T细胞受体和编码该受体的核酸的制作方法

专利名称：T细胞受体和编码该受体的核酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及构成MAGE-A4143.15i肽特异性的、HLA-A2402限制性 T细胞受体(TCR)a链的多肽、编码该多肽的核酸、构成上述TCR的卩 链的多肽、编码该多肽的核酸、由上述构成a链的多肽与构成p链的 多肽构成的T细胞受体、含有上述核酸的重组核酸、含有该重组核酸 的栽体、导入了上述核酸或栽体的细胞、以及含有上述栽体或细胞作 为有效成分的抗癌药。
背景技术：
细胞毒性T细胞(CTL)中有可通过特异性的T细胞受体(T cell receptor,以下简称为TCR)识别由主要组织相容性抗原基因复合体 (Major histocompatibility gene compler，以下简称为MHC)编码的主要 组织相容性抗原分子(MHC分子，为人时，称为人白细胞抗原(human leukocyte antigen )，以下简称为HLA)与抗原肽的结合物——复合体， 杀伤在细胞表面呈递该复合体的细胞的细胞。因此，该细胞毒反应成 立必须是l)有CTL存在，该CTL具有对靶细胞的HLAI类类型特异 性的TCR, 2)有抗原肽存在，该抗原肽与HLA分子结合形成的复合 体可被TCR识别。
上述抗原肽例如是在哺乳类细胞内合成的抗原等在细胞质中加 工，分解成小的肽而产生，并且与HLA分子締合，呈递于细胞表面。 即，在由很多亚单元构成的蛋白酶体复合体中，蛋白质被分解为含有 8-15个氨基酸的肽，其中的几个通过TAP转运蛋白从细胞质中运输 到内质网中。这些肽如果在内质网中与I类/p2微球蛋白的杂二聚体结 合，则形成三分子复合体，较稳定，通过高尔基体转运到细胞表面。 表达肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原蛋白的肿瘤细胞应该可以将被T 细胞识别的HLA限制性抗原肽呈递于细胞表面。
已知HLAI类分子主要有HLA-A、 -B、 -C,与它们结合并呈递的 抗原肽含有8-10个氨基酸，并且根据各个HLA分子的不同而具有不 同的一定的结构上的特征。例如，与世界上频率最高的HLA-A2.1分子结合的肽最为已知的是自N末端第2号为Leu、且C末端具有Leu 或Val的含9-10个氨基酸的肽。与以日本人为代表的亚洲人种中较多 的HLA-A24分子结合的肽最为已知的是自N末端第2号为Tyr、Phe、 Met、 Trp其中之一，且C末端具有Leu、 Ile、 Trp、 Phe其中之一的 含有9-10个氨基酸的肽。
目前，抗原肽已经得到鉴别的胂瘤抗原有与HLA-A1结合的 MAGE-A1、 MAGE-A3、 MAGE-A4，与HLA-A2.1结合的MAGE-A3、 MART1、酪氨酸酶、gp100、 HER2/neu、 CEA等，与HLA-Cwl结合 的MAGE-A3，与HLA-B44结合的MAGE-A3,与HLA-B37结合的 MAGE-A4，与HLA-A24结合的MAGE-A1、 MAGE-A2、 MAGE-A3、 MAGE-A4、 NY-ESO-l、 CEA、 HER2/neu、酪氨酸酶、|3-连环蛋白 (Catenin )等。其中的大部分是首先将识别肿瘤细胞的I类限制性CTL 进行林化，鉴定该CTL所识别的肿瘤抗原，接着通过遗传工程学方法 发现肿瘤抗原蛋白中的最小单位，再以与HLAI类分子结合的基序相 关的信息为基础，发现最小单位中的肽。或者首先以与上述HLAI类 分子结合的肽中共通的基序结构为基础，发现肿瘤抗原蛋白中的HLA I类分子结合肽，接着利用抗原呈递细胞选择可诱导CTL的抗原肽， 最后通过确认对肿瘤细胞具有毒性的CTL是否被诱导来确定抗原肽。 HLA I类分子被分成几个亚型，其保守亚型的种类在人种之间有 很大差异，世界上HLA-A2最多，白色人种的45。/。是HLA-A2阳性。 该HLA-A2限制性抗原肽的鉴定发展最快。在日本人中，HLA-A2阳 性占40%，观察其亚型则与白色人种相同，HLA-A'0201阳性为20%, 其余的大多是A'0206阳性。与这些亚型结合的肽不同，主要研究的 HLA-A2是HLA-A*0201。在日本人中，HLA-A24阳性占60%以上， 亚洲人种与其它人种相比，HLA-A24阳性率高。因此，HLA-A24限 制性抗原肽的发现对于亚洲人种、特别是日本人，在通过诱导特异性 地作用于肿瘤细胞的CTL、提供对肺瘤治疗有用的CTL方面显示重 要作用。
即使是相同的抗原，HLA不同则其抗原肽也不同，因此，利用 抗原肽诱导CTL较为繁杂。为解决该问题曾进行了各种研究，但尚未 得到另人满意的成果。研究的一个方面是将抗原基因导入来自患者本 身的抗原呈递细胞，利用其进行T细胞诱导的方法。对于抗原呈递细胞，研究了B细胞、巨噬细胞、树状细胞，以作为专门的抗原呈递细 胞而已知的树状细胞为中心，实施了将其以疫苗的佐剂等的形式进行 应用的临床实验。但问题是准备免疫诱导必需量的这些抗原呈递细胞 要花费很多人力。B细胞可以通过EB病毒的活化来大量制备，但是 由于是使用病毒，在安全性上有问题。
作为肿瘤抗原特异性TCR基因，例如克隆了 HLA-A2限制性的 MART1特异性TCR [非专利文献l]、 MAGE-A3特异性TCR [非专利 文献2]、 CAMEL (CTL-黑素瘤识别抗原(CTL-recognized antigen on melanoma))特异性TCR [非专利文献3]、 gpl00特异性TCR [非专利 文献4]、 NY-ESO-1特异性TCR [非专利文献5]、 HLA-24限制性的 WT1 (肾母细胞瘤l)特异性TCR [非专利文献6]、 HLA-Cwl6限制性 的MAGE-A1特异性TCR[非专利文献7]等的基因。
通过将TCR基因导入到任意的CTL中，有望使其具有目标抗原 特异性细胞毒活性。椐此，人们尝试了以MARTI [非专利文献8]、 gpl00 [非专利文献4]和mHAG HA-2抗原[非专利文献9]为耙的TCR 基因治疗。
MAGE-A4是属于癌-睾丸抗原家族的MAGE亚家族的抗原，在各 种癌中表达，并且具有高抗原性(在60%的食道癌、50%的头颈部癌、 24%的非小细胞肺癌、33%的胃癌和21%的何杰金病中显示阳性)，因 此有望作为癌症疫苗疗法的靶抗原。并取得了 HLA-A24限制性的、 MAGE-A4n3-m肽特异性CTL克隆[非专利文献10〗。
非专利文献l: CancerRes，第54巻，第5265-5268页(1994) 非专利文献2: Anticancer Res,第20巻，第1793-1799页(2000) 非专利文献3: Int. J. Cancer，第99巻，第7-13页(2002) 非专利文献4: J. Immunol,第170巻，第2186-2194页(2003) 非专利文献5: J. Immunol,第174巻，第4415-4423页(2005) 非专利文献6: Blood，第106巻，第470-476页(2005) 非专利文献7: Int. Immunol,第8巻，第1463-1466页(1996) 非专利文献8: J. Immunol,第163巻，第507-513页(1999) 非专利文献9: Blood，第103巻，第3530-3540页(2003) 非专利文献10: Clin， CancerRes,第11巻，第5581-5589页(2005)

发明内容
作为识别肿瘤相关抗原的HLA-A24限制性TCR基因，已知有识 别WT1的TCR基因，与HLA-A2.1相比，对其分析研究进展较緩慢， 无法对亚洲人种、特别是日本人的肿瘤治疗提供有用的TCR基因。 因此，人们希望发现识别各种肿瘤抗原的HLA-A24限制性的新型TCR基因。
在生物体内，经由TCR担负细胞毒活性的是具有抗原特异性TCR 的CTL,将其在体外繁殖并应用于癌等疾病的治疗时，这些细胞的使 用、例如采集或放大培养尚存在问题。因此，人们迫切希望能够提供 可用于大量且容易地制备具有所需抗原特异性的CTL的对肿瘤抗原 等具有特异性的TCR基因。
本发明人对于识别肿瘤抗原的CTL进行了深入的研究，结果成功 地从识别肿瘤抗原MAGE-A4的HLA-A24限制性CTL中克隆了编码 TCRa链和P链的cDNA。并且发现，通过向表达HLA-A24分子的 CTL等的细胞中导入由这些cDNA制备的RNA，这些细胞显示 HLA-A24限制性的、MAGE-A4来源肽特异性细胞毒性，从而完成了 本发明。
本发明的第1方案涉及构成HLA-A24限制性的、MAGE-A4143-151 特异性的T细胞受体的多肽、以及具有上述受体的可变区多肽的多肽。
本发明的第2方案涉及HLA-A24限制性的、MAGE-A4143.151特异 性TCR,其特征在于该TCR由本发明第1方案的多肽构成。
本发明的第3方案涉及编码HLA-A24限制性的、MAGE-A4143.151 特异性TCR的核酸，以及编码具有上述受体可变区多肽的多肽的核 酸。
本发明的第4方案涉及重组核酸，该重组核酸含有本发明第3方
案的核酸。
本发明的第5方案涉及栽体，该载体插入了本发明第4方案的重
组核酸。
本发明的第6方案涉及表达HLA-A24限制性的、MAGE-A4143.m 特异性TCR的细胞，其特征在于该细胞导入了本发明第3方案的 核酸，或者用第5方案的栽体转化。
本发明的第7方案涉及抗癌药，其特征在于该抗癌药含有本发明第6方案的细胞或第5方案的栽体作为有效成分。
本发明的第8方案涉及癌的治疗方法，该治疗方法包含施与本发 明第7方案的抗癌药的步骤。
本发明提供编码HLA-A24限制性的、MAGE-A4,43.囚特异性TCR 的a链和p链的核酸。还提供将不具HLA-A24限制性、或者不具有 MAGE-A4143.151特异性的T细胞作为效应细胞使用的肿瘤细胞毒化方 法。上述效应细胞例如在癌的治疗中有用。


图1是表示#2-28细胞、导入RNA的ms69细胞和ms69细胞的四 聚体测定的结果的图。
图2是表示#2-28细胞、导入RNA的CD8阳性细胞和CD8阳性 细胞的四聚体测定的结果的图。
图3是表示#2-28细胞、导入RNA的ms69细胞和ms69细胞的 ELISPOT测定的结果的图。
图4是表示导入RNA的CD8阳性细胞和CD8阳性细胞的 ELISPOT测定的结果的图。
图5是表示#2-28细胞、导入RNA的ms69细胞和ms69细胞的细 胞毒性的图。
图6是表示#2-28细胞、导入RNA的CD8阳性细胞和CD8阳性 细胞的细胞毒性的图。
具体实施例方式
本发明的第1方案涉及构成HLA-A24限制性的、MAGE-A4143.m 特异性T细胞受体的多肽，该多肽具有上述受体的可变区的多肽。上 述多肽有TCRa链和TCR卩链两种，两种链组合，构成HLA-A24限制 性的、MAGE-A4143_151特异性TCR。
上述a链多肽是可与P链一起形成HLA-A24限制性的、 MAGE-A4M3-m特异性TCR的多肽，作为a链可变区的多肽，指具有 选自序列表SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的多肽；序列表SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列中有一至多个氨基酸残基缺失、附加、插入 或置换的多肽中的多肽的多肽。本发明中，来自TCR的a链的多肽含有上述Ct链可变区的氨基酸序列或与其类似的序列作为必须构成成
分。包含含有恒定区的a链全部氨基酸序列(SEQIDNO,l)或与其类似 的序列、即具有一至数个氨基酸残基缺失、附加、插入或置换的氨基 酸序列的多肽是本发明的优选方案之一。
另外，上述卩链多肽是可与a链一起形成HLA-A24限制性的、 MAGE-A4l43.l51特异性TCR的多肽，p链可变区的多肽指具有选自序 列表SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列的多肽；序列表SEQ ID N0.7所 示的氨基酸序列中有至少一个氨基酸残基缺失、不可、插入或置换的 多肽中的多肽的多肽。本发明中，来自TCR的p链的多肽含有上述卩 链可变区的氨基酸序列或与其类似的序列作为必须构成成分。包含含 有恒定区的卩链全部氨基酸序列(SEQ IDNO,2)或与其类似的序列、即 具有一至数个氨基酸残基缺失、附加、插入或置换的氨基酸序列的多 肽是本发明的优选方案之一。
这里，"HLA-A24限制性的、MAGE-A4"3.^特异性TCR"是指特 异性识别具有序列表SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列的肽 (MAGE-A4143.151，以下简称为P143)与HLA-A24分子的复合体、且在 T细胞表面存在该TCR时，使该T细胞具有针对靶细胞的、HLA-A24 限制性的P143特异性细胞毒活性。特异性识别上述复合体可通过公 知的方法确认，优选的方法例如有使用HLA-A24分子和P143进行 的四聚体分析以及ELISPOT测定。通过进行ELISPOT测定，可以确 认在细胞表面表达该TCR的T细胞通过TCR识别靶细胞，该信号传 递至细胞内。上述复合体存在于T细胞表面时，可使该T细胞具有细 胞毒活性，其确认方法也可采用公知方法，优选的方法有例如铬释 放测定等对HLA-A24阳性靶细胞的细胞毒活性的测定。
本发明的多肽可以使用后述的本发明的核酸，通过遗传工程方法 生产。例如，将上述编码a链多肽的核酸、编码p链多肽的核酸两者 导入细胞，通过表达a链、卩链多肽，可以使该细胞表达HLA-A24 限制性的、MAGE-A4143.151特异性TCR,
本发明的第2方案涉及HLA-A24限制性的、MAGE-A4143.15i特异 性TCR，其特征在于该TCR由本发明的多肽构成。上述TCR例如 可使用后述的本发明的核酸，使上述核酸所编码的多肽人为地表达， 由此能够以与天然伴随的生物体成分分离的形态制备，但这并不受本发明特别限定。
本发明的第3方案涉及编码HLA-A24限制性的、MAGE-A4143.151 特异性TCR、或其可变区的核酸。
本发明的核酸是编码具有TCRa链可变区多肽的多肽的核酸、或 者编码具有TCR卩链可变区多肽的多肽的核酸，编码TCR卩链多肽的 核酸或者编码TCR a链多肽的核酸均导入到细胞中时，与 HL A-A24/M AGE-A4143.151复合体特异性结合的分子在上述细胞中表 达。编码具有TCR a链可变区多肽的多肽的核酸包含编码TCR a链多 肽的核酸、编码TCRa链可变区多肽的核酸，而编码具有TCR卩链可 变区多肽的多肽的核酸包含编码TCR |3链多肽的核酸、编码TCR卩 链可变区多肽的核酸。将编码TCRa链多肽的核酸和编码TCR(3链多 肽的核酸、编码TCRa链可变区多肽的核酸和编码TCRp链可变区多 肽的核酸、它们的任意组合导入细胞时，HLA-A24限制性的、 MAGE-A4143.151特异性TCR也在上述细胞中表达。
上述编码a链多肽的核酸可列举含有序列表SEQ ID NO.3所示碱 基序列的核酸、以及在严谨条件下可以与上述碱基序列的核酸或其互 补链杂交的核酸，但这并不限定本发明。编码a链多肽的可变区的核 酸可列举含有序列表SEQ ID N0.6所示的碱基序列的核酸、以及在严 谨条件下可与上述碱基序列的核酸或其互补链杂交的核酸。上述编码 卩链多肽的核酸可列举含有序列表的SEQ IDN0.4所示的碱基序列的 核酸、以及在严谨条件下可与上述碱基序列的核酸或其互补链杂交的 核酸。编码卩链多肽的可变区的核酸可列举含有序列表的SEQ ID N0.8所示的碱基序列的核酸，以及在严谨条件下可与上述碱基序列 的核酸或其互补链杂交的核酸。
这里，严谨条件可列举1989年、Cold Spring Harbor Laboratory 发行，J, Sambrook等人编辑，Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第二版等中记栽的条件。具体来说例如有在0.5%SDS、 5xdenhardt 溶液、含有0.01%改性鲑鱼精子DNA的6xSSC中，与探针一起在65 。C温育12-20小时的条件。与探针杂交的核酸例如在含有0,5%SDS的 O.lxSSC中、在37'C清洗，除去非特异性结合的探针，然后即可进行 检测。
本说明书中的核酸是指单链或双链的DNA、 RNA或DNA-RNA嵌合体、或DNA-RNA杂合双链。核酸的全部或一部分为RNA时， RNA部分的序列可以是将本说明书序列表中的T更换为U。本发明的 优选方案是本发明的编码TCRa链多肽的核酸或者编码TCRa链可
肽的核酸的两种核酸的组合。上述核酸的组合用于在细胞中表达 HLA-A24限制性的、MAGE-A4143.151特异性TCR。
本发明的核酸例如可如下获得。按照常规方法，由HLA-A24限 制性的、MAGE-A4,43-m特异性CTL、例如非专利文献10的克隆#2-28 制备RNA，合成cDNA。以此为模板，使用与编码TCRa链和卩链恒 定区的核酸互补的反义引物进行5'-cDNA末端快速扩增(RACE)。 5，-RACE可按照公知的方法进行，例如可以使用 CapFishing Full-Length cDNA Premix试剂盒(少一 ，-一》公司制)等市售的试剂盒 进行。通过上述方法扩增的DNA整合到质粒栽体中，转化大肠杆菌。 由转化体制备质粒，确定插入的DNA的碱基序列。
通过将所得碱基序列与已知的TCR a链和(3链的基因序列比较， 可以排除通过5'-RACE扩增的与TCR基因无关的DNA。 PCR时，在 碱基序列中产生突变的DNA可能被扩增，因此本发明中优选使用由 多种大肠杆菌克隆确定序列、由其共有序列推定的、上述CTL原本所 具有的TCRa链和P链基因的序列。
具有序列表的SEQIDN0.3所示的碱基序列、编码SEQIDNO.l 的氨基酸序列的TCRa链的核酸，以及具有序列表的SEQIDN0.4所 示的碱基序列、编码SEQ IDN0.2的氨基酸序列的TCRp链的核酸通 过上述方法获得。
本发明中，可以使用由上述方法得到的DNA,也可以化学合成具 有相同序列的核酸使用。
本发明的核酸中，编码与构成TCR的各链可变区相当的部分的核 酸可以与编码其它功能性分子例如编码抗体或受体的核酸中编码恒 定区或胞内区的区域连接。这样构建的新型核酸具有HLA-A24限制 性的、MAGE-A4143_151特异性结合活性，可用于嵌合功能性分子的制 备。
本发明的第4方案是重组核酸，该重组核酸含有本发明的核酸。 上述重组核酸可列举以下核酸附加了在将本发明的核酸导入细胞时，使上述核酸所编码的多肽的翻译成为可能的各种要素的核酸，但 这并不是限定本发明。
含有DNA的本发明的重组核酸可列举具有启动子(例如磷酸甘油 酸激酶启动子、Xist启动子、P-肌动蛋白启动子、RNA聚合酶II启动 子等来自哺乳类的启动子，SV40早期启动子、巨细胞病毒启动子、 单纯疱渗病毒的胸苷激酶启动子、各种反转录病毒的LTR启动子等来 自病毒的启动子)、终止子、增强子或其它的转录控制区域的重组核酸。 并且还可以编码有助于第1发明的多肽翻译的序列(Kozak序列等)。 上述各要素当然是配置在上述功能性协作的位置，以适合由本发明的 核酸进行RNA的转录、多肽的翻译。重组核酸为RNA时，则不需要 这些与控制转录相关的要素。
如后所述，本发明的重组核酸整合到栽体中使用，除此之外还可 以将作为RNA的本发明的核酸直接导入细胞，以此用于TCR表达。 RNA的导入方法可以采用公知的方法，例如可优选使用电穿孔法。
本发明的第5方案涉及插入至少一个本发明的重组核酸的栽体。 上述栽体在使HLA-A24限制性的、MAGE-A4143.151特异性TCR在所 需细胞中表达方面有用。特别优选的方案是(l)插入两种重组核酸的载 体，所述重组核酸是含有编码本发明的TCRa链多肽或具有其可变区 多肽的多肽的核酸的重组核酸，以及含有编码本发明的TCRP链多肽 或具有其可变区多肽的多肽的核酸的重组核酸；以及(2)插入了含有编 码本发明的TCR a链多肽或具有其可变区多肽的多肽的核酸的重组 核酸的载体、与插入了含有编码本发明的TCRp链多肽或具有其可变 区多肽的多肽的核酸的重组核酸的栽体的组合。上述(l)的方案中，编 码TCRa链多肽的核酸与编码TCRI3链多肽的核酸可通过各自的启动 子进行转录、翻译，也可使用内部核糖体进入位点(IRES),用一个启 动子进行转录、翻译。
本发明使用的载体没有特别限定，可根据目的从质粒栽体、病毒 栽体等公知的栽体中选择适当的栽体使用。例如，将上述重组核酸整 合到质粒载体中时，向细胞中的导入可使用磷酸钙法、阳离子脂质体 法(cationic lipid method )、脂质体法、电穿孔法等基因导入方法。
具有感染细胞、导入外来DNA的能力的病毒栽体适合本发明。 本发明中，可以使用反转录病毒载体(包括慢病毒栽体或假型栽体)、腺病毒栽体、腺病毒伴随病毒栽体、疱療病毒栽体等公知的病毒栽体。 插入了本发明的重组核酸的病毒栽体可以在适合各病毒的条件下感 染目标细胞，导入本发明的核酸。具有将插入的外来核酸整合到染色 体上的能力的反转录病毒栽体是本发明的优选。
本发明的第6方案涉及表达HLA-A24限制性的、MAGE-A4143.151 特异性TCR的细胞，其特征在于该细胞中导入了本发明的核酸。 这里，本发明的核酸可以以上述本发明的重组核酸或本发明的载体的 形式导入到所希望的细胞中，本发明的细胞的优选方案可列举导入了 编码TCRa链多肽或具有其可变区多肽的多肽的核酸以及编码TCR卩 链多肽或具有其可变区多肽的多肽的核酸二者的细胞、用本发明的栽 体转化的细胞。上述核酸整合到染色体DNA上的细胞也包含在本发 明中。
TCR在T细胞的抗原识别方面显示重要作用，因此优选的本发明 的方案是导入了本发明的核酸的T细胞。通过上述方法，将本发明的 核酸导入到由生物体采集的T细胞，则可以获得表达HLA-A24限制 性的、MAGE-A4,43.m特异性TCR的T细胞。并且，作为本发明的优 选方案，还可以是将上述核酸导入可分化为T细胞的细胞，然后使细 胞分化为T细胞。可分化为T细胞的细胞例如有造血干细胞、淋巴祖 细胞和T细胞前体细胞。导入了核酸的导入对象细胞无需分成单一的 细胞种类，可以是将含有上述导入对象细胞的细胞集团作为核酸导入 的对象。
上述的含有导入对象细胞的细胞集团可以由人或非人哺乳动物 的例如末梢血、骨髓和脐带血采集，还可根据需要，将T细胞和/或可 分化为T细胞的细胞进行分级并富集，用于本发明。将本发明的导入 了 TCR基因的细胞用于癌等的治疗时，优选该细胞集团由作为治疗 对象的患者本人、或者与患者的HLA型一致的供体采集。
将本发明的核酸导入细胞的方法没有特别限定，可以采用公知的 方法。导入本发明的核酸或本发明的重组核酸时，例如可以采用电穿 孔法、磷酸4丐法、阳离子脂质体法、脂质体法。通过使用市售的转染 试剂[例如Transl T系列(Mirus公司制)、GeneJuice (Novagene公司制)、 RiboJuice(Novagene z〉司制)、Lipofectamine (Invitrogene公司制),可 以简便且高效率地导入核酸。使用本发明的栽体时，如果栽体是质粒栽体，则可以按照与上述核酸同样的方法导入到细胞中。栽体如果是 病毒栽体，则可以选择与各种病毒栽体相适应的感染方法。特别是使
用反转录病毒栽体时，通过使用重组纤连蛋白片段CH-296 (TAKARA BIO公司制)，可以对各种细胞、特别是反转录病毒栽体的感染效率低 的造血干细胞进行高效率的基因导入。
本发明的第7方案涉及抗癌药，其特征在于该抗癌药含有本发 明第5方案的栽体或第6方案的细胞作为有效成分。由本发明第6方 案得到的、导入本发明的核酸的T细胞对于呈递HLA-A24分子和 MAGE-A4143_151肽的细胞显示细胞毒活性。因此，上述本发明的载体 和细胞可用作对于表达MAGE-A4的癌的抗癌药。
上述本发明的抗癌药的特征在于含有本发明的载体或细胞作为 有效成分。该抗癌药可以以将上述栽体或细胞悬浮于药物可接受的稀 释剂的形式提供。这里所述的稀释剂例如是适合该栽体或细胞保存的 培养基、生理食盐水、或磷酸緩沖生理食盐水。培养基没有特别限定， 通常有RPMI、 AIM-V、 X-VIVO10等培养基。另外，为了稳定化的目 的，该抗癌药还可以添加药物可接受的栽体、保存剂等。这里所述的 栽体有人血清白蛋白等。含有本发明的细胞作为有效成分的抗癌药优 选以1xl0tlxl()8个/ml、更优选5xl05 5xl()7个/ml含有上述细胞。
将含有本发明的细胞作为有效成分的抗癌药施与人时，例如可通
过注射器施与，成人每人的施与量通常是优选使上述细胞数为 1xlO、lxlO"个。上述值是一个大概值，并不限于此。另外，含有本 发明的载体作为有效成分的抗癌药根椐施与途径或栽体的种类等，抗 癌药中的栽体浓度和施与量有很大不同。
如上所迷，本发明提供癌的治疗方法。在使用本发明的第5方案 的栽体作为有效成分时，上述治疗方法是体内(in vivo)基因治疗。 而在使用本发明的细胞作为有效成分时，可以为将编码HLA-A24限 制性的、MAGE-A4,43-m特异性TCR的核酸导入到摘除到体外的细胞 中，然后将其施与患者的先体外后体内治疗。本发明的治疗方法可以 将核酸导入到来自施与个体(例如人)的细胞、或者来自HLA的类型相 同的个体的细胞中使用，因此并未见有特别的毒性。
实施例以下通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明并不受这些实 施例的限定。
实施例1 MAGE-A4特异性CTL克隆#2-28的TCR a链和卩链 基因的克隆及序列确定
(1) 由^2-28制备RNA， 5'-RACE、克隆
培养非专利文献10记栽的CTL克隆#2-28细胞，使用RNeasy Mini 试剂盒(軒7y》公司制)，从2xl()S个细胞中提取RNA。上述的CTL 克隆#2-28细胞对脉沖导入了 MAGE-A4143.151肽(序列表的SEQ ID N0.9，以下简称为P143)的靶细胞显示HLA-A2402限制性细胞毒活性。 以该RNA的200 ng为才莫板，^吏用CapFishing Full-length cDNA Premix 试剂盒0 — ^一》公司制)，按照试剂盒的使用说明书合成cDNA。 使用序列表SEQ ID NO.10所示的低聚dT衔接头(oligo dT adaptor )、 反转录酶M-MLV (不含RNaseH) ( TAKALA BIO公司制)和上述酶 所附的反应緩冲液进行反转录反应。
以上述得到的单链cDNA为模板，使用上述试剂盒进行PCR。 5， 一侧的引物是使用试剂盒所附的5'-RACE引物(SEQIDNO.ll)， 3' — 侧的引物是使用对TCR a链C区特异性的3-TRa-C引物(SEQ ID N0.12)、对TCR(3链C1区域特异性的3-TRj3画Cl引物(SEQ ID NO,13) 或对TCR卩链C2区特异性的3-TRj3-C2引物(SEQ IDN0.14)。将这些 反应依次称为PCR-a、 PCR-(31和PCR-|32。将各反应液在94'C保持3 分钟，然后将94。C40秒、58'C40秒、72'C 1分钟的循环进行30个循 环，在72。C保持5分钟。将各反应产物的一部分通过琼脂糖凝胶电泳 进行分析，发现在PCR-a和PCR-卩2中有约1 kb的DNA扩增。
通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR-a和PCR-p2的残余的反应产物， 从凝胶中回收约1 kb的DNA。将它们与pT7blue T-栽体(Novagene公 司制)连接，转化大肠杆菌DH5a。
(2) 序列的确定、群集(夕，义夕yy,)、克隆的选择
从来自上述得到的PCR-a和PCR-(32的转化体中分别选择96个， 由它们分别制备质粒，使用自动测序仪确定DNA碱基序列。由序列 数据中除去pT7blue序列，然后进行群集，发现最大的毗连群() 共同序列中所含的最长的可读框的序列如序列表的SEQ ID N0.3和 SEQ ID N0.4所示。这些序列依次为#2-28细胞的TCR a链基因和p链基因的cDNA序列。由cDNA碱基序列推定的TCRa链和|3链的氨 基酸序列如序列表的SEQ IDNO.l和SEQ IDN0.2所示。从上述质粒 中选择具有与pT7blue的T7启动子同方向的TCR a链基因和卩链基 因cDNA的共同序列的质粒，分别命名为pBS MAGE TCR a和pBS MAGE TCR|3。
实施例2 通过mRNA转染进行MAGE-A4特异性TCR的表达
(1) mRNA的制备
通过用限制酶EcoRI进行消化，使pBS MAGE TCR a和pBS MAGE TCR p形成直链。以它们为模板，使用mMESSAGE mMACHINE T7试剂盒(7*》匕'才》公司制)，按照试剂盒的使用说明 书进行体外转录。然后用Poly(A)Tailing试剂盒(7》匕'才7公司制)， 按照试剂盒的使用说明书，在上述转录的RNA上附加Poly(A)链。这 样，得到MAGE-A4 TCRa mRNA和MAGE-A4 TCR卩mRNA。将它们 溶解于磷酸緩沖生理食盐水(PBS),在使用之前一直在-80'C保存。
(2) mRNA转染
ms69细胞是对脉沖导入了 SAGE715-723肽(序列表的SEQ ID NO.15，以下简称为P715)的靶细胞HLA-A2402限制性地显示细胞毒 活性的CTL克隆，是通过与非专利文献10记栽的#22细胞同样方法 得到但与#22不同的克隆。将lxl0 个ms69细胞用X-VIVO20培养基 y y歹k 7夕义公司制)清洗两次。将各80 |ig实施例2-(l)中制备 的MAGE-A4 TCRa mRNA和MAGE-A4 TCR卩mRNA和上述细胞在 X-VIVO20培养基中混合使达到150 ^U，用ECM830基因导入装置 (BTX公司制造)，通过电穿孔法向细胞导入RNA。导入mRNA后的 细胞在X-VIVO20培养基中、在5%(:02存在下、在37。C培养一天。 以下将这样得到的细胞记载为导入RNA的ms69细胞。
通过Ficoll离心法从人末梢血中分离末梢血单核细胞(PBMC)，用 添加了 0.5%AB型血清的PBS清洗两次。向其中添加固定有抗CD8 抗体的磁珠MACS CD8微珠(;、f - 一公司制)，在4。C反应15分钟， 然后将珠子用添加了 0.5%AB型血清的PBS清洗一次。用安装了磁铁 的柱捕获磁珠，从其中回收CD8阳性细胞，将其悬浮于添加有10%AB血清和100U/ml干扰素2 (IL-2)的RPMI1640培养基中，使达到lx106 个/ml。向24孔板的各孔中分别添加300 pl用PBS稀释为1 ng/ml的 抗CD3抗体(才夕乂夕口一》0KT3， ^》七》7 7"—t公司制)，在 4匸静置过夜，然后舍去上清，向各孔中分别分注1 ili1上述CD8阳性 细胞悬浮液。培养开始4天后、7天后和IO天后将培养基分别更换一 半，在5%(:02的存在下、在37。C培养。培养开始12天后，将lx107 个CD8阳性细胞用X-VIVO20培养基(^弋》7'l^少夕只公司制)清洗 两次。按照与ms69细胞同样的方法向该细胞中导入MAGE-A4TCRa mRNA和MAGE-A4 TCR卩mRNA。导入mRNA后的细胞在X-VIVO20 培养基中、在5%(:02的存在下、在37'C培养一天。将这样得到的细 胞记为导入RNA的CD8阳性细胞。
(3) 四聚体测定
使在HLA-A2402重链的C末端附加作为生物素蛋白连接酶BirA 的底物的序列的多肽和|32-微球蛋白以不溶性包封体的形式在大肠杆 菌中表达。将上述包封体在P143肽存在下进行体外重折叠，形成 HLA-A2402/卩2/微球蛋白/P143复合体。使生物素蛋白连接酶(7* ^f 4 r 4一公司制)与所得复合体作用，用藻红蛋白标记的链霉抗生物素 (Streptavidin-PE, 4》匕'卜口 ,-工:x乂^司制)制备四聚体。
将上述导入RNA的ms69细胞和导入RNA的CD8阳性细胞与20 )ig/ml四聚物在37。C反应30分钟，然后与Tricolor标记小鼠抗人CD8 抗体(力/k夕夕'公司制)在冰上反应15分钟。清洗细胞后用FACS Calibur (BD公司制)进行流式细胞分析。使用ms69细胞和CD8阳性 细胞作为阴性对象，使用弁2-28细胞作为阳性对象。
结果，四聚体阳性率在阴性对照的ms69细胞中为0.60%,而在 导入RNA的ms69细胞中为66.65%，在阴性对照的CD8阳性细胞中 为23.1%,而在导入RNA的CD8阳性细胞中为34.4%。导入了 RNA 的ms69细胞和CD8阳性细胞的四聚体测定结果如图1和图2所示。 该结果表明，由#2-28细胞克隆的TCRa链和TCR(3链的基因产物识 别P143和HLA-A2402的复合体。
(4) ELISPOT测定粑细胞如下制备。将HL A-2402基因转染BxT杂交细胞抹174CEM. T2 (以下简称为T2细胞)，将制备的T2-A24细胞(Ikuta. Y等人、Blood、 第99巻、第3717-3724页、2002年)用含有10。/。胎牛血清(FCS)的 RPMI1640培养基进行培养，离心后舍去上清。然后悬浮于RPMI1640 培养基中，离心后舍去上清，由此清洗细胞。将这样的细胞清洗共进 行三次，然后悬浮于含1 ml 10 jxM P143或P715或不含肽的RPMI1640 培养基中，在5%<:02存在下、在37。C温育1小时。通过离心回收细 胞，悬浮于RPMI1640培养基后进行离心，清洗细胞。将细胞悬浮于 RPMI1640培养基中,使达到5xl()4个/100 pl，以此作为ELISPOT测 定的耙细胞使用。
向7》f义夕， 一》HA96孔过滤和测定板(('J水7*公司制) 的各孔中分别注入100 pl用PBS稀释为2 pg/ml的抗人千扰素y抗体 (1-D1K， 7丫f少夕公司制)，在4'C放置过夜。舍去孔内的液体，然 后向各孔中加入100 jil RPMI1640培养基，放置15分钟，舍去液 体，洗涤板。将该洗涤再进行一次，然后向各孔中加入含有10%AB 型血清的RPMI1640培养基，在37。C放置1小时，进行封闭。封闭后 吸取上清，然后向各孔中添加100 pi RPMI1640培养基，洗涂板。将 该洗涤操作共进行三次。
将实施例2-(2)制备的(a)导入RNA的ms69细胞、(b)阴性对照ms69 细胞和0)阳性对照#2-28细胞、以及实施例2-(2)中制备的(d)导入RNA 的CD8 P曰性细胞和(e)阴性对照的CD8阳性细胞离心回收，用 RPMI1640培养基清洗一次。悬浮于RPMI1640培养基中，使(a)、 (b) 和(c)为2000个、1000个或500个/100 (d)和(e)为2乂104个/100 pl， 向实施例2-(4)中制备的经洗涤的板的孔中分注100 ^tl。向其中添加 100pl上述靶细胞悬浮液，在5%(:02存在下、在37'C培养20小时。
从板的各孔中除去液体，用含有0.05%吐温20的PBS (PBS-T)清 洗六次。将生物素化抗人干扰素Y抗体(^7'r'夕夕公司制，克隆名 7-B6-l)用PBS稀释为0.2 pg/ml，向各孔中分注100^1，在4'C放置过 夜。
从板的各孔中除去液体，用PBS-T清洗6次。将用PBS稀释为1 叫/ml的碱性磷酸酶标记链霉抗生物素(户4才，少卜'公司制)向各孔 中分注100 pl，在室温下反应1小时。从板的各孔中除去液体，用PBS-T清洗三次，然后按照AP显色试剂盒(,4才，少卜'公司制，170-6432) 的使用说明书制备显色液，在各孔中各分注IO(HU,避光，进行显色 反应。用蒸馏水停止显色，然后拍摄板的照片。结果，与ms69细胞和CD8阳性细胞相比，导入了 RNA的ms69 细胞和CD8阳性细胞在靶细胞脉冲导入P143时形成了更多的干扰素 y阳性斑点。该结果如图3和图4所示。图3是使用CTL克隆作为效 应细胞时的ELISPOT测定结果，ms69细胞相对于脉沖导入P715的耙 细月包、#2-28细胞相对于脉冲导入P143的单巴细胞、导入RNA的ms69 细胞相对于任何的把细胞都形成了较多的干扰素y阳性斑点。图4是 使用CD8阳性细胞作为效应细胞时的ELISPOT测定结果，导入RNA 的CD8阳性细胞对脉沖导入P143的靶细胞特异性地形成干扰素y阳 性j效点。(5)细胞毒活性将HLA-A0201基因转染T2细胞、T2-A24细胞和T2细胞，制备 T2-A2细胞，将其用RPMI1640培养基清洗三次，悬浮于RPMI1640 培养基中，使达到5xl(^个/ml。向这些细胞悬浮液1 ml中加入终浓 度为10 pM的P143或P715,在室温下静置15分钟，然后添加1 ml 含有10%FCS的RPMI1640培养基，在37'C温育1小时。将细胞用不 含FCS的RPMI1640培养基清洗三次，将"106个细胞悬浮于100 pl 含有10%FCS的RPMI1640培养基中。向其中添加50 pi Na25lCr04水 溶液(3.7 MBq)，在37。C标记两小时。将其作为耙细胞用于细胞毒活 性的测定。将ms69细胞、导入RNA的ms69细胞、#2-28细胞、CD8阳性 细胞和导入RNA的CD8细胞用RPMI1640培养基清洗两次，悬浮于 含有10%FCS的RPMI1640培养基中(效应细胞)，使达到2xl()6个/ml、 lxl()6个/ml、 5xl()5个/ml、 2.5xl()5个/ml、 1.25x105个/ml和6.25x104 个/ml,将其100pl加入到96孔V型底板的孔中。将靶细胞悬浮于含 有10%FCS的RPMI1640培养基中，使达到lxl()6个/m1,向加入了效 应细胞的孔中各添加100^1。在37。C反应4小时，然后离心回收上清， 使用y计数仪测定100pl上清中游离的"Cr的量。通过下式，由放射 活性的测定值计算特异性细胞毒活性。[数l]特异性细胞毒活性(％)=[(各孔的测定值-最小释放值)/(最大释放值-最小释放值)]x100上式中，最小释放值是不加入效应细胞的孔中的51Cr游离量，表 示靶细胞51Cr的自然游离量。最大释放值是指将Triton X-100加入靶 细胞中进行破坏时的51Cr游离量。该结果如图5和图6所示。图5是表示CTL克隆对脉沖导入P715 的T2-A24细胞(a)、脉沖导入P143的T2-A24细胞(b)和脉冲导入P143 的T2-A2细胞(c)的细胞毒活性的图，横轴表示效应细胞数/把细胞数 比(E/T比)，纵轴表示特异性细胞毒活性(％) 。 ms69细胞只对脉沖 导入P715的T2-A24细胞、#2-28细胞只对脉沖导入P143的T2-A24 细胞显示细胞毒活性，而导入了 RNA的ms69细胞对两者靶细胞均显 示细胞毒活性。任何效应细胞对脉冲导入P143的T2-A2细胞均未显 示细胞毒活性。图6是表示CD8细胞对于脉沖导入P143的T2细胞(a)、 未脉冲导入肽的T2-A24细胞(b)和脉冲导入P143的T2-A24细胞(c) 的细胞毒活性的图，橫轴表示E/T比，纵轴表示特异性细胞毒活性 (%)。阴性对照的CD8阳性细胞对任何细胞都未显示细胞毒活性。 而导入了 RNA的CD8阳性细胞和作为阴性对照的#2-28细胞对脉沖 导入P143的T2-A24细胞显示了细胞毒活性。由以上结果表明，编码#2-28细胞的TCRa链和(3链的基因使CTL 克隆和来自末梢血的CD8细胞具有P143特异性、HLA-A2402限制性 的细胞毒活性。产业实用性通过本发明，可以提供来自对MAGE-A4为HLA-A24限制性的 CTL的TCRa链和卩链的多肽、以及编码该多肽的核酸。上述核酸可 以使T细胞对呈递HLA-A24分子和MAGE-A4143.151肽的细胞具有细 胞毒活性，因此可用于表达MAGE-A4的癌的治疗。序列表自由文本 SEQIDNO.10:寡聚dT衔接头SEQIDNO.ll: 5'-RACE引物SEQIDNO.12:用于扩增编码TCRa链的DNA片段的合成引物 3-TRa-CSEQ ID NO.13:用于扩增编码TCR p链的DNA片段的合成引物 3-TR卩-ClSEQ ID NO.14:用于扩增编码TCR P链的DNA片段的合成引物 3-TRP-C权利要求
1.多肽，该多肽具有含序列表的SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的多肽、或含该序列中有一至多个氨基酸残基缺失、不可、插入或置换得到的氨基酸序列的多肽，并且可与含有序列表的SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽一起构成HLA-A24限制性的、MAGE-A4143-151特异性T细胞受体。
全文摘要
多肽，该多肽具有含序列表的SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的多肽、或含有该序列中有一至多个氨基酸残基缺失、不可、插入或置换得到的氨基酸序列的多肽，并且可与含有序列表的SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽一起构成HLA-A24限制性的、MAGE-A4_143-151特异性T细胞受体。
文档编号A61K48/00GK101287831SQ20068003363
公开日2008年10月15日 申请日期2006年9月7日 优先权日2005年9月13日
发明者奥村悟司, 宫原庆裕, 日浅厚则, 珠玖洋, 直田浩明 申请人:国立大学法人三重大学;宝生物工程株式会社