疫苗生产方法

专利名称：：疫苗生产方法疫苗生产方法本发明涉及进行碳二亚胺缩合反应的改进方法。具体地说，本发明涉及使用碳二亚胺缩合进行的糖和蛋白的缀合。本发明还涉及含本发明的糖-蛋白缀合物的可制备免疫原性组合物。在免疫学中将细菌荚膜多糖广泛用于预防细菌疾病已有多年。但是，此应用的问题在于免疫应答的T非依赖性特性。因此，这些抗原在低龄儿童中的免疫原性差。此问题已通过将多糖抗原缀合至蛋白载体(T辅助表位源)得以克服，然后可使用该载体激发T依赖性免疫应答，甚至在生命的第一年中也可以。本领域已知多种缀合4支术。可通过如在US4365170(Jennings)和US4673574(Anderson)中所记载的直接还原性胺化法制备缀合物。其它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508。或者，缀合法可借助1-氰基-4-二甲氨基吡啶镜四氟硼酸盐(CDAP)对糖的羟基的活化而生成氰酸酯。活化的糖由此可直接或经间隔(连接)基偶联至载体蛋白上的氨基。例如，氰酸酯可与己二胺或己二酸二酰肼(ADH或AH)偶联，并使用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学法经蛋白载体上的羧基将氨基衍生化的糖缀合至载体蛋白上。这类缀合物描述于PCT公布申请WO93/15760UniformedServicesUniversity以及WO95/08348和WO96/29094。另参见ChuC.等，Infect.Immunity,1983245256。一般来说，蛋白载体上以下类型的化学基团可用于偶联/缀合A)羧基(例如经天冬氨酸或谷氨酸)，可使用碳二亚胺化学法将其与糖部分上的天然或衍生化氨基缀合；B)氨基(例如经赖氨酸)，可使用碳二亚胺化学法将其与糖部分上的天然或衍生化羧基缀合；C)巯基(例如经半胱氨酸)；D)羟基(例如经酪氨酸)；E)咪唑基(例如经组氨酸)；F)胍基(例如经精氨酸)；和G)吲哚基(例如经色氨酸)。在糖上，一般来说以下基团可用于偶联OH、COOH或NH2。醛基可在本领域已知的不同处理(例如高^典酸盐、加酸水解、过氧化氢等)之后产生。直接偶联法糖-OH+CNBr或CDAP—氰酸酯+雨2-蛋白质—缀合物糖-醛+NHr蛋白质—席夫碱(Schiffbase)+NaCNBH3—缀合物糖-COOH+雨2-蛋白质+EDAC—缀合物糖-丽2+COOH-蛋白质+EDAC—缀合物经间隔基(连接物)法直接偶联糖-OH+CNBr或CDAP~>氰酸酯+NH2——NH2—糖——丽2+COOH-蛋白质+EDAC—缀合物糖-OH+CNBr或CDAP—氰酸酯+NH2——SH—糖——SH+SH-蛋白质(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白或在例如通过SPDP修饰蛋白的氨基后获得的天然蛋白)—糖-S-S-蛋白质糖-OH+CNBr或CDAP—氰酸酯+NH2——SH—糖——SH+马来酰亚胺-蛋白质(氨基修饰)~>缀合物糖-COOH+EDAC+NH2——NH2—糖-顺2+EDAC+COOH-蛋白质—缀合物糖-COOH+EDAC+NH2——SH—糖-SH+SH-蛋白质(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白或在例如通过SPDP修饰蛋白的氨基后获得的天然蛋白)—糖-S-S-蛋白质糖-COOH+EDAC+NH2——SH—糖——SH+马来酰亚胺-蛋白质(氨基修饰)-缀合物糖-醛+NH2——NH2—糖——NH2+EDAC+COOH-蛋白质—缀合物可以观察到，碳二亚胺化学法(例如使用EDAC)对于缀合反应是非常便利的，因为其利用了糖和/或蛋白上的基团，这些基团可天然存在，或者可容易地通过衍生化插入。还通过肽键便利地连接各部分。碳二亚胺(RNONR')是具有丙二烯结构的不饱和化合物(Nakajima和Ikada1995BioconjugateChem.6:123-130;Hoare和Koshland1967JBC242:2447-2453)。该化学物质在其反应pH(4.5-6.5)相对不稳定，因此在本领域倾向于将糖/蛋白/碳二亚胺缀合反应的所有组分一起加入。本发明人已发现，根据要缀合的糖和蛋白的性质，通过将反应的某些组分緩慢加入混合物中可获得对疫苗应用较好的最终缀合物特性。这样做可实现一种或多种利益/改善，例如缀合物中的糖产量、缀合物的可除菌过滤性、缀合更好控制、更容易重现和/或防止部分内部交联。因此，在一个实施方案中，提供一种使用碳二亚胺缩合化学法将糖与蛋白载体缀合的方法，其中糖包含(例如作为其重复单元的一部分)或经衍生化后包含氨基和/或羧基，其中蛋白载体包含或经衍生化后包含氨基和/或羧基，所述方法包括以下步骤I)如果蛋白载体同时包含氨基和羧基，而糖包含氨基和羧基之中的任一个，贝'J:a)将糖和进行缀合所需的等份碳二亚胺混合，和b)在35秒至6小时的时间段内加入所需的等份蛋白载体；II)如果糖同时包含氨基和羧基，而蛋白载体包含氨基和羧基之中的任一个，贝寸a)将蛋白载体和进行缀合所需的等份碳二亚胺混合，和b)在35秒至6小时的时间段内加入所需的等份糖；III)如果糖同时包含氨基和羧基，而且蛋白载体也同时包含氨基和羧基，贝'J:a)将蛋白载体和糖混合，和b)在35秒至6小时的时间段内加入进行缀合所需的等份碳二亚胺。发明详述可使用任意合适的碳二亚胺，只要其能够在水性介质中缀合糖和蛋白。在一个实施方案中，碳二亚胺可为EDAC(l-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺)[也称为EDC]，或者可为非EDAC的碳二亚胺。术语"糖"在本说明书全文中可指多糖或寡糖，并包括这二者。糖可指脂多糖(LPS)或脂寡糖(LOS)。在使用之前，多糖(例如细菌多糖)可从来源菌林(例如细菌)分离出来，或者从来源菌林分离出来后通过已知方法(参见例如EP497524和EP497525;ShousunChenSzu等-CarbohydrateResearch第152巻，第7-20页(1986))如微流化法分级至某种程度。多糖可依大小分级，以便降低多糖样品的粘度和/或改善缀合产物的过滤性。寡糖的重复单元较少(典型地为5-30个重复单元)，典型地为水解多糖。术语"蛋白载体"意欲涵盖小肽和大的多肽("OkDa)这二者。显然，大的多肽更有可能同时包含无任何修饰的活性氨基和羧基。就本发明而言，"天然"多糖是指还未经处理的糖，因为处理的目的是降低糖的大小。在正常纯化程序中可使多糖的大小略微降低。这样的糖仍是天然的。只有在多糖已经历分级技术的情况下，多糖才不被看作是天然的。就本发明而言，"以最多x2的因数分级"是指糖经过处理，预期糖的大小下降，但将大小保持在天然多糖大小的一半以上。x3、x4等以相同方式解释，即糖经过处理，预期多糖的大小下降，但将大小保持在天然多糖大小的1/3、1/4等以上。在上述方法的步骤b)中，用于加入所有等份的终组分的35秒至6小时时间_艮可为50秒至5小时、1分钟至4小时、2分钟至3小时、3分钟至2小时、4-60分钟、5-50分钟、6-40分钟、7-30分钟或8-20分钟。所述时间段可为1分钟至5小时、10分钟至4小时、20分钟至3小时、30分钟至2小时、40-90分钟或50-70分钟。该时间可按照要缀合的精确的糖和蛋白作出调整。在一个实施方案中，在所述时间段内以恒定速率(这使用以恒定速率运转的泵便利地实现)向反应混合物中加入等份的终组分(例如碳二亚胺、糖或蛋白)，备选地，可在所述时间段内分阶段加入。尽管这可以多种方式实施，但一般来说，应在整个时间段内加入各份的等分试样。例如，可在前半个时间^歐加入至少1/4的等份试样，在后半个时间段加入至少1/4的等份试样。在整个时间段内，例如以mL或mg量度的等份试样'a，的总量可以4_100个阶段('s，)加入。在一个实施方案中，安排所述阶段，使得在所有阶段都导入相等量(a/s)。在一个实施方案中，所述阶段在整个时间段'p，(以秒计)内均匀地间隔。因此，如果1个阶段在时间段'p，的时间0发生，则随后每个阶段都可在为p/(s-l)的时刻发生。在步骤b)中加入的等份终组分的体积可依据在期望的时间段内等份试样加入到反应中的容易程度而作出调整。碳二亚胺可作为水性溶液(典型地在加入反应物前緩沖至pH7.5)或作为固体粉末(例如在水性介质中易溶的EDAC)加入。当然，如果碳二亚胺是最后加入到反应物中的组分(情形III步骤b)),则可使用緩慢溶解的碳二亚胺，使得全部等份粉末同时被加入到反应物中，但其以和期望的时间段一致的速率溶解，在所述时间段内，所述等份试样可用于反应。如果蛋白和/或糖没有氨基或羧基(或者仅有其中一个)，则其可被衍生化，以给它一个(或给它已没有的另一个)。例如，对于仅含活性羟基的糖(例如脑膜炎球菌血清群A荚膜糖)，应使用该类糖进行氨基或羧基衍生化，使得可进行EDAC缩合。这可在重复亚单元中发生，或者可为仅存在于^t分子末端的基团。应当指出的是，在发生衍生化的情况下，仅部分衍生化所述部分可能有益。对于具有重复单元的糖，靶表位可存在每个重复单元中。因此，如果发生部分衍生化(就此而言指0.5-20%、1-15%、3-12%或5-10%的目标反应基实际上被衍生化)，则其可能具有保留大部分表位和防止太多交联的益处。如果糖或蛋白已经仅具有氨基或羧基(例如伤寒沙门氏菌GSWmo"e//a0^/7/>々Vi糖，其天然具有羧基但不具有氨基)，则可发生衍生化，以给予其另一类基团(即给予Vi氨基)。但是，应当指出的是，由于衍生化可为部分的，所以该作用可将本发明的优选反应由I型变为m型。例如，如果Vi糖与既含氨基又含羧基的蛋白载体缀合，则情形I在步骤b)中緩慢地加入等份蛋白。如果用氨基部分衍生化Vi糖羧基，则其将同时具有羧基和氨基，由此在步骤b)中緩慢加入等份碳二亚胺的情形III变得最相关。衍生化可通过加入异-或同-双官能连接物发生，也可用和以上对糖-蛋白缀合步骤所述相似的化学法(例如CDAP或碳二亚胺化学法)发生。连接物可具有4-20、4-12或5-10个碳原子，并可具有两个活性氨基、两个活性羧基或每种一个(例如己二胺、6-氨基己酸或己二酸二酰肼)。典型地，通过使大量过量的连接物与要衍生化的糖和/或蛋白载体反应发生衍生化。这使得衍生化以最小的部分内交联发生(要不然例如在使用碳二亚胺缩合以氨基衍生化糖上的羧基时，这些部分内交联可能发生)。可使用诸如渗滤的技术容易地去除过量的连接物。在一个实施方案中，糖包含活性羟基作为其重复单元的一部分，所述重复单元经连接物上的氨基被部分衍生化(例如用CDAP化学法)。在另一个实施方案中，糖包含活性氨基作为其重复单元的一部分，所述重复单元经连接物上的羧基被部分衍生化(例如用碳二亚胺化学法)。在又一个实施方案中，糖包含活性羧基作为其重复单元的一部分，所述重复单元经连接物上的氨基被部分衍生化(例如用碳二亚胺化学法)。进行缀合所需的等份碳二亚胺(无论是在本发明反应的步骤a)还是b)中提供)为每mg糖0.01-3mg、0.05-2mg或0.09-1mg碳二亚胺。尽管这些数字针对EDAC为碳二亚胺计算，但如果使用任意其它碳二亚胺，则这些数字可作如下调整将在所述范围中的数字乘以(其它碳二亚胺的分子量)/(EDAC的分子量)。一般来说，在本发明方法中，糖可在步骤b)中以0.5-50mg/ml的终浓度存在。这取决于糖的大小和性质以及任意衍生化的程度。例如，对于寡糖，需要较大的浓度，^f旦对于大的多糖，小得多的浓度可能更适合。如果要用氨基或羧基部分衍生化最末端，则较小的浓度可能是适合的，以减少任意交联的可能性。蛋白载体可在步骤b)中以1-50mg/ml的终浓度存在。在本发明方法中，蛋白载体与糖的初始比率可为5:1至1:5、4:1至1:1或3:1至2:1(重量/重量)。这再次取决于糖的大小和性质以及任意衍生化的程度。盐浓度(例如NaCl)也可以才艮据糖/蛋白的性质改变。通常，在本发明方法的步骤b)中可存在约0.2MNaCl，但可为0-2M、0.1-1M或0.2-0.5M。对于本发明方法的步骤b)中的pH，反应pH可为其中碳二亚胺有活性的任意pH—例如pH4.5-6.5、4.7-6.0或5-5.5。典型地，根据需要通过加入酸/碱在整个反应中保持该pH。EDAC通常在pH7.5是稳定的，但如果缀合需要于更高的pH进行，则已知保持反应中间体稳定的化合物(例如N-羟基琥珀酰亚胺)也可存在于反应的步骤b)中，在此情况下步骤b)中的反应pH可保持在pH4.5-7.5。本发明方法的步骤b)中的反应温度可为4-37。C、10-32°C、17-30°C或22-27。C，典型地在整个反应中保持。在本发明方法中，一旦已在步骤b)中加入全部等份，则反应典型地再保持10分钟至72小时、20分钟至48小时、30分钟至24小时、40分钟至12小时、50分钟至6小时或1-3小时。反应一完成就将pH调节至7.5-9(如果存在N-羟基琥珀酰亚胺，则调节至该范围的较高位)，以回到碳二亚胺的稳定pH范围。一旦缀合，就可通过将其注射到大小排阻层析柱(例如SephacrylS400HR，Pharmacia)上由未反应的组分、游离糖等中纯化出糖-蛋白缀合物。这典型地在2-8。C进行。缀合物可过滤除菌，然后储存。最后，可将有效剂量(例如每剂1-20)dg、2-15)ig或3-10iig糖)的糖-蛋白缀合物与药学上可接受的赋形剂(例如盐或佐剂)一起配制，以生产免疫原性组合物或疫苗。就本发明的糖而言，可使用本发明方法缀合病毒、真菌、细菌或真核来源的任意糖。所述糖可为伤寒沙门氏菌(5^/附^^//00^"')的Vi糖，或者为非Vi的糖。所述糖可为得自流感嗜血杆菌(//.^y/i^加e)b型的荚膜糖Hib，或者可为非Hib的糖。在一个实施方案中，所述糖为细菌荚膜糖，例如从选自以下的细菌获得的糖脑膜炎奈瑟氏球菌(iV.附em'"g"W!'s)血清群A(MenA)、B(MenB)、C(MenC)、W135(MenW)或Y(MenY),月申炎链5泉菌(5Vre/tococcws/"ewmom'ae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、IOA、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F,B群链球菌Ia、Ib、II、ffl、IV、V、VI或VII型，金黄色葡萄球菌OSfap/ococcwsawrews)5型、金黄色葡萄球菌8型、伤寒沙门氏菌(Sa/mo"e〃aO/p/z/)(Vi糖)、霍乱弧菌(P76n'oc/io/erae)或流感嗜血杆菌(H!'My7Me"加e)b型。所述糖的重均分子量可为1000-2000000、5000-1000000、賜00掘000、50000-400000、75000-300000或100000-200000。糖的分子量或平均分子量在本文是指糖在缀合之前用MALLS测量法测得的重均分子量(Mw)。MALLS技术在本领域众所周知，典型地如在实施例2中所述进行。为了对糖进行MALLS分析，可组合使用两个柱CTSKG6000和5000PWxI),用水洗脱糖。4吏用光散射检测器(例如配有488nm的10mW氩激光的WyattDawnDSP)和干涉折射计(例如配有P100传感器和498nm红色滤光片的WyattOtilabDSP)检测糖。在一个实施方案中，糖的多分散性为1-1.5、1-1.3、1-1,2、1-1.1或1-1.05,在与载体蛋白缀合后，缀合物的多分散性为1.0-2.5、1.0-2.0、1.0-1.5、1,0-1.2、1.5-2.5、1.7-2.2或1.5-2.0。所有多分散性测量都通过MALLS进行。所述糖可为天然多糖，或者可以不超过2、4、6、8、10或20倍的因数被分级(例如通过微流化法[例如通过EmulsiflexC-50装置]或其它已知技术[例如热、化学、氧化、超声等方法])。寡糖可显著地被进一步分级[例如通过已知的热、化学或氧化方法]。这些糖中大部分的结构都是已知的(因此无论它们天然具有用于碳二亚胺化学法的任意氨基或羧基，还是具有可用氨基或羧基衍生化的任意其它反应基(参见下表)。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>IX)SNmen/Mcat/Hi在PEA上有在KDO上有OH所述糖可为细菌脂寡糖或脂多糖(参见上表)，例如从选自以下的细菌获得脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌属或粘膜炎莫拉氏菌。LOS可为脑膜炎球菌免疫型L2、L3或L10。它们可通过碱处理其脂质A部分脱毒。在一个实施方案中，MenA荚膜糖至少部分地被O-乙酰化，使得至少50%、60%、70%、80%、90%、950/。或98%的重复单元在至少一个位置净皮0-乙酰化。O-乙酰化例如存在于至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或98。/。的重复单元的至少0-3位。在一个实施方案中，MenC荚膜糖至少部分地被O-乙酰化，使得至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98。/。的(a2—9)-联NeuNAc重复单元在至少一个或两个位置被O-乙酰化。O-乙酰化例如存在于至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95°/。或98%的重复单元的0-7位和/或0-8位。在一个实施方案中，MenW荚膜糖至少部分地被0-乙酰化，使得至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98°/0的重复单元在至少一个或两个位置被O-乙酰化。o-乙酰化例如存在于至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重复单元的0-7位和/或0-9位。在一个实施方案中，MenY荚膜糖至少部分地O-乙酰化，使得至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重复单元在至少一个或两个位置被0-乙酰化。0-乙酰化存在于至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98。/。的重复单元的7位和/或9位。O-乙酰化的百分率是指重复单元含O-乙酰化的百分率。这可在糖缀合前和/或缀合后测得。蛋白载体可为任意肽或蛋白，其中可包含一个或多个T辅助表位。在本发明的一个实施方案中，蛋白载体选自TT、DT、CRM197、TT的C片段、流感嗜血杆菌的D蛋白、肺炎球菌PhtD和肺炎球菌溶血素。载体蛋白可为破伤风类毒素(TT)、破伤风类毒素C片段、破伤风毒素的无毒突变体[注意，就本发明而言，所有这些TT变异体都被看作是相同类型的载体蛋白];白喉类毒素(DT)、CRM197、白喉毒素的其它无毒突变体[例如CRM176、CRM197、CRM228、CRM45(Uchida等，J.Biol.Chem.218;3838-3844，1973);CRM9、CRM45,CRM102、CRM103和CRM107，以及Nicholls和Youle在GeneticallyEngineeredToxins,Frankel编著，MaecelDekkerInc,1992中描述的其它突变；Glu-148缺失或突变为Asp、Gin或Ser和/或Ala158缺失或突变为Gly,以及公开于US4709017或US4950740中的其它突变；至少一个或多个残基Lys516、Lys526、Phe530和/或Lys534的突变，以及在US5917017或US6455673中公开的其它突变；或在US5843711中公开的片段](注意，就本发明而言，所有这些DT变异体都被看作是相同类型的载体蛋白)；肺炎球菌溶血素(Kuo等，(1995)InfectImmun63;2706-13)、OMPC(脑膜炎球菌外膜蛋白一通常由脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B提取一EP0372501);合成肽(EP0378881、EP0427347);热激蛋白(WO93/17712、WO94/03208);百日咳蛋白(WO98/58668、EP0471177);细胞因子；淋巴因子；生长因子或激素(WO91/01146);含多种病原体源抗原的多种人CD4+T细胞表位的人工蛋白(Falugi等，(2001)EurJImmunol31;3816-3824)，例如N19蛋白(Bamldoi等(2004)InfectImmun72;4884-7)、肺炎球菌表面蛋白PspA(WO02/091998)、铁吸收蛋白(WO01/72337);艰难梭菌(Cj骄"7e)的毒素A或B(WO00/61761);流感嗜血杆菌D蛋白(EP594610和WO00/56360);肺炎球菌PhtA(WO98/18930,也称为Sp36);肺炎球菌PhtD(公开于WO00/37105，也称为Sp036D);肺炎球菌PhtB(公开于WO00/37105，也称为Sp036B)或PhtE(公开于WO00/30299,称为BVH-3)。在本发明的再一方面，提供一种通过本发明方法可获得或已获得的糖-蛋白载体缀合物(或免疫原性组合物或疫苗)。疾病的药物中的用途，以及预防或治疗疾病的方法，所述方法包括给予有需要的患者有效剂量的本发明免疫原性组合物或疫苗的步骤。所述用途或方法可用于由选自以下的细菌引起的疾病脑膜炎奈瑟氏球菌(^/V.me"/"g7'"必)，肺炎链球菌(5V，tococcusp"e謂om'ae)、粘膜炎莫拉氏菌(Mcato庁/wfe)、B群链球菌(GroupBStreptococcus)、金黄色葡萄球菌(5Va//^/ococcMSawreuy)、伤寒沙门氏菌(Sa/70we〃a妙/')、霍乱弧菌(FA"'oc/zo/erae)、大肠杆菌(￡.co//)或流感嗜血杆菌(//.本发明的免疫原性组合物还可以包含DTPa或DTPw疫苗(例如疫苗中含有DT、TT以及全细胞百日咳(Pw)疫苗或无细胞百日咳(Pa)疫苗中的任一种(例如含有百日咳类毒素、FHA、pertactin、并任选地含有凝集素(agglutinogin)2和3)。这些组合还可以含有抗乙型肝炎的疫苗(例如其可含乙型肝炎表面抗原[HepB],该抗原任选地吸附到磷酸铝上)。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含Hib、MenA和MenC糖缀合物，或Hib和MenC糖缀合物，或Hib、MenC和MenY糖缀合物，或MenA、MenC、MenW和MenY糖缀合物，其中至少一种、两种或全部糖缀合物按照本发明方法制备。本发明的免疫原性组合物任选地包含额外的病毒抗原，它们赋予如，本发明的免疫原性組合物包含来自麻疹、腮腺炎和风疹(MMR)或麻渗、腮腺炎、风渗和水痘(MMRV)的抗原。在一个实施方案中，这些病毒抗原任选地与组合物中存在的脑膜炎球菌和/或Hib糖缀合物存在于同一容器中。在一个实施方案中，这些病毒抗原被冻干。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物还包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的抗原。所述抗原任选地为来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的外膜嚢泡制备物，如在EP301992、WO01/09350、WO04/14417、WO04/14418和WO04/14419中所描述的。一般而言，本发明的免疫原性组合可包含每种糖缀合物的糖剂量介于0.1-20)Lig、2画10iug、2-6pg或4-7pg糖之间。"(大)约"或"近似"就本发明而言被定义为在给定值的10%左右。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物被调节至或緩冲至pH7.0-8.0、pH7.2-7.6，或大约地或精确地调节至pH7.4。本发明的免疫原性组合物或疫苗任选地在存在稳定剂(例如多元醇，例如蔗糖或海藻糖)的情况下被冻干。任选地，本发明的免疫原性组合物或疫苗包含用量足以增强对免疫原的免疫应答的佐剂。适宜的佐剂包括但不限于铝盐(磷酸铝或氢氧化铝)、角鲨烯混合物(SAF-1)、胞壁酰肽、皂苷衍生物、分枝杆菌细胞壁制备物、单磷酰脂质A、霉菌酸衍生物、非离子型嵌段共聚物表面活性剂、QuilA、霍乱毒素B亚基、聚磷腈和衍生物以及免疫刺激复合物(ISCOM),例如Takahashi等，(1990)Nature344:873-875描述的那些。对于脑膜炎奈瑟氏球菌或HibMen组合，不使用任何铝盐佐剂或根本不使用任何佐剂可能有利。至于所有的免疫原性组合物或疫苗，免疫原的免疫有效量必须凭经验确定。考虑的因素包括免疫原性，免疫原是否与佐剂或载体蛋白或其它载体复合或共价连接、給药途径和要给予的免疫剂量的次数。活性物质在本发明的药物组合物或疫苗中可以变化的浓度存在。典型地，最小浓度的物质是达到其期望用途必需的量，而最大浓度是保持在溶液中或均匀地悬浮在初始混合物中的最大量。例如，最小量的治疗剂任选地提供单一治疗有效剂量。对于生物活性物质，最小浓度是在重构时对生物活性必需的量，最大浓度是不能保持均匀悬浮的浓度。就单剂量单位而言，所述量是单次治疗应用的剂量。一般来说，预期每剂含有1-100吗蛋白抗原，任选地含有5-50吗或5-25吗。例如，缀合物中细菌糖的剂量为10-20pg、5-10吗、2.5-5)ig或1-2.5(ig糖。借助于经系统或粘膜途径给予本发明的疫苗制备物，所述疫苗可用于保护或治疗对感染敏感的哺乳动物(例如人类患者)。人类患者任选地为婴儿(12个月以下)、学步儿童(12-24、12-16或12-14个月)、儿童(2-10、3-8或3-5岁)、青少年(12-21、14-20或15-19岁)或成人。这些给药可包括经肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或经粘膜给予口/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。优选鼻内给予治疗肺炎或中耳炎的疫苗(可更有效地预防肺炎球菌的鼻咽部带菌，由此减弱在其最早期的感染)。尽管本发明的疫苗可作为单剂给予，但其组分也可同时或在不同时间一起共给予(例如，如果疫苗中存在糖，则这些糖可在与给予细菌蛋白疫苗相同的时间或在其后l-2周单独地给予，用于实现对彼此而言最佳的协同免疫应答)。除了单一给药途径以外，还可使用2种不同的给药途径。例如，病毒抗原可ID(皮内)给予，而细菌蛋白可IM(肌20内)或IN(鼻内)给予。如果存在糖，则其可IM(或ID)给予，细菌蛋白可IN(或ID)给予。另外，本发明的疫苗可IM给予，用于初次免疫，以及IN给予，用于加强免疫。疫苗制剂一4殳i也描述于VaccineDesign("Thesubunitandadjuvantapproach"(PowellM.F.&NewmanM丄编著)(1995)PlenumPressNewYork)。脂质体中的嚢化由Fullerton在美国专利4,235,877描述。本发明的再一方面是一种制备本发明的免疫原性组合物或疫苗的方法，所述方法包括以下步骤将通过本发明方法制备的本发明的MenA和MenC糖与还没有按照本发明制备的MenW和MenY以及药学上可接受的赋形剂混合。本发明人意将本文的术语"包含"和"含有"在每种情况下都可任选地分别被"包括"和"由……组成"替换。本专利说明书中提及的所有参考文献或专利申请都在此引入作为参考。本发明在随附的实施例中阐述。以下的实施例使用标准技术进行，这些技术对本领域技术人员而言是熟知的和常规的，另外详述的除外。这些实施例是说明性的，并不是对本发明的限制。实施例实施例1—多糖缀合物的制备实施例la—按照本发明制备脑膜炎球菌MenA和MenC荚膜多糖缀合物MenC-TT缀合物使用天然多糖(按MALLS测量超过150kDa)生产，或稍微微流化。MenA-TT缀合物使用按实施例2的MALLS方法测量超过60kDa的天然多糖或稍微微流化的多糖生产。分级通过使用勻浆器EmulsiflexC-50装置的微流化进行。然后多糖通过0.2滤器过滤。为了将MenA荚膜多糖经间隔基与破伤风类毒素缀合，使用以下方法。通过偶联化学法进行多糖和间隔基(ADH)的共价结合，借助于偶联化学法，多糖在可控的条件下被氰化剂l-氰基-4-二甲氨基-吡啶镜四氟硼酸盐(CDAP)活化。间隔基通过其肼基与氰化PS反应，以在间隔基和多糖之间形成稳定的异脲键。用新鲜制备的100mg/mlCDAP的乙腈/水(50/50(体积/体积))溶液处理10mg/ml的MenA(pH6.0)[3.5g]溶液，以获得CDAP/MenA比率为0.75(重量/重量)。1.5分钟后，pH升至pH10.0。3分钟后，加入ADH，以获得ADH/MenA比率为8.9。溶液的pH降至8.75，保持此pH继续反应2小时(温度保持在25°C)。将PSAAH溶液浓缩至其初始体积的1/4，然后使用截流分子量IOkDa的FiltronOmega膜以30倍体积的0.2MNaCl渗滤，过滤保留液。在缀合(碳二亚胺缩合)反应前，对纯化的TT溶液和PSAah溶液进行稀释，以达到10mg/ml的PSAAH浓度和10mg/ml的TT浓度。将EDAC(l-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺)加入PSah溶液(2g糖)，以便达到0.9mgEDAC/mgPSAah的最終比率。将pH调节至5.0。用振动泵(在60分钟内)加入纯化的破伤风类毒素，以达到2mgTT/mgPSAah。所得溶液在+25。C于搅拌下放置60分钟，以获得120分钟的最终偶联时间。通过加入1MTris-HClpH7.5(1/10终体积)中和溶液，于+25。C放置30分钟，然后于+2。C至+8。C放置过夜。使用10|im滤器澄清缀合物，并使用SephacrylS400HR柱(Pharmacia,Sweden)纯化。用10mMTris画HCl(pH7.0)、0.075MNaCl平衡柱子，缀合物(约660mL)上柱(+2。C至+8。C)。根据280nm光密度的变化选择洗脱合并液。当吸光度增加至0.05时开始收集。继续收集，直至Kd达到0.30。缀合物于+20。C经过滤除菌，然后储存于+2。C至十8。C。所得缀合物的多糖:蛋白比率为l:2-l:4(重量/重量)。为了将MenC荚膜多糖经间隔基与破伤风类毒素缀合，使用以下方法。通过偶联化学法进行多糖和间隔基(ADH)的共价结合，借助于偶联化学法，多糖在可控的条件下被氰化剂l-氰基-4-二甲氨基-吡啶镜四氟硼酸盐(CDAP)活化。间隔基通过其耕基与氰化PS反应，以在间隔基和多糖之间形成稳定的异脲键。用新鲜制备的100mg/mlCDAP的乙腈/水(50/50(体积/体积))溶液处理20mg/ml的MenC(pH6.0)[3.5g]溶液，以获得CDAP/MenC比率为1.5(重量/重量)。1.5分钟后，pH升至pH10.0。在活化pH加入5MNaCl，以达到2MNaCl的终浓度。3分钟后，加入ADH,以获得ADH/MenC比率为8.9。溶液的pH降至8.75,继续反应2小时(保持在25°C)。将PSCAH溶液浓缩至最低150mL，然后使用截流分子量10kDa的FiltronOmega膜以30倍体积的0.2MNaCl渗滤，过滤保留液。在缀合反应前，用0.2MNaCl稀释纯化的TT溶液和PSCah溶液(2g规模)，以获得15mg/ml的PSCah浓度和20mg/ml的TT浓度。将纯化的破伤风类毒素加入PSCAH溶液，以便达到2mgTT/mgPSCAH。将pH调节至5.0。用振动泵(在IO分钟内)加入EDAC(16.7mg/ml的Tris0.1MpH7.5溶液)，以达到0.5mgEDAC/mgPSCAH的最终比率。所得溶液在+25。C于搅拌和pH调控下放置liO分钟，以获得120分钟的最终偶联时间。然后通过加入1MTris-HClpH9.0(1/10终体积)中和溶液，于+25。C放置30分钟，然后于+2。C至+8。C^:置过夜。使用10pm滤器澄清缀合物，并使用SephacrylS400HR柱(Pharmacia,Sweden)纯化。用10mMTris-HCl(pH7.0)、0.075MNaCl平衡柱子，缀合物(约460mL)上柱(+2。C至+8。C)。根据280nm光密度的变化选择洗脱合并液。当吸光度增加至0.05时开始收集。继续收集，直至Kd达到0.20。缀合物于+20。C经过滤除菌，然后储存于+2。C至+8°C。所得缀合物的多糖:蛋白比率为l:2-l:4(重量/重量)。进行在10-45分钟内加入EDAC的各种实验一在每种情况下均获得良好品质的MenC缀合物。但是，如果最后将TT载体緩慢加入MenC-ADH+EDAC混合物，则产生无法纯化的凝胶-缀合物。还进行了将EDAC—齐加入反应中的实验，但缀合物的最终TT/PS比率(2.7/1)(重量/重量M氐于经其中在10分钟内加入EDAC的反应获得的缀合物(3.3/l);而且，相对于所检测的通过其中在IO分钟内加入EDAC的反应制备的缀合物的抗原性，otTT和otPS抗原性均较低。关于多糖衍生化的近似百分率的说明MenCAH:在用ADH进行CDAP处理后，约3.47%的羟基被ADH衍生化(估计每个重复单元有2个可用羟基)。对于MenA:约11.5%的羟基被ADH衍生化(认为每个重复单元仅有1个可用羟基)。实施例lb—肺炎球菌荚膜PS3多糖缀合物的制备1)PS03-TT^方法PS03-TT^208通过Emulsiflex分级给PS称重(以10%理论含水量为准)。将天然PS以初始浓度3mg/ml在2MNaCl中溶解过夜。分级前，用5pm截流滤器澄清天然PS的-容&。在活化步骤前使用匀浆器EMULSIFLEXC-50装置降低多糖的分子量和粘度。分级效率取决于循环压力、活塞补给压力和总循环次数。为了提升分级效率(并因此降低总循环次数)，用具有固定几何形状的室(MicrofluidicsF20Y-0.75|um互作室)替换Emulsiflex的匀化室。分级的目标是降低PS的分子量和粘度，而其抗原性没有关键下降。以6000±500psi进行尺度降低，之后在处理过程中进行粘度检测。当达到2.0±0.2cp的目标时停止分级。分级的PS经0.22|Lim过滤在Millipak40膜(截流0.22mm)上以10ml/分钟的流速过滤分级的PS。TTf汴生化于25。C在持续搅拌条件下在T。控制的水浴中进4亍衍生化步骤。将TT稀释在NaCl0.2M中，以获得25mg/ml的TT终浓度。将ADH以固体形式加入到TT溶液中，以达到0.2M终浓度。在全部ADH溶解后，用HCl将溶液设定在pH6.2±0.1。然后向TT/ADH溶液中加入EDAC，以达到0.02M终浓度。用HCl将pH设定在6.2土0.1,并在1小时内保持在pH调控下。在衍生化步骤后，用NaOH升高pH至pH9.5，以终止反应。在2小时内使溶液处于pH调控下，然后进行渗滤步骤。TTAH衍生物经渗滤以去除未反应的ADH和EDAC副产物。在centramate膜(0.09m2，10kDa截流分子量)上进行渗滤。溶液对20体积的0.2MNaCl透析。通过在渗滤5、10、15和20倍体积后定量透过液中的ADH(TNBS测定)进行渗滤步骤的跟踪。经0.22pm过滤最后在0.22iLim截流膜(Mmipack40)上以10ml/分钟的流速过滤TTAH。然后将过滤的TTah儲存于-70。C。PS3-TTAH缀合物处理条件如下初始PS3浓度2mg/ml的2MNaCl溶液，初始TTAH/PS3比率1.5/1(重量/重量)，EDAC浓度0.5mg/mgPS,TT浓度10mg/ml的0.15MNaCl溶液。用2MNaCl稀释50mgPS3,以获得2mg/ml的PS终浓度。用0.2MNaCl稀释纯化的TTah溶液，以获得10mg/ml的浓度。用HC1将PS3溶液调节至pH5。将EDAC以固体形式加入到PS3溶液中，以便达到0.5mgEDAC/mgPS的终浓度。用HC1将pH调节至5.0±0.05，在11分钟内手动加入TTah(等^f分试样/分钟)。所得溶液于+25。C在搅拌和pH调控下温育109分钟，以获得120分钟的最终偶联时间。然后，通过加入1MTris-HClpH7.5中和溶液，并在+25。C放置30分钟。最后用5膜澄清缀合物，并注射到SephacrylS々OOHR柱上。2)PS03國TT生处理PS03^-TT215通过Emulsiflex分级同上。用0.22nm过滤分级的PS同上。PS3衍生化于25。C在持续搅拌条件下在T。控制的水浴中进行衍生化步骤。用2MNaCl稀释PS3，以获得3mg/ml的PS终浓度。将PS溶液设定在pH6.0,然后加入CDAP(0.25mg/mgPS,以100mg/ml溶解在乙腈/WFI混合物中)。用NaOH升高pH至pH9.5，然后加入ADH(8.9mgADH/mgPS，以100mg/ml溶解在0.2MNaCl中)。将pH保持在9.5，并在60分钟内保持调控。衍生化的百分率等于2.4%(2.4mgADH/100mgPS)。这可用已知技术检测TNBS用于评价ADH;DMAB或间苯二酚(Monsigny等，(1988)Anal.Biochem.175,525-530)用于PS定量。在此情况下，TNBS剂量为228吗/ml，PS剂量为5250吗/ml。已知ADH的分子量为174.2,PS3的重复单元的分子量为338.27(具有1个C00H和4个OH),有1.3iamolADH/15.52iamol重复单元，或1.3jimolADH/62.08pmol活性羟基。2.09%的PS3羟基为ADH修饰的羟基。PS3AH衍生物经渗滤以去除未反应的ADH和CDAP副产物。在UFP-30-C-H24LA膜(42cm2，30kDa截流分子量)上进行渗滤。溶液对20倍体积的0.2MNaCl透析。通过在渗滤5、10、15和20倍体积后定量透过液中的ADH(TNBS测定)进行渗滤步骤的跟踪。经0.22nm过滤最后在0.22|Lim截流膜(Millipack40)上以10ml/分钟的流速过滤PSAH。然后将过滤的PS3AH储存于4。C。PS3AH-TT缀合物处理条件如下初始PS3浓度2mg/ml的2MNaCl溶液，初始TT/PS3AH比率1.5/1(重量/重量)，EDAC浓度0.5mg/mgPS,TT浓度10mg/ml的0.15MNaCl溶液。用0.2MNaCl稀释50mgPS3AH，以获得2mg/ml的PS终浓度。用0.2MNaCl稀释纯化的TT溶液，以达到10mg/ml的浓度。用HCl将PS3AH溶液调节至pH5。将EDAC以固体形式加入到PS3ah溶液中，以便达到0.5mgEDAC/mgPS的终浓度。用HC1将pH调节至5.0±0.05,在10分钟内用实验振动泵加入TT。所得溶液于+25。C在搅拌和pH调控下温育110分钟，以获得120分钟的最终偶联时间。然后，通过加入1MTris-HClpH7.5中和溶液，并在+25。C放置30分钟。最后用5膜澄清缀合物，并注射到SephacrylS400HR柱上。3)PS03^-TT处理PS3^-TT217通过Emulsiflex分级同上。用0.22nm过滤分级的PS同上。PS3衍生化如对215缀合物一样。渗滤如对215缀合物一样。经0.22nm过滤如对215缀合物一样。PS3AH-TT缀合物处理条件如下初始PS3浓度2mg/ml的2MNaCl溶液，初始TT/PS3ah比率1.5/1(重量/重量)，EDAC浓度0.5mg/mgPS，TT浓度10mg/ml的0.15MNaCl溶液。用2MNaCl稀释50mgPS3AH，以获得2mg/ml的PS终浓度。用0.2MNaCl稀释纯化的TT溶液，以获得10mg/ml的浓度。混合PS3ah和TT溶液，用HCl调节至pH5。将EDAC溶解Tris1MpH7.5緩冲液中。每分钟加入40)ulEDAC(10分钟，以达到EDAC/PS比率(0.5mgEDAC/mgPS))。所得溶液于十25。C在搅拌和pH调控下温育110分钟，以获得120分钟的最终偶联时间。然后，通过加入1MTris-HClpH7.5中和溶液，并在+25。C放置30分钟。最后用5pm膜澄清缀合物，并注射到SephacrylS400HR柱上。4)PS03M-TT处理PS3M-TT218通过Emulsiflex分级同上。用0.22fxm过滤分级的PS同上。PS3衍生化于25。C在持续搅拌条件下在T。控制的水浴中进行衍生化步骤。用2MNaCl稀释PS3，以获得3mg/ml的PS终浓度。加入固体形式的EDAC，以达到0.1mg/mgPS的EDAC/PS比率。在完全溶解后，将溶液的pH设定在5。然后使用振动泵在44分钟内加入ADH(8.9mgADH/mgPS,以100mg/ml溶解在0.2MNaCl中)(尽管如此仍存在过量的ADH，直接加入应当也是可以的)。将pH保持在5.0±0.1，并在120分钟(44'+76')内保持调控。通过使用氢氧化钠增加pH至7.5终止反应。衍生化的百分率等于3.7%(mgADH/mgPS)。TNBS剂量为220吗/ml，PS剂量为5902吗/ml，因此有1.26pmolADH/17,44)iimol重复单元(，moI活性COOH基团)。因此，7.22%的PS3羧基为ADH修饰的COOH基团。渗滤PS3AH衍生物经渗滤以去除未反应的ADH和EDAC副产物。在UFP-30-C-H24LA膜(42cm2，30kDa截流分子量)上进行渗滤。溶液对23倍体积的0.2MNaCl透析。通过在渗滤5、10、15和20倍体积后定量透过液中的ADH(TNBS测定)进行渗滤步骤的跟踪。经0.22pm过滤最后在0.22iam截流膜(Millipack40)上以10ml/分钟的流速过滤PSAH。然后将过滤的PS3ah儲存于4°C。PS3AH-TT缀合物处理条件如下初始PS3ah浓度2mg/ml的2MNaCl溶液，初始TT/PS3AH比率1.5/1(重量/重量)，EDAC浓度0.5mg/mgPS，TT浓度10mg/ml的0.15MNaCl溶液。用0.2MNaCl稀释50mgPS3AH，以获得2mg/ml的PS终浓度。用0.2MNaCl稀释纯化的TT溶液，以获得10mg/ml的浓度。将PS3AH和TT溶液混合在一起。用HC1将pH调节至5.0±0,05。在IO分钟内手动加入EDAC(每分钟加入相等部分的等份试样)。所得溶液于+25。C在搅拌和pH调控下温育110分钟，以获得120分钟的最终偶联时间。然后，通过加入1MTris-HClpH7.5中和溶液，并在+25。C放置30分钟。最后用5pm膜澄清缀合物，并注射到SephacrylS400HR柱上。结论使用碳二亚胺化学法在缀合步骤中制备不同的缀合物。在反应溶液中加入的最后组分可为TT蛋白或EDAC试剂。加入时间对所得的缀合物可能有一定影响。PS3MTT215和217缀合物使用相同的组分和条件制备这两种缀合物。这两种缀合物中加入最后组分的方式是不同的。PS3AHTT217缀合物产生的产物满足体外标准。该产物通过在IO分钟内加入EDAC制备。但是，PS3ahTT215缀合物无法在无菌膜上过滤。对于此缀合物，在反应介质中加入的最后组分是TT(在IO分钟内)。这两种缀合物的最终TT/PS比率明显不同(0.98/1对0.50/1)。如果首先向PSah(同时具有活性氨基和羧基)加入EDAC，则这可导致多糖上存在的肼基和羧基内部交联，因此可在于IO分钟内加入TT后产生更多具有更差的最终比率的交联缀合物。对PS3AHTT217缀合物未观察到该作用。通过在10分钟内加入EDAC使TT掺入完成得较好，这可能归因于较低的内部交联以及PS3ah的肼基和蛋白的羧基之间较好的相互交联。对218缀合物而言，由于PS3EDAC衍生化仅部分衍生化多糖(以保持大部分多糖表位的完整性)，又同时存在活性氨基和羧基，因此这是在最终缀合步骤中緩慢加入EDAC也有益的原因。但是，在最终缀合步骤中緩慢加入TT对其中TT被ADH衍生化(并包含氨基和羧基)的208缀合物是有益的，而PS3留下其天然-OH和-COOH活性基团作为其重复亚基的一部分。将EDAC加入到PS3中没有以上交联作用，緩慢加入衍生化TT所得的缀合物具有良好的体外特征一参见下文。体外特征:<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*相对于208缀合物实施例lc一本发明的伤寒沙门氏菌Vi多糖缀合物的制备通过Emulsiflex分级给PS称重(以15%理论含水量为准)。将天然PS以初始浓度7mg/ml在WFI中溶解过夜。在分级前，用10|nm截流滤器以50ml/分钟流速澄清天然PS的溶液。在活化步骤前使用匀浆器EMULSIFLEXC-50装置降低多糖的分子量和粘度。分级效率取决于循环压力、活塞补给压力和总循环次数。为了提升分级效率(并因此降低总循环次数)，用具有固定几何形状的室(MicrofluidicsF20Y-0.75|im互作室)替换Emulsiflex的匀4匕室。分级的目标是降j氐PS的分子量和粘度，而其抗原性没有关键下降。以15000±500psi进行尺度降低，之后在处理过程中进行粘度检测。当达到5.0±0.3cp的目标时停止分级。分级的PS经0.22|im过滤在Millipak40膜(截流0.22mm)上以10ml/分钟的流速过滤分级的PS。过滤的分级PS储存于-20。C。多糖Vi的衍生化于25。C在搅拌下将1.5g分级的ViPS溶解在EPI中(5mg/ml)。将13.35gADH(8.9mgADH/mgPS)加入PS溶液。在完全溶解后，用1NHC1调节pH至pH5.0±0.05。加入固体形式的EDAC(O.lmg/mgPS)。将溶液置于25。C达60分钟。然后通过加入1MTris-HClpH7.5中和溶液，并在25。C放置至少30分钟(最长2小时)。使用TNBS剂量(mgADH/100mgPS)估计衍生化水平为4.55%。TNBS剂量为200pg/ml,PS剂量为4034吗/ml;因此，有0.0697pmolADH/16.46jumol重复单元(分子量245)。有1.3pmolADH/16.46pmolVi上的活性COOH基团，因此7%的ViCOOH基团是ADH修饰的COOH基团。PSViAH衍生物经渗滤以去除未反应的ADH和EDAC副产物。在centramate膜(0.09m2，10kDa截流分子量)上进行渗滤。溶液对20倍体积的0.2MNaCl透析。通过在渗滤3、5、10和20倍体积后定量透过液中的ADH(TNBS测定)进行渗滤步骤的跟踪。经0.22nm过滤最后在0.22pm截流膜(Millipack40)上以10ml/分钟的流速过滤PSViAH。然后将过滤的PSVUh于+2/十8。C储存最多4天。PSViAH-TT缀合物处理条件如下初始PSViAH浓度2mg/ml的0.2MNaCl溶液，初始TT/PSViAH比率2.5/1(重量/重量)，EDAC浓度:0.25mg/mgPS，TT浓度:10mg/ml的0.2MNaCl溶液。用0.2MNaCl稀释1gPSViAH，以获得2mg/ml的PS终浓度(糖醛酸剂量)。用0.2MNaCl稀释纯化的TT溶液，以获得10mg/ml的浓度。将TT加入到PSVUh溶液中，以便达到2.5mgTT/mgPS的最终比率。用1NHCl将pH调节至5.0±0.05。然后加入EDAC溶液(7.5mg/ml的0.1MTrispH7.5溶液)(在10分钟内并使用振动泵)，以达到0.25mgEDAC/mgPSViAH。所得溶液于+25。C在搅拌和pH调控下温育50分钟，以获得60分钟的最终偶联时间。然后，通过加入1MTris-HClpH7.5中和溶液，并在+25。C放置30分钟。缀合物于4。C转移，并在层析步骤前于持续緩慢搅拌下放置过夜。纯化在SephacrylS400HR上洗脱前，使用10Kleenpak滤器澄清缀合物。流速固定在100ml/分钟。然后将缀合物注射到SephacrylS400HR上，基于Kd值收集合并液。使用以下标准进行合并液收集由280nm的OD=0.05开始收集，当Kd=0.22时终止。过滤除菌在过滤前，使母液回到室温。然后缀合物在Opticap4"除菌膜上过滤。流速固定在30ml/分钟。分析所得缀合物的最终TT/PS比率(重量/重量)为2.44/1，游离PS含量为3.7%,ocPS/ocPS抗原性为58%。实施例ld—其它多糖缀合物的制备通过Chu等(InfectionandImmunity1983，40(1);245-256)开发的偶联化学法进行流感嗜血杆菌(Hib)PRP多糖与TT的共价结合。通过加入CNBr并于pH10.5温育6分钟活化HibPRP多糖。降低pH至pH8.75,加入己二酸二酰肼(ADH)，再继续温育90分钟。使用1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)经碳二亚胺缩合将活化的PRP偶联至纯化的破伤风类毒素。向活化的PRP中加入EDAC，以达到0.6mgEDAC/mg活化的PRP的最终比率。调节pH至5.0，加入纯化的破伤风类毒素，以达到2mgTT/mg活化的PRP。所得溶液在温和搅拌下放置3天。在通过0.45pm膜过滤后，在用0.2MNaCl平衡的sephacrylS500HR(Pharmacia,Sweden)柱上纯化缀合物。MenC-TT缀合物使用天然多糖(按MALLS测量超过150kDa)生产，或稍微微流化。使用按实施例2的MALLS法测量超过60kDa的天然多糖或稍樣"鼓流化的多糖生产MenA-TT缀合物。使用按MALLS(参见实施例2)测得约100-200kDa的已分级多糖生产MenW和MenY-TT缀合物。使用匀浆器EmulsiflexC-50装置通过微流化分级。然后通过0.2|um滤器过滤多糖。活化和直接偶联如在WO96/29094和WO00/56360中所述进行。简单地讲，将在2MNaClpH5.5-6.0中10-20mg/ml浓度的多糖与CDAP溶液(IOOmg/ml在乙腈/WFI(50/50)中新鲜制备的溶液)混合，达到0.75/1或1.5/1的最终CDAP/多糖比率。1.5分钟后，用氬氧化钠将pH升高至pH10.0。3分钟后，加入破伤风类毒素，以达到1.5/1(MenW)、1.2/1(MenY)、1.5/1(MenA)或1.5/1(MenC)的蛋白/多糖比率。反应持续1-2小时。在偶联步骤后，加入甘氨酸至7.5/1的甘氨酸/PS(重量/重量)最终比率，调节pH至pH9.0。混合物放置30分钟。使用10|LimKleenpak滤器澄清缀合物，然后加到SephacrylS400HR柱上，使用洗脱緩冲液150mMNaCl、10mM或5mMTrispH7.5。在Opticap4除菌膜上过滤临床批。所得缀合物的平均多糖:蛋白比率为1:1-1:5(重量/重量)。实施例2——使用MALLS测定分子量将检测器偶联至HPLC大小排阻柱，从该柱洗脱出样品。一方面，激光散射检测器检测大分子溶液在16个角度散射的光强度，另一方面，在线放置的干涉折射计允许测定洗脱的样品量。根据这些强度可以确定溶液中大分子的大小和形状。重量的平均分子量(Mw)定义为所有物质的重量乘以它们各自的分子量的和再除以所有物质的重量和。a)重均分子量-Mw-b)数均分子量-Mn-c)均方根半径-尺-和112是平方半径，定义为:2、2Rw或(r)w=~",''——,w，r2(-m广是发散中心i的质量，-r广是发散中心i和大分子重力中心之间的距离)。d)多分散性定义为比率-Mw/Mn-。通过将脑膜炎球菌多糖加到联用的两个HPLC柱(TSKG6000和5000PWxI)上，并借助于MALLS对脑膜炎球菌多糖进行分析。将25(il多糖加到所述柱上，并用0.75ml过滤水洗脱。使用光散射检测器(WyattDawnDSP，配有10mW的488nm氩激光)和干涉折射计(WyattOtilabDSP,配有P100传感器和498nm红色滤光片)检测多糖。所有样品的分子量多分散性和回收率都使用Astra4.72软件中的1级多项式拟合通过Debye法计算。实施例3—评价连接物在MenACWY缀合疫苗中的MenA中作用的临床实验在1:1:1:1:1随机实验中，将单剂不同的MenACWY疫苗制剂给5组25名15-19岁的青少年受试者施用。测试的制剂为Fl—MenACWY与破伤风类毒素缀合，MenA缀合物中含有AH(ADH)间隔基(按照实施例1制备)一5/5/5/5吗F2—MenACWY与破伤风类毒素缀合，MenA缀合物中含有AH间隔基(按照实施例1制备)一2.5/5/2.5/2.5|ugF3—MenACWY与破伤风类毒素缀合，MenA缀合物中含有AH间隔基(按照实施例1制备)一5/5/2.5/2.5吗F4—MenACWY与破伤风类毒素缀合，在任何缀合物中都没有间隔基一5/5/5/5吗对照组一MencevaxACWY接种后30天，取受试者血样。血样用于评价疫苗接种后1个月SBA-MenA、SBA-MenC、SBA-MenW135和SBA-MenY应答者的百分率。疫苗应答定义为1)对于初始血清阴性受试者一在接种后1个月时的抗体效价>1/32,或2)对于初始血清阳性受试者一抗体效价>接种前抗体效价的4倍。结果如在下表中所示，在MenA缀合物中使用间隔基导致抗MenA的免疫应答增加。加入AH间隔基时应答者的百分率由66%升高至90-95%。这可反映为SBAGMT从4335增加至10000，以及GMC由5增加至20-40。令人惊奇的是，使用AH间隔基还导致抗MenC的免疫应答增加，这可由应答者的百分率增加和SBAGMT的增加看出。当引入间隔基时，还可以看到抗MenY(6742-7122)和抗MenW(4621-5418)的SBA-GMT增加。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>实施例4—评价连接物在MenACWY缀合疫苗中的MenA和MenC缀合物中的作用的临床实验在1:1:1:1:1随机实验中，将单剂不同的MenACWY疫苗制剂给5组25名15-19岁的青少年受试者施用。测试的制剂为Fl—MenACWY与破伤风类毒素缀合，MenA和MenC缀合物中含有AH间隔基(按照实施例1制备)一2.5/2.5/2.5/2.5|tigF2—MenACWY与破伤风类毒素缀合，MenA和MenC缀合物中含有AH间隔基(按照实施例1制备)一5/5/2.5/2.5吗F3—MenACWY与破伤风类毒素缀合，MenA和MenC缀合物中含有AH间隔基(按照实施例1制备)一5/5/5/5吗F4—MenACWY与破伤风类毒素缀合，MenA缀合物中含有AH间隔基(按照实施例1制备)一5/5/5/5吗对照组一MencevaxACWY接种后30天，取受试者血样。血样用于评价疫苗接种后1个月SBA-MenA、SBA-MenC、SBA-MenW135和SBA-MenY应答者的百分率。疫苗应答定义为1)对于初始血清阴性受试者一在接种后1个月时的抗体效价>1/32，或2)对于初始血清阳性受试者一抗体效价>接种前抗体效价的4倍。结果如在下表中所示，MenC缀合物中引入AH间隔基导致抗MenC的免疫应答增加。这表现为SBAGMT由1943增加至4329，以及抗PSCGMC由7.65增加至13.13。抗MenA、MenW和MenY的良好免疫应答得以保持。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>权利要求1.一种使用碳二亚胺缩合化学法将糖与蛋白载体缀合的方法，其中所述糖包含(例如作为其重复单元的一部分)或经衍生化后包含氨基和/或羧基，其中所述蛋白载体包含或经衍生化后包含氨基和/或羧基，所述方法包括以下步骤I)如果所述蛋白载体同时包含氨基和羧基，而所述糖包含氨基和羧基之中的任一个，则a)将糖和进行缀合所需的等份碳二亚胺混合，和b)在35秒至6小时的时间段内加入所需的等份蛋白载体；II)如果所述糖同时包含氨基和羧基，而所述蛋白载体包含氨基和羧基之中的任一个，则a)将蛋白载体和进行缀合所需的等份碳二亚胺混合，和b)在35秒至6小时的时间段内加入所需的等份糖；III)如果所述糖同时包含氨基和羧基，而且所述蛋白载体也同时包含氨基和羧基，则a)将蛋白载体和糖混合，和b)在35秒至6小时的时间段内加入进行缀合所需的等份碳二亚胺。2.权利要求1的方法，其中步骤b)中的所述时间段为50秒至5小时、1分钟至4小时、2分钟至3小时、3分钟至2小时、4-60分钟、5-50分钟、6-40分钟、7-30分钟或8-20分钟。3.权利要求1的方法，其中步骤b)中的所述时间段为1分钟至5小时、10分钟至4小时、20分钟至3小时、30分钟至2小时、40-90分钟或50-70分钟。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述碳二亚胺是EDAC(l-乙基-3-(3-二曱基-氨基丙基)碳二亚胺)或非EDAC的碳二亚胺。5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述进行缀合所需的等份碳二亚胺为每mg糖0.01-3mg、0.05-2mg或0.09-1mg碳二亚胺。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述糖和/或蛋白载体经衍生化后包含氨基或羧基。7.权利要求6的方法，其中所述衍生化是通过加入异双官能连接物或同双官能连接物实现的。8.权利要求7的方法，其中所述连接物具有4-12个碳原子。9.权利要求7或8的方法，其中所述连接物具有两个活性氨基。10.权利要求7-9中任一项的免疫原性组合物，其中所述连接物是ADH。11.权利要求7或8的方法，其中所述连接物具有两个活性羧基。12.权利要求7或8的方法，其中所述连接物在其一端具有活性氨基，而在其另一端具有活性羧基。13.权利要求7-12中任一项的方法，其中所述衍生化通过使大量过量的连接物与要衍生化的糖和/或蛋白载体反应而发生。14.权利要求7-13中任一项的方法，其中所述糖包含作为其重复单元的一部分的活性羟基，所述糖经连接物上的氨基被部分衍生化。15.权利要求14的方法，其中所述糖用CDAP化学法部分衍生化。16.权利要求7-13中任一项的方法，其中所述糖包含作为其重复单元的一部分的活性氨基，所述糖经连接物上的羧基被部分衍生化。17.权利要求16的方法，其中所述糖用碳二亚胺缩合化学法部分衍生化。18.权利要求7-13中任一项的方法，其中所述糖包含作为其重复单元的一部分的活性羧基，所述糖经连接物上的氨基被部分衍生化。19.权利要求18的方法，其中所述糖用碳二亚胺缩合化学法部分衍生化。20.权利要求1-19中任一项的方法，其中步骤b)中的所述等份碳二亚胺、糖或蛋白载体使用泵以恒定速率加入。21.权利要求1-19中任一项的方法，其中步骤b)中的所述等份碳二亚胺、糖或蛋白载体在所述时间段内分阶段加入。22.权利要求21的方法，其中在前半个时间段加入至少1/4等份试样，在后半个时间段加入至少1/4等份试样。23.权利要求21或22的方法，其中等份试样'a，以4-100个阶段's，力口入。24.权利要求23的方法，其中在每个阶段加入a/s等份试样。25.权利要求23或24的方法，其中如果1个阶段在时间段'p，的0时发生，则随后的每个阶段都在为p/(s-l)的时刻发生。26.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述糖在步骤b)中以0.5-50mg/ml的终浓度存在。27.权利要求1-26中任一项的方法，其中蛋白载体与糖的初始比率为5:1至1:5、4:1至1:1或者3:1至2:1(重量/重量)。28.权利要求1-27的方法，其中在步骤b)中存在的盐例如NaCl的浓度为0-2M、0.1-1M或0.2-0.5M。29.权利要求1-28中任一项的方法，其中蛋白载体在步骤b)中以1-50mg/ml的终浓度存在。30.权利要求1-29中任一项的方法，其中步骤b)中的反应pH保持在pH4.5-6.5、4.7-6.0或5-5.5。31.权利要求1-29中任一项的方法，其中在步骤b)的反应中还存在N-羟基琥珀酰亚胺，步骤b)中的反应pH保持在pH4.5-7.5。32.权利要求1-31中任一项的方法，其中步骤b)中的反应温度保持在4-37。C、10-32°C、17-30。C或22-27。C。33.权利要求1-32中任一项的方法，其中所述等份试样在步骤b)中已全部加入后，将反应再保持10分钟至72小时、20分钟至48小时、30分钟至24小时、40分钟至12小时、50分钟至6小时或1-3小时。34.权利要求1-33中任一项的方法，其中所述反应一完成就将pH调节至7.5-9。35.权利要求1-34中任一项的方法，所述方法包括后续步骤c)，其中糖-蛋白缀合物在大小排阻层析柱上纯化。36.权利要求1-35中任一项的方法，所述方法包括后续步骤d)，其中糖-蛋白缀合物经过滤除菌。37.权利要求1-36中任一项的方法，所述方法包括后续步骤e)，其中将有效剂量的糖-蛋白缀合物与药学上可接受的赋形剂一起配制，以生产免疫原性组合物或疫苗。38.权利要求1-37中任一项的方法，其中所述糖是细菌荚膜糖，所述细菌荚膜糖例如从选自以下的细菌获得脑膜炎奈瑟氏球菌(Wmem'"g/"tfc)血清群A、B、C、W135或Y，月申炎链球菌(&re/tococcwp"ezwzo"/ae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、IOA、IIA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F,B群链球菌Ia、Ib、II、III、IV、V、VI或VII型，金黄色葡萄球菌(5Vap/zy/ococcwsawrew"5型、金黄色葡萄球菌OStop/zy/ococcwsawrei^)8型、伤寒沙门氏菌CSa/wo"e〃a(Vi糖)、霍乱弧菌(^n'oc/zo/erae)或流感嗜血杆菌(H/"/7we"zae)b型。39.权利要求1-38中任一项的方法，其中所述糖的重均分子量为1000-2000000、5000-1000000、10000-500000、50000-400000、75000-300000或100000-200000。40.权利要求1-39中任一项的方法，其中所述糖是天然多糖，或者以不超过x10的因数被分级(例如通过微流化法)。41.权利要求1-37中任一项的方法，其中所述糖是细菌脂寡糖或脂多糖，例如从选自以下的细菌获得脑膜炎奈瑟氏球菌(TV.附e刚'"g/"cfo)、流感嗜血杆菌(//.f"/7we"加e)、大肠杆菌(五.co")、沙门氏菌属(5^/,we〃")或粘膜炎莫拉氏菌(Mca旨r/zato)。42.权利要求1-41中任一项的方法，其中所述蛋白载体包含一个或多个T辅助表位。43.权利要求1-42中任一项的方法，其中所述蛋白载体选自TT、DT、CRM197、TT的C片段、流感嗜血杆菌的D蛋白、肺炎球菌PhtD和肺炎球菌溶血素。44.一种糖-蛋白载体缀合物，其通过权利要求1-43中任一项的方法获4寻。45.—种免疫原性组合物或疫苗，其通过权利要求1-43中任一项的方法获得。46.权利要求45的免疫原性组合物或疫苗在制备用于预防或治疗疾病的药物的用途。47.—种预防或治疗疾病的方法，所述方法包括给予有需要的患者有效剂量的权利要求45的免疫原性组合物或疫苗。48.权利要求46或47的用途和方法，其中所述疾病是由选自以下的细菌引起的脑膜炎奈瑟氏球菌(Wmem'"&^fo)，肺炎链球菌()SVrepfococcus/wewmow/ae)、津占膜炎莫氏4立菌(Mcatorr/za/^),B群链球菌(GroupBStreptococcus)、金黄色葡萄球菌(5"to//2y/ococcwsawrew》、伤寒沙门氏菌0Sa/附o"e〃a/)^/h')、霍乱弧菌(KZ6n'oc/zo/erae)、大肠杆菌(￡.co/Z)或流感嗜血杆菌(//./w/7wewzae)。全文摘要本申请公开了一种使用碳二亚胺缩合化学法进行糖-蛋白缀合反应的改进方法。根据所涉及的糖或蛋白载体的性质，可通过向反应混合物中缓慢加入其中一种反应组分，改善所得缀合物的品质。本申请还提供免疫原性组合物，其中包含通过所公开的方法制备的糖-蛋白缀合物。文档编号A61K39/095GK101247827SQ200680031178公开日2008年8月20日申请日期2006年6月23日优先权日2005年6月27日发明者P·迪维维耶,R·L·比曼斯申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司