抑制由vla-4介导的白细胞粘附的嘧啶基酰胺化合物的制作方法

专利名称：抑制由vla-4介导的白细胞粘附的嘧啶基酰胺化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制白细胞粘附且尤其由α4整联蛋白介导的白细胞粘附的化合物，其中α4整联蛋白优选为VLA-4。本发明也涉及包含所述化合物的医药组合物以及使用本发明的化合物或医药组合物治疗例如炎症的方法。
参考文献
在本申请案中以上标形式引用下列公开案
1Hemler和Takada，欧洲专利申请案第330,506号，1989年8月30日公开
2Elices等人，Cell，60577 584(1990)
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29Konradi等人，PCT/US00/01686，2000年1月21日申请
上述所有公开案以引用的方式整体并入本文中，其引用的程度就像已特定地及个别地指出将各个公开案以引用的方式整体并入一般。
背景技术：
VLA-4(也称为α4β1整联蛋白和CD49d/CD29)最初由Hemler和Takada1识别，其为细胞表面受体的β1整联蛋白家族的成员，所述家族的每一成员均包含两个亚单位α链和β链。VLA-4含有α4链和β1链。存在至少九种β1整联蛋白，其均共有相同的β1链且各具有不同的α链。这九种受体均结合各种细胞基质分子的不同补体，诸如纤维结合蛋白、层粘蛋白和胶原。举例来说，VLA-4结合纤维结合蛋白。VLA-4也结合由内皮细胞及其他细胞表达的非基质分子。这些非基质分子包括VCAM-1，其在培养基中的经细胞因子激活的人类脐静脉内皮细胞上表达。VLA-4的不同抗原决定基引起纤维结合蛋白和VCAM-1结合活性且已显示各活性独立地受到抑制2。
由VLA-4和其他细胞表面受体介导的细胞间粘附与许多发炎性反应有关。在损伤或其他发炎性刺激部位，激活的血管内皮细胞表达对白细胞具有粘附性的分子。白细胞粘附内皮细胞的机制部分地涉及白细胞上的细胞表面受体的识别和细胞表面受体与内皮细胞上的相应细胞表面分子结合。一旦结合，所述白细胞将迁移穿过血管壁进入受伤部位且释放化学介质以与感染作斗争。对于免疫系统的粘附受体的评论，参见，例如Springer3和Osborn4。
发炎性脑病(诸如实验性自体免疫脑脊髓炎(EAE)、多发性硬化症(MS)和脑膜炎)为内皮/白细胞粘附机制导致破坏另外健康脑组织的中枢神经系统病症的实例。在这些发炎性疾病中，大量白细胞迁移穿过个体的血脑屏障(BBB)。白细胞释放有毒介质引起广泛组织损伤，导致神经传导受损和瘫痪。
在其他器官系统中，组织损伤也通过导致白细胞迁移或激活的粘附机制发生。举例来说，已显示心肌缺血后对心脏组织的初始损伤会因白细胞进入受损组织而进一步恶化，从而引起更进一步的损伤(Vedder等人)5。其他由粘附机制介导的发炎性或医学病状包括(例如)哮喘6-8、阿兹海默氏病、动脉粥样硬化9-10、艾滋病痴呆11、糖尿病12-14(包括急性青少年发作型糖尿病)、发炎性肠病15(包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(Crohn′s disease))、多发性硬化症16-17、类风湿性关节炎18-21、组织移植22、肿瘤转移23-28、脑膜炎、脑炎、中风和其他脑创伤、肾炎、视网膜炎、异位性皮炎、牛皮癣、心肌缺血和急性白细胞介导的肺损伤(诸如在成人呼吸窘迫综合征中发生的损伤)。
已揭示，经取代的氨基嘧啶作为一类化合物抑制VLA-4与VCAM-1结合且因此展现消炎性质29。虽然这些化合物对所述结合具有拮抗剂性质，但这些化合物的生物可用性提高将会增加其功效。


发明内容
本发明提供化合物、其医药学上可接受的盐、其组合物、其合成和治疗VLA-4介导的疾病的方法。
在一个实施例中，本发明提供式I化合物
其中 R1选自由C1-C4烷基、C1-C4卤烷基、杂芳基和-N(R5)(R6)组成的群组，其中R5和R6独立地选自由氢、C1-C4烷基组成的群组，或R5和R6连同其所侧接的氮连接在一起形成杂环； R2选自由C1-C4烷基、C2-C4烯基和C2-C4炔基组成的群组；且 R3和R4独立地为C1-C3烷基，或R3、R4连同其所侧接的氮原子连接在一起形成杂环； 或其医药学上可接受的盐、酯或前药。
在另一实施例中，本发明提供式II化合物
其中 R7为C1-C4烷基、C1-C4卤烷基或杂芳基； R8为C1-C4烷基； R9和R10独立地为C1-C3烷基，或R9、R10连同其所侧接的氮原子连接在一起形成杂环； 或其医药学上可接受的盐、酯或前药。
在另一实施例中，本发明提供式III化合物
其中 R11和R12独立地为C1-C4烷基，或R11和R12连同其所侧接的氮原子连接在一起形成杂环； R13为C1-C4烷基；且 R14和R15独立地为C1-C3烷基，或R14和R15连同其所侧接的氮原子连接在一起形成杂环； 或其医药学上可接受的盐、酯或前药。
本发明也提供表4中的化合物。
表4





无
具体实施例方式 如上述，本发明涉及抑制白细胞粘附且尤其抑制至少部分由α4整联蛋白(优选VLA-4)介导的白细胞粘附的化合物。然而，在进一步详细描述本发明之前，首先定义下列术语。
定义 除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的下列术语具有如下含义 如本文所用且除非另有限定，否则“烷基”是指优选具有1到4个碳原子且更优选1到3个碳原子的直链、支链和环状烷基。所述术语可用诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丙基、环丁基和亚甲基-环丙基的基团来举例说明。
“烯基”是指具有2到4个碳原子且优选2到3个碳原子且具有至少1个且优选1个烯基不饱和位点的直链和支链烯基。所述烯基的实例包括乙烯基(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)、正丙烯-1-基(-CH＝CHCH3)、正丁烯-2-基(-CH2CH＝CHCH3)等。顺反异构体或这些异构体的混合物包括在所述术语内。
“炔基”是指具有2到4个碳原子且优选2到3个碳原子且具有至少1个且优选1个炔基不饱和位点的直链和支链炔基。所述炔基的实例包括乙炔基(-C≡CH)、炔丙基(-CH2C≡CH)、正丙炔-1-基(-CH≡CHCH3)等。
“芳基”或“Ar”是指具有6到14个碳原子的一价芳族碳环基，其具有单个环(例如，苯基)或多个稠环(例如，萘基或蒽基)，稠环可为芳族环或可不为芳族环(例如，2-苯并噁唑啉酮、2H-1，4-苯并噁嗪-3(4H)-酮-7-基等)，条件是连接点在芳族碳原子处。优选的芳基包括苯基和萘基。
“经取代芳基”是指经1到3个取代基且优选1到2个取代基取代的芳基，所述取代基选自由以下各基团组成的群组羟基、酰基、酰胺基、酰氧基、烷基、经取代烷基、烷氧基、经取代烷氧基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、氨基、经取代氨基、氨酰基、芳基、经取代芳基、芳氧基、经取代芳氧基、羧基、羧基酯基、氰基、硫醇基、硫烷基、经取代硫烷基、硫芳基、经取代硫芳基、硫杂芳基、经取代硫杂芳基、硫环烷基、经取代硫环烷基、硫杂环基、经取代硫杂环基、环烷基、经取代环烷基、卤基、硝基、杂芳基、经取代杂芳基、杂环基、经取代杂环基、杂芳氧基、经取代杂芳氧基、杂环氧基、经取代杂环氧基、氨基磺酰基(NH2-SO2-)和经取代氨基磺酰基。
“卤基”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘，且优选为氟或氯。
“卤烷基”是指具有1到5个卤基的烷基。所述基团优选具有1到3个卤基和1到2个碳原子。特别优选的卤烷基包括三卤甲基(例如，三氟甲基)和三卤乙基(例如，2，2，2-三氟乙-1-基)。
“杂芳基”是指在环内具有2到10碳原子和1到4个选自氧、氮和硫的杂原子的芳族碳环基。所述杂芳基可具有单个环(例如，吡啶基或呋喃基)或多个稠环，其中所述稠环可为芳基或杂芳基。所述杂芳基的实例包括(例如)呋喃-2-基、呋喃-3-基、噻吩-2-基、噻吩-3-基、吡咯-2-基、吡咯-3-基、吡啶基(2-吡啶基、3-吡啶基和4-吡啶基)等。在一个实施例中，所述杂芳基的硫和/或氮原子为视情况经氧化(即，-S(O)或-S(O)2-和/或N-氧化物)。
“杂环”或“杂环的”是指具有单个环或多个稠环的饱和或不饱和非杂芳族基团，其在环内具有1到10个碳原子和1到4个选自氮、硫或氧的杂原子，其中，在稠环系统中，一个或多个所述环可为芳基或杂芳基。在一个实施例中，所述杂环的硫和/或氮原子视情况经氧化(即，-S(O)-或-S(O)2-和/或N-氧化物)。
“医药学上可接受的载剂”指可用于制备医药组合物的载剂，其通常安全、无毒且在生物学及其他方面皆无不良后果且包括可为兽医应用以及人类医药应用所接受的载剂。本说明书和权利要求书中所用的“医药学上可接受的载剂”包括一种或多种所述载剂。
“前药”是指本发明化合物的任何医药学上可接受的衍生物，当将其投与个体时其能够直接或间接地提供本发明化合物或其活性代谢物或残余物。特别有利的衍生物和前药为当将所述化合物投与个体时增加本发明化合物的生物可用性(例如，使口服投与的化合物更容易地吸收到血液中)或相对于母体物质而言提高母体化合物传递到生物代谢区(例如，脑或淋巴系统)中的化合物。前药包括本发明化合物的酯形式。酯前药的实例包括甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯和乙基丁二酸酯衍生物。前药的一般概述提供于T.Higuchi和V.Stella，作为新颖传递系统的前药(Pro-drugs as NovelDelivery Systems)，A.C.S.专题研讨会论文集(the A.C.S.Symposium Series)第14卷和Edward B.Roche编，药物设计中的生物可逆载剂(Bioreversible Carriers in Drug Design)，美国药学协会(American Pharmaceutical Association)和Pergamon出版社，1987，两者都以引用的方式并入本文中。
“医药学上可接受的盐”是指保留本发明化合物的生物有效性和性质且在生物学或其他方面没有不良后果的盐。多数情况下，本发明化合物由于存在氨基和/或羧基或与其类似的基团能够形成酸和/或碱盐。
医药学上可接受的碱加成盐可由无机碱或有机碱制备。源于无机碱的盐包括(仅举例而言)钠、钾、锂、铵、钙和镁盐。源于有机碱的盐包括(但不限于)以下各物的盐伯胺、仲胺和叔胺，诸如烷基胺、二烷基胺、三烷基胺、经取代烷基胺、二(经取代烷基)胺、三(经取代烷基)胺、烯基胺、二烯基胺、三烯基胺、经取代烯基胺、二(经取代烯基)胺、三(经取代烯基)胺、环烷基胺、二(环烷基)胺、三(环烷基)胺、经取代环烷基胺、经二取代的环烷基胺、经三取代的环烷基胺、环烯基胺、二(环烯基)胺、三(环烯基)胺、经取代环烯基胺、经二取代的环烯基胺、经三取代的环烯基胺、芳基胺、二芳基胺、三芳基胺、杂芳基胺、二杂芳基胺、三杂芳基胺、杂环胺、二杂环胺、三杂环胺、混合二胺和三胺，其中所述胺上的取代基中的至少两个不同且所述取代基选自由以下各基团组成的群组烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、环烷基、经取代环烷基、环烯基、经取代环烯基、芳基、杂芳基、杂环基等。也包括以下胺，其中两个或三个取代基连同氨基氮一起形成杂环基或杂芳基。
合适胺的实例包括(仅举例而言)异丙胺、三甲胺、二乙胺、三(异丙基)胺、三(正丙基)胺、乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、氨基丁三醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因(caffeine)、普鲁卡因(procaine)、海卓胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡萄糖胺、N-烷基葡糖胺、可可碱(theobromine)、嘌呤、哌嗪、哌啶、吗啉、N-乙基哌啶等。也应理解其他羧酸衍生物将可用于实践本发明，例如羧酸酰胺，包括羧酰胺、低碳烷基羧酰胺、二烷基羧酰胺等。
医药学上可接受的酸加成盐可由无机酸和有机酸制备。源于无机酸的盐包括以下各酸的盐盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。源于有机酸的盐包括以下各酸的盐乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、丁二酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
术语“医药学上可接受的阳离子”是指医药学上可接受的盐的阳离子。
应理解，在本文所定义的所有经取代基团中，通过限定本身具有另外取代基的取代基得出的聚合物(例如，具有经取代芳基作为取代基的经取代芳基，其本身经经取代芳基取代，等)并不打算包括在本文中。在这些情况下，所述取代基的最大数目为三个。就是说上述定义中的每一者均为有限限制，例如，经取代芳基限于经取代芳基-(经取代芳基)-(经取代芳基)。
“治疗”疾病包括 (1)预防所述疾病，即，使可能会暴露于所述疾病下或易感染所述疾病但尚未患病或尚未表现出所述疾病的症状的哺乳动物中所述疾病的临床症状不再发展， (2)抑制所述疾病，即，阻止或降低所述疾病或其临床症状的发展，或 (3)减轻所述疾病，即，使所述疾病或其临床症状消退。
“治疗有效量”指当投与哺乳动物以治疗疾病时足以治疗所述疾病的化合物的量。“治疗有效量”将视所述化合物、所述疾病和其严重程度和待治疗哺乳动物的年龄、重量等而不同。
“医药学上可接受的盐”是指式I化合物的医药学上可接受之盐，所述盐衍生自多种所属领域熟知的有机和无机相对离子，且包括(仅举例来说)钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等；且当分子含有碱性官能团时，包括有机或无机酸的盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、顺丁烯二酸盐、草酸盐等。
整联蛋白是一大族同源跨膜连接蛋白，其为动物细胞上用于结合大多数细胞外基质蛋白(诸如胶原、纤维结合蛋白和层粘蛋白)的主要受体。整联蛋白为由α链和β链组成的杂二聚体。迄今为止，已识别出20种不同的整联蛋白杂二聚体，其由9种不同的α亚单位和14种不同的β亚单位构成。术语“α4整联蛋白”是指杂二聚体类酶联细胞表面受体，其含有与β亚单位中的任一个配对的α4亚单位。VLA-4为α4整联蛋白的实例，且为α4和β1亚单位的杂二聚体，且也称为α4β1整联蛋白。
本发明提供化合物、其医药学上可接受的盐、其组合物、其合成和治疗由VLA-4介导的疾病的方法。
在一个实施例中，本发明提供式I化合物
其中 R1选自由C1-C4烷基、C1-C4卤烷基、杂芳基和-N(R5)(R6)组成的群组，其中R5和R6独立地选自由氢、C1-C4烷基组成的群组，或R5和R6连同其所侧接的氮连接在一起形成杂环； R2选自由C1-C4烷基、C2-C4烯基和C2-C4炔基组成的群组；且 R3和R4独立地为C1-C3烷基，或R3、R4连同其所侧接的氮原子连接在一起形成杂环； 或其医药学上可接受的盐、酯或前药。
在一些实施例中，-OC(O)NR3R4基团在苯环的对位。
在一些实施例中，R3和R4相连形成杂环。在其他实施例中，R3和R4相连形成吡咯烷基环。
在一些实施例中，R2为C1-C4烷基。在其他实施例中，R2为乙基。
在其他实施例中，R3和R4相连形成杂环且R2为C1-C4烷基。在其他实施例中，R3和R4相连形成吡咯烷基环且R2为乙基。
本发明化合物的实例包括具有表1中所列举的R1、R2、R3和R4基团的化合物。
表1

在另一实施例中，本发明提供式II化合物
其中 R7为C1-C4烷基、C1-C4卤烷基或杂芳基； R8为C1-C4烷基； R9和R10独立地为C1-C3烷基，或R9、R10连同其所侧接的氮原子连接在一起形成杂环； 或其医药学上可接受的盐、酯或前药。
在一些实施例中，-OC(O)NR9R10在苯环的对位。
在一些实施例中，R9和R10相连形成杂环。在其他实施例中，R9和R10相连形成吡咯烷环。
在一些实施例中，R8为C1-C4烷基。在其他实施例中，R8为乙基。
在一些实施例中，R7为C1-C4烷基。在其他实施例中，R7选自由异丙基和叔丁基组成的群组。
在一些实施例中，R7为C1-C4卤烷基。在其他实施例中，R7为三氟甲基。
在一些实施例中，R7为杂芳基。在其他实施例中，R7选自由呋喃-2-基、呋喃-3-基、噻吩-2-基和噻吩-3-基组成的群组。
在一些实施例中，R9和R10相连形成杂环，R8为C1-C4烷基，且R7为杂芳基。在其他实施例中，R9和R10连同侧接氮一起形成吡咯烷环，R8为乙基，且R7为杂芳基。
在一些实施例中，R9和R10相连形成杂环，R8为C1-C4烷基，且R7为烷基。在其他实施例中，R9和R10连同侧接氮一起形成吡咯烷环，R8为乙基，且R7为烷基。
本发明进一步提供具有表2所列举的R7、R8、R9和R10基团的式II化合物。
表2
在另一实施例中，本发明提供式III化合物
其中 R11和R12独立地为C1-C4烷基，或R11和R12连同其所侧接的氮原子连接在一起形成杂环； R13为C1-C4烷基；且 R14和R15独立地为C1-C3烷基，或R14和R15连同其所侧接的氮原子连接在一起形成杂环； 或其医药学上可接受的盐、酯或前药。
在一些实施例中，-OC(O)NR14R15基团在苯环的对位。
在一些实施例中，R14和R15相连形成杂环。在其他实施例中，R14和R15相连形成吡咯烷环。
在一些实施例中，R13为C1-C4烷基。在其他实施例中，R13为乙基。
在一些实施例中，R11和R12独立地为C1-C4烷基。在其他实施例中，R11为乙基且R12为异丙基。
在一些实施例中，R11和R12连同其所侧接的氮原子连接在一起形成杂环。在其他实施例中，所述杂环选自由哌啶-1-基和3-噻吡咯烷-1-基组成的群组。
在其他实施例中，R14和R15相连形成杂环，R13为C1-C4烷基，且R11和R12连同其所侧接的氮原子连接在一起形成杂环。
本发明进一步提供具有表3所列举的R11、R12、R13、R14和R15基团的式III化合物。
表3
在一些实施例中，本发明提供具有在各别式中在对位与苯环连接的氨甲酰基取代基的式I、II和III的化合物
在其他实施例中，表1、2和3的化合物具有在对位连接的氨甲酰基取代基。
在一些实施例中，本发明也提供具有在邻或间位连接的氨甲酰基取代基的式I、II和III的化合物，包括表1、2和3中的化合物。
本发明也提供表4中的化合物。
表4


另一方面，本发明提供包含医药学上可接受的载剂和治疗有效量的一种或多种本文所定义的化合物的医药组合物。
在本发明方法的一个方面，本发明涉及治疗患者的至少部分由α4整联蛋白，优选VLA-4介导的疾病的方法，所述方法包含投与包含医药学上可接受的载剂和治疗有效量的一种或多种本发明化合物的医药组合物。另一方面，本发明涉及包含本发明化合物的医药组合物在制造供治疗α4整联蛋白介导的疾病用的药物中的用途。
本发明的化合物和医药组合物可用于治疗至少部分由α4整联蛋白(其中所述α4整联蛋白优选为VLA-4)介导的疾病病状或白细胞粘附。所述疾病病状包括(例如)哮喘、阿兹海默氏病、动脉粥样硬化、艾滋病痴呆、糖尿病(包括急性青少年发作型糖尿病)、发炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、多发性硬化症、类风湿性关节炎、组织移植、肿瘤转移、脑膜炎、脑炎、中风和其他脑创伤、肾炎、视网膜炎、异位性皮炎、牛皮癣、心肌缺血和急性白细胞介导的肺损伤(诸如在成人呼吸窘迫综合征中发生的损伤)。
其他疾病病状包括(但不限于)发炎性病状，诸如结节性红斑、过敏性结膜炎、视神经炎、葡萄膜炎、过敏性鼻炎、强直性脊椎炎、牛皮癣性关节炎、血管炎、莱特尔氏综合征(Reiter′s syndrome)、全身性红斑狼疮、进行性周身硬化症、多肌炎、皮肌炎、韦格纳式肉芽肿病(Wegner′s granulomatosis)、主动脉炎、结节病、淋巴细胞减少症、颞动脉炎、心包炎、心肌炎、充血性心力衰竭、多发性结节性动脉炎、过敏性综合征、过敏、高嗜酸性粒细胞综合征、谢格-司托司综合征(Churg-Strauss syndrome)、慢性阻塞性肺病、过敏性肺炎、慢性活动型肝炎、间质性膀胱炎、自体免疫内分泌衰竭、原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、自体免疫再生障碍性贫血、慢性持续性肝炎和甲状腺炎。
在一个优选的实施例中，由α4整联蛋白介导的疾病病状为发炎性疾病。
本发明的化合物包括(例如)下列化合物 N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(三氟乙酰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(异丙基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(叔丁基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(呋喃-2-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(哌啶-1-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(N-乙基-N-异丙基氨基羰基)氨基}-嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(噻吩-3-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(噻吩-2-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(呋喃-3-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(3-噻吡咯烷-1-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(噻吩-2-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}-苯丙氨酸叔丁酯； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-三氟甲基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}-苯丙氨酸叔丁酯； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-叔丁基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}-苯丙氨酸叔丁酯；和 N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-呋喃-3-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}-苯丙氨酸叔丁酯； 或其医药学上可接受的盐、酯或前药。
化合物制备 本发明的化合物可使用下列一般方法和程序由可容易得到的原料来制备。应了解，给出典型或优选的工艺条件(即，反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等等)，但除非另有说明，否则也可使用其他工艺条件。最佳反应条件可随使用的特定反应物或溶剂而变，而所述条件可由所属领域的技术人员通过常规优化程序确定。
另外，如对所属领域的技术人员所显而易见，常规保护基可为防止某些官能团经受不希望的反应所必需。各种官能团的合适保护基以及保护和去保护特定官能团的合适条件在此项技术中熟知。举例来说，许多保护基描述在T.W.Greene和G.M.Wuts，有机合成中的保护基(Protecting Groups in Organic Synthesis)，第二版，怀利(Wiley)，纽约，1991和其中所引用的参考文献中。
此外，本发明的化合物通常含有一个或多个手性中心。因此，如果需要，所述化合物可以纯立体异构体形式(即，个别对映异构体或非对映异构体)或立体异构体富集混合物形式制备或分离。除非另有陈述，否则所有这些立体异构体(和富集混合物)均包括在本发明的范畴内。纯立体异构体(或富集混合物)可使用(例如)此项技术中熟知的光学活性原料或立体选择性试剂制备。或者，所述化合物的外消旋混合物可使用(例如)手性柱层析、手性拆分剂等加以分离。
在一个实施例中，本发明的化合物可按如下文方案1中所述来制备
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6如上文所定义且Pg为羧基保护基，诸如苯甲基、叔丁基等。
在方案1中，起始5-氨基嘧啶中间物(化合物1.1)在WO 03/099809中详细描述，且仅为了说明起见，在所述方案中展示为4-取代的苯丙氨酸衍生物。当然，应理解2-取代和3-取代的苯丙氨酸衍生物将遵循类似的反应途径。
具体来说，在方案1中，5-氨基-2-二乙氨基-4-取代的嘧啶(化合物1.1)(通过用5重量％Pd/C或5重量％PtO2还原由相应5-硝基-嘧啶制备)通过常规方法转化为相应三氟乙酰胺(化合物1.2)。举例来说，在诸如四氢呋喃、二氯甲烷、吡啶等的合适惰性溶剂中使稍微过量的三氟乙酸酐与化合物1.1化合。使所述反应维持在约0℃到约30℃，直到反应大体完成，其通常在约0.5到24小时内发生。在所述反应完成后，化合物1.2通过包括中和、蒸发、萃取、沉淀、层析、过滤等的常规方法回收或者不经纯化和/或分离用于下一步骤。
化合物1.2转化为相应N(R2)，N-三氟乙酰胺基嘧啶(化合物1.3)再次通过常规方法进行。举例来说，在诸如DMF的合适惰性稀释剂中在过量的诸如碳酸钾的合适碱存在下使过量的卤化物R2-I与化合物1.2化合。在一个优选的实施例中，使用约2当量的R2-I和碳酸钾。使所述反应维持在环境条件在密封容器中，且使其继续直到反应大体完成，其通常在20-72小时内发生。在所述反应完成后，化合物1.3通过包括中和、蒸发、萃取、沉淀、层析、过滤等的常规方法回收或者不经纯化和/或分离用于下一步骤。
化合物1.3的羧基保护基可通过常规条件去除以提供式I化合物(未图示)。在一个实施例中，叔丁基保护基可通过与甲酸接触来去除。在另一实施例中，苯甲基保护基可通过在钯/碳催化剂存在下在诸如甲醇的质子溶剂中在高氢压力下与氢气接触来去除。
或者，三氟乙酰基可经去除以提供相应胺，化合物1.4。在所述实施例中三氟乙酰基充当胺保护基。如上述，所述反应通常通过(例如)在水与诸如甲醇的质子溶剂的混合物中使化合物1.3与大大过量的诸如碳酸钾的合适碱接触来进行。所述反应在诸如40℃到60℃的高温下进行，且使其继续直到反应大体完成。在所述反应完成后，化合物1.4通过包括中和、蒸发、萃取、沉淀、层析、过滤等常规方法回收或者不经纯化和/或分离用于下一步骤。
在方案1中，化合物1.4可用于制备尿素衍生物(其中R1＝-NR5R6)或酰胺基衍生物(其中R1为C1-C4烷基、C1-C4卤烷基或杂芳基，其键结羰基而不是通过氮原子键结羰基)。在第一实施例中，尿素衍生物通过常规方法制备，诸如通过首先制备酰胺氯化物(化合物1.7)来制备。所述化合物通过在诸如碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸钠等的合适碱存在下使化合物1.4与过量光气接触来制备。在所述反应完成后，化合物1.7通过包括中和、蒸发、萃取、沉淀、层析、过滤等的常规方法回收或者不经纯化和/或分离用于下一步骤。
随后通过在常规条件下使酰胺氯化物(化合物1.7)与合适胺R5R6NH反应使其转化为相应尿素衍生物(化合物1.8)。优选地，所述反应在如四氢呋喃、二噁烷、氯仿等的合适溶剂中使等摩尔量或过量的胺与化合物1.7接触。在所述反应完成后，化合物1.8可通过包括中和、蒸发、萃取、沉淀、层析、过滤等的常规方法回收或者不经纯化和/或分离用于下一步骤。
化合物1.8的羧基保护基可通过常规条件去除以提供化合物1.9，式I化合物。在一个实施例中，叔丁基保护基可通过与甲酸接触来去除。在另一实施例中，苯甲基保护基可通过在钯/碳催化剂存在下在诸如甲醇的质子溶剂中在高氢压力下与氢气接触来去除。在所述反应完成后，化合物1.9可通过包括中和、蒸发、萃取、沉淀、层析、过滤等的常规方法回收。
在第二实施例中，酰胺基衍生物(化合物1.5)通过在诸如三乙胺、二异丙基乙胺等的合适碱存在下使化合物1.4与稍微过量的酰卤接触以清除所产生的酸来制备。所述反应优选在诸如四氢呋喃、二噁烷、氯仿等的合适惰性溶剂中进行。所述反应优选在约0℃到30℃下进行，且使其继续直到反应大体完成，其通常在2-48小时内发生。在所述反应完成后，化合物1.5可通过包括中和、蒸发、萃取、沉淀、层析、过滤等的常规方法回收或者不经纯化和/或分离用于下一步骤。
化合物1.5的羧基保护基可通过常规条件去除以提供化合物1.6，式I化合物。在一个实施例中，叔丁基保护基可通过与甲酸接触来去除。在另一实施例中，苯甲基保护基可通过在钯/碳催化剂存在下在诸如甲醇的质子溶剂中在高氢压力下与氢气接触来去除。在所述反应完成后，化合物1.6可通过包括中和、蒸发、萃取、沉淀、层析、过滤等的常规方法回收。
医药调配物 当作为药物使用时，本发明的化合物通常以医药组合物形式投与。这些化合物可通过包括经口、经直肠、经表皮、经皮下、经静脉内、经肌肉内和经鼻内的多种路径投与。这些化合物有效用作可注射组合物与口服组合物。所述组合物以制药技术中熟知的方式制备且包含至少一种活性化合物。
本发明也包括医药组合物，其含有一种或多种上述式I-III的化合物作为活性成分以及医药学上可接受的载剂。在制备本发明的组合物时，通常使所述活性成分与赋形剂混合，用赋形剂稀释或装入所述可呈胶囊、药袋、纸或其他容器形式的载体中。所用的赋形剂通常为适于向人类个体或其他哺乳动物投药的赋形剂。当赋形剂用作稀释剂时，其可为固体、半固体或液体材料，其充当活性成分的媒剂、载剂或介质。因此，所述组合物可呈片剂、丸剂、散剂、含片、药袋、扁囊剂、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆、气雾剂(呈固体形式或在液体介质中)、软膏(含有例如多达10重量％的活性化合物)、软或硬明胶胶囊、栓剂、无菌可注射溶液和无菌包装粉末的形式。
在制备调配物时，所述活性化合物在与其他成分混合之前可能需要将其研磨以提供适当的粒度。如果所述活性化合物大体上不溶解，则通常将其研磨至粒度小于200目。如果所述活性化合物大体上可溶于水，则通常通过研磨调整其粒度以提供在调配物中大体均匀的分布，例如约40目。
合适赋形剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄原胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。所述调配物可另外包括润滑剂，诸如滑石、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化和悬浮剂；防腐剂，诸如羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯；甜味剂；和调味剂。本发明的组合物可通过采用此项技术中已知的程序来调配以在向患者投药后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。
治疗剂通过静脉内调配物投药在制药工业中为人熟知。除治疗剂可溶于其中之组合物外，静脉内调配物应具备某些性质。举例来说，所述调配物应促进活性成分的总体稳定性，同样，调配物的制造应具有成本有效性。所有这些因素最终决定静脉内调配物的总体成果和有用性。
可包括在本发明化合物的医药调配物中的其他辅助添加剂为如下各物溶剂乙醇、甘油、丙二醇；稳定剂乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸；抗菌防腐剂苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯；缓冲剂柠檬酸/柠檬酸钠、酒石酸氢钾、酒石酸氢钠、乙酸/乙酸钠、顺丁烯二酸/顺丁烯二酸钠、邻苯二甲酸氢钠、磷酸/磷酸二氢钾、磷酸/磷酸氢二钠；和张力调节剂氯化钠、甘露糖醇、右旋糖。
缓冲剂的存在可为维持水溶液pH值处于约4到约8范围且更优选约4到约6范围所必需。缓冲系统通常为弱酸与其可溶性盐的混合物，例如柠檬酸钠/柠檬酸；或二元酸的单阳离子或二阳离子盐，例如酒石酸氢钾、酒石酸氢钠、磷酸/磷酸二氢钾和磷酸/磷酸氢二钠。
所用缓冲系统的量取决于(1)所需pH值；和(2)药物量。通常，所用缓冲剂的量使得调配物的缓冲剂与药物的摩尔比为0.5∶1到50∶1(其中缓冲剂的摩尔数采用缓冲成分(例如柠檬酸钠和柠檬酸)的组合摩尔数)以维持pH值在4到8范围内，且通常使用的缓冲剂(组合)与所存在药物的摩尔比为1∶1到10∶1。
一种可用于本发明中的缓冲剂为5-50mg/mL柠檬酸钠比1-15mg/mL柠檬酸的范围内的柠檬酸钠/柠檬酸，足以维持组合物的水溶液的pH值为4-6。
缓冲剂也可存在以通过与溶解的金属离子(例如，Ca、Mg、Fe、Al、Ba)形成可溶性金属络合物而防止药物沉淀，其可浸出玻璃容器或橡皮塞或存在于普通自来水中。所述试剂可充当药物的竞争性络合剂且产生可溶性金属络合物，导致存在不良微粒。
另外，可需要存在量为约1-8mg/mL的试剂(例如，氯化钠)以调整张力到与人类血液相同的值，从而避免在投与静脉内调配物时红血球膨胀或收缩导致不良副作用，诸如恶心或腹泻和可能的有关血液病症。通常，调配物的张力与人类血液的张力相配，其在282-288mOsm/kg范围内，且通常为285mOsm/kg，其等于与0.9％氯化钠溶液相当的渗透压。
静脉内调配物可通过直接静脉注射、静脉内大丸剂投与，或可通过添加到诸如0.9％氯化钠注射液或其他相容输注溶液的适当输注溶液中通过输注投与。
优选将所述组合物调配成单位剂型，各剂量含有约5mg到约100mg，更通常约10mg到约30mg的活性成分。术语“单位剂型”是指适合以单一剂量用于人类个体和其他哺乳动物的实体离散单位，各单位含有经计算产生所需治疗效应的预定量的活性材料以及合适的医药赋形剂。
所述活性化合物在广泛剂量范围内有效，且通常以医药学上有效的量投与。然而，应理解，所述化合物的实际投与量将由医生根据包括下列的相关情况确定待治疗的病状、所选的投药路径、实际投与的化合物、个别患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重程度等。
对于制备诸如片剂的固体组合物来说，使主要活性成分与医药赋形剂混合以形成含有本发明化合物的均匀混合物的固态预调配组合物。当称这些预调配组合物为均匀时，是指所述活性成分均匀地分散在所述组合物各处，使得组合物可容易地再分成等效单位剂型，诸如片剂、丸剂和胶囊剂。随后，将所述固态调配物再分成上述类型的单位剂型，其含有(例如)0.1mg到约500mg的本发明活性成分。
本发明的片剂或丸剂可经包衣或以另外方式混配以提供具有持久作用的优点的剂型。举例来说，所述片剂或丸剂可包含内部剂量组分和外部剂量组分，后者呈包覆于前者之上的形式。这两种组分可由肠溶层分开，所述肠溶层用以抵抗胃内的崩解作用且允许内部组分完整地进入十二指肠或延迟释放。所述肠溶层或肠溶衣可使用多种材料，所述材料包括许多聚合酸和聚合酸与诸如虫胶、十六烷醇和乙酸纤维素的材料的混合物。
本发明的新颖组合物可掺配成液体形式供经口或注射投药，其形式包括水溶液经适当调味的糖浆、水性或油性悬浮液和具有可食用油(诸如，棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油)以及酏剂和类似医药媒剂的经调味乳液。
供吸入或吹入用的组合物包括在医药学上可接受的水性或有机溶剂中的溶液和悬浮液或其混合物和散剂。所述液体或固体组合物可含有如上所述的合适的医药学上可接受的赋形剂。所述组合物优选经口或鼻呼吸路径投与以获得局部或全身效应。在优选医药学上可接受的溶剂中的组合物可通过使用惰性气体雾化。雾化溶液可从雾化装置直接吸入或可将雾化装置连接至面罩帷罩或间歇式正压呼吸机。溶液、悬浮液或粉末组合物可优选从以适当方式传递调配物的装置中经口或经鼻投与。
下列调配物实例说明本发明的医药组合物。
调配物实例1 制备含有下列成分的硬明胶胶囊 成分 量(毫克/粒胶囊) 活性成分 30.0 淀粉 305.0 硬脂酸镁 5.0 使以上成分混合且以340mg的量填充到硬明胶胶囊中。
调配物实例2 使用以下成分制备片剂配方 成分 量(毫克/片) 活性成分 25.0 微晶纤维素 200.0 胶体二氧化硅 10.0 硬脂酸 5.0 将所述组分掺合且压制形成片剂，每片重240mg。
调配物实例3 制备含有下列组分的干粉吸入器调配物 成分 重量％ 活性成分 5 乳糖 95 将活性成分与乳糖混合且将混合物添加到干粉吸入器具中。
调配物实例4 如下制备每片含有30mg活性成分的片剂 成分 量(毫克/片) 活性成分 30.0mg 淀粉 45.0mg 微晶纤维素 35.0mg 聚乙烯吡咯烷酮 4.0mg (10％无菌水溶液形式) 羧甲基淀粉钠 4.5mg 硬脂酸镁 0.5mg 滑石 1.0mg 使活性成分、淀粉和纤维素通过20号目美国筛且充分混合。使聚乙烯吡咯烷酮溶液与所得粉末混合，随后使其经过16目美国筛。将如此制得的颗粒在50℃到60℃下干燥且使其通过16目美国筛。随后，将预先通过30号目美国筛的羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和滑石添加到颗粒中，混合后，在压片机上将其压制以得到每片重120mg的片剂。
调配物实例5 如下制成每粒含有40mg药物的胶囊剂 成分 量(毫克/粒胶囊) 活性成分 40.0mg 淀粉 109.0mg 硬脂酸镁 1.0mg 总计 150.0mg 使活性成分、淀粉和硬脂酸镁掺合，使其通过20号目美国筛，且以150mg的量填充到硬明胶胶囊中。
调配物实例6 如下制成每粒含有25mg活性成分的栓剂 成分 量 活性成分 25mg 饱和脂肪酸甘油酯 至2,000mg 使活性成分通过60号目美国筛且悬浮于预先使用最少所需热量加以熔化的饱和脂肪酸甘油酯中。随后，将混合物倾入标称容量为2.0g的栓剂模具中且使其冷却。
调配物实例7 如下制成每5.0ml剂量含有50mg药物的悬浮液 成分量 活性成分50.0mg 黄原胶 4.0mg 羧甲基纤维素钠(11％) 微晶纤维素(89％) 50.0mg 蔗糖 1.75g 苯甲酸钠 10.0mg 调味剂和着色剂适当体积 纯水 至5.0mL 将活性成分、蔗糖和黄原胶掺合，使其通过10号目美国筛，且随后将其与预先制成的微晶纤维素和羧甲基纤维素钠的水溶液混合。将苯甲酸钠、调味剂和着色剂用一些水稀释且在搅拌下添加。随后添加足量水以产生所需体积。
调配物实例8 成分 量(毫克/粒胶囊) 活性成分 15.0mg 淀粉 407.0mg 硬脂酸镁 3.0mg 总计 425.0mg 将活性成分、淀粉和硬脂酸镁掺合，使其经过20号目美国筛，且以425.0mg的量填充到硬明胶胶囊中。
调配物实例9 如下制备皮下用调配物 成分 量 活性成分 5.0mg 玉米油 1.0mL 调配物实例10 如下制备局部用调配物 成分 量 活性成分 1-10g 乳化蜡 30g 液体石蜡 20g 白色软石蜡 至100g 将白色软石蜡加热直到熔化。将液体石蜡和乳化蜡掺配且搅拌直到溶解。添加活性成分且继续搅拌直到分散开。随后将混合物冷却直到成为固体。
调配物实例11 如下制备静脉内调配物 成分量 活性成分250mg 等渗盐水1000mL 本发明方法中采用的另一优选调配物使用经表皮传递装置(“贴片”)。所述经皮贴片可用来以受控量连续或不连续地输注本发明的化合物。传递药剂的经皮贴片的构造和使用在此项技术中为人熟知。参见，例如1991年6月11日颁布的美国专利5,023,252，其以引用的方式并入本文中。所述贴片可经构造以供连续地、间断地或按需要传递药剂。
经常，希望或必需将医药组合物直接或间接地引入大脑中。直接技术通常涉及将药物传递导管置于主体脑室系统中以绕过血脑屏障。美国专利5,011,472中描述一种用于将生物因子输送到身体的特定解剖学区中的可植入传递系统，所述专利以引用的方式并入本文中。
通常优选的间接技术通常涉及通过将亲水性药物转变成脂溶性药物而调配组合物以提供药物潜效化作用。潜效化作用通常通过阻断药物上存在的羟基、羰基、硫酸根和伯胺基来实现以使药物更具脂溶性且更易输送穿过血脑屏障。或者，亲水性药物的传递可通过动脉内输注可瞬时打开血脑屏障的高渗溶液来增强。
用于本发明的其他合适调配物可见于雷氏药学大全(Remington′s PharmaceuticalSciences)，Mace出版社，费城(Philadelphia)，PA，第17版(1985)。
如上文所指出，本文所述的化合物适用于多种如上文所述的药物传递系统。另外，为了提高所投与化合物的活体内血清半衰期，可将所述化合物囊封，引入脂质体腔中，制备成胶体，或可采用使所述化合物的血清半衰期延长的其他常规技术。多种方法可用于制备脂质体，如在(例如)Szoka等人，美国专利第4,235,871号、第4,501,728号和第4,837,028号中所述，各专利以引用的方式并入本文中。
本发明的结合物为VLA-4拮抗剂且预期与非结合化合物相比，本发明的结合物提供提高的活体内保持性。结合物在体内的所述改善的保持性将引起药物的需要剂量降低，需要剂量降低又将会引起副作用降低和中毒可能性降低。另外，药物调配物可频率更低地投与患者，而达成类似或改善的治疗效应。
预期本发明的结合物在活体内通过竞争性结合VLA-4而展现对由VLA-4介导的白细胞对内皮细胞的粘附的抑制作用。本发明的化合物优选可用于静脉内调配物中以治疗由VLA-4介导的疾病或白细胞粘附。所述疾病包括哺乳动物患者的发炎性疾病诸如哮喘、阿兹海默氏病、动脉粥样硬化、艾滋病痴呆、糖尿病(包括急性青少年发作型糖尿病)、发炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、多发性硬化症、类风湿性关节炎、组织移植、肿瘤转移、脑膜炎、脑炎、中风和其他脑创伤、肾炎、视网膜炎、异位性皮炎、牛皮癣、心肌缺血和急性白细胞介导的肺损伤(诸如在成人呼吸窘迫综合征中发生的损伤)。本发明的调配物特别适用于治疗多发性硬化症和类风湿性关节炎。
证明在治疗发炎性病状中具有功效的适当活体内模型包括小鼠、大鼠、豚鼠或灵长类动物的EAE(实验性自体免疫脑脊髓炎)以及其他取决于α4整联蛋白的发炎性模型。
发炎性肠病为被称为克罗恩氏病和溃疡性结肠炎的两种类似疾病的统称。克罗恩氏病是一种特发性慢性溃疡缩窄性发炎性疾病，其以肉芽肿发炎性反应引起的所有肠壁层的明显分界及通常透壁受累为特征。尽管所述疾病最通常影响结肠和/或回肠末端，但从口腔到肛门的胃肠道的任何区段均可能受累。溃疡性结肠炎是一种在很大程度上限于结肠粘膜和粘膜下层的发炎性反应。淋巴细胞和巨噬细胞在发炎性肠病病变中数目众多且可促进发炎性损伤。
哮喘是以气管支气管树对各种增强支气管气管的发作性缩窄的刺激反应增加为特征的疾病。所述刺激引起从IgE涂布的肥大细胞释放各种炎症介体，包括组织胺、嗜曙红细胞和嗜中性粒细胞趋化因子、白三烯(leukotrine)、前列腺素和血小板活化因子。这些因子的释放募集嗜碱细胞、嗜曙红细胞和嗜中性粒细胞，其会引起发炎性损伤。
动脉粥样硬化为动脉(例如，冠状动脉、颈动脉、主动脉和髂动脉)的疾病。动脉粥样化的基本病变由在内膜内具有脂质核心和纤维盖帽的隆起病灶斑块组成。粥样动脉硬块连累动脉血流动且削弱受影响的动脉。心肌梗塞和脑梗塞为这种疾病的主要后果。巨噬细胞和白细胞募集到粥样动脉硬块中且促进发炎性损伤。
类风湿性关节炎为主要引起关节损伤和破坏的慢性复发发炎性疾病。类风湿性关节炎通常首先影响手脚的小关节，而随后可涉及腕、肘、踝和膝。关节炎由滑膜细胞与从循环渗透到关节滑膜衬里中的白细胞的相互作用引起。参见，例如Paul，免疫学(Immunology)(第3版，Raven出版社(Raven Press)，1993)。
本发明的化合物的另一指示是治疗由VLA-4介导的器官或移植排斥。最近几年，在移植组织和器官(诸如皮肤、肾、肝、心脏、肺、胰腺和骨髓)的外科技术的效率方面已有相当大的改善。或许，主要的突出问题是缺乏令人满意的诱发接受者对所移植的异体移植物或器官的免疫耐受性的药剂。当异源小室或器官移植到宿主(即，供体和受体为来自相同种类的不同个体)中时，宿主免疫系统可能会增加对移植物中的外来抗原的免疫反应(移植物抗宿主疾病)，导致移植的组织的破坏。CD8细胞、CD4细胞和单核细胞均与移植组织排斥有关。结合α-4整联蛋白的本发明化合物尤其可用于阻断受体中的同种抗原诱发的免疫反应，从而防止所述细胞参与破坏所移植的组织或器官。参见，例如Paul等人，国际移植(Transplant International)，9，420-425(1996)；Georczynski等人，免疫学(Immunology)，87，573-580(1996)；Georcyznski等人，移植免疫学(Transplant.Immunol.)，3，55-61(1995)；Yang等人，移植(Transplantation)，60，71-76(1995)；Anderson等人，APMIS 102，23-27(1994)。
结合VLA-4的本发明化合物的相关用途是调节与“移植物抗宿主”疾病(GVHD)相关的免疫反应。参见，例如Schlegel等人，免疫学杂志(J.Immunol)，155，3856-3865(1995)。GVHD为当将免疫活性细胞转移到异源接受者中时发生的潜在不治病症。在这种情形下，供体的免疫活性细胞可能会攻击接受者的组织。皮肤组织、肠上皮和肝为常见靶点且会在GVHD期间被破坏。当免疫组织正被移植时，诸如在骨髓移植中，所述疾病呈现特别严重的问题，而也已报道在包括心脏和肝移植的其他情况下同样会有严重程度稍低的GVHD。本发明的治疗剂尤其用于阻断供体T细胞的激活，从而妨碍其溶解宿主中的靶细胞的能力。
本发明化合物的另一用途为抑制肿瘤转移。已报道若干肿瘤细胞表达VLA-4且结合VLA-4的化合物阻断所述细胞对内皮细胞的粘附。Steinback等人，泌尿学研究(Urol.Res.)，23，175-83(1995)；Orosz等人，国际癌症杂志(Int.J.Cancer)，60，867-71(1995)；Freedman等人，白血病与淋巴瘤(Leuk.Lymphoma)，13，47-52(1994)；Okahara等人，癌症研究(Cancer Res.)，54，3233-6(1994)。
具有所需生物活性的化合物可按需要修饰以提供所需性质，例如改善的药理学性质(例如，活体内稳定性、生物可用性)或在诊断应用中能被检测出的能力。稳定性可以多种方式加以分析，诸如，通过测量在用肽酶或人类血浆或血清培养期间蛋白质的半衰期来分析。已经描述了许多这样的蛋白质稳定性分析(参见，例如Verhoef等人，欧洲药物代谢动力学杂志(Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinet)，1990，15(2)83-93)。
本发明化合物的另一用途为治疗多发性硬化症。多发性硬化症为渐进性神经病学自体免疫性疾病，在美国估计有250,000到350,000人受其影响。认为多发性硬化症是某些白细胞攻击髓鞘且引发髓鞘(覆盖神经纤维的绝缘鞘)受破坏的特异性自体免疫反应的结果。在多发性硬化症的动物模型中，针对VLA-4的鼠科单克隆抗体已展示阻断白细胞对内皮的粘附，且因此预防中枢神经系统炎症且随后预防动物瘫痪16。
本发明的医药组合物适用于多种药物传递系统。用于本发明的合适调配物见于雷氏药学大全(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，Mace出版社，费城(Philadelphia)，PA，第17版(1985)。
投与患者的量将根据所投药物、投药目的(例如预防或治疗)、患者的病况、投药方式等改变。在治疗应用中，将组合物以一定量投与已患有疾病的患者以足以治愈或至少部分地改善所述疾病的症状和其并发症。足以实现此的量定义为“治疗有效剂量”。对此用途有效的量将取决于所治疗疾病病状以及临床主治医师依照诸如炎症的严重程度、患者的年龄、体重和一般情况等的因素参照适当动物模型资料(诸如本文所提供的资料)而作出的判断。根据所述资料估计适当人类剂量的方法此项技术中为人所知。(参见，例如Wagner，医药科学药物代谢动力学杂志(J.G.Pharmacokinetics for thePharmaceutical Scientist)，餐饮业咨询公司(Technomic，Inc.)，兰开斯特(Lancaster)，PA 1993)。
投与患者的组合物是呈如上所述的医药组合物形式。这些组合物可通过常规灭菌技术灭菌或可过滤灭菌。所得水溶液可在包装后按原样使用或冻干，投药之前将冻干的制剂与无菌水性载剂组合。
本发明化合物的治疗剂量将根据(例如)所进行治疗的特定用途、所述化合物的投药方式、患者的健康状况和情况和处方医生的判断而不同。举例来说，对于静脉内投药来说，所述剂量通常在约20μg/kg体重到约2000μg/kg体重范围内，优选在约20μg/kg体重到约500μg/kg体重范围内，更优选在约100μg/kg体重到约300μg/kg体重范围内。鼻内投药的合适剂量范围通常为约0.1pg/kg体重到1mg/kg体重。有效剂量可从源于活体外或动物模型试验系统的剂量反应曲线推知。
本发明的化合物也能够结合α6β1、α9β1、α4β7、αdβ2、αeβ7整联蛋白或拮抗α6β1、α9β1、α4β7、αdβ2、αeβ7整联蛋白的作用(尽管本发明中优选为α4β1和α9β1)。因此，本发明的化合物也可用于预防由所述整联蛋白与其各别配位体结合所诱发的症状、病症或疾病或使所述症状、病症或疾病逆转。
举例来说，1998年12月3日公开的国际公开案第WO 98/53817号(其揭示内容以引用的方式全部并入本文中)和其中所引用的参考文献描述由α4β7介导的病症。所述参考文献也描述确定α4β7依赖性结合VCAM-Ig融合蛋白的拮抗作用的分析。
另外，结合αdβ2和αeβ7整联蛋白的化合物尤其可用于治疗哮喘和相关肺病。参见，例如M.H.Grayson等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1998，188(11)2187-2191。结合αeβ7整联蛋白的化合物也可用于治疗全身性红斑狼疮(参见，例如M.Pang等人，关节炎与风湿病(Arthritis Rheum.)1998，41(8)，1456-1463)；克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和发炎性肠病(IBD)(参见，例如D.Elewaut等人，斯堪的纳维亚胃肠病学杂志(ScandJ.Gastroenterol)，1998，33(1)743-748)；史格伦氏综合征(Sjogren′s syndrome)(参见，例如U.Kroneld等入，斯堪的纳维亚胃肠病学杂志(Scand J.Gastroenterol)，1998，27(3)，215-218)；和类风湿性关节炎(参见，例如斯堪的纳维亚胃肠病学杂志(Scand J.Gastroenterol)，1996，44(3)，293-298)。并且结合α6β1的化合物可用于防止受孕(参见，例如H.Chen等人，生物化学(Chem.Biol.)1999，6，1-10)。
本发明的另一方面，本文所述的化合物和组合物可用于抑制免疫细胞从血流迁移到(在(例如)多发性硬化症的情况下)中枢神经系统或迁移到会导致发炎诱发的髓鞘破坏的区域。所述试剂优选抑制免疫细胞以抑制髓鞘脱失的方式迁移且可进一步促进再形成髓鞘。所述试剂也可预防先天性代谢紊乱的中枢神经系统的髓鞘脱失且促进再形成髓鞘，渗入的免疫细胞在所述先天性代谢紊乱中会影响主要在CNS中的髓鞘发育。当投与患有由髓鞘脱失疾病或病状诱发的瘫痪的个体时，所述试剂优选也减少瘫痪。
对于由本文所揭示的组合物、化合物和方法治疗所包括的发炎性疾病通常包括与髓鞘脱失有关的病状。组织学上，髓鞘异常为髓鞘脱失或髓鞘形成不良。髓鞘脱失暗示髓鞘破坏。髓鞘形成不良是指由少突神经胶质细胞功能障碍引起的髓鞘缺损性形成或保持。优选预期本文揭示的组合物和方法治疗与髓鞘脱失有关的疾病和病状并且帮助再形成髓鞘。预期治疗的其他疾病或病状包括脑膜炎、脑炎和脊髓损伤和通常由于发炎性反应而诱发髓鞘脱失的病状。
预期本文揭示的组合物、化合物和混合物用于治疗与髓鞘脱失相关的病状和疾病。涉及髓鞘脱失的疾病和病状包括(但不限于)多发性硬化症、先天性代谢紊乱(例如，苯丙酮酸尿症、泰-萨二氏病(Tay-Sachs disease)、尼曼-匹克氏病(Niemann-Pick disease)、高歇氏病(Gaucher′s disease)、赫尔勒氏综合征(Hurler′s syndrome)、克拉培氏病(Krabbe′sdisease)和其他脑白质营养不良)、具有异常髓鞘形成的神经病(例如，格林-巴利(GuillainBarré)、慢性免疫髓鞘脱失多发性神经病(CIDP)、多灶性CIDP、抗MAG综合征、GALOP综合征、抗脑硫脂抗体综合征、抗GM2抗体综合征、POEMS综合征、神经束膜炎、IgM抗GD1b抗体综合征)、药物相关髓鞘脱失(例如，由投与氯喹(chloroquine)、FK506、哌克昔林(perhexiline)、普鲁卡因胺(procainamide)和齐美定(zimeldine)所引起)、其他遗传性髓鞘脱失病状(例如，碳水化合物缺乏糖蛋白、科凯恩氏综合征(Cockayne′ssyndrome)、先天性髓鞘发育不良、先天性肌肉萎缩、法勃氏病(Farber′s disease)、马里内斯科-舍格伦综合征(Marinesco-

syndrome)、异染性脑白质营养不良、佩-梅二氏病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、雷弗素姆氏病(Refsum disease)、朊病毒相关病状和萨拉氏病(Salla disease))和其他髓鞘脱失病状(例如，脑膜炎、脑炎或脊髓损伤)或疾病。
存在各种可用于活体内研究这些疾病的疾病模型。举例来说，动物模型包括(但不限于) 表4
多发性硬化症 最常见的髓鞘脱失病为多发性硬化症，但许多其他代谢性和发炎性病症也会导致髓鞘形成缺乏或异常。MS为慢性神经病，其在早期成年期出现且大多数情况下进行至相当程度的失能(significant disability)。仅在美国就存在约350,000例MS。除了创伤之外，MS是早期到中期成年期神经失能的最常见原因。
MS的病因仍有待确定。MS的特点在于慢性炎症、髓鞘脱失和神经胶质过多症(瘢痕化)。髓鞘脱失可对轴突传导引起负效应或正效应。正向传导异常包括轴突传导缓慢、在高频而非低频脉冲串存在下出现的可变传导阻滞、或完全的传导阻滞。正向传导异常包括自发或机械应力后异位性脉冲产生和髓鞘脱失外显子之间的异常“串话干扰(cross-talk)”。
已观察到对髓鞘蛋白质(髓鞘碱性蛋白质(MBP)或髓鞘蛋白脂质蛋白质(PLP))有反应性的T细胞介导实验性变应反应性脑脊髓炎中的CNS炎症。也已观察到患者的CNS免疫球蛋白(Ig)含量升高。另外可能的是MS中所观察到的一些组织损伤由激活T细胞、巨噬细胞或星形细胞的细胞因子产物介导。
现今，80％诊断患有MS的患者在发病后生存20年。控制MS的疗法包括(1)针对改变疾病病程(包括治疗急性恶化)和针对长期抑制疾病进行治疗；(2)治疗MS的症状；(3)预防和治疗医学并发症；和(4)控制继发性自身和社会问题。
MS的发病可能严重或者轻微到不会引起患者寻求医疗的程度。最常见的症状包括一个或多个肢虚弱、归因于视神经炎的视觉模糊、感觉障碍、复视和共济失调。病程可分成三个一般类别(1)复发性MS，(2)慢性进行性MS，和(3)非活性MS。复发性MS的特征在于神经功能障碍的复发性攻击。MS攻击通常发展数天到数周，且接着可完全恢复、部分恢复或不恢复。从攻击恢复通常在从症状峰值的数周到数月内发生，不过很少一些恢复可能会持续2年或2年以上。
慢性进行性MS导致逐步进行性恶化，而无稳定化或症状缓解期。所述形式在患有复发性MS先前病史的患者中发展，不过在20％的患者中可能没有恢复复发。急性复发也可能在进行性病程期间发生。
第三种形式为非活性MS。非活性MS的特征在于可变大小的固定神经功能缺失。患有非活性MS的大多数患者具有复发性MS的早先病史。
疾病病程也取决于患者的年龄。举例来说，有利的预后因子包括早期发病(排除儿童期)、发病后5年复发病程和少量剩余失能。对比起来，不良预后与发病年龄迟(即，年龄为40岁或40岁以上)和进行性病程相关。这些变数互相依赖，因为慢性进行性MS趋于在复发MS的较迟年龄开始。慢性进行性MS的失能通常归因于患者的进行性截瘫或四肢麻痹(瘫痪)。本发明的一方面，患者优选在患者处于症状缓解时，而非处于疾病复发阶段时进行治疗。
短期使用促肾上腺皮质激素或口服皮质类固醇(例如，口服泼尼松(prednisone)或静脉内用甲泼尼龙(methylprednisolone))为治疗患有急性MS恶化的患者的唯一特效治疗措施。
MS的最近疗法包括用干扰素β-1b、干扰素β-1a和

(从前称为共聚物1)治疗患者。已展示所述三种药物显著降低疾病的复发率。所述药物自行肌内或皮下投药。
然而，当前治疗形式无一会抑制髓鞘脱失，更不用说促进自发再形成髓鞘或使得再形成髓鞘或减少瘫痪。本发明的一方面预期用本文所揭示的药剂单独或与其他标准治疗形式组合治疗MS。
先天性代谢紊乱 先天性代谢紊乱包括苯丙酮酸尿症(PKU)和其他氨基酸尿症、泰-萨二氏病、尼曼-匹克病、高歇氏病、赫尔勒氏综合征、克拉培氏病和其他如下文更充分描述的影响鞘发育的脑白质营养不良。
PKU为由酶-苯丙氨酸羟化酶缺乏所引起的新陈代谢的承袭错误。所述酶缺失导致智力迟钝、器官损坏、体态异常，且在母亲PKU的情况下可严重连累怀孕。已在小鼠中发现用于研究PKU的模型。优选将鉴别具有PKU的婴儿维持在无苯丙氨酸且饮食减低的条件下。本发明的一方面将是使所述饮食与本文揭示的化合物和组合物组合以防止髓鞘脱失和归因于PKU损坏再形成的髓鞘细胞。
典型泰-萨二氏病在约6个月大的个体中出现且最终将导致个体到5岁时死亡。所述疾病是由于缺乏酶己糖胺酶A(hex A)，所述酶为降解脑和神经细胞中的某些脂肪物质所必需。在所述酶不存在时，所述物质积聚且导致神经细胞破坏。hex A酶缺乏的另一形式在随后的生命中发生且称为青少年、慢性和成年发病形式的hex A缺乏。症状类似于表现典型泰-萨二氏病的症状。也存在所述酶缺乏的成年发病形式。目前，不能治愈或治疗所述疾病/缺乏，对于所述疾病仅有对胎儿子宫内试验的预防措施。因此，本文揭示的化合物和组合物可用于改善或预防所述患者的神经细胞破坏。
尼曼-匹克病分成三类急性婴儿形式；B型，其为稍不常见的慢性非神经病学形式；和C型，其为所述疾病的生物化学和遗传学不同形式。在正常个体中，将细胞胆固醇引入溶酶体以供处理，此后其释放出。已显示从患有尼曼-匹克的个体采集的细胞在从溶酶体释放胆固醇方面欠缺。这导致胆固醇在溶酶体内部过度积累，引起处理错误。发现NPC1具有类似于其他蛋白质中的固醇敏感区(sterol-sensing region)的已知固醇敏感区，这暗示它在调节胆固醇运输方面起作用。已确定对于A型和C型形式的尼曼-匹克病没有成功的疗法。对于C型，推荐患者遵循低胆固醇饮食。因此，本文揭示的化合物和组合物可用于改善或预防所述细胞破坏。
高歇氏病为由基因突变引起的遗传性疾病。通常，所述基因引起称为葡糖脑苷脂酶的酶，身体需要葡糖脑苷脂酶来分解脂肪-葡糖脑苷脂。在患有高歇氏病的患者中，身体不能适当地产生所述酶且所述脂肪不能被分解。像泰-萨二氏病一样，高歇氏病在来自东欧的犹太人(德系犹太人(Ashkenazi))的后裔中相当常见，不过任何种族的个体都可能受影响。在犹太人群中，高歇氏病为最常见的遗传病症，在450人中约有1人发病。在普通人群中，在100,000人中高歇氏病影响约1人。
在1991年，酶替代疗法可用作高歇氏病的第一有效治疗。所述治疗由静脉内给与的修饰形式的葡糖脑苷脂酶组成。预期本发明的组合物和化合物可单独或更优选与葡萄糖脑苷脂酶组合投药以治疗受折磨个体的所述疾病。
赫尔勒氏综合征(也称为I型粘多糖病)为一类重叠疾病。所述遗传性疾病通常共有成纤维细胞中的粘多糖细胞累积。所述疾病可遗传性地加以区别。成纤维细胞和骨髓移植似乎没有帮助，因此需要可用于改善疾病严重程度和进展的化合物和组合物。本文揭示的化合物和组合物可向个体投药以改善疾病进展和/或严重程度。
克拉培氏病(也称为球样细胞性脑白质营养不良)为由半乳糖神经酰胺酶(或半乳糖脑苷脂酶)缺乏引起的常染色体隐性病状，半乳糖神经酰胺酶为代谢髓鞘主要脂质组分的溶酶体酶。在法国，发病率估计为1∶150,000个出生者。所述疾病会导致中枢和周围神经系统髓鞘脱失。发病通常发生在生命第一年中且所述病状快速进行，但也已报道青少年、青年或成年发病形式，进行变化率更大。从酶分析(半乳糖神经酰胺酶缺乏)已确立诊断。存在若干天然动物模型(小鼠、狗、猴)。像所有脑白质营养不良一样，克拉培氏病没有已知的治愈或有效治疗。本发明的一个实施例使用本文所揭示的组合物和化合物治疗或改善克拉培氏病和其他脑白质营养不良。
脑白质营养不良为影响脑、脊髓和周围神经的遗传确定的进行性病症群组。其包括肾上腺脑白质退化症(ALD)、肾上腺脊髓神经病变(AMN)、埃迪-古地尔斯综合征(Aicardi-Goutiers syndrome)、亚历山大病(Alexander′s disease)、CACH(即，儿童期共济失调伴中枢神经系统低髓鞘化或消失白质疾病)、CADASIL(即，常染色体显性遗传性脑动脉病伴皮层下梗死和脑白质病)、卡拿弯病(Canavan disease)(海绵状退行性变)、脑腱性黄色瘤(CTX)、克拉培氏病(上文所述)、异染性脑白质营养不良(MLD)、新生儿肾上腺脑白质退化症、卵巢白质营养不良综合征(ovarioleukodystrophy syndrome)、佩-梅二氏病(X-连锁痉挛性截瘫)、雷弗素姆氏病、范德克纳普综合征(van der Knaapsyndrome)(空泡脑白质营养不良伴皮层下囊肿)和齐薇格氏综合征(Zellwegersyndrome)。所述疾病没有有效治疗，更不用说治愈。因此，需要诸如通过使用本文揭示的组合物和化合物治疗或改善所述疾病的症状的方式。
神经病伴异常髓鞘形成 存在多种慢性免疫多发性神经病，其导致患者髓鞘脱失。所述病状的发病年龄因情况而不同。存在所述疾病的标准治疗且其可与本文揭示的组合物和化合物组合。或者，可单独使用揭示的组合物和化合物。现有标准疗法包括下列疗法 表5 药物和辐射诱发的髓鞘脱失 某些药物和辐射可诱发个体髓鞘脱失。引起髓鞘脱失的药物包括(但不限于)氯喹、FK506、哌克昔林、普鲁卡因胺和齐美定。
辐射也可诱发髓鞘脱失。认为归因于辐射的中枢神经系统(CNS)中毒是由以下引起(1)血管结构破坏，(2)少突神经胶质细胞-2星形细胞祖细胞和成熟少突神经胶质细胞缺失，(3)海马、小脑和皮层中神经干细胞群缺失和细胞因子表达的全身性改变。大多数辐射损伤由在治疗某些癌症期间所施以的放射疗法引起。参见Belka等人，2001英国肿瘤杂志(Br.J.Cancer)851233-9的评论。然而，辐射暴露对于宇航员(Hopewell，1994空间生物学研究进展(Adv.Space Res.)，14433-42)以及在暴露于放射性物质的情况下也可为一个难题。
接受药物或意外或有意暴露于辐射的患者可通过投与一种本文揭示的化合物或组合物中以防止髓鞘脱失或促进再形成髓鞘而体验到益处。
涉及髓鞘脱失的病状 导致髓鞘脱失的其他遗传综合征/疾病包括科凯恩氏综合征、先天性髓鞘发育不良、法勃氏病、异染性脑白质营养不良、佩-梅二氏病、雷弗素姆氏、朊病毒相关病状和萨拉氏病。
科凯恩氏综合征(CS)为罕见的遗传病症，病人对日光敏感，具有矮小身材和早熟的外表。在典型形式的科凯恩氏综合征(I型)中，症状为进行性的且通常在1岁后表现出。早期发病或先天性形式的科凯恩氏综合征(II型)在出生时显而易见。受人关注地，不同于其他DNA修复疾病，科凯恩氏综合征与癌症无关。CS为引起身体和脑生长极度不足和进行性恶病质、视网膜、耳蜗和神经退化病的多系统病症，具有脑白质营养不良和髓鞘脱失神经病，但无癌症增加。暴露于紫外线(例如，日光)后，患有科凯恩氏综合征的个体不再能够执行转录偶联修复作用。迄今已鉴别出在科凯恩氏综合征中有两种基因缺失CSA和CSB。CSA基因可见于染色体5上。编码蛋白质的两种基因与转译机器的组分和DNA修复蛋白相互作用。
迄今为止，已确定对于患有所述疾病的患者没有治愈或有效治疗。因此，本发明的一个方面为用本文揭示的化合物和组合物治疗所述疾病。
先天性低髓鞘化具有若干名称，包括先天性髓鞘不良神经病、先天性髓鞘发育不良多发性神经病、先天性低髓鞘化(洋葱头(Onion Bulb))多发性神经病、先天性低髓鞘化神经病、由低髓鞘化引起的先天性神经病、低髓鞘化神经病和CHN。在人类最常见的遗传性病症中，遗传性周边神经病为产生周围神经进行性恶化的病症的复杂的临床上和遗传上异型群组。先天性低髓鞘化为病症群组中的一种。所述群组包括伴有易于压力麻痹倾向的遗传性神经病、夏-马-图三氏病(Charcot-Marie-Tooth disease)、德-索氏综合征(Dejerine-Sottas syndrome)和先天性髓鞘发育不良神经病。对于任何所述病症没有已知的治愈或有效性治疗。
法勃氏病具有若干名称，包括法勃脂肪肉芽肿、神经酰胺酶缺乏、酸性神经酰胺酶缺乏、AC缺乏、N-月桂基鞘氨醇脱酰基酶缺乏和N-酰基鞘氨醇氨基水解酶。如某些名称显示，所述病归因于酸性神经酰胺酶(也称为N-酰基鞘氨醇氨基水解酶，ASAH)缺乏而发生。所述酶缺乏导致非磺化酸性粘多糖在神经元和胶质细胞中累积。具有所述疾病的患者通常在2岁之前死亡。
异染性脑白质营养不良(MLD)为由酶-芳基硫酸酯酶A所引起的遗传性病症。其为影响髓鞘生长的称为脑白质营养不良的遗传性病症群组中的一种。存在三种形式的MLD迟发型婴儿MLD、青少年MLD和成年MLD。在最常见的迟发型婴儿形式中，症状发病在6个月大到2岁之间开始。所述婴儿通常出生时正常，但是最终丧失先前得到的能力。症状包括张力减退(低肌张力)、讲话异常、智力能力丧失、失明、僵直(即，不受控制的肌肉紧张)、惊厥、吞咽异常、瘫痪和痴呆。幼年形式的症状在4岁到14岁之间开始，且包括学习成绩异常、智力衰退、共济失调、发作和痴呆。在成年形式中，在16岁后开始的症状可包括注意力不集中、消沉、精神病学障碍、共济失调、颤动和痴呆。发作可发生在成年形式中，但与在其他形式中相比较不常见。在所有三种形式中，智力衰退通常为第一病征。
佩-梅二氏病(也称为产期嗜苏丹性脑白质营养不良(perinatal sudanophilicleukodystrophy))为引起蛋白脂质蛋白质异常的X-连锁遗传性病症。所述异常导致婴儿通常在1岁以前死亡。对于所述疾病没有已知的治疗或治愈。
雷弗素姆氏病(也称为植烷酸氧化酶缺乏、多神经炎型遗传性共济失调或遗传性运动感觉性神经病IV，HMSN IV)由基因突变引起，所述基因编码植烷酰辅酶A羟化酶(PAHX或PHYH)。主要临床特征为色素性视网膜炎、慢性多发性神经病和小脑病征。植烷酸(特殊支链脂肪酸(3，7，11，15-四甲基-十六酸))积聚在患有所述疾病的患者的组织和体液中且归因于缺乏PAHX而不能代谢。每月执行一次或两次血浆分离从身体中有效去除植烷酸且使限制植烷酸摄入的饮食控制范围放宽。
朊病毒相关病状包括戈斯特曼-斯特劳斯勒病(Gerstmann-Straussler disease，GSD)、克-雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)、家族性致命性失眠症，且朊病毒蛋白质的异常同种型可充当所述病症以及库鲁症(kuru)和羊搔痒症(scrapie)(绵羊中见到的疾病)中的致病因子(infectious agent)。术语朊病毒源于“蛋白质致病因子”(Prusiner，科学(Science)216136-44，1982)。存在产生淀粉样肽的朊病毒相关蛋白质(PRP)的蛋白水解裂解，所述淀粉样肽会聚合到不可溶原纤维中。
萨拉氏病和其他类型的斯鲁瑞症(sialurias)为涉及唾液酸储存的问题的疾病。其为常染色体隐性神经退化性病症，其可表现为严重婴儿形式(即，ISSD)和在芬兰流行的缓进型成年形式(即，萨拉氏病)。主要症状为张力减退、小脑共济失调和智力迟钝。也预期对所述病状和疾病进行减轻或改善治疗。
导致髓鞘脱失的其他病状包括感染后脑炎(也称为急性播散性脑脊髓炎)、脑膜炎和脊髓损伤。也预期本文揭示的组合物和化合物用于治疗所述其他髓鞘脱失病状。
下列合成和生物实例用以说明本发明且无论如何不能将其理解为限制本发明的范畴。除非另有说明，否则所有温度都是以摄氏温度表示。
实例 在以下实例中，下列缩写具有下列含义。如果缩写未加以定义，则其具有公认的含义。

br s＝宽单峰 BSA ＝牛血清白蛋白 d＝双峰 dd＝双二重峰 dq＝双四重峰 dsextet＝双六重峰 DMF＝二甲基甲酰胺 EDTA＝乙二胺四乙酸 EtOAc＝乙酸乙酯 EM＝发射波长(nm) EX＝激发波长(nm) g＝克 HBSS＝汉克斯平衡盐溶液(Hank′s balanced salt solution) HEPES＝4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 HPLC＝高效液相层析法 hrs或h＝小时 in.＝英寸 i-PrOH＝异丙醇 kg＝千克 L＝升 LC/MS＝液相层析/质谱 m＝多重峰 m2＝平方米 M＝摩尔浓度(molar) mbar＝毫巴 mg＝毫克 MHz＝兆赫 min.＝分钟 mL＝毫升 mm＝毫米 mM＝毫摩尔浓度(millimolar) mmol＝毫摩尔 mOsm＝毫渗摩 m/z＝荷质比 N＝当量 ng＝纳克 nm＝纳米 NMR＝核磁共振 PBS＝磷酸盐缓冲盐水 PBS++＝具有钙和镁的磷酸盐缓冲盐水 ppm＝百万分率 psi＝磅/平方英寸 q＝四重峰 Rf保持系数(物质行进距离与溶剂前沿行进距离的比) rpm＝每分钟转数 rt＝室温 s＝单峰 t＝三重峰 TFA＝三氟乙酸 THF＝四氢呋喃 TLC＝薄层层析法 UV＝紫外线 wt/wt＝重量/重量 w/v＝重量/体积 μg＝微克 μm＝微米 μM＝微摩尔浓度(micromolar) 一般方法。快速层析法使用Biotage快速75L(Biotage Flash 75L)使用800g KP-Sil二氧化硅盒(32-63μM，60

，500-550m2/g)执行。报道分析性TLC的Rf，正相使用EM科学硅胶60F(EM Sciences Silica Gel 60F)(254)，250μM厚板。NMR谱在VarianGemini 300MHz分光计(对于1H谱为300MHz且对于13C谱为75MHz)上获得。分析性HPLC在具有Phenomenex Luna，3μm，C-18，30x4.6mm管柱的Agilent 1100系列HPLC上执行。检测器为210nm下的紫外线。溶剂为在水中的0.1％TFA和在乙腈中的0.1％TFA。标准流速为1.5mL/min.，且在标准方法中，溶剂梯度经2.33分钟从20％CH3CN变化到70％CH3CN。第二替代方法的流速为2mL/min.且梯度经1.75分钟从20％CH3CN变化到70％CH3CN。第三方法的流速为1.5mL/min.，溶剂组成经10min.从20％CH3CN变化到70％CH3CN，在70％下保持2min.，随后经1min.匀变到95％且在95％下保持2分钟。LC/MS在具有1100系列MSD的Agilent 1100系列HPLC上用电喷雾离子化(除非另有陈述，否则为化学离子化)执行。管柱和条件与独立式HPLC相配。酰胺的1H NMR通常展示旋转异构体且一些峰值的积分以分数质子值报道。
实例1 制备N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(呋喃-3-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸。

步骤1制备N-[2-二乙氨基-5-{N-氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸叔丁酯2。

在60psi氢气下在室温下搅拌硝基嘧啶-氨基甲酸酯1(160.25g，0.3035mol；如WO 03/099809中制备)与5％Pd/C(15g，50/50wt/wt，具有H2O，Degussa E 101 R/W)在THF-水溶液(1L THF和50mL H2O)中的混合物。22小时后，TLC(50％EtOAc/己烷，在硅胶上)展示100％转化为产物。将反应混合物通过硅藻土垫(200mL)过滤。将氢化烧瓶和硅藻土垫用新鲜的无水THF(500mL)漂洗以得到绿色滤液。将滤液在真空中浓缩以得到呈浅绿色-黑色胶质油状的粗产物。在N2下使旋转蒸发器排气且添加新鲜的无水THF(600mL)。将溶液在真空中浓缩且在氮气下排气。(将溶解于新鲜的无水THF中和浓缩的过程再重复两次以共沸去除残余水。)由于明显的空气敏感性，将所述物质立即用于步骤2。对于所需产物的[M+1]+，m/z＝499.5。
步骤2制备N-[2-二乙氨基-5-{N-三氟乙酰基氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸叔丁酯3。

将得自步骤1的粗氨基嘧啶氨基甲酸酯2溶解于600mL无水THF中。在氮气下将溶液冷却到0℃。经45分钟通过注射泵将三氟乙酸酐(45.5mL，1.51g/mL，327.3mmol)缓慢添加到冷胺溶液中。使溶液温到室温且搅拌过夜。TLC(在己烷中的40％EtOAc，硅胶)指示反应基本完成。LC/MS分析证实反应物且未展示任何原料。将反应物用乙酸乙酯(1.4L)稀释且用水(400mL)和饱和NaHCO3水溶液(700mL，0℃)的混合物洗涤。将有机溶液用盐水(700mL)洗涤且经MgSO4(105g)干燥以得到褐色-棕色溶液。将经干燥的溶液经硅胶(400mL)衬垫过滤以得到浅绿色-灰色溶液。(褐色杂质保留在硅胶上。)将所述硅胶用EtOAc(400mL)漂洗。将滤液在真空中浓缩且在氮气下将烧瓶排气以使得最小程度地暴露于氧气。添加无水甲苯(600mL)。将溶液在真空中浓缩且再次从无水甲苯(400mL)中共沸以得到绿色-黑色胶状油。在N2下将烧瓶排气。将所述粗产物([M+1]+m/z＝595.5)转入步骤3。
步骤3制备N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-三氟乙酰基氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸叔丁酯4。

将得自步骤2的粗三氟乙酰胺基嘧啶氨基甲酸酯3溶解于DMF(350mL)中。添加固体无水碳酸钾(79.6g，575.7mmol；用研钵和研棒研磨成细粉且随后置于在110℃、28 in.Hg真空下的真空烘箱中过夜)。在室温下快速添加乙基碘(46.5mL，89.8g，575.7mmol)。将反应烧瓶紧紧盖住且强烈搅拌浆液。在室温下搅拌20小时后，对反应物取样(TLC，LC/MS)。又搅拌反应物18小时以确保完全反应。再次，对反应物取样且执行小处理，随之TLC分析指示原料消耗掉。将反应物用2.7L乙酸乙酯稀释且强烈搅拌。将浆液经沃特曼(Whatman)1号滤纸过滤以去除固体K2CO3。将有机溶液置于6L分液漏斗中。添加水(2.5L)且强烈混合。使各层缓慢分离，随后添加盐水(200mL)以破乳。将有机层另外用1L水洗涤且随后用2L盐水洗涤。
将有机层经MgSO4(50g)和Na2SO4(200g)干燥。将干燥的有机溶液通过硅胶(700mL)塞过滤以获得草绿色-烟褐色溶液。(去除紫色/红色原始杂质。)将所述硅胶用EtOAc(800mL)漂洗。浓缩有机溶液以得到草绿色固体(194.3g，103％粗产物)。添加己烷(300mL)。将烧瓶侧面用金属刮刀刮擦以释放固体产物且将磁力搅拌棒加到烧瓶中。将混合物缓慢旋转30分钟以打碎固体结块且随后快速旋转30分钟直到产生细浆。浆液通过沃特曼1号滤纸过滤且将沉淀物用己烷(1.2L)漂洗以得到白色固体(141g，74％产率，根据LC/MS纯度为92％)。浓缩滤液以得到绿-褐色胶状物(33.3g)，通过TLC分析其含有一些所需产物。
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ，ppm7.80(表观d，1H)，7.18(表观d，AA′XX′，2H)，7.03(表观dd，AA′XX′，2H)，5.00(表观d，1H)，4.80(表观dq，1H)，3.95(表观dsextet，1H)，3.4-3.7(m，8.5H)，3.0-3.3(m，3H)，2.78(sextet，0.7H)，1.93(AA′BB′，4H)，1.38(表观d，9H)，1.24-1.05(m，9H)。如由双重最大峰值所证明，所述1H NMR展示旋转异构体。
13C NMR(CDCl3，75MHz)δ，ppm166.5，166.3，155.6，152.7，150.9，146.0，145.9，128.7，128.3，125.44，125.39，117.18，77.66，(72.82，72.28，71.97-CDCl3)，50.23，49.74，41.72，41.64，40.16，39.90，37.28，32.60，32.44，23.24，23.17，21.05，20.23，8.50，8.47，7.32。
步骤4制备N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸叔丁酯5。

将三氟乙酰胺4(140g)悬浮/溶解于甲醇(1.6L)中。添加碳酸钾水溶液(7％K2CO3)(480mL)。(三氟乙酰胺部分地沉淀且形成凝胶。)使反应烧瓶降入55℃水浴中。使溶液在55℃下混合9小时，通过TLC监测。非常小心地在真空中浓缩反应物直到收集到1.2L甲醇。将溶液用水(200mL)和盐水(600mL)稀释且用EtOAc(2L)萃取以得到橙色溶液。将EtOAc层用水(1L)洗涤且随后用盐水(400mL)洗涤。将三个水层/洗涤物中的每一者用单一1L EtOAc以相继次序反萃取以获得嫩黄色溶液。将有机萃取物组合且经MgSO4(126g)干燥。将干燥的有机溶液通过碱性氧化铝(300mL)衬垫过滤且在真空中浓缩以得到棕色胶状物。从600mL甲苯中共沸后，获得淡红色固体(117.1g)。
步骤5制备N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(呋喃-3-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸叔丁酯6。

将氨基-嘧啶5(117.1g，222.2mmol)溶解于无水THF(1.5L)中。添加亨格斯碱(Hunig′s base)二异丙基乙胺(115mL，3当量，666.6mmol)。在N2下将溶液冷却到0℃。反应烧瓶配有均压加料漏斗且所述加料漏斗装有3-糠酰氯(32g；Yamamoto和Maruoka；美国化学社会杂志(J.Am.Chem.Soc)1981，103，6133-6136)在THF(90mL)中的溶液。经2小时将所述糠酰氯溶液缓慢添加到冷胺溶液中。使反应物缓慢达到室温且搅拌36小时。将反应物用EtOAc(2L)稀释且用0.2N柠檬酸(1.2L和1.0L)洗涤两次，用盐水(1.8L)洗涤一次，且用饱和NaHCO3水溶液(1.3L)洗涤一次。将鲜橙色-粉红色有机溶液经Na2SO4(250g)和MgSO4(51g)干燥。将经干燥的溶液通过硅胶(1L)衬垫过滤且将烧瓶和二氧化硅用EtOAc(1L)漂洗。在真空中浓缩溶液。在蒸发过程中，白色固体结晶出。一旦溶液充分浓缩，则获得橙色、粉红色、白色的固体。添加乙醚(400mL)和己烷(500mL)。将浆液充分混合且经沃特曼1号滤纸过滤以获得桃色-粉红色固体和鲜红色滤液。将沉淀物用己烷(500mL)、乙醚(800mL)洗涤且再次用己烷(400mL)洗涤以得到浅桃色-橙色固体。将滤液和漂洗物组合、浓缩且搁置以供随后使用。将所述固体在60℃下在28in.Hg真空(49托)下于真空烘箱中干燥2天以产生100.0g。LC/MS展示固体纯度为92％。将粗酯6在2L(1kg)硅胶上层析，所述硅胶已用3L CH2Cl2浆液填充。将桃色产物酯溶解于CH2Cl2(200mL)中且施加于2L二氧化硅管柱上。将所述管柱用CH2Cl2(3L)、在己烷中的50％EtOAc(4L)和在己烷中的75％EtOAc(4L)洗提。几分钟内，所需产物酯开始从部分EtOAc-己烷洗提份(fraction)中结晶。将通过TLC证实为纯净的洗提份浓缩以得到白色固体(82.5g，根据LC/MS纯度＞99％)。将所述纯净物质转入最终去保护步骤。将通过TLC证实被污染的洗提份与来自原始滤液/己烷和乙醚漂洗物的残余物组合。将所述物质以与上文所述类似的方式快速层析以得到稍微桃色的固体(13.2g；[M+1]+m/z＝621.5)。
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ，ppm7.58(表观d，1H)，7.35-6.90(表观AB与ABX重叠，6H)，6.45(表观d，1H)，5.25(表观d，1H)，4.85(表观dq，1H)，4.05(表观octet，1H)，3.7-3.4(m，8H)，3.0-3.3(m，2.5H)，2.90(sextet，0.5H)，1.93(AA′BB′，4H)，1.38(表观d，9H)，1.24-1.05(m，9H)。如由双重最大峰值所证明，所述1H NMR展示旋转异构体。
步骤6制备N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(呋喃-3-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸 向得自步骤5的叔丁酯6(82.5g，132.7mmol)中添加甲酸(2L)。将所得溶液加热到50℃过夜。通过TLC分析证实完全反应且将溶液在真空中浓缩。向粗产物中添加水(约200mL)且将混合物浓缩到干燥。又添加150mL水且再次将粗产物在真空中浓缩。将白色固体粗产物从异丙醇中浓缩且从无水THF中浓缩两次，随后在旋转蒸发器上在45℃和35-40毫巴(26-30托)下干燥过夜以获得90g白色固体。LC/MS展示粗产物纯度为97.7％。
1H NMR(CD3OD，300MHz)δ，ppm7.65(s，0.55H)，7.45(s，0.45H)，7.38(m，2H)，7.25(d，1.3H)，7.18(d，1H)，7.05(d，1.2H)，6.90(d，1H)，6.55(s，0.55H)，6.22(宽峰s，0.45H)，4.9-4.8剩余溶剂峰与样品峰重叠，4.10(表观septet，1.1H)，3.7(m，3.3H)，3.58(m，7H)，3.45-2.9(m，6H)，2.78(表观sextet，0.7H)，1.90(AA′BB′，4.5H)，1.85(m，3.16H)，1.23-1.0(m，10.3H)。
13C NMR(CD3OD，75MHz)δ，ppm169.6，169.2，160.8，153.9，153.6 148.8，145.8，145.2，145.1，140.7，140.5，138.0，137.9，130.3，130.2，124.7，124.6，116.5，116.4，116.2，116.1，106.9，106.6，105.1，105.0，62.4，50.7，50.1，41.0，37.9，37.2，30.5，20.2，20.0，19.4，6.9，6.8，6.1，5.9。
以下实例2-7以与实例1类似的方式制备。
实例2 制备(S)-2-(2-(二乙氨基)-5-(N-乙基-2，2，2-三氟乙酰胺基)嘧啶-4-基氨基)-3-(4-(吡咯烷-1-羧酰氧基)苯基)丙酸
1H NMR(300MHz，CD3OD)δ1.03(1.5H，t，J＝7.2Hz)，1.10-1.28(7.5H，m)，1.98(4H，m)，2.67-2.85(0.5H，m)，2.90-3.05(0.5H，m)，3.05-3.38(2H，m，与CD3OD重叠)，3.41(2H，m)，3.58(6H，m)，3.90-4.11(1H，m)，4.85-4.90(1H，与CD3OD重叠)，7.02(2H，m)，7.26(2H，m)，7.66(1H，d，J＝8.7Hz) HPLC/MSMH+＝567.1。
实例3 制备N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(噻吩-2-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸 步骤1
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.09-1.17(3H，m)，1.23-1.26(3H，m)，1.47(12H，m)，1.87-1.99(4H，m)，2.80(0.4H，br s)，3.10(1.6H，m)，3.20(1H，m)，3.44(2H，t，J＝6.0Hz)，3.54(2H，t，J＝6.0Hz)，3.88-4.15(3H，m)，4.80-4.85(1H，m)，6.48(0.6H，br s)，6.75(0.4H，s)，6.69-7.08(5H，m)，7.41(1H，s)，7.50(1H，s)，7.78(0.4H，br s)，7.85(0.6H，brs) HPLC/MSMH+＝637.2。
步骤2
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.9.0(3H，t，J＝6.9Hz)，1.10-1.30(6H，m)，1.85-1.94(4H，m)，2.85-3.24(2.4H，m)，3.35(8.6H，m)，4.00-4.15(1H，m)，4.55(0.4H，br s)，4.73(0.6H，br s)，5.85(0.6H，d，J＝5.7Hz)，5.87(0.4H，br s)，6.60-7.12(5.4H，m)，7.39(1H，m)，7.60-7.68(1.6H，m) HPLC/MSMH+＝581.2。
实例4 制备N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(噻吩-3-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸 步骤1
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.07-1.27(9H，m)，1.40(9H，s)，1.90(4H，m)，3.05-3.24(3H，m)，3.43-3.64(8H，m)，4.73-4.95(1H，m)，5.22(1H，m)，6.95-7.14(7H，m)，7.41(0.4H，s)，7.50(0.6H，s) HPLC/MSMH+＝637.2。
步骤2
1H NMR(300MHz，CDCl3)，δ0.70-1.4(9H，m)，1.81-2.08(4H，m)，2.62-4.10(12H，m)，4.95(1H，br s)，6.90-8.07(8H，m) HPLC/MSMH+＝581.2。
实例5 制备N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(呋喃-2-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸 步骤1
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.15-1.28(9H，m)，1.37(3.6H，s)，1.42(5.4H，s)，1.93-2.05(4H，m)，2.85-3.15(2H，m)，3.19-3.35(1H，m)，3.45-3.75(8H，m)，3.90-4.15(1H，m)，4.76-4.85(0.4H，m)，4.90-5.00(0.6H，m)，5.15-5.22(1H，m)，6.20-6.40(2H，m)，6.91-7.18(4H，m)，7.39(1H，s)，7.58(0.4H，s)，7.65(0.6H，s) HPLC/MSMH+＝621.3。
步骤2
1H NMR(300MHz，CD3OD)δ0.84-1.25(9H，m)，1.85-1.92(4H，m)，2.70-2.81(0.5H，m)，2.92-3.30(2.5H，m，与CD3OD重叠)，3.30-3.38(2H，m)，3.45-3.59(6H，m)，4.04-4.12(1H，m)，4.80-4.89(1H，与CD3OD重叠)，6.18(1H，m)，6.58(0.5H，br s)，6.78(0.5H，br s)，6.83(1H，d，J＝8.1Hz)，6.92(1H，d，J＝8.1Hz)，7.06(1H，d，J＝8.1Hz)，7.19(1H，d，J＝8.1Hz)，7.38(0.5H，br s)，7.44(0.5H，s)，7.47(0.5H，br s)，7.48(0.5H，s) HPLC/MSMH+＝565.2。
实例6 制备N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(叔丁基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸 步骤1
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.04-1.11(18H，m)，1.40(4.5H，s)，1.42(4.5H，s)，1.96(4H，m)，2.46-2.59(0.5H，m)，2.72-2.85(0.5H，m)，3.00-3.32(2H，m)，3.45-3.62(8H，m)，3.82-4.15(1H，m)，4.82-4.93(1H，m)，5.05(0.5H，d，J＝7.2Hz)，5.15(0.5H，d，J＝7.2Hz)，7.08-7.18(4H，m)，7.67(1H，s) HPLC/MSMH+＝611.3。
步骤2
1H NMR(300MHz，CD3OD)δ0.86-1.20(18H，m)，1.87(4H，m)，2.32-2.45(0.5H，m)，2.56-2.68(0.6H，m)，3.05-3.20(2H，m)，3.29-3.38(2H，m)，3.43-3.52(6H，m)，3.8-3.99(1H，m)，4.75-4.82(1H，与CD3OD重叠)，6.90(2H，d，J＝9.0Hz)，7.15(2H，d，J＝9.0Hz)，7.43(1H，s) HPLC/MSMH+＝555.2。
实例7 制备N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(异丙基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸 步骤1
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.90-1.21(15H，m)，1.38(9H，s)，1.92(4H，m)，2.28-2.50(1H，m)，2.80-3.16(3H，m)，3.41-3.70(8H，m)，3.80-3.95(1H，m)，4.71-4.85(1H，m)，5.05-5.11(1H，m)，7.00-7.08(2H，m)，7.08-7.16(2H，m)，7.65(1H，d，J＝5.0Hz) HPLC/MSMH+＝597.3。
步骤2
1H NMR(300MHz，CD3OD)δ0.80-0.98(9H，m)，1.15-1.19(6H，m)，1.88(4H，m)，2.20-2.42(1H，m)，2.65-2.83(1H，m)，3.08-3.25(2H，m)，3.26-3.59(8H，m)，3.88-3.97(1H，m)，4.70-5.05(1H，与CD3OD重叠)，6.92(2H，d，J＝7.8Hz)，7.17(2H，m)，7.63(1H，d，J＝5.0Hz) HPLC/MSMH+＝541.3。
实例8 制备嘧啶基脲的一般方法。
步骤1
将N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸叔丁酯(0.436g，0.83mmol)溶解于CH2Cl2(0.35mL)和饱和NaHCO3(0.7mL)中。将溶液冷却到0℃且剧烈搅拌10分钟。10分钟后，停止搅拌且使不混溶的层分离。通过注射器向底层中添加碳酰氯(0.52mL，4.97mmol)。在N2下搅拌反应混合物3小时。完成后，将有机层分离且在室温下将其真空浓缩。将其再溶解于EtOAc中且用去离子水洗涤且反萃取两次。将有机层经Na2SO4干燥且在真空中浓缩。将粗油状物不经纯化送到下一步骤。
HPLC/MSMH+＝589.0。
步骤2
将粗氨基甲酰氯(1当量)和胺(5当量)溶解于THF(0.2M)中且在N2下搅拌过夜。将反应混合物在真空中浓缩且再溶解于乙酸乙酯中。将有机层用水洗涤，经Na2SO4干燥且在真空中浓缩。产物通过HPLC纯化。在40℃下将产物用HCOOH作为溶剂来处理过夜。在减压下去除溶剂且获得产物。
实例9-11根据实例8来制备。
实例9 制备N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(哌啶-1-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.01(3H，t，J＝7Hz)，1.22(6H，t，J＝7Hz)，1.36(4H，m)，1.49(2H，m)，1.95(4H，m)，3.10-3.66(16H，m)，4.86-4.92(1H，m)，6.75(1H，d，J＝7.2Hz)，7.25(2H，d，J＝8.4Hz)，7.14(2H，d，J＝8.4Hz)，7.64(1H，s)。
HPLC/MSMH+＝582.3。
实例10 制备N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(N-乙基-N-异丙基氨基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.01(9 H，br s)，1.21(9H，m)，1.90-1.99(4H，m)，2.98(2H，m)，3.15(3H，m)，3.33(1H，m)，3.45(2H，m)，3.52-3.60(6H，m)，3.76(1H，m)，4.91-4.97(1H，br s)，6.64(1H，br s)，7.04(2H，d，J＝8Hz)，7.14(2H，d，J＝8Hz)，7.66(1H，s) HPLC/MSMH+＝584.4。
实例11 制备N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(3-噻吡咯烷-1-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.03(3H，t，J＝6.6Hz)，1.21(6H，t，J＝6.6Hz)，1.90-1.99(4H，m)，2.84(2H，t，J＝6Hz)，3.09-3.63(14H，m)，4.06-4.14(2H，q，J＝7.8Hz)，4.91-4.97(1H，m)，6.64(1H，d，J＝7Hz)，7.04(2H，d，J＝8.4Hz)，7.13(2H，d，J＝8.4Hz)，7.75(1H，s)。
HPLC/MSMH+＝586.2。
实例A α4β1整联蛋白粘附性分析JurkatTM细胞对人类血浆纤维结合蛋白的粘附性 程序 在4℃下将96孔板(Costar 3590 EIA板)用浓度为10μg/mL的人类纤维结合蛋白(Gibco/BRL，登记号33016-023)涂布过夜。随后将所述板用牛血清白蛋白(BSA；0.3％)在盐水中的溶液阻断。根据生产商的说明书用钙黄绿素AM(Calcein AM)对JurkatTM细胞(维持处于对数生长期)进行标记且将其以2x106个细胞/毫升的浓度悬浮于Hepes/盐水/BSA中。随后，在室温下使细胞暴露于试验化合物和对照化合物30分钟，之后将其转移到纤维结合蛋白涂布板的个别孔中。在37℃下使粘附进行35分钟。随后使用新鲜盐水通过轻轻抽吸和移液来洗涤所述孔。使用荧光板读数器在EX 485/EM 530下定量与剩余粘附细胞相关的荧光。
细胞培养物通过首先在第一天以1∶10且在第二天以1∶2分裂静止期的JurkatTM细胞来制备以在第三天执行分析。将在第一天以1∶10分裂的细胞在第三天以1∶4分裂以供第四天分析用。
分析板通过以下方式制备首先配制10μg/mL的Gibco/BRL人类纤维结合蛋白(登记号33016-023)于PBS++中的工作溶液。
随后在室温下以50微升/孔将Costar 3590 EIA板涂布2小时(然而也可使其处于4℃下过夜)。最后，在室温下用Hepes/盐水缓冲液以100微升/孔对所述板进行抽吸和阻断1小时，随后用150μL PBS++洗涤三次。
化合物稀释可通过如下制备化合物1∶3连续稀释液来实现。对于各板(4种化合物/板)来说，将600μL添加到在滴定架上的4个Bio-rad滴定管中。使用此项技术熟知的方法将足量化合物添加到各个适当试管中以得到2X浓度。使用Falcon柔性板(Flexiplate)，将100μL Hepes/盐水缓冲液或人类血清添加到B到G行中。使用设定为180μL的多通道移液管，在所述移液管上具有四个均匀间隔的吸头。将各组四个试管混合5次且将180μL 2X化合物转移到B行第一列各化合物稀释液中，A行保持空白。将180μL添加到A行中的其他孔中。通过转移50μL到下一稀释液且混合5次来沿所述板执行连续稀释，每次混合后更换吸头。在F行处停止稀释。G行不含化合物。
将21/6抗体于Hepes/盐水缓冲液或人类血清中的20μg/ml溶液作为阳性对照且将其搁置于试剂槽中以添加到细胞悬液板中。
细胞染色通过以下方式实现首先通过在50mL试管中离心(1100rpm，5分钟)来收集对数期的JurkatTM细胞。将细胞再悬浮于50mL PBS++中，旋转且再悬浮于20mLPBS++中。在室温下通过添加20μL钙黄绿素AM使细胞染色30分钟。用Hepes/盐水缓冲液使体积变为50mL且对细胞进行计数，旋转并以2x106个细胞/毫升再悬浮于Hepes/盐水缓冲液或人类血清中。
使用下列程序培养化合物。在新的柔性板中，将65μL的染色细胞添加到B到H行中。随后，按照板的布置将65μL 2X化合物添加到适当行中且混合3次。将65μL 2X-21/6抗体添加到H行中且混合3次。最后将所述板在室温下培养30分钟。
在下列处理程序之后使用荧光板读数器在485/EM 530下测量纤维结合蛋白粘附性。培养后，将细胞混合3次且将100μL转移到纤维结合蛋白涂布板上且在37℃下培养约35分钟。通过沿所述孔的侧边轻轻移液100μL室温的PBS++且将板转向90度抽吸来逐行洗涤各板。重复所述程序，总共洗涤3次。洗涤后通过沿所述孔的侧边移液用100μL填充各孔。
在存在人类血清和不存在人类血清的情况下，对各化合物计算IC50值。IC50为生长或活性受到50％抑制时的浓度。当根据纤维结合蛋白分析进行试验时，发现本文所揭示的化合物均具有小于10μM的IC50。
实例B 细胞对人类血浆纤维结合蛋白的粘附性。用于测定候选化合物对α4β1的结合的活体外饱和分析 以下描述活体外分析以确定化合物要在下一实例所述的实验性自体免疫脑脊髓炎(“EAE”)模型或其他活体内模型中具有活性所需的血浆含量。
将对数生长的JurkatTM细胞洗涤且再悬浮于含有20μg/mL 15/7抗体的标准动物血浆中(Yednock等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，(1995)270(48)28740)。
将JurkatTM细胞在含有66μM到0.01μM范围内的各种浓度的已知候选化合物量的标准血浆样品中稀释两倍(使用标准12点连续稀释以得到标准曲线)或在从候选化合物处理的动物周围血液中获得的血浆样品中稀释两倍。
随后，在室温下将细胞培养30分钟，用含有2％胎牛血清和1mM氯化钙和1mM氯化镁的磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)(分析培养基)洗涤两次以去除未结合的15/7抗体。
随后，使细胞以1∶200暴露于藻红蛋白-结合的山羊F(ab′)2抗小鼠IgG Fc(Immunotech，Westbrook，ME)(其已通过与5％来自所研究动物物种的血清共同培养而吸附用于提供任何非特异性交叉反应性)，且在4℃下在黑暗中培养30分钟。
将细胞用分析培养基洗涤两次且再悬浮于所述分析培养基中。随后，用如Yednock等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，1995，27028740中所述的标准荧光激活细胞分选仪(“FACS”)分析对其进行分析。
随后将数据绘制成荧光-剂量曲线，例如以标准剂量-反应形式。产生曲线上部平稳段的剂量代表在活体内模型中获得功效所需的量。
所述分析也可用于确定使其他整联蛋白(诸如α9β1整联蛋白，其为与α4β1关系最密切的整联蛋白)的结合位点饱和所需的血浆量(Palmer等人，1993，生物化学杂志(J.CellBio.)，1231289)。所述结合预示对于由α9β1整联蛋白介导的发炎性病状具有活体内效用，所述病状包括(例如)伴随慢性哮喘发生的气道高反应性和阻塞、动脉粥样硬化中的平滑肌细胞增殖、血管成形术后的血管阻塞、肾病导致的纤维化和肾小球瘢痕化、主动脉瓣狭窄、类风湿性关节炎中的滑膜肥大和伴随溃疡性结肠炎及克罗恩氏病进行发生的炎症和瘢痕化。
因此，上述分析可用通过编码α9整联蛋白的cDNA转染的人类结肠癌细胞系SW 480(ATTC #CCL228)(Yokosaki等人，1994，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，26926691)代替Jurkat细胞来执行以测量α9β1整联蛋白的结合性。作为对照，可使用表达其他α及β1亚单位的SW 480细胞。
因此，本发明的另一方面涉及治疗哺乳动物患者疾病的方法，所述疾病由α9β1介导，且所述方法包含向所述患者投与治疗有效量的本发明化合物。所述化合物优选以本文上述的医药组合物形式投与。有效日剂量将视患者的年龄、体重、病况而定，这些因素可由主治临床医师容易地确定。然而，在一个优选的实施例中，所述化合物是以每日约20μg/kg到500μg/kg投与。
实例C 用于测定生物可用性的盒式给药和血清分析 通过用盒子(即，每一给药溶液中有6种化合物的混合物)给大鼠服药来筛选口服生物可用性。所述盒子包括5种试验品和1种标准化合物，总剂量为10mg/kg。用等摩尔的1 N NaOH将各化合物/试验品转化为钠盐且以2mg/mL溶解于水中。通过等体积混合此6种溶液制备盒子。将所述盒式给药溶液充分混合且随后将pH值调整为7.5-9。所述给药溶液在研究的前一天制备且在室温下搅拌过夜。
所述筛选中使用得自查士睿华实验室(Charles River Laboratories)的6-8周龄的雄性斯普拉格道利(Sprague Dawley，SD)大鼠。将大鼠隔离至少一天且允许持续进食和饮水。在投与所述盒子之前的晚上，使大鼠禁食约16h。
各盒子中指定四只SD大鼠。将单一剂量的给药溶液经口投与每只大鼠。记录给药量(5mL/kg)和时间且在给药2小时后使大鼠进食。
在下列时间点经由心脏穿刺采集血液样品4h、8h和12h。将大鼠用CO2气体在10-20秒内麻醉以后，立即采集血液。在采集到12小时样品后，通过CO2窒息法接着颈椎脱位术将大鼠无痛致死。
在处理血液样品之前，将其在低于环境温度(4℃)下保持于肝素化的微量采集管中。将血液样品离心(10000rpm，5分钟)且移出血浆样品且储存在-20℃冰箱中直到进行药物含量分析。使用下列直接沉淀血浆的方案来分析血浆中的药物含量。
通过以下方式在1.5mL 96孔板中制备活体内血浆样品按顺序添加100μL试验血浆、150μL甲醇，随后涡旋10-20秒。添加150μL 0.05ng/μL溶于乙腈中的内标且涡旋30秒。
通过以下方式在1.5mL 96孔板中制备标准曲线样品按顺序添加100μL对照小鼠血浆、接着150μL甲醇且涡旋10-20秒。添加150μL 0.05ng/μL溶于乙腈中的内标且涡旋30秒。将0-200ng(10种浓度)溶于50％甲醇中的所关注化合物掺入样品中以获得0.5ng/mL到2,000ng/mL的标准曲线范围。再次，将样品涡旋30秒。
随后，将样品在艾本德微量离心机(Eppendorf microfuge)中以3000rpm旋转20-30分钟，之后将80-90％上清液转移到干净的96孔板中。随后将有机溶剂蒸发直到样品干燥(在N2下在40℃下，30-60min.(泽玛浓缩仪(ZymarkTurbovap)))。
随后将残余物溶解于200-600L流动相(50％CH3OH/0.1％TFA)中。随后使用PE-Sciex API-3000三重四极质谱仪(SN0749707)，珀金埃尔默(Perkin-Elmer)，200系列自动采样器和岛津(Shimadzu)10A泵进行LC/MS/MS。用PE-Sciex分析软件(v1.1)进行采集且使用PE-Sciex分析软件(v1.1)完成数据分析和定量。使用25％CH3OH、0.1％TFA-100％CH3OH、0.1％TFA的流动相将5-50μl样品体积注射到反相ThermoHypersil DASH-18管柱(吉斯通(Keystone)2.0x20mm，5μm，PN8823025-701)上。以约300μL/min.的流速运行约8分钟。
使用线性梯形法则计算t＝0到最后取样时间tx的曲线下面积(AUC)(参见基础药物动力学手册(Handbook of Basic Pharmacokinetics)，Wolfgang A.Ritschel和Gregory L.Kearns，第5版，1999)。
AUC0→tx＝x((Cn+Cn+1)/2))x(tn+1-tn)[(μg/mL)h] 在盒式给药范例情况下，在血管外给药后4、8和12小时采样，计算t＝0到t＝12h的AUC。
实例D 哮喘模型 由α4β1整联蛋白介导的发炎性病状包括(例如)伴随慢性哮喘发生的嗜曙红细胞流入、气道高反应性和阻塞。以下描述用于研究本发明化合物供治疗哮喘用的活体内效应的哮喘动物模型。
大鼠哮喘模型 按照Chapman等人，美国呼吸与急救医学杂志(Am J.Resp.Crit.Care Med)，153-4，A219(1996)和Chapman等人，美国呼吸与急救医学杂志(Am.J.Resp.Crit.Care Med.)，1554，A881(1997)(两者均以引用的方式全部并入本文中)中描述的程序。
将卵清蛋白(OA；10μg/mL)与氢氧化铝(10mg/mL)混合且在第0天将其注射(腹膜内)到棕色挪威大鼠(Brown Norway rat)体内。在第7天和第14天，重复注射OA以及佐剂。在第21天，将已致敏的动物限制于塑料试管中且使其在仅鼻子暴露的系统中暴露于OA气雾剂(10mg/kg)中(60分钟)。72小时后用戊巴比妥(pentobarbital)(250mg/kg，腹膜内)将动物处死。经由气管插管使用3等份(4mL)汉克斯溶液(Hank′ssolution)(HBSSx10，100ml；EDTA 100mM，100mL；HEPES 1M，25mL；用水补足到1L)灌洗肺；汇集回收得到的细胞且通过添加汉克斯溶液将回收得到的流体总体积调整到12mL。对全部细胞进行计数(希森美康微细胞计数器(Sysmex microcellcounter)F-500，TOA医学电子有限公司(TOA Medical Electronics Otd.)，日本)，且通过稀释回收所得流体(到约106个细胞/毫升)且将1等份(100μl)移液到离心机(细胞甩片机(Cytospin)，珊顿(Shandon)，英国)中来制作涂片。使涂片风干，使用溶于甲醇(2mg/mL)中的固绿(fast green)溶液固定5秒且用伊红G(eosin G)染色(5秒)，用噻嗪染色(5秒)(Diff-Quick，布朗有限公司(Browne Ltd.)，英国)，以区分嗜曙红细胞、噬中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞。使用油浸(x100)光学显微镜检查法计数每涂片总共500个细胞。将本发明化合物调配到0.5％羧甲基纤维素和2％吐温80(Tween 80)悬浮液中且经口投与已对过敏原卵清蛋白过敏的大鼠。在所述模型中，认为在经有效致敏的棕色挪威大鼠气道中抑制由过敏原诱发的白细胞累积的化合物具有活性。
小鼠哮喘模型 也在急性肺部炎症的小鼠模型中对化合物进行评估，所述评估是根据Kung等人，美国呼吸与细胞分子生物学杂志(Am J.Respir.Cell Mol.Biol.)，13360-365，(1995)和Schneider等人，(1999)，美国呼吸与细胞分子生物学杂志(Am J.Respir.Cell Mol.Biol.)20448-457，(1999)((两者均以引用的方式全部并入本文中)所述的程序进行。在第1天通过腹膜内注射(i.p.)0.2mL含有20μg卵(4级，西格马(Sigma))和2mg注射明矾(皮尔斯(Pierce))的卵/明矾混合物使6只雌性黑色小鼠(8-12周龄)致敏。在第14天时强化注射投药。在第28天和第29天用雾化的1％卵(溶于0.9％盐水中)激发小鼠20分钟。在第30天，即首次激发后48小时，将小鼠无痛致死且收集支气管肺泡灌洗样品(3mL)。用流式细胞仪/荧光素标记染色法(FACs/FITC staining method)定量嗜曙红细胞。将本发明化合物调配到0.5％羧甲基纤维素和2％吐温80悬浮液中且经口投与已对过敏原卵清蛋白过敏的小鼠。在所述模型中，认为在经有效致敏的C57BL/6小鼠气道中抑制由过敏原诱发的白细胞累积的化合物具有活性。
绵羊哮喘模型 此模型采用Abraham等人，临床检查杂志(J.Clin，Invest)，93776-787(1994)和Abraham等人，美国呼吸与急救医学杂志(Am J.Respir.Crit.Care Med.)，156696-703(1997)(两者均以引用的方式全部并入本文中)中所述的程序。通过向对猪蛔虫抗原(Ascaris suum antigen)过敏的绵羊静脉内投与(盐水溶液)、经口投与(2％吐温80、0.5％羧甲基纤维素)和气雾剂投与来评估本发明化合物。在所述模型中，认为减少早期抗原诱发的支气管反应和/或阻断晚期气道反应，例如具有对抗抗原诱发的晚期反应和气道高反应性(“AHR”)的保护性效应的化合物具有活性。
使用对吸入的猪蛔虫抗原显现早期与晚期支气管反应的过敏性绵羊来研究候选化合物的气道效应。用2％利多卡因(lidocaine)对鼻部通道进行局部麻醉后，将气囊导管经一鼻孔插入下食道中。随后，用柔性光导纤维支气管镜作为引导，经由另一鼻孔用有囊气管内导管培养所述动物。
根据Abraham(1994)估测胸膜压。使用一次性医学雾化器产生气雾剂(参见以下调配物)，所述雾化器提供质量中质空气动力学直径为3.2μm(用安得生级联碰撞计(Andersen cascade impactor)测得)的气雾剂。所述雾化器与由电磁阀和压缩空气(20psi)源组成的剂量计系统连接。雾化器的出口导入塑料T形部件，所述部件的一端与活塞呼吸机的吸气口连接。在呼吸机的吸气循环开始时将电磁阀启动1秒。以500mL的VT和每分钟呼吸20次的速率传递气雾剂。仅用0.5％碳酸氢钠溶液作为对照。
为评价支气管反应性，根据Abraham(1994)产生对卡巴胆碱(carbachol)的累积浓度反应曲线。在处理开始之前和之后和抗原激发24小时后均进行支气管活组织检查。根据Abraham(1994)执行支气管活组织检查。
也可根据Abraham(1994)执行肺泡巨噬细胞的活体外粘附性研究，且可计算粘附细胞百分数。
气雾剂调配物 使用下列程序制备候选化合物以30.0mg/mL的浓度溶于0.5％碳酸氢钠/盐水(w/v)中的溶液 A.制备0.5％碳酸氢钠/盐水储备溶液100.0mL 程序 1.向100mL量瓶中添加0.5g碳酸氢钠。
2.添加约90.0mL盐水且超声波处理直到溶解。
3.用盐水补足到100.0mL且充分混合。
B.制备30.0mg/mL候选化合物10.0mL 程序 1.向10.0mL量瓶中添加0.300g候选化合物。
2.添加约9.7mL 0.5％碳酸氢钠/盐水储备溶液。
3.进行超声波处理直到所述候选化合物完全溶解。
4.用0.5％碳酸氢钠/盐水储备溶液补足到10.0mL且充分混合。
实例E 对C57B6小鼠进行为期10天的毒性研究 进行为期10天的研究以评估本发明化合物对雌性C57B6小鼠的毒性。以5种剂量水平(0(媒剂对照)、10、30、100、300和1000mg/kg(mpk))通过管饲法投与所述化合物，各剂量水平投与5只小鼠。所有水平的剂量体积均为10mL/kg。剂量溶液或悬浮液在溶于0.5％羧甲基纤维素(CMC)的2％吐温80中制备且每2-3天制备新的剂量溶液或悬浮液。活着时的观察包括体重(研究第1、2、3、5、7、8和11天)、每日笼边临床观察(1-2次/天)和周期性(研究第-1、2和9天)机能观察组合。
在结束时，通过心脏穿刺采集血液样品供临床病理学(血液学和临床化学)和药物水平研究用。分析EDTA血液样品的总白细胞数、红细胞数、血红蛋白、血细胞比容、红细胞指数(MCV、MCH、MCHC)、血小板和WBC 5部分差别(嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜曙红细胞和嗜碱细胞)。分析肝素化血浆样品的丙氨酸转氨酶、门冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、总胆红素、白蛋白、蛋白质、钙、葡萄糖、尿素氮、肌酸酐、胆固醇和甘油三酯。
采集血液后，对小鼠尸体进行剖检且称重器官(肝、脾、肾、心脏和胸腺)。采集组织样品脑、唾液腺、胸腺、心脏、肺、肝、肾、肾上腺脾、胃、十二指肠、回肠、结肠和子宫/卵巢且用福尔马林(formalin)固定。处理得自媒剂对照、300和1000mpk群组的动物的组织，置于H & E有色玻璃载玻片上，且对组织病理学病变进行评估。
使用普瑞思曼软件(Prism software)通过杜耐特多重对比检验(Dunnet′s multiplecomparison test)对体重变化、绝对和相对器官重量和临床病理学结果进行分析，找出与媒剂对照相比的统计学显著差异。使用杜耐特(Dunnet′s)、费希尔(Fisher′s)精确检验对这些机能检查组合结果进行差异分析且使用SAS软件通过哥奇兰-曼特尔-亨塞尔(Cochran-Mantel-Haenszel)相关性检验进行剂量趋势效应分析。
使用常规口服调配物，本发明化合物在所述模型中将具有活性。
实例F 大鼠中由佐剂诱发的关节炎 佐剂诱发的关节炎(“AIA”)是可用于研究类风湿性关节炎(RA)的动物模型，其通过在路易斯大鼠(Lewis rat)尾根部注射结核杆菌(M.tuberculosis)诱发。在注射后的第10天和第15天之间，动物会显现严重进行性关节炎。
通常，对化合物改变大鼠由佐剂诱发的水肿所引起的后爪浮肿和骨骼损坏的能力进行试验。为了定量由AIA引起的后爪浮肿的抑制程度，已定义两种炎症期(1)原发性和继发性注射后爪炎症期，和(2)继发性未注射后爪炎症期，其通常在注射爪中诱发炎症后约11天开始显现。后一类型的炎症的降低指示具有免疫抑制活性。参见，Chang，风湿性关节炎(Arth.Rheum.)，20，1135 1141(1977)。
使用RA(诸如AIA)动物模型能够研究涉及所述疾病早期阶段的细胞事件。在佐剂关节炎的早期显现期间，CD44在巨噬细胞和淋巴细胞上的表达上调，而在所述疾病的显现后期，LFA 1表达上调。应理解粘附分子与内皮组织之间在佐剂关节炎最早期的相互作用可在用于治疗RA的方法中引起显著进展。
当根据纤维结合蛋白分析实例A进行试验时，发现下列化合物均具有小于约10μM的IC50 N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(三氟乙酰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(异丙基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(叔丁基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(呋喃-2-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(哌啶-1-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(N-乙基-N-异丙基氨基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(噻吩-3-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(噻吩-2-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(呋喃-3-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(3-噻吡咯烷-1-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(噻吩-2-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}-苯丙氨酸叔丁酯； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-三氟甲基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}-苯丙氨酸叔丁酯； N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-叔丁基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}-苯丙氨酸叔丁酯；和 N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-呋喃-3-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}-苯丙氨酸叔丁酯。
虽然已说明且描述了本发明的优选实施例，但应了解在不脱离本发明的精神和范畴的情况下可对本发明进行各种改变。
权利要求
1.一种式I化合物
其中
R1选自由C1-C4烷基、C1-C4卤烷基、杂芳基和-NR5R6组成的群组，其中R5和R6独立地选自由氢和C1-C4烷基组成的群组，或R5和R6连同其所侧接的氮一起形成杂环；
R2选自由C1-C4烷基、C2-C4烯基和C2-C4炔基组成的群组；且
R3和R4独立地为C1-C3烷基，或R3和R4连同其所侧接的氮原子连接在一起形成杂环；
或其医药学上可接受的盐、酯或前药。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述-OC(O)NR3R4基团在所述苯环的对位。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中R3和R4连同其所侧接的氮原子一起形成杂环。
4.根据权利要求3所述的化合物，其中所述杂环为吡咯烷基环。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中R2为C1-C4烷基。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中R2为乙基。
7.一种式II化合物
其中
R7为C1-C4烷基、C1-C4卤烷基或杂芳基；
R8为C1-C4烷基；
R9和R10独立地为C1-C3烷基，或R9和R10连同其所侧接的氮原子一起形成杂环；或其医药学上可接受的盐、酯或前药。
8.根据权利要求7所述的化合物，其中所述-OC(O)NR9R10基团在所述苯环的对位。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中R9和R10连同其所侧接的氮原子一起形成杂环。
10.根据权利要求9所述的化合物，其中所述杂环为吡咯烷基环。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中R8为C1-C4烷基。
12.根据权利要求11所述的化合物，其中R8为乙基。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中R7为C1-C4烷基。
14.根据权利要求13所述的化合物，其中R7选自由异丙基和叔丁基组成的群组。
15.根据权利要求12所述的化合物，其中R7为C1-C4卤烷基。
16.根据权利要求15所述的化合物，其中R7为三氟甲基。
17.根据权利要求12所述的化合物，其中R7为杂芳基。
18.根据权利要求17所述的化合物，其中R7选自由呋喃-2-基、呋喃-3-基、噻吩-2-基和噻吩-3-基组成的群组。
19.一种式III化合物
其中
R11和R12独立地为C1-C4烷基，或R11和R12连同其所侧接的氮原子一起形成杂环；
R13为C1-C4烷基；且
R14和R15独立地为C1-C3烷基，或R14和R15连同其所侧接的氮原子一起形成杂环；
或其医药学上可接受的盐、酯或前药。
20.根据权利要求19所述的化合物，其中所述-OC(O)NR14R15基团在所述苯环的对位。
21.根据权利要求20所述的化合物，其中R14和R15连同其所侧接的氮原子一起形成杂环。
22.根据权利要求21所述的化合物，其中所述杂环为吡咯烷基环。
23.根据权利要求22所述的化合物，其中R13为C1-C4烷基。
24.根据权利要求23所述的化合物，其中R13为乙基。
25.根据权利要求24所述的化合物，其中R11和R12独立地为C1-C4烷基。
26.根据权利要求25所述的化合物，其中R11为乙基且R12为异丙基。
27.根据权利要求24所述的化合物，其中R11和R12连同其所侧接的氮原子一起形成杂环。
28.根据权利要求27所述的化合物，其中所述杂环选自由哌啶-1-基和3-噻吡咯烷-1-基组成的群组。
29.一种化合物，其选自由以下各化合物组成的群组
N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(三氟乙酰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸；
N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(异丙基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸；
N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(叔丁基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸；
N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(呋喃-2-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸；
N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(哌啶-1-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸；
N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(N-乙基-N-异丙基氨基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸；
N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(噻吩-3-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸；
N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(噻吩-2-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸；
N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(呋喃-3-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸；
N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(3-噻吡咯烷-1-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}苯丙氨酸
N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-(噻吩-2-基羰基)氨基}嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}-苯丙氨酸叔丁酯；
N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-三氟甲基羰基}氨基]嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}-苯丙氨酸叔丁酯；
N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-叔丁基羰基}氨基]嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}-苯丙氨酸叔丁酯；和
N-[2-二乙氨基-5-{N-乙基-N-呋喃-3-基羰基}氨基]嘧啶-4-基]-L-4′-{(吡咯烷-1-基)羰氧基}-苯丙氨酸叔丁酯；
或其医药学上可接受的盐、酯或前药。
30.一种医药组合物，其包含医药学上可接受的载剂和治疗有效量的一种或多种根据权利要求1至29中任一权利要求所述的化合物。
31.一种治疗人类或动物个体的α4整联蛋白介导的疾病的方法，其包含向所述人类或动物个体投与根据权利要求30所述的医药组合物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述α4整联蛋白为VLA-4。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述疾病选自由以下各疾病组成的群组哮喘、阿兹海默氏病(Alzheimer′s disease)、动脉粥样硬化、艾滋病痴呆(AIDS dementia)、糖尿病、急性青少年发作型糖尿病、发炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(Crohn′sdisease)、多发性硬化症、关节炎、类风湿性关节炎、组织移植、肿瘤转移、脑膜炎、脑炎、中风、脑创伤、肾炎、视网膜炎、异位性皮炎、牛皮癣、心肌缺血、急性白细胞介导的肺损伤和成人呼吸窘迫综合征。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述疾病为发炎性疾病。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述发炎性疾病选自由以下各疾病组成的群组
结节性红斑、过敏性结膜炎、视神经炎、葡萄膜炎、过敏性鼻炎、强直性脊椎炎、牛皮癣性关节炎、血管炎、莱特尔氏综合征(Reiter′s syndrome)、全身性红斑狼疮、进行性周身硬化症、多肌炎、皮肌炎、韦格纳式肉芽肿病(Wegner′s granulomatosis)、主动脉炎、结节病、淋巴细胞减少症、颞动脉炎、心包炎、心肌炎、充血性心力衰竭、多发性结节性动脉炎、过敏性综合征、过敏、高嗜酸性粒细胞综合征、谢格-司托司综合征(Churg-Strauss syndrome)、慢性阻塞性肺病、过敏性肺炎、慢性活动型肝炎、间质性膀胱炎、自体免疫内分泌衰竭、原发性胆汁性肝硬化(primarybiliary cirrhosis)、自体免疫再生障碍性贫血、慢性持续性肝炎和甲状腺炎。
36.一种根据权利要求32所述的医药组合物的用途，其是用于制造供治疗α4整联蛋白介导的疾病用的药物。
37.根据权利要求38所述的用途，其中所述α4整联蛋白为VLA-4。
38.根据权利要求38所述的用途，其中所述疾病选自由以下各疾病组成的群组哮喘、阿兹海默氏病、动脉粥样硬化、艾滋病痴呆、糖尿病、急性青少年发作型糖尿病、发炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、多发性硬化症、关节炎、类风湿性关节炎、组织移植、肿瘤转移、脑膜炎、脑炎、中风、脑创伤、肾炎、视网膜炎、异位性皮炎、牛皮癣、心肌缺血、急性白细胞介导的肺损伤和成人呼吸窘迫综合征。
39.根据权利要求38所述的用途，其中所述疾病为发炎性疾病。
40.根据权利要求40所述的用途，其中所述发炎性疾病选自由以下各疾病组成的群组
结节性红斑、过敏性结膜炎、视神经炎、葡萄膜炎、过敏性鼻炎、强直性脊椎炎、牛皮癣性关节炎、血管炎、莱特尔氏综合征、全身性红斑狼疮、进行性周身硬化症、多肌炎、皮肌炎、韦格纳式肉芽肿病、主动脉炎、结节病、淋巴细胞减少症、颞动脉炎、心包炎、心肌炎、充血性心力衰竭、多发性结节性动脉炎、过敏性综合征、过敏、高嗜酸性粒细胞综合征、谢格-司托司综合征、慢性阻塞性肺病、过敏性肺炎、慢性活动型肝炎、间质性膀胱炎、自体免疫内分泌衰竭、原发性胆汁性肝硬化、自体免疫再生障碍性贫血、慢性持续性肝炎和甲状腺炎。
全文摘要
本发明揭示结合VLA-4的化合物。这些化合物中的某些也抑制白细胞粘附，且尤其抑制由VLA-4介导的白细胞粘附。所述化合物可用于治疗人类或动物个体的发炎性疾病，诸如哮喘、阿兹海默氏病(Alzheimer′s disease)、动脉粥样硬化、艾滋病痴呆(AIDSdementia)、糖尿病、发炎性肠病、类风湿性关节炎、组织移植、肿瘤转移和心肌缺血。所述化合物也可经投与以治疗发炎性脑病，诸如多发性硬化症(式I)。
文档编号A61K31/506GK101273034SQ200680035654
公开日2008年9月24日 申请日期2006年9月28日 优先权日2005年9月29日
发明者克里斯托夫·迈克尔·塞姆科, 许英姿, 弗兰克·斯塔潘贝克, 珍妮弗·莉·史密斯, 卡桑德拉·伊内兹·罗西特, 朱里·Y·福田, 安德烈·W·康拉迪 申请人:伊兰制药公司, 惠氏公司