专利名称：：用于治疗乳腺癌的组合物和方法
技术领域：
：本发明涉及生物科学领域，更明确地，涉及癌症研究领域。特别地，本发明涉及包括能够抑制A2254或A5623编码基因表达的核酸的组合物。在一些实施方案中，该化合物是对应于来自这些基因的亚序列的小干扰RNA(siRNA)。本发明还涉及用于鉴定可用于治疗和预防癌症的化合物的方法和试剂盒。而且，本发明还涉及治疗或预防癌症特别是乳腺癌的方法，包括施用抑制A2254与A5623之间结合的化合物，本发明还涉及包含这些结合抑制剂的组合物。
背景技术：
：乳腺癌(BRC)是一种复杂的疾病，其特征是大量基因中遗传和表观遗传改变的积累(NathansonKL.，ef,NatMed,7(5):552-6,2001)。乳&泉癌发生的多步模型，即正常细胞经由非典型导管增生、原位导管癌(DCIS)和浸润性(invasive)导管癌(IDC)等阶段的转化，与其他组织中的癌发生阶段相似，但是推进乳腺癌的确切分子机制尚未知。显然，导致原发乳腺癌发生、发展和转移的分子因子很可能成为预防和治疗这类疾病的更好工具的开发目标。通过cDNA微阵列分析获得的基因表达模式可以为表征每种癌症的本质提供相当大量的信息；这些信息的应用前景在于其通过开发新型药物改进肿瘤病临床治疗策略的潜力(Petricoin、E.F.、3rd、"a/.、NatGenet、32Suppl:474-479、2002;BangeJ，.、NatMed、7(5):548-52、2001)。带着这个目的，我们分析了77例乳腺肿瘤的表达模式，包括通过激光微光束显微解剖(LMM)和代表27,648个基因的cDNA微阵列的组合方法纯化的12个DCIS和69个IDC(NishidateT,&"/"IntJOncol.2004Oct;25(4)797-819)。这些实验的数据不仅可以提供有关乳腺肿瘤发生的重要信息，对于鉴定其产物可作为诊断标志和/或作为治疗乳腺癌的分子靶标的候选基因也很具有价值。发明公开本发明是基于如下的发现，即A2254和A5623在乳腺癌细胞中显著过高表达，并且抑制A2254或A5623的表达可有效抑制多种癌细胞，包括BRC涉及的癌细胞的细胞生长。本申请描述的发明即是部分地基于此发现。为了分离用于治疗乳腺癌的新分子靶标，本发明人组合使用cDNA阵列和激光微光束显微解剖研究了77个绝经期前乳腺癌病例的全基因组表达模式。在上调的基因中，本发明人鉴定了被指称为驱动蛋白家族成员2C(X/F2C)的A2254以及被指称为胞质分裂蛋白调节因子(户iCOl的A5623,它们的表达在本发明人能够获得表达数据的乳腺癌病例中，分别在60例中的44例和58例中的37例中有上调。随后的半定量RT-PCR和Northern印迹分析证实，与正常人类组织包括乳腺导管细胞和正常乳腺相比，A2254和A5623在临床乳腺癌样品和乳腺癌细胞系中显著过高表达。免疫细胞化学染色显示，外源A2254和A5623定位于COS7细胞的细胞质和/或细胞质器(cytoplasmicapparatus)中。特另'J地，夕卜源A5623可见于COS7细胞的中间纤维网络中。用小干扰RNA(siRNAs)处理乳腺癌细胞有效抑制了A2254和A5623的表达，并分别抑制乳腺癌细胞、T47D和HBC5的细胞/肿瘤生长。此外，本发明人发现，A2254[和A5623]在HT1080细胞中瞬时过高表达可促进划痕测定(scratchassay)中细胞的迁移，表明这些基因在细胞迁移中均发挥关键作用(数据未显示)。这些发现表明，乳腺肿瘤发生或转移中可能涉及了A2254和A5623过高表达，并可能是特异性治疗乳腺癌患者的有希望的策略。而且，本发明人证明，A5623能够通过其N端侧的一部分与A2254结合，并且在细胞分裂后期和胞质分裂期间，A5623和A2254共定位于中间体。免疫细胞化学染色显示，在乳腺癌细胞中，外源A2254在前期定位于有丝分裂纺锤体极，然后在中期和后期的早期阶段定位于整个有丝分裂纺锤体。这些发现表明，A2254和A5623的复合物可能参与了乳腺肺瘤发生，并可能是特异治疗乳腺癌患者的有希望的策略。A2254被指称为驱动蛋白家族成员2C,它具有两种不同的转录变体，分别由21和20个外显子构成，对应于A2254V1(GenBank登录号NO:AB264115,SEQIDNO:35，36)和A2254V2(GenBank登录号NO:AY026505，SEQIDNO:37，38)(图3A,上图面)。因此，在本发明中，A2254包括A2254V1和A2254V2。VI变体的外显子1和2分别是185bp和94bp,而V2变体没有VI的外显子1和2,而具有一个由346bp构成的新外显子作为外显子1。V2变体的最后一个外显子(外显子20)比VI变体的最后一个外显子(外显子21)的3'端短537bp。A2254V1和A2254V2变体的全长cDNA序列分别含有2886和2401个核苷酸。这些变体的ORF开始于每个外显子1内。最终，VI和V2转录物分别编码725和671个氨基酸。A5623被指称为胞质分裂蛋白调节因子1，它也有三种不同的转录变体，分别由15、14和14个外显子构成，对应于A5623V1(Genbank登录号NO:NM一003981;SEQIDNO:39、40)，A5623V2(Genbank登录号NO:NM—199413;SEQIDNO:41、42)和A5623V3(Genbank登录号NO:NM—199414;SEQIDNO:43、44)(图3B，上图面)。因此，本发明中A5623包括A5623V1、A5623V2和A5623V3。VI的外显子13和14有可选择的变化，其余外显子在所有变体中均相同。V2变体没有VI的外显子14,在最后一个外显子内产生新的早终止密码子。V3的外显子14被完全删除，并且V3的外显子13在3，端比VI的外显子13短77bp,也在最后一个外显子内产生一个新的早终止密码子。A5623V1、A5623V2和A5623V3变体的全长cDNA序列分别由3128、3091和3011个核苷酸构成。这些变体的ORF开始于每个外显子1内。最终，VI、V2和V3转录物分别编码620、606和566个氨基酸。本发明提供了抑制细胞生长的方法。在本文提供的方法中有这样的方法，它们包括使细胞与包含抑制A2254或A5623表达的小干扰RNA(siRNA)的组合物接触。本发明还提供了用于抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法。这些方法包括向受试者施用含有与来自A2254或A5623的序列特异杂交的小干扰RNA(siRNA)的组合物。本发明的另一个方面提供了用于抑制生物样品细胞中A2254或A5623基因表达的方法。所述基因的表达可以通过向细胞内引入足以抑制A2254或A5623基因表达的量的双链核糖核苷酸(RNA)分子来加以抑制。本发明的另一个方面包括核酸序列和载体的产物，以及包含它们的组合物，它们有用于，例如，本文提供的方法。在本文提供的产物中有这样的siRNA分子，它们具有在被引入到表达A2254或A5623基因的细胞内时抑制这些基因表达的性质。这类分子中有这样的分子，它们包括有义链和反义4连，其中有义链包括与A2254或A5623靶序列对应的核糖核苦酸序列，并且其中该反义链包括与所述有义链互补的核糖核芬酸序列。分子的有义和反义链彼此杂交形成双链分子。本发明进一步的方面是筛选可用于治疗或预防癌症，特别是乳腺癌的化合物的方法，所述方法包括如下步骤(a)在测试化合物的存在下，使包含A5623多肽的A2254-结合域的多肽与包含A2254多肽的A5623-结合域的多肽接触；(b)检测多肽间的结合；和(c)选择可抑制多肽间结合的测试化合物。技术人员可通过本领域已知的用于确定蛋白相互作用域的方法确定A5623多肽的A2254-结合域或A2254多肽的A5623-结合域。例如，相互作用域可通过相互作用域作图(interactiondomainmapping)力口以确定。例如，分别表达A2254或A5623多肽的不同部分并应用例如酵母双杂交系统筛选相互作用。由酵母双杂交系统鉴定的相互作用，可通过应用例如生物化学测定，如免疫沉淀和/或柱上相互作用，来加以确证。前面提到的用于相互作用域鉴定和/或作图的方法决没有限制意义，因为技术人员可以容易地应用其他本领域已知的用于相互作用域鉴定和作图的方法。优选地，在A5623多肽与A2254多肽之间结合的抑制剂的筛选方法中应用的含A2254-结合域的多肽，包括A5623多肽，例如A5623V1(SEQIDNO:40)、A5623V2(SEQIDNO:42)或A5623V3(SEQIDNO:44)。在另一个优选方面中，在A5623多肽与A2254多肽之间结合抑制剂的筛选方法中应用的含A5623-结合域的多肽，包括A2254多肽，例如A2254V1(SEQIDNO:36)或A2254V1(SEQIDNO:38)。本发明的另外一个方面是用于筛选治疗或预防乳腺癌的化合物的试剂盒，其中该试剂盒包括(a)包含A5623多肽的A2254-结合域的多肽；(b)包含A2254多肽的A5623-结合域的多肽；和(c)用于检测多肽间相互作用的试剂。优选地，所述含有A2254-结合域的多肽包括A5623多肽，或者所述含有A5623-结合域的多肽包括A2254多肽。在另一个方面中，本发明涉及用于治疗或预防受试者中乳腺癌的方法。其中该方法包括施用药物有效量的可抑制A5623多肽与A2254多肽之间结合的化合物的步骤。而且，本发明还涉及用于治疗或预防乳腺癌的组合物，其中该组合物包括药物有效量的抑制A5623多肽与A2254多肽之间结合的化合物和药物可接受的载体。如这里使用的，术语"生物体"是指任何由至少一个细胞构成的活体。活的生物体可以简单到例如单个真核生物细胞，或者复杂到哺乳动物，包括人类。如这里使用的，术语"生物样品"是指整个生物体或者其的组织、细胞或组成部分的一部分(例如体液，包括但不仅限于，血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜脐血、尿、阴道液和精液)。"生物样品，，进一步指从整个生物体或其细胞、组织或组成部分的一部分制备的匀浆、裂解物、提取物、细胞培养物或组织培养物，或者其级分或部分。最后，"生物样品"指含有细胞组分，例如蛋白质或核酸分子的介质，例如生物体在其中繁殖的营养肉汤或凝胶。本发明以抑制细胞生长的方法为特征。使细胞与A2254或A5623小干扰RNA(siRNA)的组合物接触抑制细胞生长。细胞进一步与转染增强剂接触。细胞在体外、体内或离体提供。受试者是哺乳动物，例如人、非人灵长动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛。细胞是乳腺导管细胞。或者细胞是肿瘤细胞(也就是癌细胞)，例如上皮细胞癌(carcinoma)细胞或腺癌细胞。例如，细胞是乳腺癌细胞。"抑制细胞生长"的意思是，被处理细胞与未处理细胞相比增殖速度较低或者生存能力下降。细胞生长通过本领域已知的增殖测定加以测量。术语"siRNA"的意思是阻止耙mRNA翻译的双链RNA分子。使用将siRNA引入到细胞的标准技术，包括其中DNA是转录RNA的模板的技术。siRNA包括有义A2254或A5623核酸序列，反义A2254或A5623核酸序列，或者两者。siRNA可以包括两个互补的分子，或者可以被构建使得单一转录物同时具有来自靶基因的有义和互补反义序列，例如发夹，在一些实施方案中发夹导致微RNA(miRNA)的产生。耙细胞内siRNA与A2254或A5623转录物的结合导致细胞的A2254或A5623产生减少。寡核苷酸的长度至少为大约IO个核苷酸，并可以与天然存在的A2254或A5623转录物一样长。优选地，寡核苷酸的长度为大约19-大约25个核芬酸。最优选地，寡核普酸的长度小于大约75个、大约50个、或者大约25个核香酸。抑制哺乳动物细胞内A2254或A5623表达的A2254或A5623siRNA寡核苷酸的实例包括分别含有靶序列的寡核苷酸，其中所述靶序列例如分别为SEQIDNO:21或25的核香酸，或29或33的核香酸。设计具有抑制靶细胞内基因表达能力的双链RNA的方法是已知的(见例如，美国专利No.6,506,559，本文引用其全部内容作为参考)。例如，可以/人Ambion网点(http:〃www.ambion.co.jp/techlib/tb/tb—506,html)获4寻用于"i殳计siRNA的计算机程序。该计算机程序可以从Ambion公司获得，根据如下的方案选择用于siRNA合成的核苷酸序列。选择siRNA乾点1.从转录物的AUG起始密码子开始向下游扫描AA双核芬酸序列。记录每个AA的出现及其3'侧相邻的19个核苷酸作为潜在siRNA靶点。Tuschl等在TargetedmRNAdegradationbydouble-strandedRNAv"ro.GewasZ)ev13(24):3191-7(1999)中不推荐针对5，和3，非翻译区(UTR)以及邻近起始密码子的区域(75个碱基之内)设计siRNA，因为这里可能更富含调节蛋白质的结合位点。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合。2.将潜在靶点与合适的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行比较，将任何与其他编码序列显著同源的靶序列排除在考虑之外。建议使用BLAST(AltschulSF、d.a/.、NucleicAcidsRes.1997;25:3389-402;JMolBiol.1990;215:403-10.),其可见于NCBI服务器www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。3.选择合格的靶序列用于合成。通常在待评估的基因的长度上选择几个靶序列。本发明还包括含有靶序列的核酸序列的分离核酸分子，所述靶序列例如SEQIDNO:21、25、29和33的核苷酸，或者与SEQIDNO:21、25、29和33的核苷酸的核酸序列互补的核酸分子。如这里使用的，"分离核酸"是从其原环境(例如，如果是自然存在的，即自然环境)移出的核酸，因而人工地(syntheticaliy)改变了其自然状态。在本发明中，分离的核酸包括DNA、RNA及其衍生物。当分离核酸是RNA或其衍生物时，应当在核苷酸序列中将碱基"t"替换为"u"。如这里使用的，术语"互补"是指核酸分子核香酸单元之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，而术语"结合"是指两个核酸或化合物、或者相关核酸或化合物、或它们的组合之间的物理或化学相互作用。互补核酸序列在合适的条件下杂交，形成含有极少或者没有错配的稳定双链体。为了本发明的目的，两条具有5个或者更少错配的序列被认为是互补的。而且，本发明分离核苷酸的有义链和反义链可通过杂交形成双链核苷酸或发夹环结构。在优选实施方案中，这种双链体在每IO个匹配中的错配数不超过1个。在双链体链完全互补的特别优选的实施方案中，这种双链体没有错配。对于A2254或A5623而言，核酸分子的长度分别小于2886或3128个核苷酸。例如，核酸分子的长度小于大约500、大约200、或者大约75个核苷酸。本发明还包括含有一个或多个本文所述核酸的载体，以及含有该载体的细胞。本发明的分离核酸可用于抗A2254或A5623的siRNA，或者编码该siRNA的DNA。当核酸用于siRNA或其编码DNA时，有义链优选地长于大约19个核香酸，更优选地长于21个核香酸。本发明部分地基于如下的发现，即编码A2254或A5623的基因在乳腺癌(BRC)中相比于在非癌性乳腺组织中过高表达。A2254V1和A2254V2的cDNA长度分别为2886和2401个核苷酸。A5623V1、A5623V2和A5623V3的cDNA长度分别为3128、3091和3011个核瞽酸。A2254V1和A2254V2的核酸和多肽序列分别如SEQIDNO:35和36、及SEQIDNO:37和38所示。A5623V1、A5623V2和A5623V3的核酸和多肽序列分别如SEQIDNO:39和40、SEQIDNO:41和42以及SEQIDNO:43和44所示。序列数据还可以从如下登录号获得。A2254:AY026505A5623:NM—003981、NM—199413、NM—199414抑制细胞生长的方法本发明涉及通过抑制A2254或A5623的表达而抑制细胞生长，即癌细胞生长。或者，本发明涉及通过抑制A5623多肽与A2254多肽的结合而抑制细胞生长，即癌细胞生长，特别是乳腺癌的生长，因为发现两种多肽可以相互作用，并且认为它们的相互作用在癌发生，特别是乳腺癌发生中发挥至关重要的作用。因此，本发明涉及通过抑制A5623多肽与A2254多肽的结合而治疗或预防受试者中乳腺癌的手段和方法。而且，本发明设想了一种A5623多肽与A2254多肽的结合抑制剂，用作治疗或预防癌症，特别是治疗或预防乳腺癌的药物。A2254或A5623的表达被例如特异性靶向A2254或A5623基因的小干扰RNA(si脂A)所抑制。A2254或A5623耙标包括例如SEQIDNO:21、25、29和33的核苷酸。在非哺乳动物细胞中，双链RNA(dsRNA)显示对基因表达具有强烈而特异性的沉默效应，这称作RNA干扰(RNAi)(SharpPA.GenesDev.1999;13(2):139-41.)。dsRNA被一种含有RNA酶III基序的酶加工成20-23个核苷酸的dsRNA，称作小干扰RNA(siRNA)。siRNA与多组分核酸酶复合物一起特异性輩巴向互补mRNA(HammondSM"a/"Nature.2000;404(6775):293-6;HannonGJ.Nature.2002;418(6894):244-51.)。在哺乳动物细胞中，由20或21聚体dsRNA构成、具有19个互补核苷酸和3'端非互补胸香或尿苷二聚体的siRNA显示具有基因特异性敲低(knockdown)作用，而不会导致基因表达的全局改变(ElbashirSMda/.,Nature.2001;411(6836):494-8.)。此外，含有小核RNA(snRNA)U6或聚合酶IIIHI-RNA启动子的质粒可有效产生这种短RNA募集型III族RNA聚合酶III,从而能够组成型抑制其耙mRNA(MiyagishiM."a/.，NatBiotechnol.2002;20(5):497画500.;BrummelkampTR，da/.，Science.296(5567):550-3,2002.)。通过使细胞与含有A2254或A5623之siRNA的组合物接触抑制细胞的生长。进一步将细胞与转染试剂接触。合适的转染试剂在本领域是已知的。"抑制细胞生长"的意思是，与没有暴露于组合物的细胞相比，细胞的增殖速度较低，生存能力下降。细胞生长用本领域已知的方法加以测量，例如MTT细力包增殖测定。A2254或A5623的siRNA指向A2254或A5623基因序列的单个靶标。或者siRNA指向A2254或A5623基因序列的多个靶标。例如，组合物含有指向A2254或A5623的2、3、4或5个或者更多个靶序列的A2254或A5623的siRNA。"A2254或A5623耙序列"是指与A2254或A5623基因的一部分相同的核苷酸序列。靶序列可包括人类A2254或A5623基因的5'非翻译(UT)区、可读框(ORF)或3'非翻译区。或者siRNA是与A2254或A%23基因表达的上游或下游调节子互补的核酸序列。上游和下游调节子的实例包括结合A2254或A5623基因启动子的转录因子、与A2254或A5623多肽相互作用的激酶或磷酸酶，A2254或A5623启动子或增强子。与靶mRNA杂交的A2254或A5623的siRNA,通过与通常为单链的mRNA转录物相结合，从而干扰翻译，进而干扰蛋白质的表达，藉此降低或抑制由A2254或A5623基因编码的A2254或A5623多肽产物的产生。因此，本发明的siRNA分子性杂交的能力加以鉴定。为了本发明的目的，术语"杂交"或"特异性杂交"用于表示两个核酸分子在"严紧杂交条件下"杂交的能力。短语"严紧杂交条件"是指在该条件下，典型地在核酸的复杂混合物中，核酸分子与其靶序列杂交而不与其他序列发生可检测的杂交。严紧条件是序列依赖性的，在不同的环境下会不同。越长的序列在越高的温度发生特异性杂交。在下列文献中可获得核酸杂交的详纟田指导Tijssen,rec/zm々wes5/oc/ze脂's^yMo/ecw/orB/o/ogy—/^n'cfeaf/owW/z7Vwc/e/c尸raZ)es，"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)。一般地，对于特定的序列，在限定的离子强度pH下，严紧条件选择比热解链温度(Tm)低大约5-10。C。Tm是在平衡状态下，与靶序列互补的探针中的50%与靶序列杂交的温度(在限定的离子强度，pH和核浓度)(因为靶序列过量存在，因此在Tm时，50%的探针被占据)。严紧条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺实现。为了选择性或特异性杂交，阳性信号至少是背景的2倍，优选地是背景杂交的10倍。严紧杂交条件的实例可如下50%曱酰胺、5xSSC和1%SDS,42。C温育,或者5xSSC、1%SDS，65。C温育，在50°C0.2xSSC、和0.1。/。SDS中清洗。本发明siRNA的长度小于大约500、大约200、大约100、大约50、或者大约25个核芬酸。优选地，siRNA的长度为大约19-大约25个核香酸。示例性的用于产生A2254或A5623siRNA的核S交序列分别包括SEQIDNO:21或25、或者29或33的核苷酸的序列作为靶序列。而且，为了提高siRNA的抑制活性，在靶序列反义链的3'端可以添加核苷酸"u"。所添加的"u"的数目为至少大约2个，一般大约2-大约10个，优选地大约2-大约5个。添加的"u"在siRNA反义链的3'端形成单链。细胞是任何表达或过高表达A2254或A5623的细胞。细胞是上皮细胞，例如乳腺导管细胞。或者，细胞是肿瘤细胞，例如癌、腺癌、母细胞瘤、白血病、骨髓瘤或肉瘤。细胞是乳腺癌。A2254或A5623的siRNA以能够结合mRNA转录物的形式直接引入到细胞内。或者，编码A2254或A5623的siRNA的DNA处于载体内。载体是通过，例如，以允许两条链均表达(通过DNA分子转录)的方式，将A2254或A5623靶序列克隆到具有位于A2254或A5623序列的侧翼的、可操作连接的调节序列的表达载体中而产生的(Lee、N.S.、"a/.、(2002)NatureBiotechnology20:500-5)。与A2254或A5623mRNA反义的RNA分子由第一启动子(例如位于克隆DNA3，侧的启动子序列)转录，对A2254或A5623mRNA而言为有义链RNA分子由第二启动子(例如位于克隆DNA的5'侧启动子序列)转录。有义和反义链在体内杂交，产生用于沉默A2254或A5623基因的siRNA构建体。或者利用两个构建体产生siRNA构建体的有义和反义链。克隆的A2254或A5623可编码具有二级结构例如发夹的构建体，其中单一转录物同时具有来自靶基因的有义和互补反义序列。在有义和反义序列之间可以存在由任意核苷酸序列构成的环序列，以形成发夹环结构。因此，本发明还提供了具有通式5'-[A]-[B]-[A，]-3，的siRNA，其中[A]是与来自A2254或A5623的mRNA或cDNA特异性杂交的序列的相应核糖核香酸序列。在优选实施方案中，[A]是这样的核糖核苷酸序列，它相应于选自SEQIDNO:21、25、29和33的核苷酸的序列。[B]是由3-23个核苷酸构成的核糖核苷酸序列，和[A，]是由[A]的互补序列构成的核糖核苷酸序列。区域[A]与[A，]杂交，然后形成由区域[B]构成的环。环序列的长度优选地为大约3-大约23个核芬酸。环序列可以从例如由如下序列构成的组中选4,(http:〃www.ambion.com/techlib/tb/tb—506.html)。而且，由23个核苦酸构成的环序列也提供活性siRNA(Jacque、J.M.da/.、(2002)Nature418:435-8.)。CCC、CCACC或CCACACC:Jacque,J.M.da/"(2002)Nature,418:435-8.UUCG:Lee、N.S.da/"(2002)NatureBiotechnology20:500-5;Fruscoloni,P.efa/.,(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(4):1639-44.UUCAAGAGA:Dykxhoorn、D.M.Wa/.，(2003)NatureReviewsMolecularCellBiology4:457-67.例如，具有本发明发夹环结构的优选siRNA如下所示。在下列结构中，环序列可以从CCC、UUCG、CCACC、CCACACC和UUCAAGAGA中选择。优选的环序列是UUCAAGAGA(在DNA中是"ttcaagaga")。GAGAAGAAGGCCCAGAACU隱[B]-AGUUCUGGGCCUUCUUCUC(对靶序列SEQIDNO:21)CUCUAGGACUUGCAUGAUU-[B]画AAUCAUGCAAGUCCUAGAG(对耙序歹'JSEQIDNO:25)GGAAAGACUCAUCAAAAGC隱[B]画GCUUUUGAUGAGUCUUUCC(对靶序列SEQIDNO:29)GCAUAUCCGUCUGUCAGAA國[B]画UUCUGACAGACGGAUAUGC(对靶序列SEQIDNO:33)。位于A2254或A5623序列侧翼的调节序列是相同或者不同的，从而它们的表达可以独立地;波调节或者以时间或空间方式净皮调节。通过将A2254或A5623基因模板克隆到含有例如来自小核RNA(snRNA)U6启动子或人HIRNA启动子的RNA聚合酶III转录单元的载体内，从而在细胞内转录siRNA。为了将载体引入到细胞内，可以使用转染增强剂。FuGENE(RocheDiagnostices)、Lipofectamine2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)和Nucleofector(WakopureChemical)可用作转染增强剂。才艮据标准方法，在体外测试寡核苷酸和与A2254或A5623的mRNA多个部分互补的寡核苷酸降低肿瘤细胞中A2254或A5623产生的能力(例如，使用乳腺细胞系，如乳腺癌(BRC)细胞系)。使用A225斗或A5623的特异性抗体或其他检测策略，检测与候选siRNA组合物接触的细胞中A2254或A5623基因产物与不存在候选组合物时培养的细胞相比的降低。对于在体外基于细胞的测定或无细胞测定中降低A2254或A5623产生的序列，随后测试其对细胞生长的抑制效应。对于在体外基于细胞的测定中抑制细胞生长的序列，将其在大鼠或小鼠体内进行测试以确认在患有恶性肿瘤的动物体内A2254或A5623的产生降低以及肿瘤细胞生长降低。治疗恶性肿瘤的方法通过施用A2254或A5623的siRNA治疗患有以A2254或A5623过高表达为特征的肿瘤的患者。siRNA治疗用于抑制罹患或者有危险发生例如乳腺癌的患者体内A2254或A5623的表达。这些患者通过具体肿瘤类型的标准方法加以鉴定。乳腺癌(BRC)的诊断通过例如CT、MRI、ERCP、MRCP、计算机断层摄影或超声波。如果治疗导致临床效益，例如受试者中A2254或A5623表达降低，或者肿瘤的大小、患病率(prevalence)或转移潜力降低，则治疗是有效的。在预防性地施加治疗时，"有效"是指治疗可推迟或阻止肿瘤形成，或阻止或减轻肿瘤的临床症状的症状。有效性是结合已知的用于诊断或治疗特定肿瘤类型的方法来加以确定。siRNA治疗的执行是通过向受试者施用siRNA,其施用是利用编码本发明siRNA的标准载体和/或基因输送系统，例如通过输送合成的siRNA分子。典型地，将合成siRNA分子化学稳定化以防止体内核酸酶降解。制备化学稳定化的RNA分子的方法在本领域是公知的。典型地，这类分子含有经过修饰的骨架和核香酸以防止核糖核酸酶作用。其他修饰也是可能的，例如胆固醇偶联的siRNA显示提高的药理学性质(SongCa/.A^weMed9:347-51(2003》。合适的基因输送系统可以包括脂质体、受体介导的输送系统或病毒载体，例如疱渗病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒及其他。治疗性核酸组合物配制在药物可接受的载体中。治疗性组合物还可以包括如上所述的基因输送系统。药物可接受的载体是适合施用于动物的生物相容性溶媒，例如生理盐水。化合物的治疗有效量是能够产生医学上理想的结果——例如受治疗动物中A2254或A5623基因产物产生降低、细胞生长如增殖降低，或者体内肺瘤生长降低一一的量。胃肠外给药例如静脉内、皮下、肌肉内和腹腔内输送途径可用于输送A2254或A5623的siRNA组合物。为了治疗乳腺肿瘤，向腹动脉、脾动脉或肝总动脉直接输注是有用的。任何一个患者的剂量取决于多种因素，包括患者的身材、体表面积、年龄、待施用的特定核酸、性别、给药的时间和途径、一般健康状况、以及同时施用的其他药物。核酸的静脉内给药剂量为核酸分子的大约106-1022个拷贝。多核苷酸通过标准方法给药，例如通过注射到组织如肌肉或皮肤的间质空间，引入到循环系统或者体腔，或者通过吸入或吹入。多核苷酸与药物可接受的液体载体例如水性或部分水性的液体载体一起注射或者通过其他方式输送给动物。多核苷酸与脂质体(例如阳离子或阴离子脂质体)结合。多核苷酸包含被靶细胞表达所需的遗传信息，例如启动子。或者患有肿瘤，特别是乳腺肿瘤的患者可以通过施用抑制A5623多肽与A2254多肽之间结合的化合物加以治疗。不受限于理论，我们相信A5623多肽与A2254多肽的相互作用的抑制剂可改变、相互影响、调节、干扰、石皮坏A5623多肽与A2254多肽的结合或者A2254多肽与A5623多肽的结合。从而，相信两种蛋白质均不再能够象它们在癌细胞内那样相互作用。因此，进一步相信，两种蛋白质在癌发生中一一特别是乳腺癌发生中，如本发明人的观察结果所提示的——所发挥的关键作用可以被阻断，从而可以实现癌症特别是乳腺癌的预防或治疗。除非另有定义，本文所用的全部技术和科学术语的意义与本发明所属领域中普通技术人员所共同理解的意义相同。尽管在实践或测试本发明时可以使用与本文所公开的方法和材料相似或等价的方法和材料，但是下文仍然描述了合适的方法和材料。本文引用本文中提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全部内容作为参考。如有矛盾，则以包括定义在内的本说明书为准。此外，材料、方法和实施例只是举例说明，而没有任何限制意义。减少或抑制A5623和A2254之间结合的化合物的产生和鉴定考虑本实施例中提供的证据，本发明的一个方面涉及减少或防止A5623与A2254之间结合的测试化合物的鉴定。用于确定A5623/A2254结合的方法包括任何用于确定两个蛋白质间相互作用的方法。下文描述了其它方法。这些测定包括，但不限于传统的方法，例如交联、免疫共沉淀和通过梯度或色谱柱共纯化。此外，可以使用基于酵母的遗传系统监^见蛋白—蛋白相互作用，该系统如Fields和其合作者戶斤4苗述(FieldsandSong,7Va^re340:245-6(1989);Chiend"/，7Va"88,9578-82(1991)),并如Chevray和Nathans所公开(尸rac.Ato/.JcW.5W.t/&489:5789-93(1992))。许多转录激活物，例如酵母GALA，由两个物理上分离的调节域构成，一个充当DNA结合域，另一个发挥转录激活域的作用。在先出版物中描述的酵母表达系统(一般称作"双杂交系统")就是利用这一性质，并采用两个杂合蛋白质，在其中一个中靶蛋白与GAL4的DNA结合域融合，在另一个内，候选激活蛋白与激活域融合。GALl-lacZ报道基因在GALA激活的启动子控制下的表达，取决于GAL4活性通过蛋白-蛋白相互作用的重建。含有相互作用多肽的菌落可以用(3-半乳糖苷酶的显色底物加以检测。用双杂交技术鉴定两个特定蛋白质之间蛋白-蛋白相互作用的完整试剂盒(MATCHMAKERtm)可以从Clontech购买。这个系统还可以扩展到用于参与特定蛋白相互作用的蛋白域作图以及定位对于这些相互作用至关重要的氨基酸残基。尽管本申请提到的是"A5623"或"A2254"，但是应当理解，在对这两者的相互作用进行分析或操作时，可以用这些蛋白质之一或二者的结合部分代替这些蛋白质的全长拷贝。通过用A5623的标准缺失分析和/或诱变以鉴定结合A2254的片段，可以容易地鉴定出结合A2254的A5623片段。可以使用类似的分析来鉴定A2254的A5623结合性片段。如本文所公开的，任何测试化合物，包括例如蛋白质(包括抗体)、突变蛋白(mutein)、多核苦酸、核酸、核酸适体、和多肽及非肽小有机分子，均可用作本发明的测试化合物。测试化合物可以从天然来源分离，合成或重组制备，或者它们的任意组合。例如，肽可以用E.Gross和J.Meienhoffer主编的《Peptides》第二版中由G.Barany和R.B.Merrifield撰写的"SolidPhasePeptideSynthesis(固相肽合成)，,一节，AcademicPress,NewYork,N.Y.，pp.100-118(1980)中描述的固相技术合成制备。类似地，核酸也可以用Beaucage、S丄.，&Iyer,R,P.(1992)Tetrahedron,48，2223-31l;和Matthese^/.,五MS(9J，3:801-5(1984)中描述的固相技术加以合成。在鉴定抑制肽时，用各种氨基酸模拟物或非天然氨基酸修饰本发明的肽，对于提高肽在体内的稳定性特别有用。稳定性可以用多种方法测定。例如，肽酶和各种生物介质，如人血浆和血清，已经被用于测试稳定性。见例如Verhoef"a/.，五,J!D，Me励泡m,h佃.11:291-302(1986)。其他本领域已知的有用肽修饰包括糖基化和乙酰化。重组和化学合成技术均可以用来产生本发明的测试化合物。例如，可通过插入到合适的载体内产生测试化合物的核酸，其可以在转染到感受态细胞中后表达。或者，可以利用PCR技术或者在合适宿主中表达来扩增核酉臾(见i"列唢口Sambrookda/.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,1989、ColdSpringHarborLaboratory、NewYork、USA)。肽和蛋白质还可以用本领域公知的重组技术进行表达，例如通过用重组DNA构建体转化合适的宿主细胞，如Morrison,J.Bact.，132:349-51(1977);禾口Clark-Curtiss&Curtiss，MethodsinEnzymology，101:347-362(Wua/.，eds,1983)所述。抗A5623和抗A2254抗体在本发明的一些方面中，测试化合物是抗A5623或抗A2254抗体。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体，包括但不仅限于人源化抗体。在一些情况下，本发明的抗体实施方案在这些蛋白质与其他蛋白质结合的界面上结合A5623或A2254。在一些实施方案中，在生理条件下，这些抗体结合A5623或A2254的Ka至少为大约105mor1、106mol"或者更大、107mol"或者更大、1()Smol"或者更大、或者1(^mol"或者更大。这些抗体可以从商业来源购得，例如Chemicon公司(TemeculaCalif.),或者可以用例如基本上纯化的A5623或A2254蛋白，例如人蛋白或其片段，作为免疫原来激发产生。由给定免疫原制备单克隆和多克隆抗体的方法在本领域是公知的。关于特定免疫原抗体的纯化技术和鉴定方法见例如PCT/US02/07144(WO/03/077838),本文引用其内容作为参考。用例如抗体亲和基质形成亲和柱来纯化抗体的方法在本领域是公知的，并可商业上获得(AntibodyShop、Copenhagen,Denmark)。能够破坏A5623/A2254结合的抗体的鉴定，使用下文详述的一^:测试化合物的测试方法进行。转换酵(convertingenzymes)转换酶可以用作本发明的测试化合物。在本发明的上下文中，转换酶是对A5623或A2254之一或者它们两者进行共价翻译后修饰的分子催化剂。本发明的转换酶将以下面所述的方式共〗tf务饰A5623和/或A2254的一个或多个氨基酸残基其导致被修饰蛋白的结构发生别构变化，或者改变被修饰蛋白的A5623/A2254分子结合位点化学或结构从而干扰A5623与A2254之间的结合。干扰两个分子之间的结合，是指相对于在30。C、离子强度O.l和不存在去垢剂的条件下测得的蛋白间的Ka,使结合Ka降低至少25%、30%、40%、50%、60%、70%或者更多。本发明的转换酶实例包4舌激酶、磷酸酶、酰胺酶、乙酰化酶、糖香酶等。构建测试化合物文库尽管测试化合物文库的构建在本领域是公知的，本部分仍然提供了在鉴定测试化合物并构建这些化合物的文库，用于筛选A5623/A2254相互作用的有效抑制剂的的额外指导。下文提供关于化合物文库的进一步指导。分子建模对具有目标性质的化合物的分子结构和/或对待抑制靶分子即A5623和A2254的分子结构的知识，方便了测试化合物文库的构建。预筛选适于进一步评估的测试化合物的方法之一，是对测试化合物与其靶标的相互作用进行计算机建模。在本发明中，A5623与A2254相互作用的建模提供了对相互作用本身细节的认识，并提示了干扰该相互作用的可能策略，包括相互作用的潜在分子抑制剂。计算机建模技术为所选分子的三维原子结构的可视化以及与该分子相互作用的新化合物的合理设计提供了可能。三维构建典型地依赖于从所选分子的x-射线晶体分析或NMR成像而来的数据。分子动力学需要力场数据。计算机图形系统为预测新化合物如何连接靶分子，以及实验操作化合物和靶分子的结构以优化结合特异性提供了可能。为了预测当分子之一或二者中产生细小改变对分子-化合物相互作用是什么样的，需要分子力学软件和计算密集型计算机，它们通常关联着分子设计程序和用户之间的用户友好的、菜单驱动的界面。上文一般性描述的分子建^f莫系统的一个实例，是由CHARMm和QUANTA程序构成，PolygenCorporation,Waltham，Mass。CHARMm#丸4亍能量最小化和分子动力学功能。QUANTA执行构建、图形建模和分子结构分析。QUANTA为分子相互行为的分析、可视化、修饰和相互作用性构建提供了可能。大量文献综述了与特定蛋白质相互作用的药物的计算机建模，例如Rotivinen,a/.爿加尸/zar應cew"caFe朋/ca97,159-166(1988);Ripka,脸w5Wew//W54-57(Jun.16、1988》McKinlayandRossmann,^"肌尸/zar應co/.7b;dc/o/.29,111-122(1989);PerryandDavies，ProgClinBiolRes,291:189-93(1989》LewisandDean,尸亂i.Soc.说o/5W.236，125-40和141-62(1989);以及关于核酸组分的模型受体，有Askew、"a/.，/爿w.C7ze肌111、1082-90(1989)。其他篩选和图形描述化学物质的计算机程序可以例如BioDesignInc.,Pasadena,Calif"AllelixInc.,Mississauga,Ontario,Canada和HypercubeInc.,Cambridge,Ontario等/>司获得。见例如DesJarlais(1988)J,Med.Chem,31:722-9;Mengdo/.(1992)J.ComputerChem.13:505-24;Mengda/.(1993)Proteins17:266-78;Shoichet"a/.(1993)Science259:1445-50。一旦鉴定了A5623/A2254相互作用的假定抑制剂，就可以根据已鉴定的假定抑制剂的化学结构使用组合化学技术构建任何数目的变体，如下文所述。对于最终的假定抑制剂或"测试化合物"文库可使用本发明的方法进行筛选，以鉴定该文库中干扰A5623/A2254结合的测试化合物。组合化学合成测试化合物的组合文库可作为涉及在已知A5623/A2254相互作用抑制剂中存在的核心结构的知识的合理药物设计程序的一部分而产生。这种方法使文库保持合理的大小，便于高通量筛选。或者可通过简单合成构成该库的分子家族的全部排列构建简单的，特别是短的聚合物分子文库。后一种方法的实例是由长度为6个氨基酸的全部肽构成的文库。这种肽文库可包括每一个6氨基酸序列排列。这种类型的文库称作线性组合化学文库。组合化学文库的制备是本领域技术人员所公知的，并可通过化学或生物合成产生。组合化学库包括，但不限于肽文库(见例如美国专利5,010,175，Furka,/"f./A尸ra/.L37:487-93(199l)和Houghtenda/.，淑脏354:84-6(1991))。也可以采用其他用于产生化学多样性库的化学。这类化学包括，但不仅限于肽(例如PCT公开第WO91/19735号)，被编码的肽(例如PCR公开第WO93/20242号)，随机生物寡聚体(例如PCT公开第WO92/00091号)，苯并二氮卓(benzodiazepine)(例如美国专利第5,288,514号)，diversomers如乙内酰脲类(hydantoins),苯并二氮卓类(benzodiazepines)和二肽(dipeptides)(DeWittefa/.,尸rac.Ato/.爿cw/.5W.90:6909-13(1993》，插婦(vinylogous)多肽(Hagihara"、《/^merOze肌5bc.114:6568-70(1992))，具有葡萄糖骨架的非肽性肽模拟物(HirschmannWa/.，《/^ww.C7ze肌Soc.114:9217-8(1992)),小化合物文库的类似有机合成(Chen"a/.，《/Jmw.Soc.116:2661(1994》，寡聚氨基曱酸酯(oligocarbamates)(Cho"a/.,5We"ce261:1303(1993))，和/或肽基膦酸盐或酯(peptidylphosphonate)(CampbellWa/.，59:658(1994)),核酸文库(见Ausubel，andSambrook,全部见上文)，肽核酸文库(见例如美国专利5,539,083),抗体文库(见例如Vaughanda/.，脂訓肠fec/wo/ogy，14(3):309画14(1996)和PCT/US96/10287)，糖文库(见例如Liang"a/.、5We"ce、274:1520-2(1996)和美国专利5,593,853),小有机分子库(见例如，苯并二氮卓，GordonEM.CurrOpinBiotechnol.1995Dec1;6(6):624-31.;类异戊二烯，美国专利5,569,588;p塞峻啉酉同类(thiazanones)和间p塞哇啉酮类(metathiazanones)，美国专利5，549,974;吡咯烷类，美国专利5,525,735和5,519,134;吗啉代化合物，美国专利5,506,337;苯并二氮卓、5,288,514等)。下文提供了关于组合化学合成进一步的指导。噬菌体展示另一种方法使用重组噬菌体产生文库。使用"噬菌体方法"(ScottandSmith,5Wewce249:386-90、1990;Cwirla,"iVoc.iVw/.5W.、87:6378-82、1990;Devlinda/.，5We"ce，249:404-6,1990)可以构建非常大的文库(例如106-108个化学实体)。第二种方法主要^f吏用化学方法，其实例是Geysen法(Geysenefa/.，Mo/ecw/ar7wmw"o/ogy23:709-15，1986;GeysenWa/.■//附mw"o/og/cMeAod102:259-74，1987)和Fodor等人的方法(5We"ce251:767-73，1991)。Furka等(第14届国际生物化学会议，第5巻，摘要FR:013、1988;Furka、/"f./尸rate/"/仏37:487-493,1991),Houghten(美国专利No.4,631,211,1986年12月公开)和Rutter等(美国专利No.5,010,175，1991年4月23日公开)描述了产生能够作为激动剂或拮抗剂加以测试的肽混合物的方法。制备组合文库的设备可以商业获得(见例如357MPS、390MPS、AdvancedChemTech，LouisvilleKY，Symphony,Rainin，Woburn，MA，433AAppliedBiosystems，FosterCity,CA,9050Plus,Millipore,Bedford,MA)。此外，大量组合文库本身也可商业获得(见例如ComGenex,Princeton,N丄,Tripos,Inc.,St.Louis,MO，3DPharmaceuticals,Exton，PA,MartekBiosciences,Columbia,MD，等)。测试化合物文库的筛选本发明的筛选方法可针对具有干扰A5623/A2254结合的高可能性的测试化合物提供高效而快速的鉴定。一般地，任何确定测试化合物干扰A5623/A2254结合能力的方法均适用于本发明。例如，可以采用ELISA样式的竟争性和非竟争性抑制测定。应当进行对照实验以确定系统的最大结合能力(例如在下文的实例中，^使结合的A5623与A22544妄触，并确定与A5623结合的A2254的量)。下面提供了筛选测试化合物文库的进一步指导。竟争性测定样式竟争性测定可用于筛选本发明的测试化合物。作为实例，竟争性ELISA样式可以包括与固体支持物结合的A5623(或A2254)。结合的A5623(或A2254)与A2254(或A5623)及测试化合物共温育。经过足够的时间使测试化合物和/或A2254(或A5623)结合A5623(或A2254)，清洗底物以除去未结合材料。然后确定与A5623结合的A2254的量。这可以用本领域已知的多种方法中的任何一种来实现，例如使用带有可检测标记作为标签的A2254(或A5623)种类，或者使已清洗的底物与标记的抗A2254(或A5623)抗体接触。与A5623(或A2254)结合的A2254(或A5623)的量将与测试化合物干扰A2254/A5623结合的能力成反比。关于蛋白质——包括但不仅限于抗体一一的才示"i己，长口下面的文献戶斤"i己载Harlow&Lane,Antibodies,ALaboratoryManual(1988)。在一种变化形式中，用亲和标签标记A5623(或A2254)。然后，将标记的A5623(或A^54)与测试化合物和A2254(或A5623)—起温育，然后进行免疫沉淀。然后用抗A2254(或A5623)抗体对免疫沉淀物进行Western印迹。与前面的竟争性测定样式一样，被发现与A5623(或A2254)结合的A2254(或A5623)的量与测试化合物干扰A2254/A5623结合的能力成反比。非竞争测定形式对于构建样式不适于立即利用竟争性测定加以筛选的测试化合物文库，如本文所述的那些文库而言，非竟争性结合测定作为初始筛选可能也是有用的。上述文库的实例是噬菌体展示库(见例如Barret，&a/.(1992)Anal.Biochem204，357-364)。噬菌体文库有用之处在于能够快速产生工作量的很多种不同重组肽。噬菌体文库不适于本发明的竟争性测定，但是可以以非竟争样式高效地进行筛选，确定何种重组肽测试化合物结合A5623或A2254。然后可以制备已鉴定为结合性的测试化合物，并用竟争性测定样式加以筛选。噬菌体和细胞展示文库的产生和筛选在本领域是公知的，在例如如下文献中有讨论Ladnerea/.，WO88/06630;Fuchsda/.(1991)Biotechnology9:1369画72;GowardeM/.(1993)TIBS18:136-40;CharbiteM/.(1986)EMBOJ5,3029-37;Cull&a/.(1992)PNASUSA89:1865-9;Cwirla,&a/.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,6378-82。示例性的非竟争性测定遵循与上述竟争性测定相似的程序，只是不添加其中一种组分(A5623或A2254)。然而，由于非竟争样式确定的是测试化合物对A5623或A2254的结合，需要对于每个候选物确定测试化合物结合A5623和A2254二者的能力。因此，例如，可通过下列步骤确定测试化合物与固定A5623的结合清洗掉未结合的测试化合物；从支持物洗脱结合的测试化合物，随后通过例如质谱，蛋白测定(Bradford或Lowry测定，或280nm吸光度的定)对洗脱物进行分析。或者可以省略洗脱步骤，通过监测支持物表面上有机层光谱学性质的变化确定测试化合物的结合。监测表面光谱学性质的方法包括，但不限于吸光度、反射率、透光度、双折射、折光率、衍射、表面等离子体共振、椭圆偏振测量、共振镜(resonantmirror)技术、光栅耦合波导技术和多极共振光谱，所有这些对于本领域技术人员而言是已知的。在测定中还可使用标记的测试化合物，从而省去洗脱步骤。在这种情况下，洗去未结合材料后与支持物结合的标记的量与测试化合物的结合成正比。已经开发了大量公知的机器人系统，用于溶液相化学。这些系统包括自动工作站，如TakedaChemicalIndustries^>司(Osaka,Japan)开发的自动合成装置，以及许多利用机器手的机器人系统(ZymateII、Zymark公司、Hopkinton,Mass.;Orca，HewlettPackard,PaloAlto,Calif.),它们才莫拟化学技术人员的手工合成操作。上面的任何一种设备均适合于利用本发明。为使其能够如本文所述地工作而对这些设备所作的修改(如果有的话)的性质和实施，对于相关领域的技术人员而言是显而易见的。此外，可以商业获4寻大量的组合文库(见例如ComGenex，Princeton、N丄，Asinex,Moscow,Ru，Tripos,Inc.，St.Louis,MO、ChemStar,Ltd,Moscow,RU，3DPharmaceuticals,Exton，PA，MartekBiosciences,Columbia,MD,等)。转换酶筛选对于是转换酶的测试化合物，可以在非竟争样式下，用待测定转换酶特异性的辅因子和辅助底物加以测定。给定待研究的转换酶类型后，这些辅因子和辅助底物对于本领域的技术人员是已知的。用于转换酶的一个示例性筛选程序包括首先在辅因子和辅助底物的存在下，优选在生理条件下，使A5623和/或A2254与转换酶接触，其中所述辅因子和辅助底物对于转换酶的特征性蛋白的共价修饰是必需的。然后测试被修饰的蛋白结合其结合配偶体的能力(即A5623对A2254的结合)。然后比较被修饰的蛋白与其结合配偶体的结合与未修饰对照对的结合，确定如上所述的必要Ka变化是否得以实现。为了在执行测定时便于蛋白质的检测，可以利用本领域技术人员公知的技术将一种或多种蛋白用上述的可才会测标记加以标记。筛选方法上述的筛选实施方案适合于高通量确定适于进一步研究的测试化合物。特别地，本发明的筛选优选地包括如下检测步骤(a)在测试化合物的存在下，使包含A5623多肽的A2254-结合域的多肽与包含A2254多肽的A5623-结合域的多肽接触；(b)检测多肽间的结合；和(c)选择可抑制多肽间结合的测试化合物。或者向正在增殖的细胞添加所研究的测试化合物，并且相对于未提供测试化合物的对照群的增殖监测该处理细胞的增殖。根据本文所提供的教导，适于筛选测试化合物的细胞系对于本领域技术人员而言是显而易见的。对于体内测试，可以将测试化合物施用于可接受的动物模型。将基因导入到动物细胞内以表达外来基因，可根据任何方法，例如电穿孔法(Chu，efa/.，NucleicAcidsRes15:1311-26(1987))，磷酸钓法(ChenandOkayama,MolCellBiol7:2745-52(1987))，DEAE葡聚糖法(Lopatada/.,NucleicAcidsRes12:5707-17(1984)，脂质体转染试剂(lipofectin)法(DerijardB，"al.Cell7:1025-37(1994);Lamb"a/.，NatureGenetics5:22-30(1993):Rabindran/，Science259:230-4(1993))等来实施。基因可以表达与标签(例如HA或Myc)融合的蛋白质。用免疫组织化学染色考察A5623和A2254的亚细胞定位。用标签-A5623、标签-A2254或其組合转染细胞。可以利用显微镜例如焚光显微镜获得定位图像。在优选实施方案中，可以通过将A2254和A5623基因的表达载体转染入合适的细胞系而获得同时表达A2254和A5623的细胞。例如，可以使用HEK293、SW480或COS7细胞作为细胞系。而且，检测试剂优选地是识別A2254的抗体。或者，当A2254或A5623表达为与标签的融合蛋白时，可使用任何可识别蛋白质所融合的标签的抗体作为检测试剂。在本发明的试剂盒中，抗体可以用荧光剂(例如FITC、TAMRA或GFP)标记。特别地，如本文所述，本发明人观察到A5623多肽与A2254多肽相互作用。因此，相信两种多肽的相互作用在癌症发生，特别是乳腺癌发生中发挥关键作用。因此，我们意图筛选可用于治疗或预防癌症，特别是乳腺癌的化合物，其抑制A5623多肽与A2254多肽的相互作用或者其相反的相互作用。即，在测试化合物的存在下，使包含A5623多肽的A2254-结合域的多肽与包含A2254多肽的A5623-结合域的多肽接触，检测两个多肽间的结合，并选择抑制两个多肽间结合的测试化合物。当然，作为选择，还可以在测试化合物的存在下，使包含A2254多肽A5623-结合域的多肽与包含A5623多肽A2254-结合域的多肽接触。优选地，含有A2254结合域的多肽包括A5623多肽，含有A5623结合域的多肽包括A2254多肽。术语"使......接触"包括在测试化合物的存在下，通过使用测试化合物的领域已知的技术和方法，使包含A5623多肽的A2254-结合域的多肽与包含A2254多肽的A5623-结合域的多肽接触，或者使包含A2254多肽的A5623-结合域的多肽与包含A5623的多肽A2254-结合域的多肽接触。例如，可应用基于细胞的测定或无细胞测定来筛选A5623多肽与A2254多肽的结合抑制剂。在基于细胞测定的一个实例中，可以使用表达含A5623结合域的多肽和含A2254结合域的多肽的细胞进行筛选。在无细胞测定的一个实例中，可以使用部分或完全纯化的含A5623结合域的多肽和部分或完全纯化的含A2254结合域的多肽。当然，也可以使用表达含A5623结合域的多肽和含A2254结合域的多肽的细胞的提取物。上文描述了试验测定和方法的进一步的实例。术语"测试化合物，，或"待测试化合物"是指作为A5623和A2254相互作用的假定抑制剂，将要通过本发明的一种或多种筛选方法加以测试的分子或物质或化合物或组合物或药剂，或其任意组合。测试化合物可以是任何化学物质，例如无机化学物质、有机化学物质、蛋白质、肽、糖、脂类、或其任意组合，或者本文所述化合物、组合物或药剂的任何一种。应当理解，术语"测试化合物，，当用于本发明上下文中时，可以和术语"测试分子"、"测试物质"、"潜在候选物"、"候选物"或上文提到的术语互换使用。因此，我们设想了将小肽或类肽分子用于相互作用抑制剂的筛选方法中。这种小肽或类肽分子结合并占据A5623结合域或A2254结合域之一的相互作用域或者它们二者的相互作用域，藉此分别使得A5623或A2254结合域不能被A2254多肽或A5623多肽触及。而且，设想任何生物或化学组合物或物质均可作为相互作用抑制剂。抑制剂的抑制功能可以用本领域已知的方法加以测量。这些方法包括相互作用测定，如免疫沉淀测定、ELISA、RIA。同样，在筛选A5623与A2254结合或者相反结合的抑制剂时优选要使用的潜在候选分子或候选分子混合物，可以是，典型地，化学或生物来源的物质、化合物或组合物，其是自然存在的和/或合成、重组和/或化学产生的。因此，候选分子可以是与A5623和/或A2254多肽结合和/或相互作用的蛋白质、蛋白质片段、肽、氨基酸和/或其衍生物，或者其他化合物，例如离子。合成化合物文库可以从MaybridgeChemicalCo.(Trevillet,Cornwall,UK)、Comgenex(Princeton,N丄)、BrandonAssociates(Merrimack,N.H.)和Microsource(NewMilford.Conn.)商购。稀有化学文库可以从Aldrich(Milwaukee,Wis.)获得。或者，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库可以,人例如PanLaboratories(Bothell.Wash.)或MycoSearch(N.C.)获得，或者可以容易地生产。此外，天然和合成产生的文库和化合物可以容易地通过常规化学、物理或生物化学方法进行^f'务饰。此外，化学文库的产生在本领域是公知的。例如，使用组合化学产生要在本文所述测定中加以筛选的化合物文库。组合化学文库通过组合大量的化学"构成单位"(buildingblock)试剂通过化学合成或生物合成产生的各种化学化合物的集合。例如，线性组合化学文库如多肽文库的形成是通过组合每种可能的氨基酸组合来产生给定长度的肽。通过这种化学构成单位的组合混合，理论上可以合成数百万种化合物。例如，一位评论者认为，系统、组合地混合100个可互换的化学构成单位，可以理论上合成1亿种四聚体化合物或者100亿种五聚体化合物(GallopA、da/.JournalofMedicinalChemistry、37(9)1233-51(1994))。也可以使用本领域已知的其他化学文库，包括天然产物文库。一旦组合文库产生，便对其进行筛选，寻找具有期望生物学性质的化合物。在本发明的上下文中，筛选化合物文库以鉴定发挥A5623和A2254多肽结合抑制剂作用的化合物。例如，首先，用本领域公知的组合文库形成方法产生小分子文库。美国专利NOs.5,463,564和5,574,656就是两个这样的教导。然后对文库的化合物进行筛选以鉴定具有期望结构和功能性质的化合物。美国专利No.5,684,711讨论了用于筛选文库的方法。举例说明筛选过程将含有A2254结合域的多肽与含有A5623结合域的多肽以及文库中的化合物相混合，并使之彼此相互作用。然后进一步观察所述化合物是否抑制这两种多肽的结合。作为实例，只要两种多肽相互作用可产生荧光信号，而该信号在测试化合物抑制多肽间结合时会减少和/或消失，则可以应用FRET技术。相应地，两种多肽均可以包含适合于FRET的标签。这类标签在本领域是众所周知的。将每个文库化合物的特征加以编码，使得在多肽结合的抑制中表现活性的化合物能够被分析，并且已鉴定的各种化合物的共同特征能够被分离并其组合到文库的进一步迭代(interation)中。一旦筛选了一个化合物文库，即用在第一轮筛选中显示具有抗相互作用活性的化学构成单位生成后继文库。使用这种方法，随后的候选化合物迭代将具有越来越多的抑制相互作用必需的结构和功能特征，直到能够发现一组对抑制两种多肽间结合具有高度特异性的抑制剂。然后可以进一步测试这些化合物用作动物例如哺乳动物中的药物时的安全性和效力。很容易意识到，这种特定的筛选方法学只是举例。其他的方法是本领域技术人员所公知的。例如，候选药剂包括许多种类的化学物质，但典型地它们是有机分子，优选地为分子量大约50且小于大约2500道尔顿，优选地小于大约750道尔顿，更优选地小于大约350道尔顿的有机小分子。候选药剂还可能包含与蛋白质结构的相互作用特别是氢键所必需的功能基团，典型地包含至少一个胺基、羰基、羟基或羧基，优选地至少两个功能化学基团。候选试剂经常含有碳环或杂环结构和/或被一个或多个上述功能基团取代的芳香或聚芳香结构。候选药剂的示例性种类可包括杂环、肽、糖类、类固醇等。这些化合物可以接受修饰以提高效力、稳定性、药物相容性等。可以利用药剂的结构鉴定来鉴定、产生或筛选其它药剂。例如，当鉴定肽试剂时，为了提高其稳定性可以用各种方法对它们进行修饰，例如使用非天然氨基酸如D-氨基酸特别是D-丙氨酸，使氨基或羧基末端功能化，例如对于氨基进行酰化或烷基化，对于羧基进行酯化或酰胺化等。其他稳定化方法可以包括包封，例如包封在脂质体中等。如上所述，候选药剂还在生物分子中，包括肽、氨基酸、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、核酸及书f生物、结构类似物或其组合中被发现。候选药剂从广泛的来源获得，包括合成或天然化合物的文库。例如，有很多方法，包括随机化的寡核苷酸和寡肽的表达，可以用来随机和定向合成多种多样的有机化合物和生物分子。或者，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库是现有可用的或者可以容易地产生。此外，天然或合成产生的文库和化合物可容易地通过常规化学、物理和生物化学方法进行修饰，并可用于产生组合文库。可以对已知的药理学药剂进行定向或随机化学修饰，例如酰化、烷化、酯化、酰胺化等，以产生结构类似物。其他的测试化合物可以是适体、抗体、affybody、trinectin或anticalin,或类似化合物。当然，对A5623或A2254特异性的适体、抗体、affybody、trinectin或anticalin自身可能已经是A5623与A2254之间结合的抑制剂，因此可以容易地用于治疗或预防癌症，特别是乳腺癌的方法。通过本文所述的用于筛选A5623多肽与A2254多肽结合抑制剂的方法所鉴定的化合物可用于预防或治疗癌症，特别是乳腺癌。因此，抑制剂具有这样的性质直接或间接与A2254结合域和/或A5623结合域相互作用，藉此，如本文所述的，影响这些域的相互作用，使它们不再能够像在癌细胞，特别是乳腺癌细胞中那样相互作用。例如，抑制剂可以是抗A2254结合域或A5623结合域的抗体。这种抑制剂的另一种实例是affybody、适体、anticalin或trinectin。筛选和治疗试剂盒在一个实施方案中，本发明提供了用于筛选可用于治疗或预防乳腺癌的制品或试剂盒，其中该试剂盒包括(a)A5623多肽的A2M1结合域；(b)A2254多肽的A5623-结合域；和(c)检测这两种多肽间相互作用的试剂。如上文讨论的，含有A2254结合域的多肽可以包括全长的A5623多肽或其A2254结合部分。类似地，含有A5623结合域的多肽可以包括全长的A2254多肽或其A5623结合部分。在本发明进一步的实施方案中，提供了制品和试剂盒，其含有可用于治疗本文所述病理状况的材料。该制品可以包括本文所述药剂的容器和标签。合适的容器包括例如瓶、小瓶和试管。容器可以用各种材料形成，例如玻璃或塑料。在本发明的上下文中，容器容纳具有活性剂的组合物，该活性剂可有效治疗细胞增殖性疾病例如乳腺癌。在一个实施方案中，组合物中的活性剂是已鉴定为能够在体内破坏A5623/A2254结合的测试化合物(例如抗体、小分子等)。容器上的标签应当指明该组合物用于治疗一种或多种以异常细胞增殖为特征的状况。标签还可以给出施用和监测技术，例如本文所述的技术的指导。除了上述容器之外，本发明的试剂盒还可以任选地包括容纳药物可接受稀释剂的第二容器。它可以进一步包括其他商业和用户角度看理想的材料，包括其他緩冲剂、稀释剂、过滤器材、针头、注射器和带有使用指导的说明书。如果期望的话，组合物可以存在于包装或分配装置内，包装或分配装置可以包含一个或多个含有活性成分的单位剂型。包装可以例如包括金属或塑料箔，例如泡壳包装。包装或分配设备可以和施用指导放在一起。还可以制备在相容性药物载体中配制的包含本发明化合物的组合物，放在合适的容器内，并标记用于治疗指定病症的标签。附图筒述图1显示了在来源于乳腺癌患者(上图面)的肿瘤细胞(3T、31T、149T、175T、431T、453T、491T、554T、571T、709T、772T和781T)、乳腺癌细胞系(HBC4、HBC5、HBLIOO、HCC1937、MCF7、MDA画MB-231、SKBR3、TWD、YMB1)(下图面)和正常人组织中(A)A2254和(B)A兄23表达的半定量RT-PCR结果。图2显示了在各种人组织(上图面)和乳腺癌细胞系及正常人生命器官图3显示了(A)A2254和(B)A5623的基因组结构。A2254具有2个不同的变体，指称为VI和V2,A5623也具有3个不同的变体(V1、V2和V3)。上图；基因组结构，下图；对每种变体特异性的半定量RT-PCR结果。图4A是通过Western印迹分析显示的A2254蛋白的外源表达。图4B显示了A2254蛋白的亚细胞定位。图4C通过Western印迹分析显示了A5623V1、A5623V2和A5623V3蛋白的外源表达。图4D-F显示了(D)A5623V1、(E)A5623V2和(F)A5623V3蛋白的亚细胞定位。图5显示了设计用于降低乳腺癌细胞中A2254表达的小干扰RNA(siRNAs)的生长抑制效果。图5A显示了在乳腺癌细胞系T47D(左图面)和HBC5(右图面)中A2254内源表达受抑制的半定量RT-PCR。G^PDH用作内部对照。图5B显示的是MTT测定，其表明通过敲低T47D(左图面)和HBC5(右图面)细胞中的A^5斗降低了集落的数目。图5C显示的是集落形成测定，其表明通过敲低T47D(左图面)和HBC5(右图面)细胞中的A2254降低了集落的数目。图6显示了设计用于降低乳腺癌细胞中A5623表达的小干扰RNA(siRNAs)的生长抑制效果。图6A显示了在乳腺癌细胞系T47D(左图面)和HBC5(右图面)中A%23内源表达受抑制的半定量RT-PCR。Gl4尸Z)i/用作内部对照。图6B显示的是MTT测定，其表明通过敲低T47D(左图面)和HBC5(右图面)细胞中的A5623降低了集落的数目。图6C显示的是集落形成测定，其表明通过敲4氐T47D(左图面)和HBC5(右图面)细胞中的A5623降低了集落的数目。图7。A5623和A2254在乳腺癌细胞系和组织切片中的表达。图7A，乳腺癌细胞系中的内源A5623和A2254表达与HMEC细胞系中的比较，其是用抗A5623抗体或抗A2254抗体进行Western印迹分析而考察的。图7B，在乳腺癌细胞系中，内源A5623蛋白或A2254蛋白在细胞周期中的亚细胞定位。使用亲和纯化的抗-A5623多克隆抗体或抗-A2254多克隆抗体(绿色)，对HBC4、HBC5和MCF-7细胞进行A5623的免疫组织化学染色，对HBC5细胞进行A2254的免疫组织化学染色，并用DAPI(蓝色)染色以区分细胞核(见材料和方法)。白色箭头指示末期细胞中间体中A5623的定位。图7C,乳腺癌和正常组织切片(正常乳腺组织、肺、心脏、肝脏、肾和睾丸)的免疫组织化学染色结果。内源A5623蛋白用抗-A5623抗体染色。正常乳腺组织(样品No.10441)中几乎不可检测到表达，但是在所有研究的癌组织中癌细胞均被强烈染色，包括实性管状癌(sold-tubularcarcinoma)(样品No.234)、乳头管状癌(papillotubularcarcinoma)(样品No.240)和硬癌(样品No.179)。代表性图来自于原始放大倍数x200的显微镜观察。图8A5623与A2254间的相互作用。图8A,通过半定量RT-PCR检测的A5623和A2254在乳腺癌细胞系(HBC4、HBC5、HBL100、HCC1937、MCF7、MDA-MB-231、SKBR3、T47D、YMB1)和正常人组织(N，正常乳腺导管细胞；MG,乳腺；LUN,肺；LIV，肝；HEA，心脏；KID，肾；以及BM，骨髓)中的表达。图8B、C，A5623与A2254的免疫共沉淀。对来自转染了HA标签A2254和Flag标签A5623蛋白的COS7细胞的细胞裂解物用抗HA或抗Flag免疫沉淀。免疫沉淀物用单克隆抗HA或抗Flag抗体进行免疫印迹。图8D，内源A5623或A2254在稳定表达细胞中的亚细胞定位。左图面显示在稳定表达A2254的细胞中，内源A5623蛋白(红色)与外源A2254蛋白(绿色)共定位，而右图面显示在稳定A5623细胞中，内源A2254(红色)与外源A^B(绿色)共定位。外源A2254蛋白(红色)与外源A5623蛋白共定位(右图)。图9外源A2254在NIH3T3细胞中的促生长或浸润作用。图9A,表达高水平或中等水平外源A2254的细胞或者模拟载体转染的细胞的Western印迹分析。用抗HA标签单克隆抗体确认了A2254表达的外源引入。用卩-肌动蛋白用作上样对照。图9B，NIH3T3-A2254细胞的体外生长。用A2254(NIH3T3-A2254-#1、-#2、-#3、和-#4)和模拟物(NIH3T3-模拟-弁l、-#2、-#3)转染NIH3T3细胞，通过MTT测定加以测量。图9C,Matrigel浸润测定证实NIH3T3-A2254—#3、和-#4和MH3T3-模拟-弁l可增强浸润。计算迁移通过Matrigel包被滤膜的细胞数目。每次一式三孔进行3次测定。实施本发明的最佳模式在下面的实施例中将对本发明进行进一步的描述，它们并不限制由权利要求所述的本发明的范围。[一般方法]细胞系和临床材料人乳腺癌细胞系HBC4、HBC5、MDA-MB-Ml由Yamori博士(财团法人癌研究会，东京)惠赠，BT-549、MCF-7、T47D、SKBR3、HCC1937、MDA-MB-435S、YMB1、HBL100和COS7从ATCC获得。全部细胞培养在合适的培养基中，即BT-549、HBC4、HBC5、SKBR3、T47D、YMB1、和HCC1937用RPMI-1640(Sigma、St.Louis、MO)(含2mML-谷氨酰胺)；HBL100、COS7用Dulbecco修饰的Eagle培养基(Invitrogen、Carlsbad、CA);MCF-7用含0.1mM必需氨基酸(Roche),lmM丙酮酸钠(Roche)、0.01mg/ml胰岛素(Sigma)的EMEM(Sigma),MDA-MB-231和MDA-MB-435S用L-15(Roche)。每种培养基均添加10。/。胎牛血清(Cansera)和1%抗生素/抗真菌剂溶液(Sigma)。MDA-MB-231和MDA-MB-435S细胞维持在37。C无C02的湿润气氛中。其他的细胞系维持在37。C含5。/。C02的湿润气氛中。临床样品(乳腺癌和正常乳腺导管)从外科标本获得，并获得了所有患者的相关知情同意。4//7的cDA^凝萍/li:^"54和爿56W的i^《摩/七袭的新入类差^的为Sf为了检测在乳腺癌中通常被上调的基因，对微阵列上27,648个基因的全部表达图式进行了筛选，以选择分别在>50%的i)全部77个绝经前乳腺癌病例，ii)69个浸润性导管癌，iii)31个高度低分化损害、iv)14个中等低分化损害或v)24个低分化损害的病例中表达比>3.0的基因。在全部493个在肺瘤细胞中表现为上调的基因中，我们着眼于内部标识号为A2254和A5623的基因，因为它在超过50%的提供信息的乳腺癌病例中的表达比大于3.0，而通过正常人组织表达模式发现它在包括心脏、肺、肝和骨髓在内的正常组织中过低表达。羊定量ir-尸C7为、#我们从激光捕获细胞的各个群体中提取总RNA，然后进行基于T7的扩增和反转录，如前文所述(OnoK、"a/.、CancerRes.、60、5007-11、2000)。我们通过监测甘油醛-3-磷酸脱氢酶(01PZ)^)作为定量内部对照，制备了每种单链cDNA的合适的稀释物，用于随后的PCR扩增。PCR引物序列如下5'-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3'(SEQIDNO;l)和5'画GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT画3'(SEQIDNO;2)用于04尸￡>//;5，-AACTTAGAGGTGGGAGCAG-3，(SEQIDNO:45)和5，-CACAACCATGCCTTACTTTATC-3，(SEQIDNO:46)用于々2MG;5'画ACTCTAGGACTTGCATGATTGCC画3'(SEQIDNO;3)和5'-TGGGTGTCAAACCAAACAGA-3'(SEQIDNO;4)用于A2254V1,5'-GTTAGAACTTGTTTCCTCCTCCG-3'(SEQIDNO;5)和5'-ATCCTCAATGGTATTTCAGC-3'(SEQIDNO;6)用于A2254V2,5'画GTGGTCCTAGGAGACTTGGTTTT画3'(SEQIDNO;7)和5'國TACATGCATACCCCCAACAA-3'(SEQIDNO;8)用于A5623的共有区域，5'國GCTTCAGCGAGAACTTTC-3'(SEQIDNO;9)和5'-CAACTGTAACACTCATTCACATC-3'(SEQIDNO;10)用于A5623V1,5'画CTATTCTGAGTTTGCGCGAGAAC-3'(SEQIDNO;1l)和5'-CAACTGTAACACTCATTCACATC-3'(SEQIDNO;10)用于A5623V2,5'画CATCCTGAGTGCGAGAACTTTC-3'(SEQIDNO;12)和5'陽CAACTGTAACACTCATTCACATC-3'(SEQIDNO;10)用于A5623V3。7Vor^ze/72-6/o/#浙根据制造商的说明书，用Rneasy试剂盒(QIAGEN)从所有乳腺癌细胞系中提取了总RNA。用DNaseI(NipponGene、Osaka、Japan)处理后，用mRNA纯化试剂盒(AmershamBiosciences)根据制造商的说明书分离mRNA。将l-昭等份的每种mRNA与从正常成人乳腺(Biochain)、肺、心脏、肝、肾、骨髓(BD、Clontech，PaloAlto，CA)分离的聚A(+)RNA—起在1%变性琼脂糖凝胶上分离，并转移到尼龙膜上(乳腺癌-Northem印迹)。将乳腺癌-和人多组织Northern印迹(Clontech，PaloAlto,CA)与[a32p]-dCTP-标记的A2254和A5623PCR产物杂交，该PCR产物通过RT-PCR制备(见下文)。根据供应商的推荐进行预杂交、杂交和清洗。印迹用增感屏在-80。C放射自显影14天。针对A2254(548bp)和A5623(454bp)的特异性探针使用如下引物组通过PCR制备5'-ACTCTAGGACTTGCATGATTGCC-3'(SEQIDNO;3)和5'隱TGGGTGTCAAACCAAACAGA陽3'(SEQIDNO;4)用于A2254的共有区域，5'画GTGGTCCTAGGAGACTTGGTTTT-3'(SEQIDNO;7)和5'-TACATGCATACCCCCAACAA-3'(SEQIDNO;8)用于A5623的共有区域。此外，A2254V1的特异性探针(350bp)用如下的特异性引物组通过PCR制备5'-CTGGAAGAGCAGGCTAGCAG誦3'(SEQIDNO;13)和5'-GCTGCGGAGAAAGCTCTATG-3'(SEQIDNO;14)。袭这裁谬的询建为了构建A5623和A2254表达载体，用KOD-PlusDNA聚合酶(Toyobo，Osaka,Japan)通过PCR扩增PRC1cDNA的整个编码序列。引物组为A5623-正向，5'画CCGGAATTCTCCGCCATGAGGAGAAGTGA-3'(SEQIDNO:47)(下划线表示EcoRI位点)和A5623-反向，5'扁TTGCCGCTCGAGGGACTGGATGTTGGTTGAA-3'(SEQIDNO:48)(下划线表示Xhol位点)，A2254-正向，5，-CCGGAATTCATGGCCATGGACTCGTCG隱3，(SEQIDNO:49)和A2254-反向，5'-GCTCCGCTCGAGCTGGGGCCGTTTCTT-3'(SEQIDNO:50)。将PCR产物插入到pCAGGS-nHA或pCAGGS-Flag表达载体的EocRI和XhoI位点中。戎-562J-謦我体和戎-225謦我沐使用pET21载体(Novagen、Madison、WI)制备质粒，这些质粒被设计用于分别表达A5623两个片段(179-360和234-360位氨基酸)或A2254的两个片段(86-239和124-239位氨基酸)，其中所述片段的C端带有His标签标记的表位。分别在大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21codon-plus抹(Stratagene、LaJolla、CA)中表达重组肽，并用Ni-NTA树脂琼脂糖(Qiagen)根据供应商的实验方案进行纯化。将纯化的重组蛋白混合在一起，然后免疫接种到兔子体内。将免疫血清在亲和柱上根据标准方法学纯化。将亲和纯化的抗-A5623抗体或抗A2254抗体用于Western印迹、免疫沉淀和免疫细胞染色，如下文所述。我们通过Western印迹分析证实，这些抗体可以分别特异性识别MCR7乳腺癌细胞中的内源A5623蛋白或A2254蛋白。^瘦勿應必孝豸惑为了r查内源A5623蛋白或A2254蛋白在乳腺癌细胞系MCF7、HBC4和HBC5中的亚细胞定位，我们以每孔lxl05个细胞4妾种细胞(Lab-TekII腔室玻片、NalgenNuncInternational、Naperville、IL)。温育24小时后，细胞用含有4°/。多聚甲醛的PBS(-)固定15分钟，并用含有0.1%TritonX-100的PBS(-)于4°C处理2.5分钟以使其可渗透。随后，在4°C用含3%BSA的PBS(-)覆盖细胞12小时，以封闭非特异性杂交，随后用1:1000稀释的兔抗A5623多克隆抗体或1:1000稀释的抗A2254多克隆抗体温育。用PBS(-)清洗后，将细胞用1:1000稀释的Alexa488-偶联的抗兔第二抗体(MolecularProbe,Eugene,OR)染色。用4',6，-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸(4',6'-diamidine-2'-phenylindolendihydrochrolide)(DAPI)3于细刀包核复染色。在TCSSP2AOBS(Leica,Tokyo,Japan)下获得荧光图像。我们用FuGENE6转染试剂(Roche)根据制造商说明书分別将l|ugpCAGGS誦A2254陽HA、pCAGGS隱A5623Vl-HA、pCAGGS画A5623V2-HA或pCAGGS-A5623V3-HA瞬时转染到COS7细胞内。将细胞裂解物在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到硝酸纤维素膜上，然后与1:1000稀释的作为第一抗体的小鼠抗HA抗体(Roche)温育。与作为第二抗体的绵羊抗小鼠IgG-HRP(AmershamBiosciences"显育后，用ECL^式剂盒(AmershamBiosciences)使信号可视化。而且，为了检测乳腺癌细胞系(BT-474、BT-549、HBC4、HBC5、HBL-100、MCF-7、MDA-MB-231、SKBR3和T47D)和HMEC(人乳腺上皮细胞)中的内源A5623蛋白或A2254蛋白，将细胞在含有0.1%蛋白酶抑制剂合剂III(Calbiochem,SanDiego，CA)的裂解緩冲液(50mMTris-HCl,pH8.0/150mMNaCl/0.5。/。NP-40)中裂解。用蛋白测定试剂盒(Bio-Rad、Hercules、CA)估计总蛋白量，然后将蛋白与SDS-上样緩沖液混合，煮沸，然后加载到10%SDS-PAGE凝胶。电泳后，将蛋白点样到硝酸纤维素膜(GEHealthcare)上。将含有蛋白的膜用封闭液封闭，然后与抗A5623多克隆抗体或抗A2254多克隆抗体一起温育，用于检测内源A5623蛋白或A2254蛋白。最后将膜与HRP偶联的第二抗体温育，并通过ECL检测试剂(GEHealthcare)使蛋白条带可视化。对(3-肌动蛋白进行实验作为上样对照。^瘦勿/g必孝籴悉为了检查A2254或A5623V1、A5623V2和A5623V3的亚细胞定位，我们对于所有4个构建体以每孔lxl()S个细胞接种C0S7细胞。24小时后，使用FuGENE6转染试剂(Roche)根据制造商说明书分另'J以l吗pCAGGS誦A2254画HA、pCAGGS画A5623Vl-HA、pCAGGS-A5623V2-HA或pCAGGS-A5623V3-HA瞬时转染COS7细胞。然后，用含有4%多聚曱醛的PBS固定细胞15分钟，并用含有0.1%TritonX-100的PBS4°C处理2.5分钟以使其可渗透。随后，于4。C将细胞用含3。/。BSA的PBS覆盖12小时以封闭非特异性杂交。接着，将每种被构建体转染的COS7细胞与1:1000稀释的大鼠抗HA抗体(Roche)—起温育。用PBS清洗后，用1:1000稀释的Alexa594-偶联的抗大鼠第二抗体(MolecularProbe)对所有转染细胞进行染色。用4'，6-二脒基-2-苯基巧l哚二盐酸(4',6'画diamidine-2'-phenylindolendihydrochrolide)(DAPI)对细胞核复染色。在TCSSP2AOBS(Leica,Tokyo,Japan)显微镜下获得荧光图像。我们根据先前的报道(WO2004/076623)用psiU6BXsiRNA表达载体建立了基于载体的RNAi系统。通过将表1中的双链寡核苷酸克隆到psiU6BX3.0载体的5&I位点中制备针对A2254(psiU6BX-A2254)和A5623(psiU6BX-A5623)的siRNA表达载体。对照质粒——psiU6BX-模拟，是通过将如下的双链寡核香酸克隆到psiU6BX3.0载体的万fel位点中制备的GCTTC-3，(SEQIDNO;15)和GCTTC-3，(SEQIDNO;16》针对A2254和A5623小干扰RNA的寡核苷酸序列如下所示。表1.针对A2254和A5623小干扰RNA的寡核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>下划线指示特异性siRNA序列。爿"M和^5仍的^踏兄默效^将人乳腺癌细胞系T47D和HBC5涂布在10-cm培养皿上(lx106个细胞/皿)，并用FuGENE6试剂根据供应商的推荐(Roche)以psiU6BX-模拟(作为阴性对照)、psiU6BX-A2254或psiU6BX-A5623进行转染。每种构建体转染后7天，从细胞提取总RNA,然后用上述针对A2254和A5623共有区域的特异性引物通过半定量RT-PCR确认siRNA的敲低效应。作为内部对照的04尸Z)/f的引物如下5'-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3'(SEQIDNO;l)和5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3'(SEQIDNO;2)。另夕卜，将使用T47D和HBC5细胞系表达siRNA的转染子在含有0.7mg/ml新霉素的选择培养基上培养28天。用4%多聚曱醛固定后，将转染细胞用Giemsa溶液染色，以评估集落形成。进行MTT测定以定量细胞生存能力。在含有新霉素的培养基中培养12天后，添加MTT溶液(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)(Sigma)，浓度为0.5mg/ml。37。C温育2.5小时后，添加酸-SDS(0.01NHCl/10。/。SDS);剧烈混合悬浮液，然后37。C温育过夜以溶解深蓝色晶体。用MicroplateReader550(BioRad)测量570nm吸光度。,H定养,他m伊遂将细胞在裂解緩沖液(50mMTris-HCL(pH8.0)、150mMNaCL、0.5%NP-40和蛋白酶抑制剂合剂组III(Calbiochem、SanDiego、CA))中裂解。将等量的总蛋白与1mg大鼠抗HA抗体(Roche)或小鼠抗Flag抗体(SantaCruz)在4。C共温育1小时。将免疫复合物与蛋白G-Sepharose(ZymedLaboratories,SouthSanFrancisco,CA)共温育1小时，然后用裂解缓冲液清洗。共沉淀蛋白通过SDS-PAGE进行分离。将SDS-PAGE分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，然后与大鼠抗HA抗体或小鼠抗Flag抗体(SantaCruz)共温育，在与偶联HRP的第二抗体共温育之后，用ECL试剂盒(AmershamBiosciences)使信号可视化。^jfl;t袭迷J56W成^2254的JV/i/Jr3勿/《如上所述，用FUGENE6将A5623或A2254表达载体或4莫拟载体转染进入NIH3T3细胞。将转染的细胞在含有0.9mg/ml遗传霉素(G418)(Invitrogen)的培养基中温育。将克隆NIH3T3细胞通过有限稀释进行亚克隆。用抗HA单克隆抗体通过Western印迹分析对带HA标签的A5623或A2254的表达进行评估。最后，建立了数个克隆，并命名为A5623-NIH3T3或A2254-NIH3T3。为了研究A2254的促生长作用，我们将4种独立的A2254-NIH3T3细胞和3种独立的MOCK-NIH3T3细胞每种接种了5000个细胞，并通过MTT测定每天记录细胞数目，经过6天。这些实验按一式三份进行。而且，我们研究了A2254-NIH3T3细胞(A2254-NIH3T3-3和-4)浸润通过matrigel的能力。简而言之，我们将2种独立的A2254-NIH3T3细胞(A2254-NIH3T3-3和-4)和一种独立的模拟-NIH3T3细胞分别接种了10000个细胞，并且将细胞在含有10%FCS的DMEM中培养到汇合。将细胞通过胰蛋白酶处理加以收集，在不加血清或蛋白酶抑制剂的DMEM中清洗，并以lXl()S个细胞/mL的浓度悬浮在DMEM中。在制备细胞悬液前，在室温下用DMEM只十Matrigel基质(BectionDickinsonLabware、Bedford,MA)干燥层再水化2小时。向24孔Matrigel浸润小室的每个下部小室添加含有10%FBS的DMEM，并向每个上部小室的插入片(insert)添加0.5mL(5X104个细胞)细胞悬液。将板在37。C温育22小时。温育后，对小室进行处理，将浸润通过matrigel包被的插入片的细胞加以固定，并用Giemsa染色，以上步骤均按照供应商(BectionDickinsonLabware)的说明。名瘦jg织化夢染悉用抗A5623兔多克隆抗体研究A5623蛋白在乳腺癌和正常组织中的表达图式。简而言之，将石蜡包埋的标本用二曱苯和乙醇处理，并用蛋白封闭试剂(DakoCytomation,Carpinteria,CA)封闭。添加抗体稀释溶液(1:100)中的多克隆抗体，然后用底物-色原(DAKOliquidDABchromogen、DakoCytomation)染色。最后，将组织标本用苏木精染色以区分细胞核和细胞质。[结果]謇;t^2254和爿56W力#乙靡^勿/《中的J:濕差西当我们用代表27,648个人类基因的cDNA微阵列分析来自77位绝经前乳腺癌患者的癌细胞的基因表达模式时，我们鉴定了493个在乳腺癌细胞中普遍上调的基因。在它们中，我们关注了下面两种基因一种内部编号为A2254,被指称为驱动蛋白家族成员2C(X/F2C)(SEQIDNO;35、36),另一种内部编号为A5623,被指称为胞质分裂蛋白调节子1(Genebank登录号No.NM—003981;SEQIDNO;39、40)。在微阵列上，与正常乳腺导管细胞相比，A2254和A5623基因的表达分别在60例乳腺癌中的44例和58例乳腺癌中的37例中有所升高。为了确认这些上调基因的表达，我们进行了半定量RT-PCR分析来比较乳腺癌标本与含有正常乳腺导管细胞的正常人组织之间的表达水平。首先，我们发现，与正常乳腺导管细胞和正常人组织，包括乳腺、肺、心脏、肝、肾和骨髓相比，A2254的表达在12例临床乳腺癌标本(低分化型)中的7例中有所升高(图1A,上图面)。此外，该基因在全部9种乳腺癌细胞系中均过高表达(图1A，下图面)。接着，我们还发现，与正常人组织，特别是正常乳腺导管细胞(图1B，上图面)相比，A5623的表达在12例乳腺癌标本(低分化型)中的7例中有所升高，并且在我们检查的全部9种乳腺癌细胞系中均过高表达(图1B，下图面)。为了进一步检查这些基因的表达图式，我们用A2254和A5623的cDNA片段作为探针对多种人组织和乳腺癌细胞系进行了Northern印迹分析(见材料和方法)。A2254在除睾丸和胸腺外的正常人组织无表达或者表达无法检测(图2A,上图面)，而与除骨髓之外的其他正常组织相比，其在乳腺癌细胞系中令人惊讶地过高表达(图2A，下图面)。A5623也仅在睾丸中表达(图2B，上图面)，而与除骨髓之外的其他正常组织相比，特别是与正常人乳腺相比，在所有乳腺癌细胞系中显著过高表达(图2B,下图面)。因此，我们关注这些乳腺癌特异性表达的转录物。为了获得A2254和A5623的完整cDNA序列，我们用乳腺癌细胞系T47D作为模板进行RT-PCR。A2254由21个外显子构成，指称为驱动蛋白家族成员2C(X/F2C)，位于染色体lp34.1上。A2254的全长mRNA序列包含2886个核苷酸，编码725个氨基酸。A2254具有两种不同的转录变体，它们分别由21和20个外显子构成，分别对应于A2254V1(GenBank登录号NO:AB264115,SEQIDNO:35,36)和A2254V2(GenBank登录号NO:AY026505,SEQIDNO:37，38)(图3A，上图面)。VI变体的外显子1和2分别是185bp和94bp，而V2变体没有VI的外显子1和2，而具有一个由346bp构成的新外显子作为外显子1。V2变体的最后一个外显子(外显子20)比VI变体的最后一个外显子(外显子21)的3，端短537bp。A2254V1和A2254V2变体的全长cDNA序列分别含有2886和2401个核苷酸。这些变体的ORF开始于每个外显子1内。最后，VI和V2转录物分别编码725和671个氨基酸。为了进一步确认每种变体在乳腺癌标本和正常人组织中的表达图式，我们用识別每种变体的引物组进行半定量RT-PCR。结果，我们发现，与V2变体的表达相比，A2254V1变体主要在乳腺癌细胞中表达，而V2变体仅在睾丸中表达(图3A;下图面)。因此，我们关注A2254VI变体。A5623也有三种不同的转录变体，它们分别由15、14和14个外显子构成，分别对应于A5623V1(Genbank登录号NO:NM—003981;SEQIDNO:39，40),A5623V2(Genbank登录号NO:NM—199413;SEQIDNO:41,42)和A5623V3(Genbank登录号NO:NM—199414;SEQIDNO:43，44)(图3B,上图面)。VI的外显子13和14有可选择的变化形式，其余外显子在所有变体中保持相同。V2变体没有VI的外显子14,在最后一个外显子内产生新的早期终止密码子。V3的外显子14被完全缺失，并且V3的外显子13比VI的外显子13在3'端短77bp,在最后一个外显子内也产生一个新的早期终止密码子。A5623V1、A5623V2和A5623V3变体的全长cDNA序列分别由3128、3091和3011个核苷酸构成。这些变体的ORF开始于每个外显子l内。最后，VI、V2和V3转录物分别编码620、606和566个氨基酸。为了进一步确认每种变体在乳腺癌标本和正常人组织中的表达模式，我们用识别每种变体的引物组进行了半定量RT-PCR。结果，我们发现，与正常人组织相比，所有变体在乳腺癌细胞细胞中高度过高表达(图3B;下图面)。因此，我们进一步对A5623的全部变体进行了功能分析。^2254和J562J的亚勿/《;t位为了进一步考察A2254和A5623的特征，我们检查了这些基因产物在COS7细胞中的亚细胞定位。首先，当我们将表达A2254蛋白(pCAGGS-A2254-HA)的质粒瞬时转染到COS7细胞中时，我们通过Western印迹分析观察到了具有预期大小的81KD-A2254蛋白(图4A)。此外，免疫细胞化学染色显示外源A2254在转染细胞中位于质膜下(图4B)。令人惊讶的是，免疫细胞化学染色中的阳性信号在细胞-细胞附着的膜中消失，提示该基因可能在细胞-细胞相互作用或细胞极性中发挥关键作用。接着，当我们又将表达A5623V1、V2和V3蛋白(pCAGGS-A5623-HA)的质粒瞬时转染到COS7和T47D细胞中时，通过Western印迹分析观察到了具有各自预期大小的外源A5623VI、V2和V3蛋白(图4C)。而且，免疫细胞化学染色显示，A5623的全部变体蛋白在转染细胞中均作为中间纤维定位于细胞质器(图4D、E、F)，提示A5623可能也在细胞-细胞相互作用中发挥关键作用。我们开发了抗A5623或A2254的多克隆抗体，然后通过Western印迹分析，用HMEC(人乳腺上皮细胞)作为实验对照，研究了A5623蛋白或A2254蛋白在来自乳腺癌细胞系BT-474、BT-549、HBC4、HBC5、HBL-100、MCF-7、MDA-MB-231、SKBR3和T47D的细胞裂解物中的内源表达。全部乳腺癌细胞系均显示了高水平的A5623或A2254表达，而HMEC细胞显示非常微弱的表达。随后用抗A5623多克隆抗体对乳腺癌细胞系HBC4、HBC5和MCF7进行免疫细胞化学分析显示，内源A5623主要定位于中期细胞的细胞质和/或细胞核器中。特别地，观察到内源A5623位于所有乳腺癌细胞系的中间纤维网络。当细胞经历有丝分裂时，A5623发生显著的再分布。在前期，它与有丝分裂纺锤体极共定位，然后从中期到后期的早期阶段与整个有丝分裂纺锤体共定位。到中后期为止，A5623在细胞的后期纺锤体中间区集中成为一系列窄带(图7B)。随后用抗A2254多克隆抗体对乳腺癌细胞系、HBC5进行免疫细胞化学染色表明，内源A2254被观察到主要定位于中期细胞的细胞质器中，尽管外源A2254位于转染细胞的质膜下。当细胞经历有丝分裂时，A2254经历显著的再分布。尽管A2254在中期细胞中仍然定位于细胞质内，但是A2254在细胞的后期纺锤体中间区集中成为一系列窄带(图7B)。最后，该蛋白积累在末期细胞的中间体。这些发现提示，在乳腺癌细胞以及先前描述的HeLa细胞中(MollinariC、etal.JCellBiol、2002;157;1175—86.;MollinariC、etal.MolBiolCell.2005;16;1043-55.)，A5623和A2254在胞质分裂中发挥重要作用。为了进一步研究A5623在乳腺癌和正常组织切片中的表达，我们用抗A5623抗体进行了免疫组织化学染色。我们确认在三种不同组织亚型的乳腺癌即管内癌、乳头管癌和硬癌的细胞质和细胞核中有强烈染色，但是其表达在正常乳腺组织中几乎才企测不到(图7C，上图面)。而且，与Northen印迹分析结果一致，在睾丸中检测到其表达，而在心脏、肺、肝和肾中均未见表达(图7C，下图面)。说V"力膠效^"54*^5(5"羞这的'/、i挽'iA^&7A^j的ji为了评估A2254和A5623的促生长作用，我们以基于哺乳动物载体的RNA干扰(RNAi)技术(见上文)为手段，敲低了已显示A2254和A5623过高表达的乳腺癌细胞系T47D和HBC5中内源A2254和A5623的表达。通过半定量RT-PCR实验检查了A2254和A5623的表达水平。如图5和6所示，与对照siRNA构建体(psiU6BX-模拟)相比，这两个基因各自的siRNA构建体——A2254(si2和si5)和A5623(sil和si2)特异性siRNA，显著抑制了各自基因的表达(图5A，6A)。为了确认A2254和A5623特异性siRNAs的细胞生长抑制，我们分别实施了集落形成和MTT测定。A2254(si2和si5)(图5B、C)和A5623(sil和si2)(图6B、C)构建体的引入抑制了T47D和HBC5细胞的生长，与上文降低表达的结果一致。每个结果都得到了3次独立实验的验证。这些发现提示，A2254和A5623在乳腺癌细胞生长中具有重要的功6匕叱。」2254的致症活嫂为了进一步证实A2254的促生长作用，我们建立了稳定表达外源A2254的NIH3T3-衍生细胞(NIH3T3-A2254-1、-2、-3和-4细胞)。Western印迹分析表明在三个衍生克隆(NIH3T3-A2254-l、-2和-3)中有高水平的外源A2254蛋白，在一个克隆(A2254-4)中有低水平的A2254(图9A)。随后的MTT测定显示，外源A2254的过高表达对细胞生长无显著提高(图9B)。这些发现提示，尽管单是A2254基因过高表达不具有促生长活性，但该基因产物缺乏对于乳腺癌细胞的存活具有重要影响。而且，因为我们首次观察到外源A2254位于转染细胞的质膜下，所以我们进行matrigel浸润测定以确定A2254在细胞运动性中是否发挥某种作用。稳定表达外源A2254的NIH3T3-衍生细胞(NIH3T3-A2254-3和-4细胞)通过matrigel的浸润，相比于模拟稳定转染细胞(NIH3T3-模拟)显著提高，且根据Western印迹结果显示该提高依赖于A2254蛋白表达(图9C)，这表明A2254基因可能在肺瘤细胞浸润中也具有关键作用。为了进一步研究A5623在乳腺癌细胞中的生理功能，我们尝试了鉴定其相互作用蛋白。我们发现驱动蛋白家族成员2C/有丝分裂-着丝粒-相关驱动蛋白(KIF2c/MCAK)蛋白(A2254)是可能的候选A5623-相互作用蛋白，因为该蛋白已知在晚后期或末期细胞中定位于中间体中或收缩环附近，并且在中间区形成和胞质分裂中发挥作用。此外，有报道称A5623与数种驱动蛋白家族蛋白相互作用(KurasawaY，"a/.EMBOJ2004;23;3237-48.;ZhuC,&a/.ProcNatlAcadSciUSA2005;102;343—8.;GrunebergU，"2006;172;363-72.)。我们首先通过半定量RT-PCR分析研究A2254在乳腺癌病例中的表达图式，发现A2254和A5623在乳腺癌病例中共上调(图8A)。随后，我们用共转染到C0S7细胞中的Flag-标签A5623和HA-标签A2254进行免疫共沉淀实验。利用抗Flag和抗HA抗体，我们确认Flag-标签A5623与HA-标签A2254共沉淀(图8B),并且HA-标签A2254反过来与Flag-标签A5623共沉签(图8C),表明这两种蛋白相互作用。随后，我们建立了稳定表达外源A5623和A2254的NIH3T3-衍生细胞(NIH3T3-A5623和NIH3T3-A2254细胞)。免疫细胞化学分析显示，内源小鼠A5623和稳定表达的外源A2254在NIH3T3细胞中在晚后期共定位于中间区形成物(图8D，左图面)，内源A2254和稳定表达的外源A5623在NIH3T3细胞中在晚后期共定位于中间区形成物(图8D)。尽管还需要进一步研究内源A5623和内源A2254在乳腺癌细胞中的共定位，但是这些结果强烈提示A5623和A2254的构像(conformation)可能在癌细胞的胞质分裂中发挥关键作用。[讨论]通过利用全基因组cDNA微阵列技术的乳腺癌的精确表达^^莫式，我们分离了新基因A2254和A5623,与正常人组织相比，它们在乳腺癌细胞中显著过高表达。而且，Northern印迹分析显示，A5623和A2254的表达在除睾丸和骨髓之外的所检查的任何正常人组织中几乎不能检测到。而且，利用抗A5623多克隆抗体或抗A2254多克隆抗体进行的免疫组织化学染色实验清晰地表明，A5623或A2254的表达在乳腺癌组织切片中上调。这些结果显示，该基因可能成为开发乳腺癌抗癌剂的有价值的靶标。我们的免疫细胞化学染色实验显示，A5623在分裂间期的乳腺癌细胞中定位于细胞质和/或细胞核，在晚后期定位于中间区，在末期定位于收缩环。进一步，我们证实，用siRNA处理乳腺癌细胞，有效抑制了所有三种靶基因A2254和A5623的表达，并显著抑制了乳腺癌细胞/肿瘤的生长。这些发现提示，A2254和5623可能在肿瘤细胞生长增殖中发挥关键作用，并可作为具有前景的用于开发抗癌药物的靶标。我们证实，通过siRNA敲低内源A5623诱使乳腺癌细胞中胞质分裂失败，造成多核细胞的积累和随后细胞死亡。这些发现提示，A5623也在乳腺癌细胞的胞质分裂中发挥作用。A5623据报道还与几种驱动蛋白家族蛋白相互作用(KurasawaY，a/.E固OJ2004;23;3237—48.;ZhuC,d<a/.ProcNatlAcadSciUSA2005;102;343-8.;GrunebergU,"2006;172;363-72.)。根据报道，A5623能够与几种分子，例如与有丝分裂事件，特别是胞质分裂相关的KIF4或KIF14相互作用(KurasawaY，da/.EMBOJ2004;23;3237~48.;ZhuC,"a/.ProcNatlAcadSciUSA2005;102;343-8,)。然而，在我们的整个乳腺癌表达模式中，KIF4和KIF14在乳腺癌中均不表达(数据未显示)。因此，我们进一步通过鉴定A5623的相互作用蛋白考察了其在乳腺癌细胞中的生物学作用，并且鉴定A2254(驱动蛋白家族成员2C/有丝分裂-着丝粒相关驱动蛋白)蛋白作为候选相互作用蛋白，因为该蛋白已知在晚后期或末期细胞中定位于中间体中或收缩环附近，并且在中间区形成和胞质分裂中发挥作用。如图8所示，我们证实了细胞周期中，特别是在末期细在乳腺癌病例中的证据提示，它们的相互作用在乳腺癌发生中发挥关键作用。而且，我们确定了A5623与A2254的结合区(51-70和200-4卯氨基酸)(数据未显示)。尽管还需要进一步分析A5623的功能，但是所提供的数据应当有助于更加深入地理解乳腺癌的发生和开发乳腺癌的新型治疗方法。工业适用性本发明人已证明特异性靶向A2254或A5623基因的小干扰RNA(siRNA)抑制细胞生长。因此，这种新型的siRNA是用于开发抗癌药物的有用靶标。例如，阻断A2254或A5623表达或者阻止其活性的药剂可用作抗癌剂，特别是用于治疗乳腺癌(BRC)的抗癌剂。本发明参考其特定的实施方案进行了详细的描述，但是本领域的技术人员在不背离本发明精神和范围的前提下显然知道可以作出各种变化和修改。权利要求1.一种治疗或预防受试者中乳腺癌的方法，包括向所述受试者施用组合物，所述组合物含有抑制A2254(SEQIDNO35或37)或A5623(SEQIDNO39，41或43)表达的小干扰RNA(siRNA)。2.权利要求l的方法，其中所述siRNA包括有义核酸序列和反义核酸序列，所述反义核酸序列与来自A2254或A5623的序列特异杂交。3.权利要求2的方法，其中所述siRNA包含如下所述的核糖核苷酸序列作为靶序列该核糖核苷酸序列对应于选自SEQIDNO:21、25、29和33的序列。4，权利要求3的方法，其中所述siRNA具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，，其中[A]是与从SEQIDNO:21、25、29和33的核苷酸中选择的序列对应的核糖核苷酸序列；[B]是由3-23个核苷酸构成的核糖核苷酸环序列，[A，]是由[A]的互补序列构成的核糖核苷酸序列。5.权利要求l的方法，其中所述组合物包括转染增强剂。6.—种双链分子，包括有义链和反义链，其中有义链包括与从SEQIDNO:21、25、29和33中选择的靶序列对应的核糖核苷酸序列，其中反义链包括与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链彼此杂交形成所述双链分子，并且其中所述双链分子在被引入到表达或」5623基因的细胞内时抑制所述基因的表达。7.权利要求6的双链分子，其中所述靶序列包括来自从SEQIDNO:35、37、39、41和43中选"f奪的核苷酸序列的至少大约IO个连续核苷酸。8.权利要求7的双链分子，其中所述靶序列包括来自从SEQIDNO:35、37、39、41和43中选择的核苷酸序列的大约19至大约25个连续核苷酸。9.权利要求8的双链分子，其中所述双链分子是单一核糖核苷酸转录物，包括通过单链核糖核苷酸序列连接的有义链和反义链。10.权利要求7的双链分子，其中该双链分子是长度小于大约100个核苦酸的寡核苷酸。11.权利要求10的双链分子，其中该双链分子是长度小于大约75个核苦酸的寡核苷酸。12.权利要求11的双链分子，其中该双链分子是长度小于大约50个核芬酸的寡核香酸。13.权利要求12的双链分子，其中该双链分子是长度小于大约25个核苷酸的寡核苷酸。14.权利要求13的双链分子，其中该双链分子是长度为大约19-大约25个核苷酸的寡核芬酸。15.—种编码权利要求7的双链分子的载体。16.权利要求15的载体，其中该载体编码转录物，所述转录物具有二级结构并且包括有义链和反义链。17.权利要求16的载体，其中该转录物进一步包括连接所述有义链和所述反义链的单链核糖核香酸序列。18.—种包含多核苷酸的载体，该多核芬酸包括有义链核酸和反义链核酸的组合，其中所述有义链核酸包括SEQIDNO:21、25、29和33的核苷酸序列，所述反义链核酸由与有义链互补的序列构成。19.权利要求18的载体，其中所述多核苷酸具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，其中[A]是SEQIDNO:21、25、29和33的核苷酸序列；[B]是由3-23个核苷酸构成的核苷酸序列；[A，]是与[A]互补的核芬酸序列。20.—种用于治疗或预防乳腺癌的药物组合物，包括作为活性成分的药物有效量的小干扰RNA(siRNA)和药物可接受的载体，其中该siRNA可抑制A2254或A5623的表达。21.权利要求20的药物组合物，其中该siRNA包含从SEQIDNO:21、25、29和33选择的核苷酸序列作为靶序列。22.权利要求21的组合物，其中该siRNA具有通式5'-[A]-[B]-[A，]-3，其中[A]是相应于SEQIDNO:21、25、29和33的核苷酸序列的核糖核苷酸序列；[B]是由3-23个核苷酸构成的核糖核苷酸序列；[A，]是与[A]互补的核糖核普酸序列。23.—种筛选用于治疗或预防乳腺癌的化合物的方法，所述方法包括如下步骤(a)在测试化合物的存在下，使包含A5623多肽的A2254-结合域的多肽与包含A2254多肽的A5623-结合域的多肽接触；(b)检测多肽间的结合；和(C)选择抑制多肽间结合的测试化合物。24.权利要求23的方法，其中该含有A2254-结合域的多肽包括A5623多肽。25.根据权利要求23的方法，其中该含有A5623-结合域的多肽包括A2254多肽。26.筛选可用于治疗或预防乳腺癌的化合物的试剂盒，其中该试剂盒包括(a)包含A5623多肽AM54-结合域的多肽；(b)包含A2254多肽A5623-结合域的多肽；和(c)用于检测多肽间相互作用的试剂。27.根据权利要求26的试剂盒，其中该含有A2254-结合域的多肽包括A5623多肽。28.根据权利要求26的试剂盒，其中该含有A5623-结合域的多肽包括A2254多肽。29.用于治疗或预防受试者中乳腺癌的方法，其中该方法包括施用药物有效量的抑制A5623多肽与A2254多肽结合的化合物的步骤。30.用于治疗或预防乳腺癌的组合物，其中该组合物包括药物有效量的抑制A5623多肽与A2254多肽结合的化合物和药物可接受的载体。全文摘要本发明展示了一种通过使细胞与可抑制A2254或A5623表达的siRNA组合物接触抑制癌细胞生长的方法。本发明还包括治疗癌症的方法。本发明还展示了用于所提供方法的产品，包括核酸序列、载体以及由它们构成的组合物。本发明还提供了用于抑制肿瘤细胞，例如乳腺癌细胞，生长的方法，以及用于鉴定可降低或防止A5623与A2254结合的化合物的方法。而且，本发明还涉及治疗或预防癌症，特别是乳腺癌，的方法，包括施用可抑制A2254与A5623结合的化合物，并涉及含有这些结合抑制剂的组合物。文档编号A61K38/00GK101273132SQ20068003539公开日2008年9月24日申请日期2006年7月21日优先权日2005年7月25日发明者中村佑辅,中鹤修一,片桐丰雅申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司