-Luc质粒。从各个6拷贝SPXE-Luc质粒产生多于40个克隆的9拷贝SP-Luc质粒以覆盖所有添加3拷贝组件可能出现的组合。9拷贝SP-Luc质粒的转录活性的分布在图5C中显示。9拷贝SP-Luc质粒的总体活性相对于原始6拷贝SPXE-Luc质粒要高。它们大部分的活性低于CMV启动子活性12%(图5C)。但是，很明显有相当数量的克隆显示其活性高于CMV启动子活性12%,其大于6拷贝SPXE-Luc质粒，这表明顺式元件数量的增加对转录活性有正作用。另外，一些克隆显示出其活性高于CMV启动子活性25%，其相当于LPK启动子活性的7倍。检测这些合成启动子中顺式元件的组成并在图4B中显示。观察到在所述合成启动子中的顺式元件顺序中没有相似性。为调查合成启动子的体内活性，产生重组腺病毒，其表达在所选择9拷贝合成启动子控制下的胰岛素基因。我们选择了SP23137、SP23142和7325，其显示高于CMV启动子活性30。/。。作为普遍的强病毒启动子控制，在这些实验中应用CMV的调控区。因为耙器官是肝脏，使用弗林蛋白酶可切割的胰岛素原，其在合成后可被加工成成熟胰岛素。简言之，根据制造商的说明使用Transpose-ADTM腺病毒载体系统(Qbiogene，Carlsbad,CA)构建重组腺病毒。弗林蛋白酶可切割的大鼠胰岛素cDNA(rINSfur)从VR3503质粒中获得，该质粒含有在B链和C肽接头具有弗林蛋白酶切割位点的大鼠胰岛素基因(Abai,A.M.,Hobart，P.M.,&Barnhart,K.M.(1999).InsulindeliverywithplasmidDNA.(^we77^f:,10:2637-2649)。rINSfurDNA片段在Xbal位点,皮消化并且克隆进pCR276腺病毒转移载体，产生pCR276-rlNSfur，其用作进一步构建含有合成启动子的腺病毒载体的骨架。通过将来自pCR276-rlNSfur的rINSfur区插入pCR259腺病毒转移载体产生pCMV-rINSfur,所述pCR259腺病毒转移栽体具有驱动转基因表达的CMV启动子。含有合成启动子、弗林蛋白酶可切割的大鼠胰岛素cDNA、多聚A区域和SV40增强子的经Notl/Sall消化的SP-rINSfur片段,皮克隆进PCR276转移载体的相同位点，产生PCR276-SP-rlNSfur质粒。所得的质粒被转化进High-QTranspose-AD294化学感受态细胞，其中来自重组腺病毒转移载体的转基因转座到Transpose-294质粒，产生pAd-SP-rINSfur质粒。从pCMV-rINSfur以相同方式产生pAd-CMV-rINSfur质粒。>^生转座的白色菌^_取的DNA4皮再次转化进化学感受态HighA-lTM细胞，以分离并扩增来自腺病毒转移载体的pAd-SP-rINSfur质粒。分离的pAd-SP-rINSfur质粒接着被纯化进入HEK293细胞以产生重组腺病毒(pAd-SP-rINSfur)，其表i^L合成启动子控制下的胰岛素基因。rAd-CMV-rINSfur病毒以同样方式产生。重组病毒在HEK293细胞中大量扩增并且通过两次CsCl密度-梯度离心进行纯化，以及用腺病毒稀释緩冲液透析(10mMTris-ClpH8.0，2mMMgCl2，4%蔗糖)。透析的病毒被保持在-80。C保存。通#260nm处测量O.D.来确定病毒效价。在通过^内注射将剂量为140mg/kg体重的pH4.0柠檬酸緩冲液中的链脲菌素(STZ)施用给NOD/SCID小鼠之后，施用病毒。在血液葡萄糖增加到400mg/dL并持续连续3天之后，通i^C静脉静脉内施用重组腺病毒。通过葡萄糖氧化酶方法，使用尾血液和One-TouchProfile便携式血液葡萄糖监控仪(Lifescan，MilpitasCA)测定血液葡萄糖。最先检测^使用CMV启动子的不受控的强启动子驱动的胰岛素基因表达的效果。如上文所述产生在CMV启动子控制下可产生胰岛素蛋白的重组腺病毒(rAd-CMV-rINSfur)。这些病毒以效价为5xl01。(n=5)，1010(n=6)，5xl09(n=4)和109(n=4)的病毒颗粒通itvC静脉静脉内施用进STZ诱导的糖尿病NOD.scid小鼠。如图6所示，用最高效价的rAd-CMV-rINSfur处理过的动物在治疗后两天内死亡。尽管使用较低效价病毒治疗过的小鼠存活比用较高效价病毒处理过的小鼠存活时间更长，但是最终所有小鼠由于低血液葡萄糖水平而死亡。所有的动物在死前患有严重的低血糖，如图6所示，其中血液葡萄糖水平降低到低于20mg/dl。也检测了9拷贝合成启动子的体内活性，其选自使用大鼠肝细胞瘤细胞系体外测定的启动子。通过施用5xl01Q(n=5)、10"(n=6)和5xl09(n=6)不同剂量病毒颗粒的rAd-23142-rlNSfur来检测所述合成启动子的剂量影响。使用最高剂量治疗的动物显示出在几天内血液葡萄糖水平很快降低到正常水平，而使用101()病毒颗粒治疗的动物显示出血液葡萄糖浓度相对慢的降低(图7)。在血液葡萄糖水平到达正常范围之后，在使用1010病毒颗粒治疗的小鼠中正常血糖维持最长达l个月，而在使用5xl0"病毒颗粒治疗的小鼠中维持的时间更长。相比于使用较高剂量病毒治疗的小鼠，使用rAd-23142-rlNSfur的5xl09病毒颗粒治疗的动物显示出血液葡萄糖水平的中等降低，其表明源于此效价病毒的胰岛素的量不足以将高血液葡萄糖水平降低到正常范围。如图7所示，经rAD-23142-rlNSfur治疗的动物不显示任何有害的低血糖事件，其与经rAD-CMV-rINSfur治疗的动物相反。尽管在使用5xl(^病毒颗粒治疗的小鼠中在早期观察到相对低的血液葡萄糖水平，但是它不造成动物死亡。也检测了图4B显示的在所选择合成启动子SP23137和SP23142之间的转录活性差异，其前6拷贝组件具有相同的顺式元件和后3拷贝组件不同的元件。生成用于胰岛素基因表达的含有SP23137的重组腺病毒并通过尾静脉以10病毒颗粒的效^h^脉内施用给STZ谦导的糖尿病NOD.scid小鼠。如图8所示，所述治疗的动物在一周内显示出正常的血液葡萄糖水平，并且正常血糖维持长达1个月，其与经rAd-23142-rlNSfur治疗的动物类似。在经rAd-23142-rlNSfur和rAd-23137-rlNSfur治疗的动物之间没有显著差异。所有经rAd-23142-rlNSfur或rAd-23137-rlNSfur治疗的糖尿病NOD.scid小鼠在病毒治疗后一个月显示出高血糖的复发。此结果可通过只缺乏EIA基因的第一代腺病毒发生短暂基因表达来解释。因此，在病毒施用后10、25和50天时检测腺病毒基因组的存在。从经rAd-23137-rlNSfur治疗的NOD.scid小鼠中获得肝脏，分离基因组DNA，以及4吏用针对大鼠胰岛素基因的特异性引物在腺病毒基因组中进行PCR扩增。简言之，在病毒施用后IO、25和50天时，使用DNeasyTissueKit(Qiagen，Mississauga，ON,Canada)才艮据制造商的说明从rAd-23137-rlNSfur治疗的糖尿病NOD.scid小鼠中纯化DNA。应用来自rAd-CMV-rINSfur治疗的动物肝脏和pAd-23137-rlNSfur(含有大鼠胰岛素基因的腺病毒转移载体)的DNA作为对照。使用100ng的每种DNAj吏用的上游和下游引物如下正义，GTGGATGCGCTTCCTG(SEQIDNO:17);反义，ACAATGCCACGCTTCTG(SEQIDNO:18)。在扩增之后，产物在1。/。琼脂糖凝胶中电泳，并且通过溴化乙锭染色来检测。在10和25天观察到清晰的条带，而在50天的肝脏中显示出4艮;敞弱的条带，在这时动物表现出高血糖状况的复发。这些结果表明，在治疗晚期恢复的高血糖状态是由于肝脏细胞中表达胰岛素基因的腺病毒基因组数量的减少所致。对所述合成启动子的葡萄糖应答也进行了评估。如图6中所示，胰岛素基因不受控的组成型表iiit成在治疗实验动物中的致死效应，W明在胰岛素基因治疗中转录调控元件的葡萄糖应答的重要性。尽管使用rAd-23137-rlNSfur治疗的动物在将血液葡萄糖水平控制在正常范围内的方面看起来是有效的，但是鉴定合成启动子的葡萄糖应答是有益的。为确定它响应葡萄糖变化的能力，在正常对照动物、糖尿病对照动物以及rAd-23137-rlNSfur治疗的动物中进行葡萄糖耐受实验。在动物禁食16小时后，以2g/kg体重的剂量皿内注射200mM的葡萄糖溶液给禁食动物。在注射葡萄糖之前、在葡萄糖载入后第一个小时中以15分钟间隔的时间、以及卯分钟、120分钟、和240分钟时，从小鼠尾末端的小切口收集血液样本。葡萄糖激发之前的血液葡萄糖水平是99±21mg/dl(正常对照小鼠)、80±21mg/dl(rAd-23137-rlNSfur治疗的小鼠)、和368±48mg/dl(糖尿病对照小鼠)(图9)。尽管使用rAd-23137-rlNSfur治疗的动物显示出比正常对照小鼠较低的血液葡萄糖水平，但是它们是健康的且在禁食期后不显示出低血糖。糖尿病对照小鼠仍然遭受高血液葡萄糖水平。在葡萄糖1之后，血液葡萄糖水平在30分钟内分别上升到285±47mg/dl(rAd-23137画rlNSfur治疗的小鼠)、252±36mg/dl(正常对照小鼠)和620±48mg/dl(糖尿病对照)。在正常对照小鼠中升高的血液葡萄糖水平在60分钟内快速降低到正常范围，而rAd-23137-rlNSfur治疗的动物相比于正常对照表现出相对延緩的血液葡萄糖降低速率。尽管受治疗的动物相比于正常对照表现出相对较低的血液葡萄糖水平，但是在正常对照或rAd-23137-rlNSfur治疗的动物中没有观察到低血糖。通过所述合成启动子的肝脏特异性基因表达也在体外和体内得到确定。在这一点上，通过感染rAd-23137-rlNSfur病毒iiyV—些来源于不同物种和组织的细胞系，确定所述合成启动子的体外组织特异性。用rAd-CMV-rINSfur病毒作为对照。各个细胞系的来源如下3T3-L1细胞系来自小鼠胚胎成纤维细胞，HeLa细胞系来自人子宫颈，L6细胞系来自大鼠骨骼肌，L-929细胞系来自小鼠皮下结締组织，NRK细胞系来自大鼠肾，和H4IIE细胞系来自大鼠肝脏。使用下述步骤进行细胞系的免疫染色。简言之，所有用于4^研究的细胞在37X:下，在5%<:02/95%潮湿空气的气氛中，培养在Dulbecco，smodifiedEagel，s培养基(DMEM)中，该培养基加入了10%胎牛血清(Invitrogen)、青霉素(200IU/ml)、链霉素(100ug/ml)和L-谷氨酰胺(2mM)。所使用的细胞如下L6(Dutheil,N.,Shi,F.，Dup謂oir,T.&Linden,R.M.(2000).Adeno-associatedvirussite-specificallyintegratesintoamuscle-specificDNAregion.iVoc.TV^/.Joirrf.Sc/.U.S.A.，97:4862-4866),L929(小鼠皮下结締组织细胞系)，3T3LI(小鼠成纤维细胞细胞系)，H4IIE(大鼠肝细胞瘤细胞系)，HeLa(人上皮细胞系)，和NRK细胞(大鼠肾细胞系)。细胞以2x104/孔的量接种于特别设计的玻片(Labtek，NalgeNucc，Naperville，IL，USA),并孵育一天，接着是病毒再感染一天。感染之后，使用磷酸緩冲盐溶液(PBS)中的4。/o多聚甲醛(PFA)室温固定细胞15分钟，接着用PBS中的1。/。tritonX-100进行通透处理。使用封闭緩沖液(PBS中的l%(w/v)BSA和0.2%(v/v)Tween-20)封闭非特异性抗体结合1个小时。第一抗体(豚鼠抗大鼠胰岛素(DAKO，Carpiteria，CA，USA))在封闭緩冲液中稀释(1/200)，并且施加给细胞持续1小时。然后细胞在PBS中洗3遍。第二抗体(生物素化的抗豚鼠抗体)在封闭緩冲液中稀释(1/300)然后施加给细胞1小时。洗三遍之后，HRP缀合的链霉亲和素在封闭緩沖液中稀释(1/300)并施加给细胞1个小时，接着使用VectorVIP(VectorLaboratorey)才艮据制造商的i兌明进行显影。在使用rAd-CMV-rINSfur病毒感染的所有细胞系中观察到胰岛素表达。结果在图10中显示并表明了CMV启动子的普遍转录活性，而SP23137只在H4IIE细胞中诱导胰岛素基因表达(图10A)。在NOD.scid小鼠模型中也检测到通过合成启动子的组织特异性靶基因表达。为评估体内活性，rAd-23137-rlNSfur病毒被施用给STZ谦导的糖尿病NOD.scid小鼠。rAd-CMV-rINSfur病毒被作为普遍性对照。当到达正常血糖时，处死受治疗的动物。收集一些器官，例如肾脏、脾脏、肝脏、肺、和心脏，以提取总RNA。简言之，动物的一些器官(肝脏、脾脏、肺、心脏、和肾脏)被置于10体积的RNAlaterRNA稳、定试剂(Qiagen，Mississauga，ON,Canada)中，储存于-80"C。根据制造商的说明使用RNeasyMiniKit(Qiagen,Mississauga,ON,Canada)分离总RNA，并储存于-80X:。4吏用5ug的总RNA合成cDNA，其应用SuperscriptII逆转录酶(Invitrogen，Burlington,ON，Canada)和寡聚(dT)12-18(Invitrogen,Burlington,ON，Canada)。使用大鼠胰岛素的特异性引物进行PCR。小鼠次黄噤呤磷酸核糖转移酶(HPRT)被用作内标。所用的上游和下游引物如下大鼠胰岛素，正义，GTGGATGCGCTTCCTG(SEQIDNO:19);大鼠胰岛素，反义，ACAATGCCACGCTTCTG(SEQIDNO:20);小鼠HPRT,正义GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC(SEQIDNO:21);小鼠HPRT,反义CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA(SEQIDNO:22)。针对每纟且fj物优>(匕PCR条件。PCR混合物(Chalkley,GE.&Verrijzer,CP.(1999).DNAbindingsiteselectionbyRNApolymeraseIITAFs:aTAF(II)250-TAF(II)150complexrecognizestheinitiator.五MSO/"18:4835-4845)^^有各0.2mM的每种脱氧核糖核苷三磷酸，各1uM的每种特异性引物，1.5mM或2mM的MgCl2，50mMKCl，10mMTris画Cl，pH9.0和2.5U的Taq聚合酶(NEB)。在扩增之后，产物在1%琼脂糖凝胶中电泳并通过溴化乙锭染色来检测。RT-PCR结果在图11中显示。由于它的普遍性转录活性，在来自rAd-CMV-rINSfur治疗的NOD.scid小鼠的所有器官中观察到大鼠胰岛素基因表达，其与我们的体外实验结果相一致。但是只在来自rAd-23137-rlNSfur治疗的NOD.scid动物的肝脏中检测到胰岛素mRNA，其表明合成启动子SP23137具有肝脏特异性转录活性。也通过组织学分析评价了体内组织特异性表达。当血液葡萄糖水平降到低于150mg/dL时，从病毒治疗的NOD.scid小鼠中移除肝脏、肾脏、脾脏和胰脏。在组织移除之前2个小时加载葡萄糖(2g/kg体重)以加强胰岛素表达。使用10%緩冲福尔马林固定样品，在石蜡中包埋，进行4.5jtm切片，并放置在玻璃载玻片上。使用二甲苯，和100%、卯％、80%、和70。/。乙醇依次处理样品，并使用自来水冲洗。使用封闭緩冲液(PBS中的l%(w/v)BSA和0.2%(v/v)Tween-20)封闭非特异性抗体结合1个小时。第一抗体(豚鼠抗大鼠胰岛素(DAKO,Carpiteria，CA，USA))在封闭緩冲液中稀释(1/200)，并且施加给细胞1个小时。然后细胞在PBS中洗3遍。第二抗体(生物素化的抗豚鼠抗体)在封闭緩冲液中稀释(1/300)然后施加给细胞l个小时。洗三遍之后，HRP缀合的链霉亲和素在封闭緩冲液中稀释(1/300)并施加给细胞1个小时，接着根据制造商的说明使用VectorVIP(VectorLaboratorey，Burlingame，CA,USA)进行显影。在使用自来水冲洗后，使用Meyer苏木精溶液对样品进行反染色。获得的结果证实所述合成启动子的转录活性被限制于肝脏并且未在其它器官中观察到。也评估了rAd-23137-rlNSfur在糖尿病动物模型中的疗效。为检测SP23137在NOD小鼠中的转录活性，将3x101Q病毒颗粒的效价的rAd-23137-rlNSfur病毒施用给糖尿病NOD小鼠。动物在病毒施用之前遭受554±45mg/dl的高血液葡萄糖水平。如图12中所见，血液葡萄糖水平在2-3天内快速降低到正常范围。这些结果证明rAd-23137-rlNSfur在具有免疫力的自身免疫I型糖尿病动物模型和免疫缺陷的化学诱导糖尿病动物模型中具有疗效。但是在rAd-23137-治疗的NOD小鼠中正常血糖保持10天，然后又复发高血糖。在NOD.scid小鼠中血液葡萄糖水平正常后的一个月中观察到高血糖的复发。宿主对于腺病毒载体的免疫应答越强烈可能导致NOD小鼠中高血糖的复发越早。上述研究的结果揭示了，大多数具有3元件拷贝的合成启动子具有相当于天然LPK启动子的转录活性，其中多拷贝的单个元件具有相对低的活性，其与之前的报道一致(Li,X.,Eastman,E.M.,Schwartz,R.J.,&Draghia-Akli,R.(1999).Syntheticmusclepromoters:activitiesexceedingnatuallyoccurrngregulatorysequences.7Vat5/^c/mo/"17:241-245)。但是，最近也已显示在构建体中包含另外的转录因子结合元件可增强基因表达(Walters,M.C.，Fiering,S.,Eidemiler，J.,Magis，W"Groudine,M.，&Martin,D.J.(1995).Enhancersincreasetheprobabilitybutnotthelevelofgeneexpression./Vrc.A^"cflflf.5W.U.S.A.,92:7125-7129;Sutherland,H.G,Martin,D.&Whitdaw，E.(1997).Aglobinenhanceractsbyincreasingtheproportionoferythrocytesexpressingalinkedtransgene-Mo/.CW/所o/.，17:1607-1614)。因此，通狄构建体中导入另外的3拷贝组件发现3拷贝合成启动子转录活性的增强。为研究方向的影响，以与在先存在组件的相同或相反的方向插入3拷贝组件。这些构建体转录活性的分布表明它们中的大多数显示出与3拷贝合成启动子相同或较小的转录活性(图5A和5B)。但是，一些较高拷贝数的启动子显示出高的多的活性(图3B)。在具有相同或相反方向的3拷贝组件的构建体之间转录活性的分布没有显著的差异。这些整体的观察表明顺式元件的某些组合对于启动子活性可具有协同效应。但是，在显示出高于CMV启动子活性8。/。的合成启动子中，使用6拷贝或9拷贝组件没有观察到共有模式的存在。在9拷贝合成启动子中转录活性的分布显示，它们中的大多数具有相同或较小的活性，其中有一些相比于它们的母构建体具有较高的活性。在具有高活性的9拷贝合成启动子的各个元件排列顺序上没有发现相似之处。尽管合成启动子的转录活性相比于天然LPK启动子是增强的，还评估了有关它们调控胰岛素基因治疗能力的葡萄糖应答。如图6所示，在rAd-CMV-rINSfur治疗的动物中，通过CMV启动子的胰岛素不受控表达导致了由于低血糖的死亡。相反，在STZ诱导的糖尿病模型中通过合成启动子的胰岛素表达是响应葡萄糖变化而适当受控的。值得注意的是，在使用5xl01()病毒颗粒治疗的动物中没有发现严重的低血糖。不进一步增加所述载体剂量以避免第一代腺病毒的病毒毒性。另外，在rAd-SP-rINSfur治疗的动物中禁食血液葡萄糖水平是与正常健康动物中相当的，表明胰島素表达响应血液葡萄糖水平而被调控。这些结果表明本发明合成启动子具有响应葡萄糖水平的变化来调控胰岛素产生以及在糖尿病动物中维持正常血糖的能力。另外，来自rAd-23137-rlNSfur治疗的动物中葡萄糖耐受测试的结果支持了合成启动子响应葡萄糖变化表达胰岛素的能力。在葡萄糖激发后15和30分钟处的峰值之后，血液葡萄糖水平降低到与对照类似的正常范围。但是，对照动物在60分钟内显示正常葡萄糖，而rAd-23137-rlNSfur治疗的动物在葡萄糖加载后120分钟时显示相同的水平。另外，在治疗的动物中葡萄糖激发后180到240分钟之间观察到相对于正常对照动物较低的血液葡萄糖水平，在270分钟时回复到与正常对照动物相似的范围。这些结果表明，本发明的合成启动子仍然可被进一步优化，尤其是_针对负反馈。但是，所述合成启动子比之前报道的启动子有效的多，在用之前报道的启动子治疗的动物中非禁食葡萄糖水平有略」敞的高。所述合成启动子的负调控可通过导入胰岛素应答元件来实现，其已经显示出在胰岛素存在下抑制启动子活性(O'brien,R.M.，Streeper，R.S.，Ayala，丄E.,Stadelmaier,B.T"&Hornbuckle，LA.(2001).Insulin-regulatedgeneexpression.所0c/^柳.5W".7)Yms.,29:552-558)。另外，也有可能通过在序列中加入导致快速降解的特定元件控制转基因胰岛素mRNA的半衰期(Wilusz，C.J.&Wilusz,J.(2004).BringingtheroleofmRNAdecayinthecontrolofgeneexpressionintofocus.7>dfcG^""20:491-497)，因为胰岛素i秀导低血糖的潜在风险主要取决于胰岛素mRNA的相对稳定性(Dong,H.&Woo,S.L.(2001).Hepaticinsulinproductionfortype1diabetes.rmwfc￡"rtflfocn'"d"fl6.，12:441-446)。在本申请中，有多个出版物在括号中被引用。由此，这些出版物公开的内容以整体通过引用并入本申请，以更全面的描述与本发明相关的技术状态。尽管通过所公开的实施方案描述了本发明，本领域技术人员应当容易理解，具体的实施例和上文详述的研究只是对本发明的举例说明。应当理解在不脱离本发明精神的情况下，可对本发明作出各种修改。因此，本发明只受所附权利要求的限制。权利要求1.一种分离的组织特异性葡萄糖应答启动子，其包含在至少一个三联转录因子结合顺式元件3’侧的聚合酶结合结构域，所述三联转录因子结合顺式元件具有肝细胞核因子-1(HNF-1)元件、CAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)应答元件和葡萄糖应答元件(GRE)。2.权利要求l的启动子，其中所述聚合酶结合结构域包含肝脏丙酮酸激酶(LPK)启动子。3.权利要求1的启动子，其中所述HNF-1元件包含约25-30个核苦酸。4.权利要求3的启动子，其中所述HNF-l元件包含SEQIDNO:l。5.权利要求1的启动子，其中所述C/EBP应答元件包含约20-25个核苷酸。6.权利要求5的启动子，其中所述C/EBP应答元件包含SEQIDNO:2。7.权利要求1的启动子，其中所述GRE包含约45-50个核苷酸。8.权利要求7的启动子，其中所述GRE包含SEQIDNO:3。9.权利要求l的启动子，其中三联转录因子结合顺式元件内的所述HNF-1元件、所述C/EBP应答元件和所述GRE是基本上相邻的。10.权利要求1的启动子，其中三联转录因子结合顺式元件内的所述HNF-1元件、所述C/EBP应答元件和所述GRE是邻接的。11.权利要求1的启动子，其包含选自图3A中所示元件的三联转录因子结合顺式元件。12.权利要求l的启动子，其还包含第二个三联转录因子结合顺式元件。13.权利要求12的启动子，其包含选自图3B或图4A中所示元件的三联转录因子结合顺式元件。14.权利要求l的启动子，其还包含第三个三联转录因子结合顺式元件。15.权利要求14的启动子，其包含选自图4B中所示元件的三联转录因子结合顺式元件。16.权利要求1的启动子，其还包含可操纵连接的胰岛素编码核酸或亚基编码序列。17.—种包含权利要求1、12或14的组织特异性葡萄糖应答启动子的宿主细胞。18.—种治疗或预防糖尿病的方法，其包括给个体施用有效量的含有包含了组织特异性葡萄糖应答启动子的载体的病毒颗粒，所述启动子包含在至少一个三联转录因子结合顺式元件3，侧的聚合酶结合结构域，所述三联转录因子结合顺式元件具有肝细胞核因子-1(HNF-1)元件、CAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)应答元件和葡萄糖应答元件(GRE)，所述元件可操纵的连接胰岛素编码核酸，其中所述胰岛素编码核酸的表达是组织特异性的及葡萄糖应答的。19.权利要求18的组织特异性葡萄糖应答启动子，其中所述聚合酶结合结构域包含肝脏丙酮酸激酶(LPK)启动子。20.权利要求18的组织特异性葡萄糖应答启动子包含约25-30个核普酸。21.权利要求20的组织特异性葡萄糖应答启动子包含SEQIDNO:l。22.权利要求18的组织特异性葡萄糖应答启动子元件包含约20-25个核苷酸。23.权利要求22的组织特异性葡萄糖应答启动子元件包含SEQIDNO:2。24.权利要求18的组织特异性葡萄糖应答启动子45-50个核苷酸。25.权利要求24的组织特异性葡萄糖应答启动子，其中所述GRE包含SEQIDNO:3。26.权利要求18的组织特异性葡萄糖应答启动子，其中所述三联转录因子结合顺式元件内的所述HNF-1元件、所述C/EBP应答元件和所述GRE，其中所述HNF-1元件，其中所述HNF-1元件，其中所述C/EBP应答，其中所述C/EBP应答,其中所述GRE包含约是基本上相邻的。27.权利要求18的组织特异性葡萄糖应答启动子，其中所述三联转录因子结合顺式元件内的所述HNF-1元件、所述C/EBP应答元件和所述GRE是邻接的。28.权利要求18的组织特异性葡萄糖应答启动子，其包含选自图3A中所示元件的三联转录因子结合顺式元件。29.权利要求18的组织特异性葡萄糖应答启动子，其还包含第二个三联转录因子结合顺式元件。30.权利要求29的组织特异性葡萄糖应答启动子，其包含选自图3B或图4A中所示元件的三联转录因子结合顺式元件。31.权利要求18的组织特异性葡萄糖应答启动子，其还包含第三个三联转录因子结合顺式元件。32.权利要求31的组织特异性葡萄糖应答启动子，其包含选自图4B中所示元件的三联转录因子结合顺式元件。33.权利要求18的方法，其中所述载体包括腺病毒载体。34.权利要求18的方法，其中所述病毒颗粒在药用可接受载体中被施用。全文摘要本发明提供分离的组织特异性葡萄糖应答启动子，其具有在至少一个三联转录因子结合顺式元件3’侧的聚合酶结合结构域，所述转录因子结合顺式元件具有肝细胞核因子-1(HNF-1)元件、CAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)应答元件和葡萄糖应答元件(GRE)。所述启动子可包含第二个或第三个三联转录因子结合顺式元件。本发明也提供包含了本发明组织特异性葡萄糖应答启动子的宿主细胞。还提供了治疗或预防糖尿病的方法。所述方法包括将有效量的具有包含了组织特异性葡萄糖应答启动子的载体的病毒颗粒施用给个体，所述启动子包含在至少一个三联转录因子结合顺式元件3’侧的聚合酶结合结构域，所述转录因子结合顺式元件具有肝细胞核因子-1(HNF-1)元件、CAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)应答元件和葡萄糖应答元件(GRE)，所述元件可操纵的连接到胰岛素的编码核酸上，其中胰岛素编码核酸的表达是组织特异性的及葡萄糖应答的。文档编号A61K31/70GK101212977SQ200680023956公开日2008年7月2日申请日期2006年5月30日优先权日2005年6月1日发明者尹址垣申请人:国际创新生物技术研究所有限公司