超价化合物的制作方法

专利名称：超价化合物的制作方法
专利说明超价化合物 本发明涉及肽化合物。
随着蛋白研究的发展，已经发现了许多具有不同生物和药学活性的肽。有些这样的肽通过结合靶分子例如受体分子(例如细胞因子受体)，发挥它们的作用。
已经证实造血生长因子(HGF)是临床上成功的治疗剂；但是，它们的大小(15-70kDa)、构象不稳定性、对蛋白水解性降解的敏感性、较差的膜穿透性、抗原性、高生产成本、和不利的药代动力学，使得它们难以成为理想的药物候选品。此外，天然蛋白的低生物利用度要求肠胃外施用它们。因此，有利的是开发HGF受体的小分子激动剂(和拮抗剂)，它们与它们的多肽对应物等效，但是缺少大蛋白的一些固有缺点。鉴别和检查能结合和激活细胞因子受体的小肽，也会更好地理解配体-受体相互作用。该信息可以用于合理地设计可口服利用的小分子细胞因子模仿物。当配体结合受体上的特异性结构域时，生长因子和细胞因子会激活跨膜受体，从而诱导构象变化和触发受体链的二聚化或寡聚化。配体结合后，I类细胞因子受体中的几个成员会形成同型二聚体，包括红细胞生成素受体(EPOR)，血小板生成素受体(TPOR)，粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)，生长激素受体(GHR)，和促乳素受体(PrR)。已经报道了几项研究，其旨在发现二聚化界面的精确细节和未结合配体的受体作为二聚体存在的程度。这些研究的结果已经证实了I类细胞因子受体之间的结构和功能相似性。研究还证实，单独的受体二聚化尽管是细胞内信号传递所必需的，但是不足以产生信号转导。最近的报道已经证实，小分子和肽二者都可以通过作为激动剂起作用和模仿天然蛋白的作用，结合和激活同型二聚的细胞因子受体(见Laber，E.G.(2004).Small-Molecule and Peptide AgonistsA Literature Review.Hematopoietic Growth Factors inOncology-Basic Science and Clinical Therapeutics.G.Morstyn，M.Foote和G.J.Lieschke65-80)。但是，它们的生物活性经常劣于天然分子。因此，尝试改善模仿分子的生物活性。
这样的肽的成功的实例包括，结合红细胞生成素受体且模仿红细胞生成素的功能的肽，和结合血小板生成素受体且模仿血小板生成素的功能的肽。
激素红细胞生成素(EPO)是一种糖蛋白，它由165个氨基酸构成，且具有4个糖基化位点。它会刺激有丝分裂和红细胞前体细胞的分化，从而确保红细胞的生成。由于EPO或重组EPO的应用具有包括免疫原性反应在内的几个缺点，使用与EPO不具有任何序列同源性或结构关系、但是仍会结合EPO-R并与其相互作用的合成肽(见例如Wrighton等，1996)。模仿EPO活性的合成肽(“EPO模仿肽”)此时是本领域众所周知的(见例如WO 96/40772；WO 96/40749；WO 01/38342；WO 01/091780；WO 2004/101611；WO 2004/100997；WO 2004/101600；WO 2004/101606)。
通过结合受体的胞外域并可能使2个受体单体二聚化成受体复合物，从而启动信号转导，EPO和EPO模仿肽会激活EPO受体(Johnson等，1997)。结合到EMP1(一种众所周知的EPO模仿肽)上的EPO受体的晶体结构，揭示了由结合到2个受体单体上的2个肽组成的受体-肽复合物的形成。因此，并不非常令人意外的是，这些结合域中恰好两个组合在单一一个分子中，大大地提高活性，带来的结果是具有单一一个结合域的肽显示出相同的定性活性模式，而连接在一起的两个结合域显示出低得多的ED50(有效剂量50％，活性的度量)。
各肽二聚体(例如EPO或TPO模仿肽的二聚体)的制备方法，也是本领域众所周知的，例如通过PEG化、二硫桥或赖氨酸侧链的二聚化(见例如WO 96/40772；WO 96/40749；WO 01/38342；WO 01/091780；WO 2004/101611；WO 2004/100997；WO 2004/101600；WO 2004/101606，Wrighton等，1997；Johnson等，1997；WO 98/25965)。所有这些方法，都通过连接体结构联合单体肽，以便得到希望的二聚体或甚至多聚体分子，后者会增强有活性的二聚体或甚至多聚体受体复合物的形成。
也知道关于其它结合分子的联合单体单元的类似概念(见例如WO 2004/014951)。为了产生能与各二聚体或多聚体受体复合物相互作用的分子，该申请教导了使用小支持结构，以便以允许与各受体复合物的相互作用(和例如诱导受体的二聚化或三聚化)的空间关系连接单体受体结合域。
但是，尽管与各单体肽相比单体肽单元的二聚化(或甚至在多聚体受体的情况下多聚化)通常会提高活性，仍然期望进一步提高活性。例如，关于细胞机理的活化，甚至二聚体EPO模仿肽也仍远不如EPO分子有效。
现有技术还已知将一个或多个亲水载体单元(例如PEG)偶联到肽上。已经发现，当用亲水聚合物衍生肽时，它们的溶解度和循环半衰期会提高，它们的免疫原性会降低(见例如WO 98/25965)。但是，也已经报道，这样的亲水载体的附着，可能会降低生物活性。没有报道生物活性的升高。
提出了几种方案来增加肽的活性，例如通过氨基酸序列的变化，以便鉴别更有效的候选物。但是，迄今为止现有技术还不知道提高肽的活性、尤其是EPO或TPO模仿肽的活性的适当方案。
因而，本发明的目的是，提供能结合受体靶物并具有提高的活性的肽化合物。
下述化合物解决了该问题，所述化合物会结合靶分子，并且包含 i)至少两个肽单元，其中每个肽单元包含至少两个能结合靶物的结构域(且因而包含至少2个单体结合单元)； ii)至少一个聚合物载体单元； 其中所述肽单元结合到所述的聚合物载体单元上。
令人意外地，已经发现两个或更多二价肽或多价肽在聚合物支持体上的组合，正在大大地增加二价(或甚至多价)肽结合各自靶物(其通常是受体分子)的效力，这不仅仅是加和的，而且甚至是超过加和的。因此，观测到对结合效力的协同效应。
将用于本发明目的的术语“二价”定义为包含两个具有结合靶物能力的结构域的肽，其中所述的靶物通常是受体(因而在下文中使用该术语)。术语“二价”与术语“二聚体”可互换使用。因此，“多价”或“多聚”肽具有几个各自的结合域(且因此单体结合单元)。不言而喻，术语“肽”和“肽单元”不包含与大小有关的任何限制，并包含寡肽和多肽以及蛋白。但是，优选地，偶联到载体单元上的肽单元的长度是约200个氨基酸或更少、或约150个氨基酸或更少、更优选约100个氨基酸或甚至50个氨基酸或更少。
包含两个或更多个连接于聚合物载体单元的二价或多价肽单元的化合物，在本发明的上下文中被称为“超价(supravalent)”。这些超价分子非常不同于现有技术中已知的二聚体或多聚体分子。现有技术仅仅组合几个单体肽单元，以便产生二聚体或多聚体。相比之下，通过将已经(至少)二价的肽单元连接至聚合物载体单元从而产生携带几个二聚体或多聚体肽单元的超价分子，来生成超价分子(

图13至图15给出了该概念的解释性实例)。因此，大大地提高了二聚体或多聚体肽的总活性和效力，并因此减少EC50剂量。
迄今为止，还没有完全了解与现有技术中已知的二聚体或多聚体分子相比，超价分子具有大效力的原因。可能是由于下述事实现有技术中已知的二聚体分子(例如二聚体EPO模仿肽)每个化合物分子分别仅仅为一个靶物提供一个活性受体结合单元。因此，在二聚化合物结合时，仅仅生成一个(二聚体)受体复合物，从而在细胞中仅仅诱导一个信号转导过程。例如，通过PEG连接两个单体EPO模仿肽来形成肽二聚体，从而促进信号转导所需的受体单体的二聚化(Johnson等，1997)。
与此相比，根据本发明的超价化合物包含几个已是二聚或多聚的受体结合单元。根据本发明的超价化合物因而携带几个(二价或多价)受体结合单元。与载体偶联的每个二聚体或多聚体肽单元代表着一个受体结合单元。这可使得每个化合物分子在细胞表面上生成几个受体复合物，从而诱导(或在拮抗剂的情况下，阻断)几个信号转导，并因此超加和性地加强肽单元的活性。超价化合物的结合，可能导致受体复合物在细胞表面上成簇。
根据本发明的肽单元可以是同质或异质的，这意味着将相同的或不同的肽单元偶联到聚合物载体上。这同样适用于也可以是同质或异质的肽单元的结合域。在结合由相同蛋白亚基组成的靶受体(例如同型二聚体EPO受体)的情况下，同质结合域(单体)是优选的。但是，同质结合域的氨基酸序列仍然可以变化，尽管它们结合相同的受体靶物(且因而是功能上同质的)。在结合由不同蛋白亚基组成的靶受体(例如异型二聚体白介素受体)的情况下，异质结合域(单体)是优选的。优选地，结合于载体单元的二价或多价肽单元结合相同的受体靶物。然而，它们当然仍然可以在氨基酸序列上有差异。二价或多价肽单元的单体结合单元可以是线状的或环状的。可以通过例如形成分子内半胱氨酸桥，产生环状分子。
聚合物载体单元包含至少一个天然的或合成的分支的、线状的或树枝状的聚合物。聚合物载体单元优选可溶于水和体液，并优选是药学上可接受的聚合物。水溶性聚合物部分包括但不限于，如聚亚烷基二醇及其衍生物，包括PEG、PEG均聚物、mPEG、聚丙二醇均聚物、乙二醇和丙二醇的共聚物，其中所述的均聚物和共聚物是未被取代的，或在一端被例如下列所取代酰基；甘油聚合物或聚唾液酸；碳水化合物，多糖，纤维素和纤维素衍生物，包括甲基纤维素和羧甲基纤维素；淀粉(如羟烷基淀粉(HAS)，特别是羟乙基淀粉(HES))和糊精，及其衍生物；葡聚糖和葡聚糖衍生物，包括硫酸葡聚糖，交联糊精和羧甲基糊精；壳聚糖(一种线性多糖)，肝素及肝素片段；聚乙烯醇和聚乙烯基乙基醚；聚乙烯吡咯烷酮；α，β-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺；和聚氧乙基化多元醇。载体单元的一个实例是例如聚乙二醇的同双功能聚合物(二-马来酰亚胺，二-羧基，二-氨基等)。
由于适合与本发明结合的不同聚合物的不同性质，与根据本发明的肽单元偶联的聚合物载体单元可以具有大范围的分子量。因此没有大小限制。然而，优选分子量为至少3kD，优选至少10kD和约20至500kD，更优选约30至150或约60或80kD。载体单元的大小取决于所选择的聚合物，并因此可发生变化。例如，特别当使用淀粉(例如羟乙基淀粉)时，分子量可显著更高。则平均分子量可位于约100至4,000kD或甚至更高。但是，优选地，HES分子的分子量是约100至300kD，优选约200kD。优选选择载体单元的大小，使得每个肽单元各自最适于结合它们各自的受体分子。
为了有利于这一点，本发明的一个实施方案使用包含分支单元的载体单元。根据该实施方案，将聚合物(例如PEG)连接于分支单元，因此得到允许许多肽单元掺入的大载体分子。合适分支单元的实例是甘油或聚甘油。例如根据Haag(2000，在本文中通过参考引入)的教导，还可使用树枝状分支单元。HES载体也可以以分支形式使用。这例如从支链淀粉得到至高比例。
优选地，在通过连接单体结合单元(头连接头、头连接尾或尾连接尾)到肽单元而产生肽单元后，将聚合物载体单元连接/偶联到肽单元上。通过共价的或非共价的(如配位)键，将聚合物载体单元连接到肽单元。然而，优选使用共价键。
例如可通过肽单元的反应性氨基酸例如赖氨酸，半胱氨酸，组氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸或N末端氨基以及C末端羧酸进行连接。如果肽不携带各自的反应性氨基酸，可以将这样的氨基酸导入氨基酸序列。应当选择偶联，使得与靶物的结合不受阻碍或尽可能少地受到阻碍。根据肽单元的构象，反应性氨基酸是在肽序列的开头、末尾或内部。
如果聚合物载体单元不具有合适的偶联基团，可使用一些偶联物质/连接体，以便适当地修饰聚合物，使它能与肽单元上的至少一个反应性基团起反应，形成超价化合物。例如如下是可用于修饰聚合物的适宜化学基团 与蛋白的氨基起反应的酰化基团，例如酸酐基、N-酰基咪唑基、叠氮化物基、N-羧基酐基、双乙烯酮基、二烷基焦性碳酸酯基、亚氨酸酯基以及碳二亚胺活化的羧基。已知所有上述基团都与蛋白/肽上的氨基起反应，形成共价键，包括酰基键或相似的键； 与肽单元上的巯基(硫氢基)、甲硫基、咪唑并基或氨基起反应的烷基化基团，例如卤-羧基、马来酰亚胺基、活化的乙烯基、乙撑亚胺基、芳卤基、2-羟基5-硝基-苄基溴基团；以及连同还原剂一起与肽的氨基反应的脂族醛基和酮基； 与肽的羧基起反应的酯和酰胺形成基团，例如重氮羧酸酯基，以及碳二亚胺基和胺基一起； 与肽上的巯基起反应的二硫化物形成基团，例如5，5′-联硫基双(2-硝基苯甲酸酯)基，邻吡啶基二硫化物和烷基硫醇基(在氧化剂例如碘的存在下，其与肽的巯基起反应)； 与蛋白的胍部分起反应的二羰基，例如环己二酮基，和其它1，2-二酮基； 与肽上的酚基起反应的重氮基； 与蛋白上的氨基起反应的反应基，其来自溴化氰与多糖的反应。
因此，总的来说，通过(任选地)首先化学修饰聚合物载体来生成其上具有至少一个化学基团(该化学基团能够与肽单元上可利用的或被引入的化学基团起反应)的聚合物载体，然后将(任选地)修饰的聚合物与肽单元一起反应，利用(如果必要)修饰的聚合物的化学基团形成共价结合的复合物，从而制备根据本发明的化合物。
如果通过肽的游离SH基发生偶联，优选使用聚合物中的马来酰亚胺基。
为了生成所限定的分子，优选使用将肽单元附着于聚合物载体单元的靶向方法。在期望的附着位点不存在合适的氨基酸时，应将合适的氨基酸掺入肽单元。对于位点特异的聚合物附着，优选独特的反应基，如在肽单元末端的特异氨基酸，以便避免会产生异质混合物的整个肽上不受控制的偶联反应，其中异质混合物包含多个不同聚合物分子的群体。
使用本领域技术人员原则上已知的反应，将肽单元偶联到聚合物载体单元例如PEG或HES上。例如，已有许多本领域技术人员可利用的PEG和HES附着方法(参见例如给出其它参考文献的WO2004/100997，Roberts等，2002；US 4,064,118；EP 1 398 322；EP 1398 327；EP 1 398 328；WO 2004/024761；它们全部在此通过参考引入)。
重要的是应当理解本文中所述的超价性(supravalency)的概念不同于已知的PEG化或HES化的概念。在现有技术中，例如仅仅使用PEG化来生产肽二聚体，或通过将一个或多个PEG单元结合到肽上来改进药物代谢动力学参数。然而如上所述，将两个或更多个至少二价的肽单元附着到作为聚合物载体单元的例如HES上，还大大提高效力(因此减少EC50的剂量)。因此，本发明的构思不仅如现有技术中已知的PEG化或HES化概念那样，对药物代谢动力学参数有影响，而且对药效学参数具有强烈影响。然而，例如作为聚合物载体单元的PEG或HES的掺入，当然也具有与药物代谢动力学有关的已知的优点。
通常进行PEG化来改善肽的生物药物性质。在PEG缀合后，蛋白分子的最相关的变化是尺寸扩大、蛋白表面和糖基化功能屏蔽、电荷改变以及表位遮蔽。具体地说，通过被动式增强渗透和滞留机理，尺寸扩大使得肾超滤变慢，并促进向渗透性组织中的蓄积。蛋白遮蔽会降低属于重要的清除路径的蛋白水解和免疫系统识别。蛋白和聚合物性质以及通过采用的PEG化策略，严格决定PEG化对蛋白的物理化学及生物学性质的特异性作用。
然而，使用PEG或其它的非生物降解的聚合物，可导致新的问题。
在体内应用期间，药物作用的丧失引发在临床环境中的剂量间隔。常规的剂量和剂量间隔是适合的，使得在剂量间隔期间不会失去作用。由于附着于非生物可降解的大聚合物单元(如PEG部分)的肽的降解比身体可以消除的支持分子更快，因此可产生载体单元蓄积的风险。所述的蓄积风险总是发生，因为药物的效应-半衰期短于药物本身或其组分/代谢物之一的消除半衰期。因此，应避免载体分子的蓄积，特别在长期治疗中，因为肽通常用非常大的PEG部分(～20-40kD)进行PEG化，其因此显示缓慢的肾消除。肽部分本身经历了酶促降解，甚至部分裂解可能足以使肽失活。
为了寻找该问题的解决方法，本发明的一个实施方案教导了使用由至少两个亚单元组成的聚合物载体单元。通过生物可降解的共价连接体结构来连接聚合物亚单元。根据该实施方案，由通过生物可降解的连接体连接的多个小亚单元或中等大小的亚单元(例如每个亚单元具有5至10kD的分子量)，产生大载体分子的分子量(例如40kD)。把模块亚单元的分子量加起来，从而生成载体分子的期望分子量。然而，生物可降解的连接体结构可在体内裂解，从而释放更小的载体亚单元(如5至10kD)。与具有总分子量(如40kD)的聚合物分子相比，小载体亚单元显示出更好的肾脏清除。在图16中提供了一个解释性实例。
根据已知的在体液中的降解性和降解时间尺度，选择连接体结构。可分解的结构包含例如可裂解的基团如羧酸衍生物，如可被水解的酰胺/肽键或酯(参见如Roberts，2002，被本文通过参考引入)。使用PEG主链中各种酯键，还可合成PEG琥珀酰亚胺酯，来调控在生理pH中的降解速率(Zhao，1997，被本文通过参考引入)。在温和还原环境下，例如在细胞的内体隔室中(Zalipsky，1999)，可裂解苯甲基尿烷二硫化物等其它可分解结构，因此也是适宜的。用于选择合适连接体的其它标准，是快(通常是酶促的)降解或慢(通常是非酶促分解)降解的选择。在体液中这两种机理的组合也是可行的。显然这种非常有利的概念并不限于本文中所述的或所涉及的特殊肽单元，而且也可应用于其中出现了相同蓄积问题的其它连接于大聚合物单元(例如PEG分子)的药物分子。
根据一个实施方案，羟烷基淀粉和优选HES可用作聚合物载体单元。HES具有一些重要的优点。首先，HES是生物可降解的。而且，通过羟乙基比例可调控并因此影响HES的生物可降解性。0.4-0.8的摩尔取代度(平均40-80％的葡萄糖单元含有羟乙基)非常适合于本发明目的。由于生物可降解性，通常不会出现与PEG相关的上述的蓄积问题。而且，HES已经长期用于医疗中，如以血浆扩容剂的形式。因此它的无毒性得到承认。
此外，通过气相色谱法可检测HES水解产物的衍生物。在肽单元仍然稳定的条件下，可水解HES-肽缀合物。这可允许量化和监测降解产物，并可允许评价和标准化活性肽。
根据另一个实施方案，使用第一种类型的聚合物载体单元并负载肽单元。优选该第一载体是容易生物降解的，例如是HES。然而，并不是第一载体的所有附着点都被肽单元占据，而是例如仅仅约20至50％。根据所用聚合物的大小，几百个肽单元可被偶联到载体分子上。但是，根据所用的肽，通常偶联较少的肽单元(2-50，2-20，2-10或3-5)。其余的(或至少有些)剩余的附着点被不同的载体占据，如具有比第一载体更低的分子量的小PEG单元。这个实施方案优点在于，由于第一载体而产生了超价组合物，然而由于优选由3-5或3-10kD的PEG单元组成的第二载体的存在，第一载体是非常耐久的。然而，整个实体是非常易降解的，因为第一载体(如HES)和肽单元是可生物降解的，第二载体(如PEG)小到足以容易地从身体中清除。
组成肽单元的结合域的单体可识别靶物的结合位点。术语结合域指，单体肽中参与结合靶物的结合部分。根据肽，结合域可以由肽的不同结构基序(例如β-折叠，α-螺旋，β转角)组成，这些基序确定了肽的三维构象中的结合域。
根据一个实施方案，肽单元会结合跨膜受体。当配体结合受体上的特异性结构域时，生长因子和细胞因子通常会激活跨膜受体，从而诱导构象变化和/或触发受体链的二聚化或寡聚化。配体结合后，I类细胞因子受体中的几个成员会形成同型二聚体，所述I类细胞因子受体包括红细胞生成素受体(EPOR)，血小板生成素受体(TPOR)，粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)，生长激素受体(GHR)，和促乳素受体(PrR)。这些I类细胞因子受体表现出彼此之间的结构和功能相似性。根据一个实施方案，选择肽单元，使得它们结合这些I类细胞因子受体。
如所述的，同型二聚体受体是由2个非共价结合的相同蛋白亚基组成的任意生物靶蛋白。这样的受体通常仅在2个亚基以同型二聚体形式结合时才有功能。作为同型二聚体受体这后一种性质，会将EPO-受体和例如相关的TPO-受体与许多其它的细胞因子受体区分开。在细胞因子受体的大多数其它情况下，受体是异型二聚体(许多白介素-受体)或甚至异型三聚体(例如IL-2)。
根据本发明的包含至少2个单体结合域的肽单元会结合它们的靶物，且优选地能相应地各自使靶物二或多聚化和/或稳定化靶物，从而建立信号转导诱发复合物。所述肽单元优选地具有同型二聚体靶分子，后者优选地是细胞因子受体(见上文)。
如上所述，用于建立超价分子的肽单元会结合靶受体。根据一个实施方案，肽单元会作为受体激动剂。术语激动剂指生物活性肽，其会结合它的互补生物活性受体(靶物)，并激活它，以造成受体的生物反应或增强受体(靶物)的原有生物活性。根据一个不同的实施方案，肽单元会作为受体拮抗剂。所述拮抗剂也会结合它的互补生物活性受体(靶物)。但是，拮抗剂不会诱导或增强受体(靶物)的生物活性。
现有技术已知几种使单体肽单元二聚化或多聚化的方法。这些方法可以用于建立根据本发明的肽单元。按照二聚化方案的流行方案的特征在于， a)下述事实，即首先分别合成结合域，作为单价或单体肽，后者可以通过例如反应基团的附着来修饰以准备用于步骤b)， b)在第二个反应步骤中，在分开的二聚化反应中，将2个(在大多数情况下，相同的)结合域连接到一起，其也可以包含通常插入2个二聚化的结构域之间的连接体分子。
这样的二聚体是二价(二聚体)肽的实例，且表现出与单体基本上相同的生物功能，但是由于与受体更好的相互作用，表现出增强的生物活性。
一些使单体二聚化或寡聚化的技术是本领域技术人员所知的，其根据本发明的教导也可进行应用。通过例如共价连接于连接体，可使单体二聚化。连接体是在本发明的多肽单元之间创建共价键的连接分子。可以以改进与EPO受体结合的方式，通过连接体来组合多肽单元(Johnson等，1997；Wrighton等，1997)。此外，还可参见由Wrighton等(Wrighton，1997)描述的通过与蛋白载体分子的非共价相互作用，单体生物素化的肽的多聚化。还可能使用生物素/链霉抗生物素系统，即将肽的C末端进行生物素化，并随后使用链霉抗生物素培育生物素化的肽。或者，众所周知通过形成二酮哌嗪结构来完成二聚化。例如Cavelier等详细描述了为技术人员所知的这种方法(在PeptidesThe wave of the Future；Michal Lebl and Richard A.Houghten(eds)；American Peptide Society，2001)。与二聚化和非共价多聚化有关的这些文件的公开内容通过参考引入本文。现有技术中已知的另一种可替代的获得肽二聚体的方法是，使用双功能活化二羧酸衍生物作为随后连接体部分的反应前体，其与N末端氨基起反应，从而形成最终的二聚体肽(Johnson等，1997)。通过共价连接于连接体，也可使单体二聚化。优选连接体包含NH-R-NH，其中R是用使得能结合另一个分子部分的官能团(例如羧基或氨基)取代的低级亚烷基。连接体可包含赖氨酸残基或赖氨酸酰胺。同样PEG可用作连接体。连接体可以是含有两个羧酸的分子，并任选在一个或多个原子上被官能团(例如能结合一个或多个PEG分子的胺)取代。在WO 2004/101606中也公开了用于肽与连接部分寡聚化和二聚化的可能步骤的详细说明。
尽管根据本发明的教导，合成二聚物分子的现有技术方法在功能上是足够的并因此是可用的，但其对于有些肽会具有一些缺点。
感觉到一个潜在的缺点在于，必须首先分别合成要连接的单体。由于在二聚化反应期间单体肽的随机配对，通过该方法特别难于(有选择地和有意地)获得异型二聚体二价肽。至少这将在特殊的、计划的异型二聚体的生产中导致重大损失。包含两个或更多个略微不同的单体结合域的二价肽是非常合乎需要的，因为由于它们的异型二聚体特性，可在两个结构域之间引入特殊的相互作用，其能在最终的二价肽中稳定它们的相互作用，同时维持或甚至增强与同型二聚体受体的结合。然而，由于与现有技术“随机二聚化反应”有关的产率中的高损失，这通常是经济上没有吸引力的方法。
因此应用现有技术二聚化方法(即使技术上是适宜的)对于提供这些具有所述的异质结合域的肽而言，具有一些经济上的缺点。因而优选地，使用更有效的策略来得到高活性的二价肽单元，其甚至可能包含异质结合域。
这种二聚化方法的核心概念是，避免在二聚化或多聚化前的单独反应中合成形成二价肽的一部分的单体肽，而是可在一个步骤中，如在一个单一固相反应中，合成作为单个肽的具有至少2个结合域的最终肽单元。因此不再需要现有技术教导的单独的二聚化或多聚化步骤。这个方面提供了很大的优点，即在最终的肽单元中对各个序列位点的全面和独立控制。由于对各个序列位置的独立控制，该方法容许在肽单元中容易地包含至少两个不同的受体特异性的结合域。
根据该实施方案，在结合域之间的最终肽序列(即“连接体区”)仅仅由氨基酸组成，因此产生一个单一的、连续的肽单元。在本发明的优选实施方案中，连接体由允许高度构象柔性的天然或非天然的氨基酸组成。在这方面，可以有利地使用已知在扭转方面具有高度柔性的甘氨酸残基作为连接氨基酸。然而，也可使用其它的氨基酸，例如丙氨酸或β-丙氨酸、或其混合物。所用氨基酸的数量和选择取决于各自的空间情况。这个实施方案容许通过分子建模定制设计适宜的连接体，以便避免生物活性构象的扭曲，且因此允许与受体单元完美匹配。特别优选由3至5个氨基酸组成的连接体。
值得注意的是在肽单元的功能结合域(也称作单体单元)之间的连接体可以是肽的独特部分，或可以完全或部分地由属于单体结合域的一部分的氨基酸组成。因此，术语“连接体”更应在功能上进行定义而不是在结构上进行定义，因为氨基酸可能形成连接体单元以及单体结合亚基的一部分。
由于如上所述，在合成二价肽的期间，最终肽之中的各个序列位置是受控制的，并因此可被精确确定，有可能定做或定制包括连接体在内的肽单元或其特异性区域或结构域。这具有特殊的优点，因为它允许创建对聚合物的特异性附着位点，并避免由于不利的分子内相互作用而扭曲肽单元的生物活性构象。在合成前，通过分子建模可评价扭曲的风险。这特别适用于设计单体结构域之间的连接体。
根据本发明的连续二价/多价肽，显示出比相应单体肽高得多的活性，并因而证实了从其它二聚体肽已知的观测结果，即功效的增加与二价肽概念有关。
根据一个优选的实施方案，所有肽单元(其中每个肽单元视作一个受体结合单元)会结合相同的靶受体。但是，它们可以是异质的，因而在它们的氨基酸序列中存在差异。
根据一个优选的实施方案，所述肽单元会结合EPO受体，从而使EPO受体复合物二聚化。优选地，它们诱导信号转导，因而是EPO受体激动剂。可以从EPO模仿肽组中选择肽单元，相应地建立肽单元的单体结合域。适当的EPO模仿肽是现有技术众所周知的，且可以与本发明一起使用(请参见例如WO 96/40772；WO 96/40749；WO 01/38342；WO 01/091780；WO 2004/101611；WO 2004/100997；WO 2004/101600；WO 2004/101606)。
可以根据本发明使用的其它合适的EPO模仿肽单元包含，长度为至少10个氨基酸的结合EPO受体的结合域。它们优选地在通常称作EPO模仿肽的位置10的位置中不包含脯氨酸(关于编号，请参阅Wrighton等，1996和Johnson，1998)，但是包含带正电荷的氨基酸。这些EPO模仿肽携带β-转角结构特征性的氨基酸基序(Wrighton等)，其中根据该实施方案的肽单元的结合域在所述的β-转角基序中位置10处不包含脯氨酸，而是包含带正电荷的氨基酸，优选K或R。也可能使用其它碱性氨基酸，尤其非天然氨基酸，例如高精氨酸。EPO模仿结合域的位置9和10可以被5-氨基乙酰丙酸(5-Als)占据。该肽结构域也可以在位置17中携带R。
根据一个实施方案，肽单元的至少一个EPO受体结合域包含下述的氨基酸序列 X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15 其中每个氨基酸选自天然或非天然氨基酸，且 X6是C，A，E，α-氨基-γ-溴代丁酸或高半胱氨酸(hoc)； X7是R，H，L，W或Y或S； X8是M，F，I，高丝氨酸甲基醚(hsm)或正异亮氨酸； X9是G或G的保守性交换； X10是脯氨酸的非保守性交换； 或X9和X10被单个氨基酸替代； X11独立地选自任意氨基酸； X12是T或A； X13是W，1-nal，2-nal，A或F； X14是D，E，I，L或V； X15是C，A，K，α-氨基-γ-溴代丁酸或高半胱氨酸(hoc) 条件是，X6或X15是C或hoc。
所述肽单元的一个结合域的长度优选在10至40或50或60个氨基酸之间。在优选的实施方案中，肽共有序列具有至少10、15、18或20个氨基酸的长度。当然，它们可分别地被更长的序列包含。所述的单体肽序列可被看成是EPO受体的结合域。作为EPO模仿肽，它们能够结合和激活EPO受体。
非常令人意外的是，尽管一个(或根据一些实施方案，甚至两个)脯氨酸可以被其它的天然的或非天然的氨基酸替代，这些肽确实表现出EPO模仿活性。事实上，根据本发明的肽具有与含脯氨酸的肽相当的活性。然而，值得注意的是，替代脯氨酸残基的氨基酸不代表保守性交换，而是非保守性交换。优选地，使用带正电荷的氨基酸，例如碱性氨基酸(例如K、R和H，并且特别是K)用于替代。用于替代的非保守性氨基酸还可是非天然的氨基酸，并优选是具有带正电荷侧链的氨基酸。也包括所提到的氨基酸各自的类似物。非天然氨基酸的适宜实例是高精氨酸。根据一个实施方案，除了天然的氨基酸精氨酸之外，肽在10位上具有带正电荷的氨基酸。因此根据该实施方案，脯氨酸10被选自K、H或非天然的带正电荷的氨基酸如高精氨酸的氨基酸替代。优选地，肽在10位上具有赖氨酸或高精氨酸。如上所述，在17位上的脯氨酸也可被非保守性氨基酸替代。在这一方面还优选的是所述的非保守性氨基酸是具有带正电荷侧链的氨基酸，例如K、R、H，或各自的非天然氨基酸，例如高精氨酸。根据该实施方案的子实施方案，除了天然的氨基酸精氨酸之外，肽在17位上具有带正电荷的氨基酸。因此根据该实施方案，脯氨酸17被选自K、H或非天然的带正电荷的氨基酸例如高精氨酸的氨基酸替代。优选地，该肽在17位上具有赖氨酸或高精氨酸。
此外，EPO-R结合域可以包含下述氨基酸序列 X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15 其中用标准字母缩写表示每个氨基酸，并且 X6是C； X7是R，H，L或W； X8是M，F或I； X9是G或G的保守性交换； X10是脯氨酸的非保守性交换； X11独立地选自任意氨基酸； X12是T； X13是W； X14是D，E，I，L或V； X15是C。
此外，X7可以是丝氨酸，X8可以是hsm或正异亮氨酸，且X13也可以是1-nal，2-nal，A或F。肽共有序列的长度优选在10至40或50或60个氨基酸之间。在优选的实施方案中，肽共有序列包含至少10、15、18或20个氨基酸。
下面的肽共有序列定义了可以用于建立根据本发明的肽单元的其它EPO模仿肽 能结合EPO受体的肽，其选自 -包含下述共有氨基酸序列的肽 X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15 其中每个氨基酸选自天然或非天然氨基酸，且 X6是具有能形成共价键的侧链官能团(functionality)的氨基酸或A或α-氨基-γ-溴代丁酸； X7是R，H，L，W，Y或S； X8是M，F，I，高丝氨酸甲基醚或正异亮氨酸； X9是G或G的保守性交换； X10是脯氨酸的非保守性交换(或根据另一个实施方案，脯氨酸或脯氨酸的保守性交换)； 或X9和X10被单个氨基酸替代； X11选自任意氨基酸； X12是不带电荷的极性氨基酸或A； X13是W，1-nal，2-nal，A或F； X14是D，E，I，L或V； X15是具有能形成共价键的侧链官能团的氨基酸或A或α-氨基-γ-溴代丁酸，和 -上面共有序列定义的肽的功能等同片段、衍生物和变体，其具有EPO模仿活性，并在位置X10具有构成脯氨酸的非保守性交换(或根据另一个实施方案，脯氨酸或脯氨酸的保守性交换)的氨基酸，或其中X9和X10被单个氨基酸替代。
根据第一个实施方案的共有序列，X6和X15表示具有能形成共价键的侧链官能团的氨基酸。这些氨基酸因而能形成桥单元。根据一个实施方案，选择在位置X6和X15的氨基酸，使得它们能通过在彼此之间形成共价键，在肽内形成分子内桥。分子内桥的形成可导致肽的环化。合适的桥单元的实例是二硫桥和二硒桥。在它们的侧链中具有这样的桥形成官能团的氨基酸的合适实例是例如半胱氨酸和半胱氨酸衍生物例如高半胱氨酸或硒代半胱氨酸，但也可以是硫代赖氨酸。二硒桥(例如在2个硒代半胱氨酸残基之间)的形成，甚至具有胜过半胱氨酸桥的优点。这是因为，硒化物桥在还原环境中更稳定。因而甚至在困难的条件下保存肽的构象。
但是，显然的是，这样的氨基酸也适合在位置X6和X15，其描述具有允许在含有带正电荷侧链的氨基酸(例如蛋白生成性(proteinogenic)氨基酸K，H，R或鸟氨酸，DAP或DAB)和含有带负电荷侧链的氨基酸(例如蛋白生成性氨基酸D或E)之间形成不同共价键(例如酰胺键)的官能团的侧链。其它实例是酰胺和硫醚桥。
长度至少10个氨基酸的肽，其能结合EPO受体，选自下述替代物 (a)包含下述核心氨基酸序列的肽 X9X10X11X12X13 其中每个氨基酸选自天然或非天然氨基酸，且其中 X9是G或G的保守性交换； X10是脯氨酸的非保守性交换(或根据另一个实施方案，脯氨酸或脯氨酸的保守性交换)；或X9和X10被单个氨基酸替代； X11选自任意氨基酸； X12是不带电荷的极性氨基酸或A； X13是萘基丙氨酸。
(b)能结合EPO受体的肽，其包含下述氨基酸序列 X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15 其中每个氨基酸选自天然或非天然氨基酸，且 X6是C，A，E，α-氨基-γ-溴代丁酸或高半胱氨酸(hoc)； X7是R，H，L，W或Y或R，H，L，W，Y或S； X8是M，F，I，高丝氨酸甲基醚或正异亮氨酸； X9是G或G的保守性交换； X10是脯氨酸的非保守性交换； 或X9和X10被单个氨基酸替代； X11选自任意氨基酸； X12是T或A； X13是1-nal，2-nal； X14是D，E，I，L或V； X15是C，A，K，α-氨基-γ-溴代丁酸或高半胱氨酸(hoc)； 条件是，X6或X15是C或hoc。
(c)上述共有序列定义的肽的功能等同片段、衍生物和变体，其具有EPO模仿活性，且在位置X10具有构成脯氨酸的非保守性交换(或根据另一个实施方案，脯氨酸或脯氨酸的保守性交换)的氨基酸，或其中X9和X10被单个氨基酸替代，且在位置X13具有萘基丙氨酸。
长度至少10个氨基酸的肽，其能结合EPO受体，且具有激动剂活性，其选自 -包含下述核心氨基酸序列中至少之一的肽 X9X10X11X12X13； X9X10X11X12X13X14X15X16X17 或 X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19 其中每个氨基酸选自天然或非天然氨基酸，且其中在位置X10、X17或X19中的至少一个位置处是带负电荷的氨基酸，且其中 X9是G或G的保守性交换； X11选自任意氨基酸； X12是不带电荷的极性氨基酸或A；优选苏氨酸，丝氨酸，天冬酰胺或谷氨酰胺； X13是W，1-nal，2-nal，A或F； X14是D，E，I，L或V； X15是具有能形成共价键的侧链官能团的氨基酸或A或α-氨基-γ-溴代丁酸； X16独立地选自任意氨基酸，优选G，K，L，Q，R，S，Har或T； X18独立地选自任意氨基酸，优选L或Q； -上述共有序列定义的肽的功能等同片段、衍生物和变体，其具有EPO模仿活性，且其中在位置X10、X17或X19中的至少一个位置处是带负电荷的氨基酸。
下述扩展的共有序列也可以描述在位置X10、X17或X19中的至少一个位置处具有带负电荷的氨基酸的EPO模仿肽 X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19 其中每个氨基酸选自天然或非天然氨基酸，且其中 X6是具有能形成共价键的侧链官能团的氨基酸或A或α-氨基-γ-溴代丁酸； X7是R，H，L，W或Y或S； X8是M，F，I，Y，H，高丝氨酸甲基醚或正异亮氨酸； X9是G或G的保守性交换； 在X10不是带负电荷的氨基酸时，X10是脯氨酸、脯氨酸的保守性交换或脯氨酸的非保守性交换，或X9和X10被单个氨基酸替代； X11选自任意氨基酸； X12是不带电荷的极性氨基酸或A；优选苏氨酸，丝氨酸，天冬酰胺或谷氨酰胺； X13是W，1-nal，2-nal，A或F； X14是D，E，I，L或V； X15是具有能形成共价键的侧链官能团的氨基酸或A或α-氨基-γ-溴代丁酸； X16独立地选自任意氨基酸，优选G，K，L，Q，R，S，Har或T； 在X17不是带负电荷的氨基酸时，X17选自任意氨基酸，优选A，G，P，Y或带正电荷的天然、非天然或衍生的氨基酸，优选K，R，H，鸟氨酸或高精氨酸； X18独立地选自任意氨基酸，优选L或Q； 在X19不是带负电荷的氨基酸时，X19独立地选自任意氨基酸，优选带正电荷的氨基酸，例如K，R，H，鸟氨酸或高精氨酸； 条件是，X10、X17或X19中的至少一个是带负电荷的氨基酸。
长度至少10个氨基酸的肽，其能结合EPO受体，且具有激动剂活性，其选自下述肽组 (a)包含下述核心氨基酸序列的肽 X9X10X11X12X13； X9X10X11X12X13X14X15X16X17 或 X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19 其中每个氨基酸选自天然或非天然氨基酸，且其中 X9是G或G的保守性交换； X11选自任意氨基酸； X12是不带电荷的极性氨基酸或A；优选苏氨酸，丝氨酸，天冬酰胺或谷氨酰胺； X13是W，萘基丙氨酸，A或F； X14是D，E，I，L或V； X15是具有能形成共价键的侧链官能团的氨基酸或A或α-氨基-γ-溴代丁酸， 以及上面共有序列定义的肽的功能等同片段、衍生物和变体，其具有EPO模仿活性， 其中位置X10，X16，X17或X19中的至少一个描述了带正电荷的非蛋白生成性氨基酸，其具有与赖氨酸相比延长的侧链； (b)包含下述氨基酸序列的肽，尤其能结合EPO受体的肽 X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15 其中每个氨基酸选自天然或非天然氨基酸，且 X6是C，A，E，α-氨基-γ-溴代丁酸或高半胱氨酸(hoc)； X7是R，H，L，W或Y或S； X8是M，F，I，高丝氨酸甲基醚或正异亮氨酸； X9是G或G的保守性交换； X10是Har X11选自任意氨基酸； X12是T或A； X13是W，1-nal，2-nal，A或F； X14是D，E，I，L或V； X15是C，A，K，α-氨基-γ-溴代丁酸或高半胱氨酸(hoc)； 条件是，X6或X15是C或hoc； (c)包含下述氨基酸序列的肽 X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18 其中X6-X15具有上述变体(b)的含义，且其中 X3独立地选自任意氨基酸，优选D，E，L，N，S，T或V； X4是Y； X5独立地选自任意氨基酸，优选A，H，K，L，M，S，T或I； X16独立地选自任意氨基酸，优选G，K，L，Q，R，S或T； X17是高精氨酸； X18独立地选自任意氨基酸。
这些肽也可以通过下述核心氨基酸序列来描述 X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19 其中每个氨基酸选自天然或非天然氨基酸，且其中 X6是具有能形成共价键的侧链官能团的氨基酸或A或α-氨基-γ-溴代丁酸； X7是R，H，L，W或Y或S； X8是M，F，I，Y，H，高丝氨酸甲基醚或正异亮氨酸； X9是G或G的保守性交换； 在X10不是带正电荷的、具有与赖氨酸相比延长的侧链的非蛋白生成性氨基酸时，X10是脯氨酸，脯氨酸的保守性交换或脯氨酸的非保守性交换，或X9和X10被单个氨基酸替代； X11选自任意氨基酸； X12是不带电荷的极性氨基酸或A；优选苏氨酸，丝氨酸，天冬酰胺或谷氨酰胺； X13是W，1-nal，2-nal，A或F； X14是D，E，I，L或V； X15是具有能形成共价键的侧链官能团的氨基酸或A或α-氨基-γ-溴代丁酸； 在X16不是带正电荷的、具有与赖氨酸相比延长的侧链的非蛋白生成性氨基酸时，X16独立地选自任意氨基酸，优选G，K，L，Q，R，S或T； 在X17不是带正电荷的、具有与赖氨酸相比延长的侧链的非蛋白生成性氨基酸时，X17选自任意氨基酸，优选A，G，P，Y或带正电荷的天然、非天然或衍生的氨基酸，优选K，R，H或鸟氨酸； X18独立地选自任意氨基酸，优选L或Q； 在X19不是带正电荷的、具有与赖氨酸相比延长的侧链的非蛋白生成性氨基酸时，X19独立地选自任意氨基酸，优选带正电荷的氨基酸例如K，R，H或鸟氨酸； 条件是，X10，X16，X17或X19中的至少一个是带正电荷的、具有与赖氨酸相比延长的侧链的非蛋白生成性氨基酸。
单体EPO模仿肽单元(其中的至少2个构成一个肽单元)可能包含替代氨基酸残基X9和X10的单个氨基酸。优选地，这2个残基被一个非天然氨基酸(例如5-氨基乙酰丙酸或5-氨基戊酸)替代。
在另一个实施方案中，在肽单元中使用的结合域包含下述序列 X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15 其中X6-X15具有上面的含义，且其中 X4是Y； X5独立地选自任意氨基酸，优选A，H，K，L，M，S，T或I。
结合域可以延长，且可以包含共有序列 X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18 其中X4-X15具有上面的含义，且其中 X3独立地选自任意氨基酸，优选D，E，L，N，S，T或V； X16独立地选自任意氨基酸，优选G，K，L，Q，R，S或T，更优选K，R，S或T； X17独立地选自任意氨基酸，优选A，G，P，R，K，Y或具有带正电荷侧链的非天然氨基酸、更优选R，K或非天然氨基酸例如高精氨酸； X18独立地选自任意氨基酸。
在本发明的另一个实施方案中，优选地，所述肽包含作为C、E、A或hoc、优选C的X6，和/或作为R、H或Y的X7，和/或作为F或M的X8，和/或作为G或A、优选G的X9，和/或作为K的X10，和/或作为V、L、I、M、E、A、T或正异亮氨酸的X11，和/或作为T的X12，和/或作为W的X13，和/或作为D或V的X14，和/或作为C或hoc、优选C的X15，和/或作为P、Y或A的X17，但是，也优选地，X17是K或具有带正电荷侧链的非天然氨基酸例如高精氨酸。
图19公开了其它新的和合适的具有EPO模仿活性的肽单体。结合本发明，它们可以用作适用于创建根据本发明的肽单元的结合域(单体)。此外，它们可以用作上面所述的单体或多聚体EPO模仿肽。
在结合单体的开头(N末端)和结尾(C末端)，可以去除和/或添加最高达5个氨基酸。
由于仅仅肽的功能特征(在这里是结合能力，且在EPO受体激动剂的情况下是激活EPO受体的能力)是决定性的，肽单元的精确氨基酸序列可以变化。上面仅仅给出了EPO模仿肽的合适实例，以便支持总的构思。但是，具有不同氨基酸序列的其它EPO模仿肽也可以用于本发明。
根据另一个实施方案，所述肽单元会结合TPO受体，从而使TPO受体复合物二聚化。优选地，它们会诱导信号转导，因而是TPO受体激动剂。肽单元(相应地建立肽单元的单体结合域)可以选自TPO模仿肽。适当TPO模仿肽是现有技术众所周知的，且可以用于本发明。合适的实例记载在例如WO 98/25965，US5932546，WO0024770，Cwirla，S.E.，P.Balasubramanian，D.J.Duffin，C.R.Wagstrom，C.M.Gates，S.C.Singer，A.M.Davis，R.L.Tansik，L.C.Mattheakis，C.M.Boytos，P.J.Schatz，D.P.Baccanari，N.C.Wrighton，R.W.Barret t和W.J.Dower(1997).″Peptide agonist of thethrombopoietin receptor as potent as the natural cytokine.″Science 276(5319)1696-1699，US6083913，US6465430，US5869451，US6121238，US6251864，Dower，W.J.，S.E.Cwirla，P.Balasubramanian，P.J.Schatz，D.P.Baccanari和R.W.Barrett(1998).″Peptide agonists of the thrombopoietin receptor.″StemCells 16 Suppl 221-29，WO05023834，WO0024770，关于TPO模仿肽的结构/氨基酸序列的所有文件的公开内容，完全通过参考引入。
根据本发明的肽单元，除了L-氨基酸或立体异构D-氨基酸之外，还可包含非天然/非常规的氨基酸，诸如α，α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸或乳酸，例如1-萘基丙氨酸，2-萘基丙氨酸，高丝氨酸-甲基醚，β-丙氨酸，3-吡啶基丙氨酸，4-羟脯氨酸，O-磷酸丝氨酸，N-甲基甘氨酸(肌氨酸)，N-乙酰基丝氨酸，N-乙酰基甘氨酸，N-甲酰基蛋氨酸，3-甲基组氨酸，5-羟赖氨酸，正赖氨酸，5-氨基乙酰丙酸或5-氨基-戊酸。特别优选使用N-甲基甘氨酸(MeG)和N-乙酰基甘氨酸(AcG)，特别是在末端位置。同样在本发明范围内的是，为所定义肽的逆肽(retro peptide)、反向肽(inverso peptide)和逆/反向肽的肽，以及全部由D-氨基酸组成的那些肽。
也可以使用肽的衍生物，如甲硫氨酸的氧化产物、或脱酰氨基的谷氨酰胺、精氨酸以及C末端酰胺。
在本文中，大写字母形式的单字母密码的缩写是标准多肽命名法的那些缩写，其通过添加非天然氨基酸而被扩展。


通过例如单个氨基酸的保守性交换，可以修饰肽单元。这类交换会改变结合分子的结构和功能，但在大多数情况下只是轻微地改变。在保守性交换中，一个氨基酸被具有相似性质的一组中的另一个氨基酸替代。
相应组的实例是 -具有非极性侧链的氨基酸A，G，V，L，I，P，F，W，M -具有极性侧链的不带电荷的氨基酸S，T，G，C，Y，N，Q -具有芳香族侧链的氨基酸F，Y，W -带正电荷的氨基酸K，R，H -带负电荷的氨基酸D，E -相似大小或分子量的氨基酸，其中替代氨基酸的分子量与原始氨基酸的分子量偏差最大为+/-25％(或+/-20％、+/-15％、+/-10％)。
更具体地说，Wrighton等(美国专利5,773,569，以及相关专利)使用噬菌体展示技术详细考查了EPO-模仿肽的哪些氨基酸可被替代，同时保持活性。他们还研究和公开了关于可能截短(即给定单体肽的最小长度)的数据。
根据本发明的一个实施方案，选自下面给出的SEQ ID NO 2、4-9的单体，可以用于形成所述的至少二价的肽单元。良好活性表明，如SEQ ID NO 2的在10位上具有K和在17位上具有K的肽。
SEQ ID NO 2GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG SEQ ID NO 4GGTYSCHFGKLTWVCKPQGG SEQ ID NO 5GGTYSCHFGRLTWVCKPQGG SEQ ID NO 6GGTYSCHFGRLTWVCKKQGG
5-氨基乙酰丙酸(Als)的掺入 SEQ ID NO 7GGTYSCHF-(Als)-LTWVCKPQGG SEQ ID NO 8GGTYSCHF-(Als)-LTWVCKKQGG SEQ ID NO 9GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG 根据一个实施方案，在根据上文给出的SEQ ID NO 2和4至9的单体或其修饰型的基础上，形成肽单元。可以例如通过单个氨基酸的保守性交换来修饰肽，其中优选地，交换不超过1、2或3个氨基酸。优选地，这些肽在N末端被修饰成AcG，和在C末端修饰成MeG。
随后列出了用于使EPO受体二聚化的适当肽单元的一些实例。在结合域上面的线条，代表任选的、但是优选的分子内二硫桥 SEQ ID NO 10(基于SEQ ID NO 2)
SEQ ID No 11
通过分子建模，定制这些二价结构中的连接体，以避免生物活性构象的扭曲(图1)。
SEQ ID NO 12 连接体序列可以缩短一个甘氨酸残基。该序列也是由甘氨酸残基组成的连接体的实例，同时形成结合域的一部分(见SEQ ID NO 2)。

SEQ ID NO 14
该序列呈现携带2个略有不同的(异质的)结合域的连续二价肽单元。这样的二价肽利用现有技术的二聚化方案(见上文)不能经济地得到。该异型二聚体分子的优点在于，偏离氨基酸(目前在C末端的K和D)彼此相互作用，从而稳定化二聚体。因而，有利地，通过分子建模，将各个稳定化修饰掺入分子中。
另一个实例是 GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG 根据另一个实施方案，肽任选在N-末端携带有额外的氨基酸，优选具有反应性侧链的氨基酸如半胱氨酸，例如在如下序列中 C-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG C-GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG 半胱氨酸的反应性侧链可用作连接纽带，例如用于附着聚合物载体单元。此外，肽任选包含在第一个和第二个和/或第三个和第四个半胱氨酸之间的分子内二硫桥。
SEQ ID 2，4-9和12，13和15，15a例示的单体单元可以有利地组合成肽单元。
应用于肽单元的单体的二聚化方法的实例包括(但不限于) 1.通过C末端至C末端的连接进行的二聚化，其中所述单体肽之一的C末端共价结合于另一个肽的C末端。在单体之间的连接体/间隔子可包含二酮哌嗪单元。通过活化C末端甘氨酸单体，可获得优选的Gly-Gly二酮哌嗪构架。该原理还可用来形成C末端二聚化。

下列式和实例代表通过分子建模优化的四个定制实例 (a)以SEQ ID NO 2为基础的二聚体(图2中显示了二聚体构象)
(b)以SEQ ID NO 2为基础的具有被截短一个甘氨酸的连接体的二聚体；图3中显示了其构象。

(c)以甘氨酸被β-丙氨酸替代的SEQ ID NO 2为基础的二聚体(图4)。单体(SEQ ID NO 16)也可用作EPO模仿肽。

(d)以备选的甘氨酸被β-丙氨酸替代的SEQ ID NO 2为基础的二聚体(图5)。单体(SEQ ID NO 17)也可用作EPO模仿肽。

2.通过N末端至N末端的连接进行的二聚化，其中所述单体肽之一的N末端共价结合于另一个肽的N末端，由此间隔单元优选含有二羧酸构件块(building block)。

(a)在一个实施方案中，得到的以在N末端延长一个甘氨酸残基的SEQ ID NO 2(SEQ ID NO 18)为基础的二聚体，包含作为连接体/间隔子的己二酰单元(图6)
(b)在一个替代性实施方案中，可通过使用作为连接体/间隔子的辛二酰单元(图7)，来实现二聚化。

3.通过侧链进行的二聚化，其中所述单体肽之一的氨基酸侧链共价结合于另一个肽的氨基酸侧链，其中包括连接两个肽单体的合适间隔分子。

这可包括 (a)通过酰胺键的连接。

(b)或通过二硫桥的连接

X代表参与形成各肽键的各氨基酸的主链核心。
根据一个不同的策略，在第一个单体肽单元的C-末端氨基酸和第二个肽单体的N-末端氨基酸的侧链之间，形成将肽单体彼此连接、从而形成肽单元的共价键。因此，根据该二聚化策略优选的是，要二聚化的单体肽携带下述氨基酸其在N-或C-末端具有桥形成官能团，从而允许在第一个肽的最后一个氨基酸和第二个肽的第一个氨基酸之间形成共价键。建立二聚体的键优选地是共价键。各桥的合适实例是例如二硫桥和二硒桥。但是，例如带正电荷的和带负电荷的氨基酸之间的酰胺键或其它共价连接键(例如硫醚键)也适合用作连接部分。
适用于在单体结合单元之间形成各连接桥以形成最终的肽单元的优选氨基酸是，例如半胱氨酸、半胱氨酸衍生物例如高半胱氨酸或硒代半胱氨酸或硫代赖氨酸。它们会形成二硫桥，或在含硒氨基酸的情况下，形成二硒桥。
下面使用EPO模仿肽作为实例，给出了分别创建的肽单元二聚体的合适实例

根据另一项发展，在肽二聚体的N-或C-末端(因而在位于二聚体的开头或结尾的各个单体肽单元的N-或C-末端)包含额外的氨基酸，其允许偶联聚合物载体例如HES，以便建立超价化合物。结果，导入的氨基酸携带各个偶联官能团例如SH-基。这样的氨基酸的一个常见实例是半胱氨酸。但是，具有允许形成共价键的官能团的其它氨基酸(例如所有带负电荷的和带正电荷的氨基酸)也是合适的。

在肽单体上面的线条代表分子内共价键；在该情况下，是二硫桥。
根据另一项发展，参与形成将单体单元连接成二聚体的共价键的C和/或N末端氨基酸，呈现带电荷的基团，例如COO-或NH3+基团。该特征导致分子间桥结构的有利的稳定化
4.上面已经描述了通过形成连续的二价或多价肽来二聚化。

该策略核心构思避免在二聚化或多聚化前的单独反应中合成形成多价或二价肽的一部分的单体肽，而是在一个步骤中，如在一个单一固相反应中，合成作为单个肽的最终二价或多价肽。因此不再需要单独的二聚化或多聚化步骤。这个方面提供了很大的优点，即对最终的肽单元中每个序列位点的全面和独立控制。由于对各个序列位置的独立控制，该方法容许在肽单元中容易地包含至少两个不同的受体特异性的结合域。
关于单体和二聚体或多聚体肽，连续的二价/多价肽可以通过例如乙酰化或酰胺化来修饰，或在C-末端或N-末端位置延长。
所有可能的修饰也适用于修饰连接体。更具体地，可能有利地将可溶聚合物部分结合到连接体，例如PEG，淀粉或葡聚糖。
根据本发明的最终多价或二价肽的合成，也可以有利地包括在每个结合域内2个随后的且独立的二硫键或其它分子内键形成。因而肽也可以环化。
肽的反应性侧链可用作连接纽带，例如用于进一步的修饰。此外，肽单元任选包含在具有形成桥的侧链官能团的氨基酸(例如半胱氨酸)之间的分子内桥。
肽可以通过例如乙酰化或酰胺化来修饰，或在C-末端或N-末端位置延长。在2个末端之一(N或C)处延伸一个或多个氨基酸，例如用于制备聚合物载体的附着位点，经常会产生异型二聚体二价肽单元，其最好生产为连续肽。
现有技术已知用于将载体偶联到蛋白和肽上的几种反应性氨基酸。一种优选的偶联氨基酸是半胱氨酸，其可以偶联到N或C末端，或可以导入肽序列内。但是，偶联方向可以产生显著差异，因而应当为肽单元仔细选择。这将在EPO模仿肽的下述实例的基础上证实 使用下述的2个二聚体 AGEM400C6C4
AGEM40C6C4
1-Nal1-萘基丙氨酸 Cys(tBu)S-叔丁基保护的L-半胱氨酸 41聚体AGEM400C6C4和AGEM40C6C4具有相同的核心序列。AGEM400C6C4的氨基酸1-40与AGEM40C6C4的氨基酸2-41相同。唯一的不同是tBu-保护的半胱氨酸的位置。该氨基酸不参与受体药物相互作用，但是注定在最终的缀合物中起与聚合物载体的连接基团的功能。在AGEM400C6C4的情况下，tBu-保护的半胱氨酸结合在C端，在AGEM40C6C4的情况下，它结合在N端。连接线条代表半胱氨酸桥。
AGEM400C6C4有2个胜过AGEM40C6C4的优点。
第一个优点是，它的合成的可达性。AGEM400C6C4可以以比GEM40C 6C4更高的总产率进行分离。在合成AGEM40C6C4的线性序列的情况下，观察到ClZ-22聚体(ClZ-RGGGTYSCHFGKLT-1-Nal-VCKKQRG-NH2，ClZ2-氯苄氧基羰基)是副产物。在用反相高压液相色谱(RP-HPLC)纯化线性序列的过程中，它会表现出与AGEM40C6C4的线性前体类似的色谱行为，因此难以与其分离，导致目标产物总产率的损失。在AGEM400C6C4的情况下，没有发现类似的化合物。
AGEM400C6C4胜过AGEM40C6C4的第二个优点是，可以更容易地分析去保护的肽与聚合物载体的最终缀合物。分析肽缀合物的一个策略是，通过内切蛋白酶切割，选择性地降解缀合物。理想的是，在酶促水解的过程中，整个肽会从聚合物载体释放出来。通过标准的分析技术，如HPLC与UV或MS检测等，可以鉴别和定量这些肽片段。
在AGEM400C6C4的情况下，切割可以受到胰蛋白酶的影响，所述胰蛋白酶是一种已知会高选择性切割位于带电荷的氨基酸精氨酸和赖氨酸的C末端的肽键的内切蛋白酶(F.Lottspeich，H.Zorbas(Hrsg.)，“Bioanalytik”，Spectrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Berlin，1998)。应用于AGEM400C6C4的缀合物，这会释放出覆盖结合到载体分子上的原始肽的41个氨基酸中38个的片段。在AGEM40C6C4的情况下，胰蛋白酶消化释放出41个氨基酸中仅21个的片段。
AGEM400C6C4的缀合物
AGEM40C6C4的缀合物
通过后续分析可以检测的释放出的片段，用灰色标示。
由于活性药物成分的分析是其开发过程中的关键问题，AGEM400C6C4具有胜过AGEM40C6C4的明显优点。
因而，在带正电荷的氨基酸位于各个位置的情况下，非常优选地，在C末端掺入连接氨基酸(在这里是半胱氨酸)，因为可能产生几乎完全的肽片段，其原因是，切割位点是在聚合物前面相当靠右的单体位置X19中的精氨酸。
上面描述的各个装配方法也可以用于制备作为肽单元的多聚体。
应当指出，单独的或作为二价肽的一部分的本文所述所有结合域，也可以与一个或多个其它相同或不同的肽结构域相组合，以便形成各个同质或异质二价或多价肽单元。
肽单元任选地在N末端被修饰成AcG，和在C末端修饰成MeG。
肽单元可以通过例如乙酰化或酰胺化来修饰，或在C-末端或N-末端位置延长。在2个末端中的仅一个处延伸一个或多个氨基酸，尤其用于制备以后的载体单元结合，经常会产生异型二聚体二价肽单元，其最好生产为连续肽(见上文)。
根据本发明的最终多价或二价肽的合成，也可以有利地包括在每个结合域内2个随后的且独立的二硫键或其它分子内键形成。
本发明还包含各化合物生产方法，其中所述肽单元连接到各载体单元。本发明的化合物可以有利地用于制备人和/或兽用药物组合物。适应症取决于与其结合的肽单元。
在偶联EPO模仿肽的情况下，根据本发明的化合物特别适用于与红细胞生成素相同的适应症。因而，本发明也提供了治疗遭受对红细胞生成素激动剂治疗敏感的病症的患者的方法，其包括，给所述患者施用治疗有效剂量或量的本发明化合物，后者携带具有红细胞生成素激动剂活性的肽单元。
红细胞生成素是细胞因子超家族的一个成员(见上文)。除了在引言中所述的刺激效应之外，还发现红细胞生成素可刺激干细胞。因此，本文中所述的EPO模仿物适合于由干细胞相关作用所引起的所有适应症。非限制性实例是预防和/或治疗与神经系统相关的疾病。实例是神经损伤、疾病或紊乱，例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、戈谢病、Tay-Sachs病、神经病、周围神经损伤、脑肿瘤、脑损伤、脊髓损伤或中风损伤。根据本发明的EPO模仿肽还适用于遭受心力衰竭或处于遭受心力衰竭危险中的患者的预防和/或治愈性治疗。实例是心肌梗塞、冠状动脉病、心肌炎、化学疗法治疗、酒精中毒、心肌病、高血压、心脏瓣膜病包括二尖瓣关闭不全或主动脉瓣狭窄、和甲状腺紊乱、慢性和/或急性冠脉综合征。此外，EPO模仿物可用于刺激内皮前体细胞的生理动员、增殖和分化，用于刺激血管发生，用于治疗与内皮前体细胞的功能障碍相关的疾病，并用于生产治疗所述疾病的药物组合物和包含所述肽和其它适合于刺激内皮前体细胞的药剂的药物组合物。所述疾病的实例是高胆固醇血症、糖尿病、内皮介导的慢性炎性疾病、内皮增生包括网状内皮增生、动脉粥样硬化症、冠心病、心肌缺血、心绞痛、年龄相关的心血管疾病、雷诺病、妊娠诱导的张力过高、慢性或急性肾衰竭、心力衰竭、创伤愈合以及继发性病。携带EPO模仿肽单元的化合物特别适用于治疗以红细胞生成素缺乏或红细胞群体低或有缺陷为特征的障碍，并特别适用于治疗任何类型的贫血和中风。这样的药物组合物可任选包含药学上可接受的载体，以便采取用于预定给药过程的组成。例如在WO 2004/101611中(被本文通过参考引入)描述了合适的输送方法和载体以及添加剂。
在携带TPO模仿肽单元(具有激动剂活性)的化合物的情况下，化合物可以用于血小板生成素的所有适应症。它们因而可以用于预防和治疗由TPO介导的疾病，例如血液病症，包括血小板减少症，粒细胞减少症和贫血，和治疗血液学恶性肿瘤。因而，本发明也提供了治疗遭受对血小板生成素激动剂治疗敏感的病症的患者的方法，其包括，给所述患者施用治疗有效剂量或量的本发明化合物，后者携带具有血小板生成素激动剂活性的肽单元。
实施例 A.超价物化合物的概念的解释 超价分子的概念应通过实施例进行解释。图13显示了根据本发明的简单超价分子的实例。通过携带马来酰亚胺基的双功能PEG部分，将两个连续的二价肽进行N末端连接。选择半胱氨酸作为PEG载体单元的反应附着位点。
然而，超价分子可包含超过两个连续二价或多价肽单元。图14显示的实例是以具有作为分支单元的中心甘油单元的载体单元为基础，并包含三个连续的二价肽。再次将半胱氨酸用于连接。图20显示了使用HES作为聚合物载体单元的实例。修饰HES，使它携带与肽单元的SH基起反应的马来酰亚胺基。根据该实例，将所有的附着位点结合于肽单元。然而，小的PEG单元(如3至10kD)也可占据至少一些附着位点。
如上解释的，超价物概念还可以扩展为多价的树枝状聚合物，其中树枝状的和/或聚合物载体单元连接于大量连续的二价肽。例如，树枝状分支单元可以以聚甘油为基础(请参见Haag 2000，在此通过参考引入)。
在图15中显示的实例是基于具有树枝状分支单元的载体单元的超价分子，其含有六个连续的二价肽。
超价分子的其它实例包含具有淀粉或葡聚糖的载体单元，其中使用如高碘酸来氧化载体单元，以包含大量醛官能团。在第二步中，许多二价肽附着于载体单元，并一起形成最终分子。请注意，可将甚至几百个(如50至1000个、优选150至800个、更优选250至700个)肽单元偶联至载体分子，如HES。但是，也可以将少得多的肽单元结合到HES分子上，如图所示，尤其在偶联EPO模仿肽时。待偶联的肽单元的平均数可以选自约2-1000，2-500，2-100，2-50，优选2-20和最优选2-10，这取决于肽和待结合的受体。
图16证实了简单的生物可降解的超价分子的概念。通过两个双功能PEG部分，将两个连续的二价肽进行N末端连接，其中所述的两个双功能PEG部分通过具有中间裂解位置的生物可降解的连接体相连。连接体允许在亚单元中大PEG单元被裂解，从而促进肾脏清除。
与超价效应有关的优点是非常令人惊奇的和意外的。最初担心与大分子缀合可能降低效力。该预期是基于结合速率的假设缺点，后者是由于较大分子的降低的扩散速率。另一个预期是，从与载体结合的几种肽API，不是所有的都能结合受体，可能是由于同时结合的空间问题，或因为受体的数目(这可以通过延伸大分子载体来达到)有限和可能低于肽API的数目。因而，没有预见到对本发明的超价概念观察到的肽API(活性药物成分)效价的增加。
另一方面，由于大分子载体能导入的显著的药物代谢动力学变化，由于整个肽/载体复合物更长的半衰期，体内效力可能提高。该现象也具有下述效应，即难以在体内测定超价效应，因为它是药效学实体，必须分开测定。体外测定因而不仅是足够的，而且可能是清楚地证实超价效应的唯一有用途径。
通过对比肽API(缀合到载体上相对于未缀合)的摩尔量，可以证实本发明所述的超价效应。
在测定体外EPO-样活性的欧洲药典推荐的标准TF-1细胞测定(也参见下文)中，进行实验。基本上，在有多种不同浓度的EPO或EPO-模仿物质存在下，培养TF-1细胞(它们的增殖依赖于EPO-样活性的存在)。使用比色法MTT-测定和光度计测量，定量所得到的细胞数。基于这些数据，可以确定每种给定物质的标准化的剂量-反应关系。
在该测定中，使用EPO和肽AGEM40(见下文)，后者是具有已知的EPO-模仿活性的连续二价肽。
使用AGEM40作为未缀合的肽和作为缀合到大分子载体(在该情况下是平均分子量130kD的羟乙基淀粉；商品来源是pharmacay，Voluven作为血浆代用品)上的肽。该缀合物的构件块大小约是40kD，这意味着平均HES-分子携带约2-5个、优选3-4个肽部分。也可以使用HES 200/0.5。修饰130kD HES后，缀合约4个AGEM 40肽(缀合的分子的分子量150kD)。当使用分子量为200kD的HES时，总计约5个肽单元缀合到HES上(缀合的分子的分子量220kD)。
在图33中所示的对比是基于肽浓度的摩尔对比，无论肽是否缀合。令人惊奇地，效力在增加(EC50在降低，剂量反应曲线位于未缀合的肽的左边)，从而证实了与大分子载体的寡价缀合的积极药效学影响。
因而，独立于预期的药物代谢动力学改进，根据本发明的缀合构思清楚地提高了总活性药物成分(API)的效价且因此提高了它的功效。
这是一个新的机理，可以确定地用于针对EPO-受体的肽，但是潜在地也适用于其它膜结合的药理学靶物，尤其是其它细胞因子受体，例如血小板生成素、G-CSF、白介素等的受体(见上文)。
B.肽单元向羟乙基淀粉缀合的构思 如上所述，根据一个实施方案，多糖(例如羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉)用作肽单元的聚合物载体。为了能将肽单元缀合到载体上，可行地将适当连接基团导入淀粉分子中，以便促进偶联。根据一个实施方案，将氨基导入到淀粉(在下文中，以实例羟乙基淀粉描述)主链上。可以遵循不同的策略。其中的3个将在下文中更详细地解释，在图34中给出了这些方法的概要 1.两步法通过氧化导入醛基，随后还原性胺化 通过几种氧化剂，即高碘酸钠(NaIO4)，和2-碘氧苯甲酸(IBX)，可以实现HES分子的氧化。用NaIO4氧化是长期以来众所周知的，通过打开糖环，产生醛。

可以化学计量地用于将伯醇基团转化成醛，无需打开糖环(见图36，综述见V.V.Zhdankin，Current Organic Synthesis，2005，2，121-145和引用的论文)。更易溶于水的衍生物描述在文献中(Thottumkara，A.P.；Vinod.T.K.，Tetrahedron Lett.，2002，43(4)，569)。
根据一个不同的方案，通过在有氧化剂存在下使含有碳水化合物(优选淀粉分子例如HAS)的原料接触产生氧铵离子(oxoammonium ion)的试剂，或通过使原料直接接触反应物质氧铵离子，氧化碳水化合物(优选淀粉分子，例如HAS)。
氧化剂是例如化学氧化剂，例如次卤化物如次氯酸钠和次溴酸钠或过氧化氢。或者，可以将氧化酶用作氧化剂(见例如WO 99/23240，通过参考引入本文)。
产生氧铵离子的试剂优选地是硝酰基化合物，更优选联-三硝酰基化合物(di-tert-nitroxyl compound)，例如2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO)或其各衍生物。在有化学计量量的适当辅助氧化试剂即次氯酸钠(NaOCl)存在下，用催化量的TEMPO氧化，主要导致伯醇基团向醛的氧化(见图35，在HES的情况下，位置6或羟乙基的末端C原子被转化成醛)，而不打开糖环(文献P.L.Bragd，H.van Bekkum，A.C.Besemer，Topics in Catalysis，2004，27，1-4；综述W.Adam，C.R.Saha-Moller，P.A.Ganeshpure，Chem.Rev.2001，101，3499-3548和引用的论文，A.E.J.de Nooy，A.C.Besemer，H.v.Bekkum，Carbohydrate Research，1995，269，89，EP 1 093467，EP 1 173 409，WO 00/50621，EP 1 077 221，EP 1 149 846)。
或者，替代催化量的TEMPO，可以使用化学计量量活性物质-氧铵化合物(文献J.M.Bobbitt，N.Merbouh，Organic Syntheses，2005，82，80)。其它TEMPO衍生物(即4-乙酰氨基-，4-羟基-TEMPO)也适合，特别是在反应的pH或在水中的溶解度方面。
在氧化后，通过还原性胺化，将得到的醛基转化成胺。可以使用例如氰基硼氢化钠或硼烷-二甲基胺复合物(或其它复合硼烷化合物)作为还原剂。可以使用例如氯化铵或二胺(例如1，3-二氨基丙烷，1，3-二氨基丙烷-2-醇)或赖氨酸作为胺化合物，优选在微酸性pH值下。二胺的使用，会增长HES主链和肽药物之间的间隔物长度、和还原性胺化的产率。
未转化的醛基将被再次还原回起始伯醇。
在有N-羟基琥珀酰亚胺存在下，可以在DMSO中修饰IBX氧化(图39)。在该情况下，直接形成对应的激活的糖醛酸酯。该物质可以用二胺即1，3-二氨基丙烷直接转化成胺化的HES(文献R.Mazitschek，M.M lbaier，A.Giannis，Angew.Chem.2002，114，21，4216-4218；A.Schulze，A.Giannis，Adv.Synth.Catal.2004，346，252-256)。
2.两步法，其中HES被“偶联”试剂激活，并与过量的双功能胺反应。
关于多糖活化描述了几种方法，即1，1′-羰基二咪唑(CDI)(文献G.S.Bethell，J.S.Ayers，M.T.W.Hearn，W.S.Hancock，J.of Chromatography，1981，219，361-372)、表溴醇(1-溴-2，3-环氧-丙烷，或者表氯醇，1-氯-2，3-环氧-丙烷)(文献H.

E.Huchuli，Patent，0253303 B1)、2，2，2-三氟乙烷磺酰氯(tresylchloride)(文献H.P.Jennissen，J.Mol.Recogn.，1995，8，116-124)、氰化溴(BrCN)(文献G.S.Bethell，J.S.Ayers，M.T.W.Hearn，W.S.Hancock，J.of Chroma tography，1981，219，361-372；H.P.Jennissen，J.Mol.Recogn.，1995，8，116-124，H.

E.Huchuli，Patent，EP0253303 B1)。所有试剂的共同之处是，它们会导入高反应性的、且可以在第二步中与过量的双功能亲核物质(如胺即氯化铵(不适用于所有激活剂)或二胺(即1，3-二氨基丙烷，1，3-二氨基丙烷-2-醇)或赖氨酸)反应的官能团。
3.一步法，其中通过添加合适的胺前体来激活HES。
合适的胺前体是例如含卤烷基胺(即作为它们的盐，即溴代乙基铵溴化物)或反应性氮杂环(azaring)即氮丙啶即L-氮丙啶-2-羧酸锂。
所有3种所述策略的共同之处是，向羟乙基淀粉导入氨基后，将这些氨基转化成马来酰亚胺，作为适当连接体的合适实例。这可以例如通过与即激活的ω-马来酰亚胺基羧酸即3-(马来酰亚胺基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯或4-(马来酰亚胺基)丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应来实现。得到的马来酰亚胺代表最终的活性官能团，其用于与携带游离巯基的肽偶联。
1.两步法通过氧化导入醛基，随后还原性胺化。
1.1.伯醇至醛的氧化 通过直接氧化羟乙基淀粉中的伯醇，更确切地葡萄糖的C6-OH和羟乙基，可以形成醛基。用可商业得到的氧化剂如TEMPO或IBX(例如Sigma-Aldrich或Acros)制备这些氧化产物。
a)用高碘酸盐氧化 该方法更详细地描述在C下的实验部分(见下文)。
b)用TEMPO氧化 通过使用2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO)或它的衍生物如4-乙酰氨基-TEMPO或4-羟基-TEMPO和辅助氧化剂如次氯酸钠与溴化钾的混合物(摩尔比TEMPO∶NaOCl∶KBr例如1∶40∶20)，可以在约60min的短反应时间内在pH6-8的磷酸盐缓冲液中氧化伯醇，更高的pH增加反应速率。利用不同摩尔浓度的氧化混合物，尤其辅助氧化剂，可以控制形成的醛的数量。结果，通过该第一步，可以控制载体上锚基团的数量和因此肽药物的数量。
使用试剂Purpald监测优化，所述试剂Purpald只与醛形成紫色加合物，用碘/淀粉复合物还原氧化滴定剩余的次氯酸盐。
使用不同分子量截止值的PES膜，通过超滤技术进行后处理，随后冷冻干燥(文献P.L.Bragd，H.van Bekkum，A.C.Besemer，Topics in Catalysis，2004，27，1-4；综述W.Adam，C.R.Saha-Moller，P.A.Ganeshpure，Chem.Rev.2001，101，3499-3548和引用的论文；A.E.J.de Nooy，A.C.Besemer，H.v.Bekkum，Carbohydrate Research，1995，269，89)。
图35给出了TEMPO介导的伯醇氧化机理的解释性概况。向羧酸的进一步氧化仅仅通过使用过量的氧化剂而发生。
c)用IBX氧化 通过使用氧化剂2-碘氧苯甲酸(IBX)或它的衍生物，可以在作为溶剂的DMSO中氧化HES。1-2h反应时间后，通过加入水(10倍)，可以去除IBX，并通过过滤去除沉淀的IBX。使用不同分子量截止值的PES膜，通过超滤技术进行后处理，随后冷冻干燥。
利用不同摩尔浓度的IBX，可以控制形成的醛的数量。通过该浓度，也可以控制载体上锚基团的数量和因此肽药物的数量。
使用试剂Purpald监测优化，所述试剂Purpald只与醛形成紫色加合物(综述参见V.V.Zhdankin，Current Organic Synthesis，2005，2，121-145和引用的论文)。
图36给出了用TEMPO或IBX氧化伯醇、随后还原性胺化的示意性概述。
图37解释了马来酰亚胺基的导入和与肽药物的缀合。
1.2还原性胺化 a)使用氯化铵的还原性胺化 该方法更详细地描述在C的实验部分(见下文)。
b)使用二胺连接体的还原性胺化 为了增长HES主链和肽药物之间的间隔物长度、和还原性胺化的产率，可以使用二胺(例如1，3-二氨基丙烷，1，3-二氨基丙烷-2-醇)或赖氨酸作为胺源，和不同的还原剂(即氰基硼氢化钠或硼烷-二甲基胺复合物)，进行反应。
实例使用1，3-二氨基丙烷的还原性胺化 在含有与在前面步骤中使用的氧化剂相比10倍过量的1，3-二氨基丙烷的1M磷酸盐缓冲液pH＝5中，进行对氧化的HES的还原性胺化。平衡约90min后，分几部分加入过量的氰基硼氢化钠(Na[CN]BH3)。使用不同分子量截止值的PES膜，通过超滤技术进行后处理，随后冷冻干燥。从优化的HES衍生物中，只使用大于100kDa的摩尔质量范围。
图38给出了用二胺如1，3-二氨基丙烷还原性胺化、随后通过高碘酸盐氧化的HES的实例导入马来酰亚胺基的示例性概述。
伯醇直接氧化成活化的酯 通过直接氧化羟乙基淀粉中的伯醇，更确切地，葡萄糖的C6-OH和羟乙基。对于这些氧化，常见的可商业得到的氧化剂IBX(例如Sigma-Aldrich或Acros)，在有N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)存在下，将醇氧化成OSu-酯，后者可以使用二胺直接转化成胺。
在有HOSu存在下，用IBX氧化-直接转化成胺 通过使用氧化试剂2-碘氧苯甲酸(IBX)或它的衍生物，在有N-羟基琥珀酰亚胺存在下，可以在作为溶剂的DMSO中氧化HES。1-2h后，氧化结束，向形成的OSu-酯中，加入大量过量的(10倍)二胺，例如1，3-二氨基丙烷。
使用不同分子量截止值的PES膜，通过超滤技术进行后处理，随后冷冻干燥。从优化的HES衍生物中，只使用大于100kDa的摩尔质量范围(文献参见R.Mazitschek，M.M lbaier，A.Giannis，Angew.Chem.2002，114，21，4216-4218；A.Schulze，A.Giannis，Adv.Synth.Catal.2004，346，252-256)。
图39解释了伯醇氧化成OSu-酯，随后用二胺直接转化。
2.两步法，其中用“偶联”剂激活HES，并与过量的双功能胺反应。
可以应用几个替代方案，以将胺基导入HES主链上。一些实例 a)用羰基二咪唑(CDI)修饰 将干燥的HES悬浮于无水丙酮中1h。加入CDI，将混合物搅拌1h。或者，可以加入一些盐例如碘化钾作为激活剂/辅亲核物质。离心沉淀HES(2000U/min，＞10min)。倾析后，加入新丙酮，再次离心沉淀HES。用丙酮洗涤3次后，将HES吸收于1M碳酸盐缓冲液pH 10中，加入1，3-二氨基丙烷(pH 11)，将混合物搅拌1h。通过超速离心(MWCO100kD)，处理HES，随后冷冻干燥。
图40解释了用羰基二咪唑、随后用二胺修饰，以导入胺基。
b)用表溴醇(Epi)修饰 将HES溶于一些DMF中，加入表溴醇(或者也可以加入一些盐例如碘化钾作为激活剂/辅亲核物质)，将混合物搅拌过夜。用水(10倍)稀释HES，通过超速离心(MWCO 50或100kD)后处理，随后冷冻干燥。将产物溶于1M磷酸盐缓冲液pH＝7，加入1，3-二氨基丙烷，将混合物搅拌1h。通过超速离心(MWCO 50或100kD)处理HES，随后冷冻干燥。
图41解释了用表氯醇、随后用二胺修饰，以导入胺基。
3.一步法，其中通过加入合适的胺前体来激活HES。
a)用2-氨基乙基溴氢溴化物修饰 将HES溶于DMSO中，加入2-溴代乙基胺氢溴化物(或者也可以加入一些盐例如碘化钾作为激活剂/辅亲核物质)，搅拌过夜(也可以使用一些加热)。用水(10倍)稀释HES，通过超速离心(MWCO 50或100kD)处理，随后冷冻干燥。
图42解释了用2-氨基乙基溴氢氯化物修饰，以导入胺基。
b)用L-氮丙啶-2-羧酸锂修饰 将HES溶于DMSO或缓冲水溶液，加入2-L-氮丙啶-2-羧酸锂(或者也可以加入一些盐例如碘化钾作为激活剂/辅亲核物质)，搅拌过夜。用水(10倍)稀释混合物，通过超速离心(MWCO 50或100kD)处理，随后冷冻干燥。
图43解释了用L-氮丙啶-2-羧酸锂修饰，以导入胺基。
C.本发明的实施方案的详细实施例 I.单体的肽合成 手工合成 通过使用Discover微波系统(CEM)，使用PL-Rink-Amide-Resin(置换率0.4mmol/g)或者预装填Wang-Resins，以0.4mmol规模，进行合成。通过添加30ml哌啶/DMF(1∶3)，并用100W照射3×30秒，完成Fmoc-基团的去除。通过添加在作为偶联添加剂的DMFPyBOP/HOBT/DIPEA中的5倍过量的氨基酸，并用50W照射5×30秒，完成氨基酸的偶联。在所有照射周期之间，借助于冰浴来手工冷却溶液。在脱保护和偶联后，用30ml DMF将树脂洗涤6次。在最后的氨基酸脱保护后，通过与1.268ml加帽溶液(100ml DMSO中，4.73ml乙酸酐和8.73ml DIEA)温育5分钟，将一些肽乙酰化。在裂解之前，用30ml DMF将树脂洗涤6次，并用30ml DCM洗涤6次。通过用5ml的TFA/TIS/EDT/H2O(94/1/2.5/2.5)在惰性气氛中处理120分钟，完成粗肽的裂解。将该溶液过滤到40ml冷乙醚中。沉淀物溶解于乙腈/水(1/1)，并通过RP-HPLC(Kromasil 100 C18 10μm，250×4.6mm)纯化肽。
自动合成 通过使用Odyssey微波系统(CEM)，使用PL-Rink-Amide-Resin(置换率0.4mmol/g)或者预装填Wang-Resins，以0.25mmol规模，进行合成。通过添加10ml哌啶/DMF(1∶3)，并用100W照射10×10秒，完成Fmoc-基团的除去。通过添加在作为偶联添加剂的DMFPyBOP/HOBT/DIPEA中的5倍过量的氨基酸，并用50W照射5×30秒，完成氨基酸的偶联。在所有照射周期之间，通过将氮气起泡通过反应混合物，冷却溶液。在脱保护和偶联后，用10ml DMF将树脂洗涤6次。在最后的氨基酸脱保护后，通过与0.793ml加帽溶液(100ml DMSO中，4.73ml乙酸酐和8.73ml DIEA)温育5分钟，将一些肽乙酰化。在裂解之前，用10ml DMF将树脂洗涤6次，并用10ml DCM洗涤6次。通过用5ml的TFA/TIS/EDT/H2O(94/1/2.5/2.5)在惰性气氛中处理120分钟，完成粗肽的裂解。将该溶液过滤到40ml冷乙醚中，并将沉淀物溶解于乙腈/水(1/1)，并通过RP-HPLC(Kromasil 100 C18 10μm，250×4.6mm)纯化肽。
纯化 使用Nebula-LCMS系统(Gilson)，纯化所有肽。将所有肽的粗料溶解于乙腈/水(1/1)，并通过RP-HPLC(Kromasil 100 C18 10μm，250×4.6mm)纯化肽。流速是20ml/min，并且LCMS分流比是1/1000。
II.分子内二硫桥的形成 用K3[(FeCN6)]环化 溶液1将10mg肽溶于0.1％的TFA/乙腈，并用水稀释直至达到0.5mg/ml的浓度。加入固态碳酸氢铵，直至达到约pH8。
溶液2在第二个小瓶中，用10ml水稀释10ml的0.1％TFA/乙腈。加入固态碳酸氢铵，直至达到pH8，并加入1滴0.1M的K3[(FeCN6)]溶液。
经3小时，将溶液1和溶液2逐滴地加入乙腈/水的混合物(1/1；pH＝8)中。在室温过夜温育混合物，并浓缩混合物和通过LCMS纯化。
用CLEAR-OXTM-树脂环化 将固态碳酸氢铵加入100ml乙腈/水(1/1；0.1％TFA)中，直至达到pH8。通过氩气吹泡30分钟，来除去该溶液的气体。现在加入100mg的CLEAR-OXTM-树脂。10分钟后，加入10mg固态的肽。温育2小时后，过滤溶液、浓缩以及通过LCMS纯化。
环肽的纯化 使用Nebula-LCMS系统(Gilson)，纯化所有肽。将所有肽的粗料溶解于乙腈/水(1/1)或DMSO中，并通过RP-HPLC(Kromasil 100 C18或C8 10μm，250×4.6mm)纯化肽。流速是20ml/min，并且LCMS分流比是1/1000。
III.使用单体进行体外分析 通过BrdU掺入使用TF-1细胞进行增殖分析 将对数生长期中的TF-1细胞(～2.105-1.106细胞/ml；RPMI培养基；20％胎牛血清；补充了青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺；0.5ng/ml白细胞介素3)进行洗涤(以1500rpm离心5分钟，并以500.000细胞/ml的浓度重悬浮于无IL3的RPMI完全培养基中)，并在分析开始之前不使用IL-3进行预培养24小时。第二天，将细胞接种在24孔或96孔平板中，其中通常每个待测试剂使用至少6个浓度和每个浓度4个孔，含至少10.000细胞/孔。每个实验包含对照，其中包括作为阳性对照试剂的重组EPO和作为阴性对照试剂的无添加细胞因子的孔。将肽和EPO对照在培养基中预稀释至期望的浓度，并加入细胞中，在标准培养条件(37℃、5％二氧化碳的气相、水饱和的环境)下开始3天的培养期。在这3天的培养期中，浓度一直指的是培养孔中试剂的终浓度。在该培养期的结束时，加入FdU直至终浓度8ng/ml培养基，并继续培养6小时。然后，加入BrdU(溴脱氧尿苷)和dCd(2-脱氧胞苷)直至它们的终浓度(在培养基中，BrdU的终浓度为10ng/ml，dCD的终浓度为8ng/ml)，并继续另外培养2小时。
在该温育和培养期的结束时，在含1.5％BSA的磷酸盐缓冲盐水中洗涤细胞一次，并以最低液体量进行重悬浮。从该悬浮液中，将细胞逐滴地加入-20℃的70％乙醇中。由此，将细胞在冰上培养10分钟并然后直接进行分析，或可在分析之前将其保存于4℃。
在分析之前，通过离心沉淀细胞，弃去上清液，并将细胞重悬浮在最小量的剩余液体中。然后悬浮细胞，并将其在0.5ml的2MHCl/0.5％triton X-100中温育10分钟。然后，再次沉淀它们，并重悬浮在最小量的剩余液体中，其中在立即重沉淀细胞之前，用0.5ml的0.1N Na2B4O7(pH8.5)稀释细胞。最后，将细胞重悬浮在40μl磷酸盐缓冲盐水(1.5％BSA)中，并分装入两个反应管中，各含20μl细胞悬浮液。将2μl抗-BrdU-FITC(DAKO，克隆Bu20a)加入一个管中，并将2μl对照mIgG1-FITC(Sigma)加入第二管中，室温下开始30分钟的温育期。然后，加入0.4ml磷酸盐缓冲盐水和10μg/ml碘化丙锭(终浓度)。在流式细胞仪中的分析，涉及4C细胞或具有更高倍数性的细胞的部分，和涉及BrdU-阳性细胞的部分，由此确定在细胞周期的相关阶段中细胞的分数。
通过MTT使用TF-1细胞进行增殖分析 将对数生长期中的TF-1细胞(～2.105-1.106细胞/ml；RPMI培养基；20％胎牛血清；补充了青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺；0.5ng/ml白细胞介素3)进行洗涤(以1500rpm离心5分钟，并以500.000细胞/ml的浓度重悬浮于无IL3的RPMI完全培养基中)，并在分析开始之前不使用IL-3进行预培养24小时。第二天，将细胞接种在24孔或96孔平板中，其中每个待测试剂通常使用至少6个浓度和每个浓度4个孔，含至少10.000细胞/孔。每个实验包括对照，其中包含作为阳性对照试剂的重组EPO和作为阴性对照试剂的无添加细胞因子的培养孔。将肽和EPO对照在培养基中预稀释至期望的浓度，并加入细胞中，在标准培养条件(37℃、5％二氧化碳的气相、水饱和的环境)下开始3天的培养期。在这4天的培养期中，浓度一直指的是培养孔中试剂的终浓度。
在第4天，在分析开始之前，在多个孔中制备已知数目的TF-1细胞的稀释系列(在100μl培养基中0/2500/5000/10000/20000/50000个细胞/孔)。这些孔以与测试孔相同的方式进行处理，随后提供校正曲线，由该曲线可以确定细胞数目。在设定这些参照孔后，将来自MTT增殖试剂盒(Promega，CellTiter 96含水非放射性细胞增殖分析)的MTS和PMS在37℃的水浴中解冻，并将100μl PMS溶液加入2ml MTS溶液。将20μl该混合物加入分析板的各个孔中，并在37℃下温育3-4小时。在ELISA读板仪中进行测量E492之前，将25μl的10％的十二烷基硫酸钠水溶液加入各个孔中。
使用基于剂量-反应关系计算(使用程序GraphPad)的如图17和图18所示的图解评价，基于MTT-分析数据确定下列EC50值 下表显示了一些示例性的肽单体的EC50值 SEQ ID NO 2GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG 3284nmol/l SEQ ID NO 4GGTYSCHFGKLTWVCKPQGG 4657nmol/l SEQ ID NO 5GGTYSCHFGRLTWVCKPQGG 5158nmol/l SEQ ID NO 6GGTYSCHFGRLTWVCKKQGG 4969nmol/l SEQ ID NO 7GGTYSCHF-(Als)-LTWVCKPQGG5264nmol/l SEQ ID NO 8GGTYSCHF-(Als)-LTWVCKKQGG4996nmol/l GGTYSCHFGPLTWVCKKQGG 2518nmol/l GGTYSCHFAKLTWVCKKQGG 5045nmol/l GGTYSCHFGGLTWVCKPQGG 无可检测活性 IV.二价EPO模仿肽单元的合成 线性SEQ ID NO 11(AGEM11)的自动合成 通过使用Liberty微波系统(CEM)，使用Rink-Amide-Resin(置换率0.19mmol/g)，以0.25mmol规模进行合成。通过用10ml哌啶/DMF(1∶3)加倍处理、并用50W照射10×10秒，完成Fmoc-基团的除去。通过用作为偶联添加剂的DMF PyBOP/HOBT/DIPEA中的4倍过量的氨基酸进行加倍处理，并用50W照射5×30秒，完成氨基酸的偶联。在所有照射周期之间，通过将氮气吹泡通过反应混合物，冷却溶液。在脱保护和偶联后，用10ml DMF将树脂洗涤6次。在双加倍联周期后，通过用10倍过量的N-(2-氯苄基氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(0.2M的DMF溶液)处理并用50W照射3×30秒，来封闭所有未反应的氨基。在最后的氨基酸脱保护后，通过与0.793ml加帽溶液(100ml DMSO中，4.73ml乙酸酐和8.73ml DIEA)温育5分钟，将肽进行乙酰化。在裂解之前，用10ml DMF将树脂洗涤6次，并用10ml DCM洗涤6次。通过用5ml的TFA/TIS/EDT/H2O(94/1/2.5/2.5)在惰性气氛中处理120分钟，完成粗肽的裂解。将该溶液过滤到40ml冷乙醚中，并将沉淀物溶解于乙腈/水(1/1)，并通过RP-HPLC(Kromasil 100 C18 10μm，250×4.6mm)纯化肽。
图8和图9中描述了线性AGEM11的纯化示意图，Kromasil 100 C1810μm(250×4.6mm)以及为此所用的50分钟内5％乙腈至50％乙腈(0.1％TFA)的梯度。
线性AGEM11的环化
将30mg线性肽溶于60ml溶液A中。将该溶液和60ml DMSO逐滴地加入60ml溶液A(加入总时间3小时)。48小时后，蒸发除去溶剂，并将残余物溶于30ml DMSO/水(1/1)。加入30ml乙酸和17mg碘(溶于DMSO/水(1/1))，并在室温将溶液混合90分钟。然后加入20mg抗坏血酸，并蒸发除去溶剂。将粗的混合物溶于乙腈/水(2/1)，并通过RP-HPLC(Kromasil 100 C18 10μm，250×4.6mm)纯化肽。
溶液A含0.1％TFA的乙腈/水(1/1)。通过加入碳酸氢铵，调节pH至8.0。
在图10和图11中显示了环状AGEM11的纯化参数(环状AGEM11的纯化示意图Kromasil 100 C18 10μm，250×4.6mm，梯度为50分钟内5％至35％乙腈(0.1％TFA))。
V.用于测定EPO活性的体外增殖试验 对对数生长期中的TF1细胞(在含有20％胎牛血清(FCS)和0.5ng/mlIL-3的RPMI培养基中生长的2.105-1.106细胞/ml)进行计数，并对进行分析所需数量的细胞进行离心(5分钟，1500rpm)，然后以300000细胞/ml的浓度重悬浮于含有5％FCS无IL-3的RPMI中。将细胞在这种没有IL-3的(饥饿)培养基中预培养48小时。在开始分析之前，再次计数细胞。
在开始分析之前，立即制备肽和EPO的储液。将肽称重，并溶于含有5％FCS的RPMI直至浓度为1mM、467μM或200μM。EPO储液是10nM或20nM。将292μl这些储液吸移至96孔培养平板的一个孔中，每种待测的物质采用一块板。吸取200μl含有5％FCS的RPMI到各个平板的十七个其它孔中。吸取92μl储液到含200μl培养基的孔中。混合内含物，并将来自该孔的92μl转入下一个孔中，如此类推。以这种方式制备每种物质的稀释系列(18个稀释浓度)，使得各个连续孔中的浓度是其前一孔中的浓度的1∶√10。将来自各个孔的3×50μl转入三个空孔中。以这种方式，一式四份测量各个物质浓度。注意将各个平板的最上行孔和最下行孔留空。
离心预处理的(饥饿的)细胞(5分钟，1500rpm)，并以200,000细胞/ml的浓度重悬浮于含有5％FCS的RPMI中。将50μl细胞悬浮液(含10,000细胞)加入各孔中。注意的是由于加入细胞，孔中物质的终浓度是起始稀释范围的一半。将平板在37℃、5％CO2下温育72小时。开始评价之前，已知量的TF-1细胞向孔中的稀释范围制备如下一式四份吸取0/2500/5000/10000/20000/50000细胞/孔(在100μl的RPMI+5％FCS中)。
为了测量每孔的活细胞的数目，将现成可用的MTT试剂(Promega，Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay)在37℃水浴中解冻。每孔加入20μl的MTT试剂，并将平板在37℃、5％CO2中另外温育1-2小时。加入25μl的10％SDS溶液，并在ELISA读数仪(Genios，Tecan)中测量平板。在电子数据表(Excel)中加工数据，并在Graphpad软件中制图。
在图12中总结了所述数据。
ED50(nM) EPO 0.0158 BB49(单体，SEQ.ID NO 2) 4113 AGEM11(二价)36.73 VI.扩展的肽试验 在扩展试验中，对约200条肽序列测试了它们的EPO模仿活性。
在LIPS-Vario合成仪系统上，合成作为肽酰胺的肽。在专门的MTP合成平板中进行合成，规模是每种肽2μmol。合成使用作为活化试剂的HOBT，遵循标准的Fmoc方案。偶联步骤作为4次偶联进行。每个偶联步骤耗时25分钟，并且每个步骤的过量氨基酸是2.8。用含90％TFA、5％TIPS、2.5％H2O以及2.5％DDT的裂解液进行肽的裂解和脱保护。将含有连接于树脂的成品肽的合成平板保存在96深孔板的顶部。每孔加入50μl裂解液并进行裂解10分钟，重复该过程三次。用200μl裂解液通过重力流入深孔平板中，来洗脱裂解肽。在深孔平板中，对侧链官能团进行另外2.5小时的脱保护。然后，用冰冷的乙醚/己烷来沉淀肽，并进行离心。肽溶于中性水溶液中，并在4℃下过夜温育环化。冷冻干燥肽。
图19显示了对合成的和测试的肽单体的概述。
在体外增殖试验中，测试了肽的EPO模仿活性。如V中所述实施该试验。在每个分析日，制备用于平行测量38条待测肽、1个参照实例和EPO的体外活性的40块微量滴定板。EPO储液是20nM。
结果如图19所示。从结果可知，不满足本发明的共有序列的测试肽并不显示EPO模仿活性。
VII.使用高碘酸盐氧化合成肽HES-缀合物 在图21中显示了反应原理示意图。
所述方法的目的是生产淀粉衍生物(根据该实施例是HES)，其可在温和的水性反应条件下与硫醇基选择性反应。通过马来酰亚胺基来实现这种选择性。
首先用氨基对HES进行官能化，然后将其转变成相应的马来酰亚胺衍生物。通过超滤膜，反应批次没有低分子反应物。产物、中间产物以及浸提物全部是多分散性的。
修饰的HES的合成 通过渗滤获得羟乙基淀粉(

130/0，4或SerumwerkBernburg 200/0，5)，并随后进行冻干。平均摩尔重量是约130kDa，摩尔取代度是0.4，以及200kD，MS＝0.5。
根据在通过参考引入本文的Jacob Piehler的论文″Modifizierung von

für die thermodynamische undkinetische Charakterisierung biomolekularer Erkennung mitoptischen Transducern″1997中所述的用于氨基葡聚糖的合成法，进行合成。通过如Floor等(1989)所述使用高碘酸钠，将二醇羟基部分地、选择性氧化成醛基，来活化HES。在氨的存在下，通过使用氰基硼氢化钠(NaCNBH3)进行还原性胺化，将醛基转变成氨基(Yalpani和Brooks，1995)。
1.1伯醇氧化成醛 a)高碘酸盐氧化/打开 通过高碘酸钠水溶液对糖中1，2-二醇的温和氧化，导入醛基。通过使用不同摩尔浓度的氧化剂，可以控制可利用的锚基的数目和因此载体上肽药物的数量。为了优化方案，使用试剂Purpald监视氧化，所述试剂Purpald只与醛形成紫色加合物。反应时间可以缩短至8-18h。使用的高碘酸盐的量代表着葡萄糖构件块数目的20％(应用180g/mol的葡萄糖构件块质量，DS＝0，4)。通过超滤技术和冷冻干燥进行后处理。使用不同分子量截止值的PES膜，通过超滤技术进行每种聚合产物的纯化，随后冷冻干燥。从优化的HES衍生物中，仅仅使用大于100kDa的摩尔质量范围。
醛分析 定性/半定量可利用醛基的Purpald反应 1.2还原性胺化 a)用氯化铵进行还原性胺化 在下面的步骤中，用氰基硼氢化钠在微酸性pH值氯化铵饱和溶液中的还原性胺化，将导入的醛基转化成胺。
为了优化方案，原料的醛基用Purpald试剂追踪，形成的胺用TNBS追踪。这些实验已经证实，起始阶段后亚胺中间体的形成处于平衡，加入的还原剂偏好亚胺胜过醛。也可以发现，通过几次加入还原剂，总反应时间24小时，进行最佳反应。
通过产物的沉淀或超滤，进行后处理。
胺分析 定性茚三酮反应(Kaiser-试验) 定量使用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)，与氨基葡聚糖相比。
达到的取代度约2.8％。这产生携带一个氨基的一个构件块约6400g/mol的摩尔质量。
马来酰亚氨基丙酰-氨基-羟乙基淀粉(“MalPA-HES”)的合成 导入氨基(存在几种不同的策略，例如见上文)后，用ω-马来酰亚胺烷基(或芳基)酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯导入锚基马来酰亚胺。
合成 用3-马来酰亚氨基丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MalPA-OSu)，将马来酰亚胺基最终导入HES。当在微酸性缓冲液中使用过量(5-10倍)时，转化是定量的(50mM磷酸盐缓冲液，pH 6或7，20％DMF，过夜)。超滤和冻干的产品保藏在-18℃。
分析 使用茚三酮和TNBS来验证氨基的反应。通过谷胱甘肽(GSH)的反应，和用Ellmans试剂(DNTB)以及通过700MHz-1H-NMR-光谱检测过量的硫醇基，来证明所引入的马来酰亚胺基数目。
达到的取代度大约是2％，相当于每个马来酰亚胺构件块8500g/mol(180g/mol葡萄糖构件块质量，MS＝0.4)。
图22显示了马来酰亚胺修饰的HES的1H-NMR光谱(D2O，700MHz)。马来酰亚胺质子(6.8ppm)与端基异构C-H(4.8-5.6ppm)的比例，给出约6,900g/mol的构件块大小(相比较GSH/DNTB试验给出7,300g/mol)。
通过用GSH饱和以及与DNTB反应，可以测量马来酰亚胺基的数量和因此构件块大小。形成的黄色是显著的，且可以容易地定量。这些值会给出5,000至100,000g/mol的可靠的构件块大小，这分别取决于使用的原料、氧化步骤中高碘酸盐的量。通过产物的1H-NMR光谱，已经验证了该方法。在NMR中，从所有端基异构C-H信号和马来酰亚胺环质子的比例，可以定量马来酰亚胺基的含量。

表1通过高碘酸盐氧化，在HES主链中锚基的可达到的实际构件块大小的实例 肽-羟乙基淀粉-缀合物(Pep-AHES) 合成 使用含半胱氨酸的肽，该肽具有游离的N末端(肽-IA)或生物素化N-末端(肽-IB)。整夜过量转化4∶1肽-IA/B混合物(约6当量，MalPA-HES在磷酸盐缓冲液，50mM，pH6.5/DMF 80∶20中)；通过超滤和冻干进行后处理。
分析 在280nm测定UV吸光度，并用GSH/DNTB测定马来酰亚胺基的剩余含量。
肽产率几乎是定量的。几乎检测不到游离的马来酰亚胺基。
对于肽药物的缀合，通过导入游离巯基(例如通过在N-末端导入半胱氨酸残基)，使用肽结构域Ac-GGTYSCHFGKLT-Nal-VCKKQRG-Am(BB68)来建立肽单元，如在 Ac-C(tBu)-GGTYSCHFGKLT-Nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-Nal-VCKKQRG-Am(AGEM40)中。
在微酸性缓冲液中缀合10-50％过量的去保护的肽1-2h。已经优化条件，一方面确保HES主链、马来酰亚胺基和二硫桥是稳定的，另一方面为了观察到定量转化。通过使用不同的马来酰亚胺官能化的HES化合物，AplaGen可以合成多种超价的EPO-模仿肽，其已经在体外表现出超价效应。下面给出了一些实例
表2具有不同肽含量的AGEM40的超价EPO-模仿肽缀合物 在2个步骤中，实现了超价的EPO-模仿肽缀合物的容易的化学分析。首先，在温和水解HES主链后，通过HPLC定量肽含量，其次，在用硫酸完全水解后，通过苯酚的比色试验，测量多糖的量。
图23显示了超价EPO-模仿肽缀合物AGEM40-AHES A2的TFA/水水解的HPLC色谱图(Shimadzu HPLC)。一段时间后，所有含肽的物质的紫外吸光度恒定在最大值，通过与游离肽对比，可以计算出37％的肽含量(理论值39％)。
VIII.其它体外实验 已经在上面描述了下述的许多实验。但是，下面的细节对所述实验和结果进行了总结。主要讨论了人细胞培养和骨髓测定。
一方面，快速的基于细胞系的测定用于检查在优化的早期阶段中优化的肽序列的效力。这些细胞培养测定，仍然象新肽或新批次的快速效力测试一样有效。细胞系TF-1(人细胞)使用的2个端点是增殖(在这里通常测定为在特定时间点的活细胞的数目)，和分化，如在TF-1细胞中的显著的血红蛋白生产。
另外，原代细胞(人骨髓干细胞)用于CFU-测定，它们非常接近体内情形。在使用EPO模仿肽作为肽单元的情况下，它们以更体内样方式给出红细胞生成活性的答案。但是，对它们的操作更复杂，每个测定需要比细胞培养测定更多的时间。
使用人TF-1细胞的测定 TF-1是仅仅响应于某些细胞因子(例如IL3或EPO)而增殖的人红白血病细胞系。另外，TF-1细胞可以响应于EPO而向红细胞系统表型分化。从DSMZ(Braunschweig，Germany)得到TF-1细胞。可以在DSMZ网站dsmz.de得到产品说明书。TF-1是欧洲药典推荐的EPO-活性评估用细胞系。
我们的用于维持培养的内部培养方案 培养基RPMI+P/S+AmphoB+L-Glut.+20％FCS+h-IL-3 1.-500ml RPMI+5ml P/S+5ml AmphoB 2.-200ml RPMI+PS/AmphoB+2，5ml L-谷氨酰胺+50ml FCS＝完全培养基(1个月，4℃) 3.-45ml完全培养基+22，5ul h-IL-3(1周，4℃) 培养维持在200.000-1.000.000细胞/ml，3天，2×105/ml ■2天，3×105/ml ■1天，5×105/ml TF-1增殖测定的设计 在TF-1增殖测定中，在多孔平板中，接种TF-1细胞，在不同浓度的EPO或EPO模仿肽中培养几天。
为了得到最佳结果，在开始测定前，应在没有任何细胞因子(饥饿)的情况下，培养TF-1细胞2天。开始测定后3天，通过测定存活细胞的数目，间接测量细胞增殖。
加入称作MTS的四唑盐试剂，它被还原成有颜色的甲臢。该反应依赖于NADH和NADPH。换而言之，依赖于线粒体活性。分光光度法测量甲臢的量。使用一系列已知细胞数用于校正，可以确定在每种条件下存在的活细胞的绝对数量。在图24中也解释了设计原理。
通过下述方法，可以测定某些试剂在该试验中的活性 1.评估该试剂是否在特定浓度会造成活细胞数目的增加，和 2.在何种浓度，该试剂会发挥半数最大效应(EC50的测定)。
TF-1增殖试验的结果 作为总的评述，必须提到，所有EPO-模仿肽(EMP1和上述脯氨酸修饰的肽)在该试验中表现为部分激动剂，即最大响应比对EPO观察到的响应弱。然而，该试验可以用于测定标准化的图中的右/左移，从而确定优化的结果。
第一个图描述了没有标准化的绝对响应中的该效应。所有其它图显示了标准化的图，这允许从曲线确定EC50值。
在试验中使用了2种参照物质 1)EMP1，公开的具有已知EPO-模仿性质的肽序列(Johnson等，1997). 2)在药房购买的重组人红细胞生成素(EPO)，作为OrthoBiotech产品阿法依伯汀(德国商品名ErypoR) 用黑线绘制这些物质的图，EPO的线是连续的，EMP1的线是虚线。
在接下去的图中显示了脯氨酸-修饰的EPO模仿肽，作为有颜色的连续线。这些修饰的肽描绘了下述序列 1)BB49 Ac-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG 显示出与EMP1相同范围的功效和效价； 2)BB68 Ac-GGTYSCHFGKLT-Nal-VCKKQRG-Am 甚至比EMP1和BB49更有效； 3)AGEM40， Ac-C(tBu)-GGTYSCHFGKLT-Nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-Nal-VCKKQRG-Am 它是二价连续肽，它基于描述改进的特征的BB68序列而设计； 4)AGEM40_HES，它是先进的、高效的和强有力的肽(AGEM40)，根据本发明的超价原理HES化。
这些序列用作特别的实例，以便解释超价原理的益处。
图25描述了与EPO相比单体EPO模仿肽的结果。图25包括的实际吸光度数据图证实了在该试验中一般肽和EPO之间的绝对差异。
图26给出了从拟合的标准化图计算出的EC50值。
图27显示了BB68比BB49改善的作用。使用优化的BB68作为创建根据本发明的肽单元的构件块，会使作用改善2个额外的数量级。这在图27和图28中显示的对应的表中证实。
然后，以优化的密度，将二聚体肽单元偶联到大分子载体HES上。得到的API在摩尔对比上至少与EPO等效，且在质量对比上非常接近于EPO(见下面的图29和图30)。
图30和前面的图和表清楚地证实了超价概念的极大效力。鉴于可以用细胞培养测定达到的精确度，所获得的API在体外至少与EPO等效。因而优于不采用超价概念的任何已知的EPO-模仿肽API。
骨髓测定 骨髓含有造血干细胞，后者具有自我更新和发育成所有类型的血细胞的潜力。另外，骨髓含有能发育成一种或几种血细胞系的定向祖细胞。在这些祖细胞中，几种会发育成红细胞(红细胞系统祖细胞)。
通过将骨髓细胞平板接种在基于甲基纤维素的半固体培养基中，可以证实祖细胞。在有适当细胞因子混合液存在下，祖细胞会增殖和分化，产生特定谱系细胞的集落。髓系祖细胞会发育成粒细胞集落(源自CFU-G)，单核细胞集落(源自CFU-M)，或混合的粒细胞-单核细胞集落(源自CFU-GM)。红细胞系统祖细胞会发育成红细胞的集落。根据红细胞集落的大小，祖细胞称作BFU-E(产生200个细胞或更多细胞的集落)或CFU-E(产生小于200个细胞的集落)。在定向的较早阶段祖细胞可以发育成混合的粒细胞-红细胞-单核细胞-巨核细胞集落。这些早期的祖细胞称作CFU-GEMM。
如果也存在某些不同的细胞因子，EPO会刺激从BFU-E或CFU-E发育红细胞集落。如果没有EPO，红细胞集落不能发育。因此，在甲基纤维素中从同源批次骨髓细胞长出红细胞集落，是EPO活性的衡量。
由于上述过程与体内骨髓中发生的过程非常类似(如果不完全相同的话)，它们是EPO-样活性的优异预测。
骨髓测定的设计 从冷冻管融化人骨髓细胞(商业上从Cryosystems得到，经过血清学检查)，并以固定的细胞密度平板接种在具有给定细胞因子(但是没有EPO)背景的甲基纤维素培养基中。加入不同浓度的EPO或EPO-模仿肽。在37℃温育培养物12-14天。然后，通过显微镜检查，计数髓系和红系集落的数目。
骨髓测定的终点 1.前提没有EPO的培养物应当仅仅产生髓系(白色)而非红系(红色)集落。含有EPO的培养物应当产生红细胞集落的浓度依赖性的增加，和红细胞集落大小的浓度依赖性的增加。
2.如果会造成红细胞集落的浓度依赖性的增加和红细胞集落大小的浓度依赖性的增加，则该肽显示出EPO-模仿活性。但是，肽不应当干扰所得到的髓系集落的数目。
骨髓测定的结果 上述脯氨酸修饰的EPO模仿肽不会刺激髓系集落的形成，但是表现出对红色集落形成的显著活性。定性地，以培养平板的照片显示在图31中，集落的计数记录在图32中。
参考文献
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Wrighton NC，Farrell FX，Chang R，Kashyap AK，Barbone FP，Mulcahy LS，JohnsonDL，Barrett RW，Jolliffe LK，Dower WJ(1996)Small Peptides as Potent Mimetics of theProtein Hormone Erythropoietin.Science 273458-463
Johnson，D.L.，F.X.Farrell，et al.(1997).″Amino-terminal dimerization of anerythropoietin mimetic peptide results in increased erythropotietic activity.″Chemistry and Biology 4939-950.
Haag R，Sunder A，StumbéJF，J.Am.Chem.Soc.(2000)，122，2954.
Roberts，M.J.，M.D.Bentley，et al.(2002).″Chemistry for peptide and proteinPEGylation.″Advanced Drug Delivery Review 54(4)459-476.
Zalipsky S，Qazen，S，Walker II JA，Mullah N，Quinn YP，(1999)“New detachable poly(ethylene glycol)conjugatesCysteine-cleavable lipopolymers regenerating naturalphospholipid，diacyl phosphatidylethanolamine，Bioconjug.Chem.10703-707.
Zhao，X.et al(1997)，″Novel Degradable Poly(ethylene glycol)esters for drugdelivery.″In“Poly(ethylene glycol)chemistry and biological applications；Harris JM，Zalipsky，S.Eds.；ACS Symposium Series 680；American Chemical SocietyWashington DC，1997；458-472.
权利要求
1. 结合靶分子的化合物，其包含
(i)至少2个肽单元，其中每个肽单元包含至少2个能结合靶物的结构域；
(ii)至少一个聚合物载体单元；
其中所述肽单元附着到所述的聚合物载体单元上。
2. 根据权利要求1的化合物，其中所述的靶分子是受体分子，优选跨膜受体。
3. 根据权利要求2的化合物，其中所述肽单元会结合所述受体，并起受体拮抗剂或受体激动剂的作用。
4. 根据权利要求1-3中的一项的化合物，其中所述肽单元的长度是约200个氨基酸或更少，约150个氨基酸或更少，约100个氨基酸或更少或约50个氨基酸或更少。
5. 根据权利要求1-4中的一项的化合物，其中所述的聚合物载体单元载有约50个肽单元或更少，25个肽单元或更少，15个肽单元或更少，10个肽单元或更少，优选2-6个肽单元。
6. 根据权利要求1-5中的一项的化合物，其中所述的载体单元是或包含至少一种天然的或合成的分支的、树枝状的、或线性的聚合物，优选地选自聚甘油，聚唾液酸，葡聚糖，多糖，淀粉或聚乙二醇，或其它生物惰性的水溶性聚合物。
7. 根据前述权利要求1-6中的至少一项的化合物，其中所述的聚合物载体单元包含分支单元，其中所述的分支单元优选地包含甘油或聚甘油。
8. 根据前述权利要求1-7中的至少一项的化合物，其中所述的载体分子的分子量是至少5kD，优选20至200或4000kD，在使用聚乙二醇等更小的载体的情况下，是20-80kD。
9. 根据前述权利要求1-8中的至少一项的化合物，其中所述的载体单元由至少2个聚合物亚单元组成，其中所述的聚合物亚单元通过至少一个生物可降解的共价连接体结构相连接。
10. 根据前述权利要求中的至少一项的化合物，其包含第一生物可降解的载体单元，其中肽单元和第二聚合物载体单元附着到所述的第一聚合物载体单元上。
11. 根据权利要求10的化合物，其中所述的第二载体单元具有比所述第一载体单元低的分子量，且其中优选是HES的所述第一载体单元的约20-50％附着位点被优选是分子量约3-10kD的PEG的所述第二载体单元占据。
12. 根据前述权利要求中的至少一项的化合物，其中使用经修饰的聚合物载体单元。
13. 根据权利要求12的化合物，其中所述肽单元通过共价键附着到所述的聚合物载体单元上，且附着通过所述肽单元的反应性氨基酸、N-末端氨基和/或C-末端羧酸发生，其中所述的反应性氨基酸优选地选自赖氨酸，半胱氨酸，组氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸，且
其中在所述的聚合物载体单元不具有适当的反应性偶联基团的情况下，使用偶联单元来修饰聚合物载体单元，
其中所述的偶联单元优选地选自与所述肽单元的氨基起反应的酰化基团；与所述肽单元上的巯基(硫氢基)、甲硫基、咪唑并或氨基起反应的烷基化基团，最优选马来酰亚胺基；与蛋白的羧基起反应的酯和酰胺形成基团；与所述肽单元上的巯基起反应的二硫化物形成基团，例如5，5′-联硫基双(2-硝基苯甲酸酯)基团，邻吡啶基二硫化物和烷基硫醇基团；与所述肽单元的胍部分起反应的二羰基，例如环己二酮基，和其它1，2-二酮基；与所述肽上的酚基起反应的重氮基；与所述肽单元上的氨基起反应的反应基团，其来自溴化氰与所述聚合物载体单元的反应。
14. 根据权利要求13的化合物，其中所述的反应性氨基酸是半胱氨酸，且其中所述的偶联基团是马来酰亚胺。
15. 根据前述权利要求1-14中的至少一项的化合物，其中至少一个所述肽单元会结合同型二或多聚受体，优选I类细胞因子受体成员，包括红细胞生成素受体(EPOR)，血小板生成素受体(TPOR)，粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)，生长激素受体(GHR)，和促乳素受体(PrR)。
16. 根据前述权利要求1-14中的至少一项的化合物，其中至少一个所述肽单元会结合异型二或多聚受体，例如白介素受体。
17. 根据前述权利要求1-14中的至少一项的化合物，其中所述肽单元会结合和激活EPO受体，并选自EPO模仿肽。
18. 根据权利要求17的化合物，其中至少一个所述肽单元包含特征在于下述氨基酸序列的结合域
X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15
其中每个氨基酸选自天然或非天然氨基酸，且
X6是C，A，E，α-氨基-γ-溴代丁酸或高半胱氨酸(hoc)；
X7是R，H，L，W或Y或S；
X8是M，F，I，高丝氨酸甲基醚或正异亮氨酸；
X9是G或G的保守性交换；
X10是脯氨酸的非保守性交换；
或X9和X10被单个氨基酸替代；
X11选自任意氨基酸；
X12是T或A；
X13是W，1-nal，2-nal，A或F；
X14是D，E，I，L或V；
X15是C，A，K，α-氨基-γ-溴代丁酸或高半胱氨酸(hoc)
条件是，X6或X15是C或hoc。
19. 根据权利要求17的化合物，其中至少一个所述肽单元包含特征在于下述氨基酸序列的结合域
X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15
其中用标准字母缩写表示每个氨基酸，并且
X6是C；
X7是R，H，L或W；
X8是M，F或I；
X9是G或G的保守性交换；
X10是脯氨酸的非保守性交换；
X11独立地选自任意氨基酸；
X12是T；
X13是W；
X14是D，E，I，L或V；
X15是C；
或其中X9和X10被单个氨基酸替代。
20. 根据前述权利要求1-19中的至少一项的化合物，其中所述肽单元的所述结合域(单体结合单元)通过连接体结构、优选连续的肽连接体在内部连接。
21. 根据前述权利要求17-20中的至少一项的化合物，其中至少一个所述肽单元包含选自下组肽的结合域
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GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-1nal-VCKKQRG
其中X是1-萘基丙氨酸，且U是2-萘基丙氨酸，且其中5-氨基乙酰丙酸(Als)是
22. 根据权利要求1-21中的至少一项的化合物在制备药物组合物中的应用。
23. 根据权利要求1-21中的至少一项的化合物在制备药物组合物中的应用，所述化合物携带能结合和激活EPO受体的肽单元，所述药物组合物用于预防或治疗特征在于红细胞生成素缺乏或者低或有缺陷的红细胞群体的障碍，并特别适用于治疗任何类型的贫血和中风。
24. 根据权利要求1-21中的至少一项的化合物在制备药物组合物中的应用，所述化合物携带能结合和激活TPO受体的肽单元，所述药物组合物用于预防或治疗特征在于血小板生成素缺乏的障碍，并特别适用于治疗血液学障碍，包括血小板减少症，粒细胞减少症和贫血。
25. 药物组合物，其包含根据权利要求1-21中的至少一项的化合物和任选包含药学上可接受的载体。
26. 生产根据权利要求1-21中的至少一项的化合物的方法，其包括
(i)制备至少2个肽单元，其中每个肽单元包含至少2个能结合受体的结构域；
(ii)制备至少一个聚合物载体单元；
(iii)将所述肽单元附着到所述的聚合物载体单元上。
27. 根据权利要求26的方法，其中所述肽单元合成为连续肽链。
28. 根据权利要求26或27的方法，其中使用的聚合物载体单元上面具有至少一个化学基团，后者能与所述肽单元上可利用的化学基团反应，然后反应性聚合物载体单元和肽单元一起反应，利用聚合物载体单元的化学基团，形成其共价键合的复合物。
29. 根据权利要求26-28的方法，其中所述的聚合物载体是已经被氧化的修饰的淀粉分子，且其中氨基已经导入淀粉主链中，且其中所述的氨基通过导入连接基、优选马来酰亚胺基而进行修饰。
30. 根据权利要求29的方法，其中如下实现所述氧化通过在有氧化剂存在下，使淀粉分子接触产生氧铵离子的试剂，或通过使原料直接接触反应物质氧铵离子。
31. 根据权利要求30的方法，其中所述氧化剂是化学氧化剂，例如次卤化物如次氯酸钠和次溴酸钠或过氧化氢或氧化性酶。
32. 根据权利要求30或31的方法，其中所述产生氧铵离子的试剂优选地是硝酰基化合物、更优选联-三硝酰基化合物例如2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO)或其衍生物。
全文摘要
本发明涉及具有增强的效力的超价肽化合物。超价化合物包含几个至少二价的肽单元，它们会结合受体靶物并连接到大聚合物载体单元上。
文档编号A61K38/16GK101248086SQ200680030767
公开日2008年8月20日 申请日期2006年6月23日 优先权日2005年6月23日
发明者H-G·弗兰克, U·哈勃尔 申请人:阿普拉根有限公司