包含丙型肝炎病毒多肽和用于引起免疫应答的Fc片段的嵌合抗原的制作方法

专利名称：：包含丙型肝炎病毒多肽和用于引起免疫应答的Fc片段的嵌合抗原的制作方法
技术领域：
：本发明涉及嵌合抗原(例如，融合蛋白)，用于耙向并活化抗原呈递细胞(抗原提呈细胞，APC)，以引起(引发，elicit)细胞和体液免疫应答。特别地，本发明描述了包含或〗吏用一种或多种嵌合抗原的组合物和方法，所述嵌合抗原包含一种或多种预选的丙型肝炎病毒(HCV)抗原以及免疫球蛋白片段，其中所述嵌合抗原能够结合并活化APC特别是树突细胞，其加工并扭j亍抗原呈递以引发(引起)细"包和体液免疫应答。
背景技术：
：全世界有多于1.7亿的人是慢性HCV携带者[Delwaideetal.(2000)Rev.Med.Liege55:337-340]。目前不存在可用于HCV的预防性或治疗性疫苗。感染途径是通过血液和其他体液，并且70%以上的患者成为慢性病毒携带者。持续感染引起可能导致进展性肝病的慢性活动性肝炎[Alteretal.(1999)N.Engl.J.Med.341:556-562]。目前，用于丙型肝炎感染的p舉一治疗是干护C素-I(IFN-I)和利巴韦林(病毒唑)。然而，该治疗昂贵，具有显著副作用，并且^叉在约50%的患者选#^组中有效。增强宿主免疫应答以消除'隻性HCV感染的治疗性疫苗一等成为治疗该疾病的一个主要进展。免疫系统在HCV感染的结局中起关4建作用。暴露于HCV的大多婆t个体均会发起对病毒的广泛强大且多抗原特异性CD4+(调节性)和CD8+(细胞毒性)T细胞应答。这些个体仅发展成自限性感染(self-limitedinfection)。然而，在某些暴露于HCV的个体中，《敬弱或不可4企测且局部(narrowly)免疫应答引起'("曼性感染。HCV是RNA病毒的黄病毒家族的一个成员。该HCV基因组是约9.5Kb的编码单个多聚蛋白的正义单链RNA分子，该多聚蛋白可由宿主和病毒蛋白酶4崔4匕而切割成单个蛋白(individualprotein),以产生3种结构蛋白(核心、El、E2)、p7蛋白以及6种非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)[卿kkataetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:5547-5551],NS3蛋白是在所述非结构蛋白的蛋白水解加工中涉及的病毒丝氨酸蛋白酶[Bartenschlagereta1.(1993)J.Virol.67:3835-3844]。病毒逃避宿主免疫过#呈(immunemachinery)的才几制尚未;青楚地确立[Shoukryetal.(2004)Ann.Rev.Microbiol.58:391-424]。已经证明几种HCV蛋白与免疫逃避机制有关。这些蛋白包括NS5A,已表明其"i秀导IL-8(其抑制IFN诱导的抗病毒反应)生成[Polyakatal.(2001)J.Virol.75:6095-6106],并氺p命J细月包IFN-y-i秀导的PKR蛋白激酶，乂人而抑制抗病毒免疫应答[Tanetal.(2001)Viro1284:1-12];核心和NS3，已表明其抑制DC分化[Dolganiucetal.(2003)J.Immunol.170:5615-5624];以及冲亥心和El[Sarobeetal.(2002)J.Virol.77:10862-10871;以及Grakouietal.(2003)Science302:659-662],已表明通过调节DC成熟而调节T细月包应答；以及最后的缺乏记忆T细胞的辅助[Shojietal.(1999)Virology254:315-323]。
发明内容本发明涉及用于耙向并活化APC(引发免疫应答的最初步骤之一)的组合物和方法。本发明的组合物包4舌一类新的分子(下文中指定为"嵌合抗原")，该分子包含免疫应答结构域(功能区)(IRD)例如重组蛋白，其连接于靶结合结构域(TBD)例如抗体片段部分。更具体地说，嵌合抗原是使病毒抗原例如丙型肝炎核心、如El和E2的包膜蛋白、或非结构蛋白与免疫球蛋白片段例如鼠免疫球蛋白GFc片段相偶联的分子。在某些具体实施方式中，抗体片段是异源(p耆异寸生，xenotypic)#元体片4殳。物和方法可用于诱导抗任何与HCV有关的病毒抗原的细胞和/或体液宿主免疫应答。本发明包括用于治疗'l"曼性HCV感染的治疗性疫苗以及用于予页防HCV感染的予贞防性疫苗。本发明的一个或多个具体实施方式包4舌一种或多种适合于引起抗HCV的免疫应答的嵌合抗原。在发明的这些具体实施方式中，将选4奪的HCV抗原连接于抗体的片l殳。得到的嵌合抗原能够靶向并活化i者如一对突细力包的APC。本发明还包括用于克隆编码融合蛋白的DNA构建体(construct)以及在异源表达系统中生成融合蛋白的方法。在本发明的优选具体实施方式中，克隆和生产方法引入独特的翻i%后<'务饰，该修饰包括但不限于表达的融合蛋白的糖基化(例如，甘露糖化(mannosylation))。为了提供抗原的有效呈递(提呈)，本发明的发明人研发了一种新型病毒抗原-鼠单克隆抗体Fc片^a融合蛋白。借助于该Fc片^:,这种分子可由APC(例如，树突细胞)通过特异性受体高效识别，加工融合蛋白，并将来自病毒抗原的肽表位与主要组织相容性复合物(MHC)I类一起作为复合体而呈递。该加工和抗原呈递导致细胞毒性T淋巴细胞的反应(应答)上调，由此消除病毒感染的细胞群。此外，由于MHCII类分子的抗原呈递以及辅助T细;9包的活化,可诱导抗病毒抗原的体液反应将有助于预防和/或消除病毒感染。J夂(例如，树突细胞)，通过特异性靶向APC受体使其成为慢性感染性疾病治疗中的独特途径(方法)。这一点可用于开发用于治疗慢性丙型肝炎感染的治疗性疫苗。给予这些嵌合性融合蛋白可引起宿主广泛的免疫应答，包括细胞和体液应答两者。因此，可将它们用作治疗性疫苗以治疗对HCV感染为免疫耐受的受治疗者。更具体地说，本发明的特征在于一种用于引起免疫应答的嵌合抗原，该嵌合抗原包含免疫应答结构域和靶结合结构域(目标结合结构域)，该免疫应答结构域包含丙型肝炎(HCV)抗原，而该靶结合结构域包含抗体片段。该抗体片段可为异源(异种型)抗体片段。该嵌合抗原可引起体液免疫应答、细胞免疫应答，或体液免疫应答和细胞免疫应答两者。此外，该嵌合抗原可以引起Thl免疫应答、Th2免疫应答，或可引起Thl免疫应答和Th2免疫应答两者。该免疫应答可以为体内(invivo)或体夕卜(离体，exvivo)免疫应答。该免疫应答结构i或可以包含一个以上蛋白；例如，该免疫应答结构i或可以包含一种或多种蛋白的一个或多个免疫原部分，所述一种或多种蛋白包括，例如HCV核心(1-191)蛋白、HCV核心(1-177)蛋白、HCVp7蛋白、HCVE1蛋白、HCVE2蛋白、HCVEl-E2蛋白、HCVNS3蛋白、HCVNS4B蛋白、或HCVNS5A蛋白。该輩巴结合结构域能与抗原呈递细胞(APC)结合。该抗体片段可以为Fc片段。该嵌合抗原可以进一步包括6xHis标签(tag)、蛋白酶切割位点以及用于连接免疫应答结构域和耙结合结构域的连4妄子(连接体)中的一种或多种。该连接子可以选自亮氨酸拉链、结合于抗生物素蛋白的生物素以及共〗介肽4建。而且，该嵌合抗原可以为糖基化的，例如甘露糖糖基化的。该抗体片段可以包括免疫球蛋白重链片段，而所述免疫球蛋白重链片段可以包含铰链区。此外，该免疫球蛋白重《连片段可以包含一个抗体片段的全部或部分，所述抗体片段逸自由Ch1、4交链区、Ch2結枸域、以及Ch3结构域组成的组。本发明的另一个具体实施方式是一种将抗原递送至抗原呈递细胞的方法，该方法包括将本文中披露的任何嵌合抗原给予抗原呈递细力包。该抗原呈递细力包可以为初t突细月包。本发明还提供了一种活化抗原呈递细胞的方法；该方法可以涉及4吏抗原呈递细胞与本文中披露的任何一种嵌合抗原相接触。该接触可以发生在体外(离体)或体内。例如，该接触可以发生在人体内。所述方法可以包括将包含本发明的任何嵌合抗原的组合物给予受治疗者，而所述抗原呈递细月包存在于受治疗者体内。4妾触可以引起体液免疫应答、细月包免疫应答、或可以引起体液免疫应答和细胞免疫应答两者。该细胞免疫应答可以为Thl应答、Th2应答、以及CTL应答中的一种或多种。受治疗者可以患有或可能患有免疫-可治疗的疾病。免疫-可治疗的疾病可以为急性感染(例如，急性病毒感染)或者其可以为慢性感染(例如，慢性病毒感染)。慢性感染可以是慢性丙型肝炎病毒感染。免疫-可治疗的疾病可以是丙型肝炎病毒感染，而免疫应答结构域可以包含一种或多种蛋白的一个或多个抗原部分，所述一种或多种蛋白选自由HCV核心(1-191)蛋白、HCV核心(1-177)蛋白、HCVE1蛋白、HCVE2蛋白、HCVE1-E2蛋白、HCVp7蛋白、HCVNS3蛋白、HCVNS4B蛋白、以及HCVNS5A蛋白组成的组。利用该方法，受治疗者可接种以抵抗病毒感染，例如预防性接种以抵抗病毒感染或治疗性接种以抵抗现有病毒感染。本发明的另一方面是一种生产嵌合抗原的方法。该方法可以包括(a)提供微生物或细胞，所述微生物或细胞包含编码嵌合抗原的多核苷酸；以及(b)在表达嵌合抗原的条件下，培养所述微生物或细力包。该樣走生物或细力包可以为真核-微生物或细力包。该细力包可以为酵母细月包、才直物细月包或昆虫细月包。此外，嵌合4元原可以净皮翻i奪后修饰以包括糖基化，例如其可以被翻译后修饰以包括甘露糖糖基化。本发明的又一具体实施方式是一种编码嵌合抗原的多核苷酸，该多核苷酸包含编码免疫应答结构域的第一多核苷酸部分以及编码耙结合结构域的第二多核普酸部分，该靶结合结构域包含抗体片段。该抗体片段可以为异源抗体片段。该多核苷酸可以包含，例如选自由在SEQIDNO:39以及41-51中列出的核普酸序列组成的组中的核香酸序列。此外，该多核普酸可以编石马嵌合4元原，其至少90%相同于选自由在SEQIDNO:40以及52-62中列出的氨基酸序列组成的组中的整个氨基酸序列。该多核香酸可以在严才各的条件下选裤r性地杂交于一种多核苷酸，所述一种多核苷酸具有选自由在SEQIDNO:39以及41-51中列出的一亥苷g^序列《且成的^L中的冲亥苷酸序列。本发明还提供了一种包含本文中所披露的任何多核苷酸的载体，例如，其中所述多核香g吏可才喿作性地连4妄于转录调节元件(TRE)的载体。此外，本发明还包括一种含有本文所才皮露的任何多核普酸的孩史生物或细月包。本发明的另一个具体实施方式是一种制品(产品)，该制品可以包含本文中披露的任何嵌合抗原以及用于将所述嵌合抗原给予需要该抗原的受治疗者的i兌明书。本发明的又一个方面是一种药物组合物，该组合物包含本文中披露的任何嵌合抗原以及药用赋形剂。另外，本发明提供了另一种生产嵌合抗原的方法。该方法可以包括(a)提供微生物或细胞，所述微生物或细胞包含编码耙结合结构域-连接子分子(linkermolecule)的多核苦酸，该乾结合结构域-连接子分子包含结合于连接子分子的靶结合结构域；(b)在表达所述把结合结构域-连4妄子分子的条件下，；咅养所述樣t生物或细月包；以及(c)在适合于使连接子与免疫应答结构域结合的条件下，使嵌合抗原。所述微生物或细胞、多核苷酸、靶结合结构域、连接子分子、以及免疫应答结构域可以为本文中所4皮露的任<可一种。除非另有定义，本文中所4吏用的所有技术和科学术语具有与如本发明所属领域中的普通才支术人员通常所理解的相同的含义。在矛盾的情况下，则将受包括该定义的本申请文件支配。下文将描述优选的方法和材料，尽管与本文所描述的那些相似或等同的方法和材料也可用于实施或试验本发明。所有的出版物、专利申请、专利以及其他本文中提到的参考资料的全部内容均结合于此作为参考。本文中所纟皮露的材并牛(物质)、方法、以及实施例^f又是举例i兌明并且不用于限制本发明。根据以下的说明、附图以及权利要求，本发明的其他特征和优点，例如用于治疗或预防免疫-可治疗的疾病的嵌合抗原，将变得显而易见。图1是Chimigen3疫苗二聚化形式的示意图。其包含两个亚单位(亚单元)，每个亚单位均由免疫应答结构域(IRD)和把结合结构域(TBD)构成。图2A和2B分别是质粒pFastBacHTa-TBD中ORF(开方文阅读框架(可译框架))的核苷酸序列(SEQIDNO:9)以及由该ORF编石马的氨基酸序列(SEQIDNO:IO)的一见图。图3A和3B分别是质并立pFastBacHTa-NS5A-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQIDNO:39)以及由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:40)的^L图。图3A和图3B中的下划线和粗体位置处存在^f呆守自发突变(TTC(Phe)至TTT(Phe))。在该一亥苷g臾序列中核香酸l-3:起始密码子核芬酸13-30:6xHis表位标签(附加表位)核苦酸91-1431:HCVNS5A核苷酸1432-1461:连接肽核普酸1462-2157:TBD核苦酸2158-2187:末端肽核苦酸2188-2190:纟冬止密石马子核香S臾1639-1641:TBDTTC-TTTM呆守突变在该氨基IH序列中氨基酸5-10:6xHis表位标签氨基酸31-477:HCVNS5A氨基酸478-487:连接肽氨基酸488-719:TBD氨基酸720-729:末端肽图4A和B分别是质粒pFastBacHTa-gp64-NS5A-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQIDNO:41)以及由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:52)的—见图。图4A和图4B中的下划线和^L体^立置处存在人工突变(GAT(Asp)至TAT(Tyr))以及保守自发突变(TTC(Phe)至TTT(Phe))。在该核苷酸序列中核苷酸l-3:起始密石马子核香酸1-72:gp64信号肽核苷酸97-114:6xHis表位标签核苷酸175-1515:HCVNS5A核香S复1516-1545:连4秦肽核芬酸1546-2241:TBD核普酸2242-2271:末端肽冲亥香酉臾2272-2274:纟冬止密石马子冲亥香S臾61-63:〗言号力太GAT至TAT人工突变斗亥香f复1725:TBDTTC至TTT^f呆守突变在该氨基酸序列中氨基酸1-24:gp64分泌信号氨基酸33-38:6xHis表位标签氨基酸59-505:HCVNS5A氨基酸506-515:连接肽氨基酸516-747:TBD氨基S臾748-757:末端肽图5A和B分别是质粒pPSC12-NS5A-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQIDNO:42)以及由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:53)的3见图。图6A和B分别是质粒pFastBacHTa-gp64誦NS3-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQIDNO:43)以及由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:54)的碎见图。存在由图6A中的下划线密码子和图6B中的氨基酸所示的两个突变。对于图6A乂人上游至下游以及对于图6B从N末端至C末端，突变为(基因)工程CGG(Arg)至GCG(Ala)突变；以及自发CCA(Pro)至GGA(Gly)突变。图7A和B分別是质粒pFastBacHTaNS3mut-TBD中ORF的核香酸序列(SEQIDNO.'44)以及由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:55)的—见图。存在由图7A中的下划线密石马子和图7B中的氨基酸所示的两个突变。对于图7A乂人上游至下游以及对于图7B从N末端至C末端，突变为自发保守AGG(Arg)至CGG(Arg)突变；以及基因工程CGG(Arg)至GCG(Ala)突变。在核苷酸序列中核苷酸l-3:起始密码子核芬酸13-30:6xHis表位标签核苦酸91-1965:HCVNS3mut核芬酸1966-1995:连接肽核芬酸1996-2691:TBD核香酸2692-2721:末端肽才亥苷l吏2722-2724:纟冬止密；马子核普酸1462-1464:NS3mutAGG至CGG自发突变核香酸1474-1476:NS3mutCGG至GCG基因工程突变在该氨基酸序列中氨基酸5-10:6xHis表位标签氨基酸31-655:HCVNS3mut氨基酸656-665:连接肽氨基酸666-897:TBD氨基酸898-907:末端肽氨基酸488:NS3mutR至R自发突变氨基酸492:NS3mutR至A基因工程突变图8A和B分别是质粒pFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD中ORF的核普酸序列(SEQIDNO:45)以及由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:56)的一见图。存在由图8A中的突出显示的密石马子和图8B中的氨基酸表示的三个突变。对于图8A乂人上游至下游以及》于于图8B从N末端至C末端，突变为'.人工突变(GAT(ASP)至TAT(Tyr));自发保守AGG(Arg)至CGG(Arg)突变；以及基因工程CGG(Arg)至GCG(Ala)突变。在该核苷酸序列中核苷酸l-3:起始密码子核苦酸l-72:gp64信号肽核苦酸97-114:6xHis表位标签核芬酸175-2049:HCVNS3mut核苷酸2050-2079:连接肽核芬酸2080-2775:TBD核苦酸2776-2805:末端肽斗亥苦商臾2806-2808:纟冬止密石马子核香酸61-63:信号肽GAT至TAT人工突变核香酸1546-1548:NS3mutAGG至CGG4呆守突变核苦酸1558-1560:NS3mutCGG-GCG基因工程突变在该氨基酸序列中氨基酸1-24:gp64分泌信号氨基酸33-38:6xHis表位标签氨基酸59-683:HCVNS3mut氨基酸684-693:连接肽氨基酸694-925:TBD氨基酸926-935:末端肽氨基酸21:信号肽D至Y人工突变氨基酸520:NS3mutR至A基因工程突变图9A和B分另'j是质粒pFastBacHTa画gp64NS3-NS4B-NS5A-TBD中ORF的4亥香@臾序列(SEQIDNO:46)以及由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:57)的一见图。存在由图9A中的下划线且4且体密石马子和图9B中的氨基酸表示的四个突变。只十于图9A/人上;桴至下;誇以及对于图9B^人N末端至C末端，突变为人工突变(GAT(Asp)至TAT(Tyr));基因工程TCG(Ser)至GCG(Ala)突变；基因工程CGG(Arg)至GCG(Ala)突变；以及自发CCA(Pro)至GGA(Gly)突变。图10A和B分别是质粒pFastBacHTa-gp64-NS3-NS5A-TBD中ORF的核香酸序列(SEQIDNO:47)以及由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:58)的一见图。存在由图IOA中的下划线密码子和图10B中的氨基酸表示的四个突变。对于图10A从上游至下游以及只于于图10B乂人N末端至C末端，突变为人工突变(GAT(Asp)至TAT(Tyr));基因工程TCG(Ser)至GCG(Ala)突变；基因工程CGG(Arg)至GCG(Ala)突变；以及自发CCA(Pro)至GGA(Gly)突变。在该才亥苷酸序列中核苷酸1-3:起始密石马子核芬酸l-72:gp64信号肽核普酸97-114:6xHis表位标签核香酸175-2049:HCVNS3mut核普酸2050-2058:连接肽核普酸2059-3402:HCVNS5A核香酸3403-3426:连4妄肽核香酸3427-4122:TBD4亥香酸4123-4152:末端肽片亥香S吏4153-4155:纟冬止密石马子核普酸61-63:信号肽GAT至TAT人工突变核苦酸589:NS3mutTCG至GCG基因工程突变核香酸1558-1559:NS3mutCGG至GCG基因工程突变核苷酸2050-2052:NS3mutCCA至GGA自发突变在该氨基酸序列中氨基酸l-24:gp64分泌信号氨基酸33-38:6xHis表位标签氨基酸59-683:HCVNS3氨基酸684-686:连4妄肽氨基酸687-1134:HCVNS5A氨基酸1135-1374:TBD氨基酸1375-1384:末端肽氨基酸21:信号肽D至Y人工突变氨基酸197:NS3mutS至A基因工程突变氨基酸520:NS3mutR至A基因工程突变氨基酉臾684:NS3mutP至G自发突变图11A和B分别是质粒pFastBacHTaHCV核心(1-177)-TBD中ORF的核香酸序列(SEQIDNO:48)以及由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:59)的一见图。图12A和B分别是质4立pFastBacHTa-E1-TBD中ORF的核香酸序列(SEQIDNO:49)以及由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:60)的^L图。图13A和B分别是质粒pFastBacHTa-E2-TBD中ORF的核普酸序歹'j(SEQIDNO:50)以及由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:61)的#见图。图14A和B分别是质粒pFastBacHTa-El-E2-TBD中ORF的核普酸序列(SEQIDNO:51)以及由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:62)的碎见图。图15是一系列示出了以三种不同的浓度使NS5AChimigen3蛋白与未成熟DC结合的荧光流式细胞仪(FFC)谱图(外形，profile)。图16是一对条形图，示出了通过特异于CD32和CD206的抗体4中制NS5AChimigen3蛋白与未成熟DC的结合。图17是一系列条形图，示出了通过如在实施例中所描述而生成的成熟DC指定的细胞表面标记物的表达。通过FFC获得数据，并以"阳性细胞％"(上图)和"平均荧光强度"("MFI")(下图)示出。图18A-C是三组条形图，示出了第4天时表达CD69的T细胞(图18A)、表达CD69的CD8+T细胞(图18B)、以及表达CD69的CD4+T细胞(图18C)在不同浓度的T细胞和NS5AChimigen3蛋白或破伤风类毒素负载(致敏，loaded)的DC的培养物中的比率。通过FFC获得数据。5AC1和5AC2:NS5AChimigen3蛋白的两种不同制备物(制剂)。图19A-C是三组条形图，示出了第4天时CFSEloT细胞(图19A)、CFSEloCD8+T细胞(图19B)、以及CFSEloCD4+T细月包(图19C)在不同浓度的T细胞和NS5AChimigen3蛋白或破伤风类毒素负载的DC的培养物中的比率。通过FFC获得l史据。5AC1和5AC2:NS5AChimigen3蛋白的两种不同制备物。图20A-C是三组条形图，示出了第7天时表达CD69的T细胞(图20A)、表达CD69的CD8+T细月包(图20B)、以及表达CD69的CD4+T细胞(图20C)在不同浓度的T纟田月包和NS5AChimigen3蛋白或破伤风类毒素负载的DC或植物凝集素(PHA;在图20A中)的培养物中的比率。通过FFC获得数据。5AC1和5AC2:NS5AChimigen3蛋白的两种不同制备物。图21A-C是三组条形图，示出了第7天时CFSEloT细胞(图21A)、CFSEloCD8+T细胞(图21B)、以及CFSEloCD4+T细胞(图21C)在不同浓度的T细胞和NS5AChimigen3蛋白或石皮伤风类毒素负载的DC或PHA(在图21A中)的培养物中的比率。通过FFC获得数据。5AC1和5AC2:NS5AChimigen3蛋白的两种不同制备物。图22是一系列条形图，示出了第7天时在不同浓度的T细胞和NS5AChimigen3蛋白或破伤风类毒素负载的DC或PHA的培养物中胚细胞的T细胞比例。通过FFC获得凄史据。5AC1和5AC2:NS5AChimigen3蛋白的两种不同制备物。图23是一系列条形图，示出了通过指示细月包表面标记物的成熟的、抗原负载的DC的表达。通过FFC荻得数据。图24是一对条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中所述而制备)刺激三次后胚细胞的T细胞的比率，通过FFC获得数据。5AC:NS5AChimigen3蛋白。图25是一系列条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中所述而制备)剌激三次后含细胞内干扰素K(IFN-K)的T细胞的比率。通过FFC获得数据。5AC:NS5AChimigen3蛋白；PMA:佛波醇肉豆蔻酸；杜尔贝科磷酸盐緩冲盐水(DPBS)。图26是一对条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中所述而制备)刺激三次后含细胞内IFN-K的CD8+T细胞的比率。通过FFC获得数据。5AC:NS5AChimigen3蛋白。图27是一对条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中所述而制备)刺:敫三次后含细月包内IFN-K的CD4+T细月包的比率。通过FFC获得数据。5AC:NS5AChimigen3蛋白。图28是一对条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中所述而制备)刺激三次后含细胞内肿瘤坏死因子I(TNF-I)的T细月包的比率。通过FFC获4寻凄t才居。5AC:NS5AChimigen3蛋白；PMA:佛波醇肉豆蔻酸；杜尔贝科磷酸盐；DPBS。图29是一对条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中所述而制备)刺激三次后含细胞内TNF-I的CD8+T细胞(左图)和CD4+T细胞(右图)的比率。通过FFC获得数据。5AC:NS5AChimigen3蛋白。图30是一对条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中所述而制备)刺激三次后表达颗粒蛋白GrB(左图)和Pfn(右图)的CD8+T细胞的比率。通过FFC获得数据。5AC:NS5AChimigen3蛋白。图31是一对条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中所述而制备)刺激三次后淋巴细月包的总l丈(Rl门细月包(gatedcell))以及母细胞的比率。在最后刺激6天后对细胞进行分析。通过FFC获得数据。5AC:NS5AChimigen3蛋白。图32是一对条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中所述而制备)刺;:敫三次后表达CD69的CD8+T细月包(左图)以及表达CD69的CD4+T细胞(右图)的相对比率。在最后刺激6天后对细胞进行分析。通过FFC获得数据。5AC:NS5AChimigen3蛋白。图33是一对条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中所述而制备)刺激三次后，具有抗原特异性T细胞受体(TCR)(其结合EBV肽/HLA-A2四聚体(阳性对照)或对照四聚体(阴性四聚体))的CD8+T细胞(左图)以及CD4+T细胞(右图)的相对比率。在最后刺激6天后对来自三个不同培养孔(对应于测试組和对照组的三个条(bar))的细胞进行分析。通过FFC获得凄史据。图34是一对条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中所述而制备)刺激三次(利用不同数量的T细胞和DC)后，具有结合NS5A肽/HLA-A2五聚体的TCR的CD8+T纟田胞的相对比率。在最后刺激6天后对来自三个不同i备养孔(对应于测试组和对照组的三个条)的细胞进行分析。通过FFC获得数据。5AC:NS5AChimigen3蛋白。图35是一系列FFC谱图，示出了在两个不同浓度下NS3Chimigen3蛋白与未成熟DC的结合。图36是一对条形图，示出了通过对CD32和CD206特异性的抗体抑制NS3Chimigen3蛋白与未成熟DC的结合。图37是一系列条形图，示出了第4天(上图)和第7天在含NS3Chimigen3蛋白或破伤风类毒素负载的DC的培养物中，表达CD69的CD8+T细胞(左图)以及表达CD69的CD4+T细胞(右图)的相对比率。通过FFC获得数据。3C:NS3Chimigen3蛋白。图38是一系列条形图，示出了第4天(上图)和第7天在含NS3Chimigen3蛋白或石皮伤风类毒素负载的DC的i咅养物中，CFSEloCD8+T细胞(左图)以及CFSEloCD4+T细胞(右图)的比率。通过FFC获得数据。3C:NS3Chimigen3蛋白。图39是一对条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中用于NS5AChimigen3蛋白所述而制备)刺激三次后胚细胞T细胞的比率(比例)。利用两种不同T细胞和两个不同DC浓度进行刺激。通过FFC获得数据。3C:NS3Chimigen3蛋白。图40是一系列条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中所述而制备)刺激三次后，含细胞内IFN-K的T纟田胞的比率。通过FFC获4寻凄a居。3C:NS3Chimigen3蛋白。图41是一对条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中所述而制备)刺激三次后，含细胞内IFN-K的CD8+T细胞(左图)和CD4+T细胞(右图)的比率。通过FFC获得数据。3C:NS3Chimigen3蛋白。图42是一对条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中所述而制备)刺激三次后，含细胞内TNF-I的CD8+T细胞(左图)和CD4+T细胞(右图)的比率。通过FFC获得数据。3C:NS3Chimigen3蛋白。图43是一对条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中所述而制备)刺激三次后表达颗粒蛋白GrB(左图)和Pfn(右图)的CD8+T细胞的比率。通过FFC获得数据。3C:NS3Chimigen3蛋白。图44是一对条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中所述而制备)刺激三次后表达CD69的CD8+T细胞(左图)以及表达CD69的CD4+T细胞(右图)的相对比率。在最后刺激6天后对细胞进行分析。通过FFC获得数据。3C:NS3Chimigen3蛋白。图45是一对条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中所述而制备)刺激三次后'淋巴细胞的总凄t(Rl门细胞)(左图)以及母细胞的比率(右图)。在最后刺激6天后对细胞进行分析。通过FFC获得数据。3C，AS60-1:NS3Chimigen3蛋白。图46是一对条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中所述而制备)刺激三次(利用不同lt量的T细胞和DC)后，具有结合NS3肽/HLA-A2五聚体的TCR的CD8+T细胞的相对比率。在最后刺激5天后对来自三个不同培养孔(对应于测试组和对照组的三个条)的细胞进行分析。通过FFC获得数据。3C:NS3Chimigen3蛋白。图47是一系列荧光流式细胞仪(FFC)谱图，示出了在三种不同的浓度下HCV核心Chimigen3蛋白与未成熟DC的结合。图48是一对条形图，示出了通过对CD32和CD206特异性的抗体、甘露糖化的牛血清白蛋白(mBSA)和鼠IgG片4殳来抑制HCVChimigen3核心蛋白与未成熟DC的结合。图49是一对条形图，示出了用成熟的、抗原负载的DC(其如实施例中所述而制备)刺激三次后，含细胞内IFN-K的CD8+T细胞(左图)和CD4+T细胞(右图)的比率。通过FFC获得数据。HCV核心-TBD:HCV核心Chimigen3蛋白。图50是一对二维FFC点图，示出了用负载有HCV核心Chimigen3蛋白(HCV核心-TBD)(右侧点图)或仅用TBD(TBD)(左侧点图)的DC刺激三次后，具有结合HCV核心肽/HLA-B7四聚体的TCR的CD8+T细力包的比率。具体实施例方式A,概述本文4皮露了用于引起针对抗原的免疫应答的组合物和方法。在特定的具体实施方式中，该组合物和方法引起针对抗原的免疫应答，该抗原以其它方式^皮宿主识别为"自体"抗原。通过将包括免疫应答结构域和把结合结构i或的嵌合抗原呈递纟合宿主免疫系统来增强免疫应答，其中所述靶结合结构域包括抗体片段。通过该靶结合结构域，APC内化、加工并呈递引起体液和细胞免疫应答两者的嵌合抗原。HCV是黄病毒家族的成员，其可以感染人类，引起急性和慢性肝炎，并且可能导致肝细胞癌[Hoofnagle(2002)Hepatology36:S21-S29]。HCV基因组是9.6Kb无帽正才及性(positivepolarity)单链RNA分子，并通过负《连中间体而实现复制[LindenbachandRice(2005)Nature436:933-938]。HCV基因组编码单个开放阅读框架，该开it阅读框架编码多聚蛋白，加工该多聚蛋白以生成核心或衣壳蛋白(C)、两种包膜糖蛋白(El和E2)、一种小的疏水蛋白(p7)、以及6种非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。将该多聚蛋白加工成单个蛋白是通过宿主和病毒蛋白酶来催化的[Lohmannetal.(1996)J.H印atol.24:11-19，Penineta1.(2004)J.Hepatol.24:11-19]。当健康宿主(人或动物)遭遇异种蛋白(foreignantigen)(例如来自细菌、病毒和/或寄生虫的蛋白)时，宿主通常引发免疫应答。适应性的免疫应答可以为体液、细胞或两者[Whittonetal.(2004)Adv.VirusRes.63:181-238]。细胞应答的特征在于选4奪并扩增能直接消除包含该抗原的细胞的特异性T辅助细胞和T淋巴细胞(CTL)。在体液反应的情况下，响应于纟元原刺激，抗体由B细"包生成并一皮分泌入血液,口/或、淋巴中。4元体中和(neutralize)#元原(侈'B口，病毒)，通过特异性地结合于抗原表面上的表位，对其进4于标记以用于吞噬细胞破坏和/或通过补体介导机制以裂解受感染细胞[Carro(2005)NatureImmunol.5:981-986]。專甫助细月包(多数为CD4T细月包)4是供CTL(多数为CD8T细胞)和B细胞介导的抗体反应(应答)所必需的^t助活性。在患有慢性病毒感染的个体中，免疫系统不对新来的病原体发生反应以产生适应性免疫应答乂人而清除感染，因Jt匕宿主变得^t该病原体耐受。虽然HCV用来逃避免疫监视的机制尚未完全理解，但已经提出了几种可能性。这些可能的机制包括由NS3-4A、E2和NS5A序列阻断IRF3介导的I型IFN诱导、阻断PKR(双链RNA活化的蛋白激酶)以及通过NK细月包的功能来干4尤HCV蛋白[Rehermannetal.(2005)NatureRev.Immunol.5:215-229]。最近的结果也表明T细胞在HCV感染的控制和消除中具有关4建作用[Bowenetal.(2005)Nature436:946-952;Wielandetal.(2005)J.Virol.79:9369-9380]。在急性HCV感染中，尽管HCV感染后7-8周可才全测到病毒特异性抗体[Pawlotsky(1999)J.Hepatol.31(suppl):71-79],但抗体的作用仍不清楚，因为已证实黑猩猩体内的HCV感染可在无抗HCV抗体的情况下消退[Cooperetal.(1999)Immunity10:439-449],而人体内的HCV感染则可在无血清转化的情况下消退[Postetal.(2004)J.Infect.Dis.189:1846-1855〗。jt匕夕卜，最近有i正据表明个体不能产生抗引起'f曼性感染的HCV的可4企测水平CD4+和CD8+T细J包应答，[上文，Cooperetal.(1999);Thimmeetal.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:15661-15668;Thimmeetal.(2002)J.Exp.Med.194:1395-1406;Shoukryetal.(2003)J.Exp.Med.197:1645-1655]。尽管已表明如在I型IFN反应中与在抗病毒复制过程中产生的双链RNA的免疫反应中的转录变化的免疫功能存在相互作用，但在病毒感染的清除中尚未观察到该效应的直接证据[上文，Rehermannetal.(2005)]。已经观察到在消退HCV感染的患者中，免疫系统产生强烈的多表位特异性CD4+和CD8+T细胞应答[上文，Rehermannetal.(2005)],然而在患有'ft性HCV感染的患者中，T细月包应答4交晚、短暂或局卩艮[上文，Thimmeetal.(2001);Diepolderetal.(1995)Lancet36:1006-1007;Lechneretal.(2000)J.Exp.Med.191:1499-1522]。导致慢性感染的强健的抗HCV抗原的T细胞应答的缺乏还可能是由于缺乏将合适的病毒抗原呈递至宿主免疫系统的适当呈递。消除病毒方面的成功可能由通过APC加工和呈递抗原的方式以及涉及调节性T辅助细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)而产生。抗原呈递过程中的主要参与者是捕获并加工抗原的树突细胞>(DC)。此外，DC表达淋巴细胞协同刺激分子并将其迁移至淋巴器官，其中它们分泌细胞因子以引发免疫应答。DC还控制B和T淋巴细胞增殖，而B和T淋巴细胞是免疫介导者[Steinmanetal.(l999)Hum.Immunol.60:562-567]。CTL反应的产生在消除病毒感染的细月包并且由此在感染的消退方面是关4建的。取决于抗原定位通过APC对接触到的抗原进行不同的加工[上文，Steinmanetal.(l999)]。夕卜源性抗原在APC的内涵体内力卩工，并将生成的肽片段呈递于与主要组织相容性复合体(MHC)II类分子复合的细胞表面上。将该复合物呈递至CD4+T细胞可使其活化。结果，由辅助T细胞分泌的细胞因子提供B细胞活化所需的可溶性因子，以产生针对外源性抗原的抗体(体液反应)。相反，细胞内抗原在蛋白酶体内加工，并且得到的肽片段作为与MHCI类分子的复合物而呈递于APC的表面上。在该复合物结合于T细胞受体(TCR)后，可将抗原呈递至CD8+T细胞，这引起CTL免疫应答。CTL可以通过杀死受感染细力包以及生成i者如细胞因子千扰素-y(IFN-y)的因子(其发挥作用以抑制病毒复制)而消除病毒。由于病毒在患有慢性病毒感染的个体中复制活跃，因此在宿主细胞内产生病毒抗原，并且分泌的抗原存在于循环中。尽管存在这些抗原，但仍然缺乏抗病毒的有效免疫应答。有效的免疫应答将涉及生成CTL,其能够以高亲和力识别大量(boardarray)的病毒表位。因此，含病毒抗原的适宜治疗性疫苗必须净皮内化并在适当的细月包腔隙内加工，以使病毒肽可呈递于MHCI类分子的沟内。在I类呈递的背景下，病毒表位的识别可允许CD8+T细胞的活化、生成并分化为功能性CTL,该功能性CTL能够发起抗病毒感染的有效反应(应答)。因此，如果将含病毒抗原的治疗性疫苗通过蛋白酶体(proteasomal)途径加工并通过MHCI类呈递，则其将会是有岁丈的[Larssonetal.(2001)TrendsImmunol.22:141-148]。这可以通过在宿主细i包内生成该抗原或通过递送至适当的细l包腔隙以4吏该抗原以将引起期望细胞应答的方式而被加工并呈递来实现。在文献中已记载了几种用于抗原的细胞内递送的途径，包括病毒载体[Lorenzetal.(2001)Hum.GeneTher.10:1095-1103],使用DNA转染的细月包[Donnellyetal.(1997)Annu.Rev.Immunol.15:617-648]以及通过注射的DNA载体表达该^t原[Laietal.(1998)Crit.Rev.Immunol.18:449-484]。4昔助于其APC功能性，已表明来源于单核细^^的DC具有作为能刺激原发T细胞应答的免疫调节剂的巨大潜能[Banchereauetal.(1998)Nature392:245-252]。DC能捕获、力口工并有效地呈递抗原的这种独特性能使其成为治疗性疫苗研发非常重要的工具[Laupezeetal.(1999)Hummmunol.60:591-597]。使抗原革巴向于DC是一个决定性步骤，并且已采用几种存在于对单克隆抗体(mAb)的Fc区域特异性的DC上的受体用于该目的[Regnaultetal.(1999)J.Exp.Med.189:371-380]。这种途径的实例包4舌卵巢癌mAb-B43.13[Berlynetal-pOOl)ClinImmunol.101:276-283]、抗PSAmAb、以及抗HBV抗体抗原复合物[Wenetal.(1999)Int.Rev.Immunol.18:251-258]。利用负载有肿瘤相关抗原的DC的癌症免疫疗法已表明可产生肿瘤特异性免疫应答禾口4元月中瘤；舌寸生[Camptonetal.(2000)J.Invest.Dermatol.115:57-61;Fongetal.(2000)A醒.Rev.Immunol.18:245-273]。体内使用肿瘤抗原搏动的DC，在临床试验中获得了有前途的结果[Tarteetal.(1999)Leukemia13:653-663]。这些研究清楚地表明利用DC来产生抗癌症抗原的免疫应答的效力。治疗性疫苗必须能够引起抗病毒抗原的宿主免疫应答，且宿主免疫系统能耐受该免疫应答。该过程涉及将抗原递送至DC、适当的抗原呈递以及启动在'f曼性携带者中可引起治疗效应的HCV特异性CD8+T细胞。本发明的嵌合抗原疫苗是一类新型的重组"嵌合抗原，，，其以选定抗原与抗体的特异性区域的融合蛋白的形式生成。分子的双功能设计适合于将病毒抗原扭向于APC特别是DC,以引起抗选定抗原的体液和细胞免疫应答两者。图1中示意性地示出了其二聚化(dimerized)形式的HCVChimigen疫苗。该疫苗具有两个结构域含有重组HCV病毒抗原的免疫应答结构域(IRD)以及含有单克隆抗体的Fc片段的靶结合结构域(TBD)。该疫苗的设计为其功能赋予几种独特性能。该嵌合设计有利于形成抗体样(抗体状)结构并引起适当的抗原呈递，该抗体样结构能促进其通过特异性受体而吸收。该嵌合i殳计可通过蛋白酶体途径力口工，并且肽以与MHCI类的复合体而净皮呈递，引起CTL反应。ChimigenTM疫苗还可以通过内f函体(endosomal)途^圣力口工，由MHCII类呈递，以产生体液反应。TBD介导ChimigenTM疫苗与特异性APC受体例如Fcy受体的结合。虽然本发明不受任何特定的作用机制的限制，但似乎该分子与APC(例如，未成熟DC)上Fcy受体的结合可引起该抗原通过MHCI类通路而加工。在某些具体实施方式中，异源TBD、重组抗原、结合于该抗原氨基和羧基末端的不同长度的连接肽使得整个分子成为"异质(foreign)"并允许宿主免疫系统发起抗包4舌HCV抗原的融合蛋白的多表位免疫应答。融合蛋白Chimigen3蛋白还可以在非哺乳动物细月包(例如，酵母或昆虫细月包)中生成，以7吏它们以非哺乳动物方式糖基化，从而增强其在哺乳动物(例如，人类)宿主体内的免疫原性。昆虫细胞内引入的甘露糖/寡甘露糖糖基化也允许该疫苗通过APC上的甘露糖受体而吸收。因此，ChimigenTM疫苗可以由APC通过特异性Fcy受体I、II和III(CD64、CD32、CD16)、甘露糖受体(CD206)、其他C型凝集素受体并通过吞噬作用而内化[Geijtenbeeketal.(2004)Annu.Rev.Immunol.22:33-54]。通过特异性受体的吸收、通过内涵体和蛋白酶体途径的加工、以及在两类MHC分子上的呈递，可以引起广泛的能够预防病毒感染或清除病毒感染的细胞的免疫应答。CTL反应的发生对于清除病毒感染的细胞是关键的[Whittonetal.(2004)Adv.VirusRes.63:181-238]。用于治疗慢性HBV感染的HepaVaxxB，ViRexx，sfirstChimigen治疗性疫苗，已经在临床前研究中表现出非常有前景的纟吉果[Georgeetal.(2003)Anovelclassoftherapeuticvaccinesforthetreatmentofchronicviralinfections:evaluationinduckschronicallyinfectedwithduckhepatitisBvims(DHBV),in:Hepdart2003，FrontiersinDrugDevelopmentforViralHepatitis:■December14-18，Kauai,Hawaii,USA;Georgeeta.(2003)Anovelclassoftherapeuticvaccinesforthetreatmentofchronicviralinfections.InternationalMeetingoftheMolecularBiologyofHepatitisBViruses.September7-10,CentroCongressiGiovanniXXIII,Bergamo,Italy;Georgeetal.(2004)ImmunologicalEvaluationofaNovelChimericTherapeuticVaccinefortheTreatmentofChronicHepatitisBInfections.(2004)InternationalMeetingoftheMolecularBiologyofHepatitisBViruses.WoodsHole，MA,USA，October24-27，2004;Georgeetal.(2005)BioProcessingJournal4:39-45;Georgeetal.(2006)AnewclassoftherapeuticvaccinesforthetreatmentofchronichepatitisBinfections.In"FramingtheKnowledgeofViralHepatitis"Schi腹i,R.F.Editor,IHLPressUSA]。B.定义本申请，指明)。"抗体"是指由B淋巴细胞产生的免疫球蛋白分子。这些分子的特征在于具有与抗原特异性结合的能力，每一个分子均可根据另一个而确定。"抗体应答"或"体液应答"指一种免疫应答，其中抗体由B-淋巴细l包产生，并响应于^t原刺〗敫而分泌入血'液和/或'淋巴中。在适当作用的免疫应答中，抗体特异性结合于细胞(例如，病原体)表面上的抗原，4吏得该细胞纟皮吞噬细胞、抗体依赖的细胞毒性(ADCC)效应纟田刀包、和/或补体介导才几制而石皮坏。4元体还在全身4盾环，且可以结合于游离病毒体(freevirion)。这种抗体结合可以中和所述病毒体，并防止其感染细月包以及^f吏该病毒体在肾内通过吞喧作用或过滤而/人宿主中清除。"抗原"指任何物质，作为与适当的细胞接触的结果，该物质可i秀导每文感性和/或免疫应答性状态，且可在体内或体外(invitro)以一种可i仑i正性方式与致敏受治疗者的纟元体和/或免疫细力包反应。因it匕，抗原可包纟舌，例如细力包或病毒颗外立和/或其纽—件(组成，component)中的一种。在病毒的情况下，该组件特异性地包括病毒蛋白。"抗原呈递细胞"("APC")是指抗原诱导事件的辅助细胞(佐细胞)，其主要通过内化抗原、加工抗原并在主要组织相容性复合物(MHC)I类或II类分子的背景下将抗原表位呈递纟合淋巴细胞而起作用。APC与抗原的相互作用是免疫诱导中的一个必要步骤，因为其4吏得淋巴细力包4妄触并识别抗原性分子，并1"吏淋巴细胞变得活化。示例性的APC包括巨喧细胞、单核细胞、朗格汉斯细胞、交错树突状细胞、滤泡树突状细胞，以及B细胞。"B细胞，，是指一类淋巴细胞，该淋巴细胞可产生与抗原相互作用的免疫球蛋白(抗体)。"CH1区"、"CH2区"、"CH3区"每一个均指抗体重《连恒定域(恒定结构域)的不同区域。"细胞应答"或"细胞宿主应答"是指一类由特异性辅助和杀伤T细胞介导的免疫应答，所述特异性辅助和杀伤T细胞能够直4妾或间接清除病毒感染的细胞或癌细胞。如在本文中所使用的，术语"嵌合抗原"是指一种包括免疫应答结构域(IRD)和耙结合结构域(TBD)的多肽。该免疫应答结构域和把结合结构域可通过共价或非共价方式直接或间接地连接。"复合物"或"抗原-抗体复合物"是指抗体与抗原之间的反应产物。由多Y介抗原形成的复合物在含水体系中倾向于不可溶。"细胞毒性T淋巴细胞"是一种专门类型的淋巴细胞，其能够破坏外源细胞和感染有传染性病原体(infectiousagent)(其能产生病毒^生:抗原)的宿主细胞。"表位"是指复杂抗原分子上抗原决定簇的最简单形式；其为由抗体或T细胞受体识别的抗原的特异性部分。"片段"是指已破坏的实体(entity)的一部分。在本发明的背景中，其还可以用来指相应的实体的一部分。因此，包括Fc片,殳的融合蛋白可以指包括与天然片段相同肽序列的重组分子。"融合蛋白"指通过由合并两个或多个编码序列得到的杂合基因表达而形成的蛋白。"铰链区"指抗体中连接Fab片段与Fc片段的部分；所述铰链区包含将两条重链共价地连接在一起以形成二聚分子的二硫键。术语"同系物"指与另一个分子表现出同源性的分子，例如在相应位置具有相同或相似的化学残基序列。短语"同源百分比，，或"同源性百分比"指在相同或类似的同源多核普酸或多肽的相同位置处的核苷酸或氨基酸百分比。例如，如果在两个蛋白中80个残基中有75个是相同的，则所述两个蛋白是93.75%同源的。同源性百分比可以使用本领域中普通技术人员已知的各种软件程序来确定。"宿主"指例如可纟合予嵌合抗原的温血动物。在本发明的背景中，"杂交"意思是指低聚化合物的互补链的配对。在本发明中，优选的配对机制涉及氢键，该氢键可为低聚化合物的互^卜核苷或才亥苦酸石咸基(核芬&臾石威基(nucleobase))链之间的Watson-Crick、Hoogsteen或反Hoogsteen氪4建。侈'B口，^>口票令禾口胸腺嘧啶是通过形成氢键而配对的互补核苷酸石咸基。杂交可在不同的情况下发生。杂交可以在不同的环境下发生。在多核苷酸的背景中使用的术语"杂交"以及类似用语，意思是指常规杂交条件，优选例i口在50。/o甲酰胺/6XSSC/0.1%SDS/100pg/mLmDNA中的杂交，其中杂交的温度高于37°C，而在0.1XSSC/0.1%SDS中的洗涤温度高于55°C。"免疫性"或"免疫应答"是指身体(body)对抗原的应答(反应)。在特定的具体实施方式中，其指身体4氏抗感染性疾病或^f呆护自身免于感染性疾病的能力。免疫应答结构域(IRD)"指嵌合分子的不同构象的抗原部分。IRD包括一个或多个抗原或者一个或多个重组抗原。优选的病毒抗原包括但不限于HCV核心、HCVE1-E2、HCVE1、HCVE2、HCVP7、HCVNS3-丝氨酸蛋白酶、HCVNS4A、HCVNS4B、以及HCVNS5A。如在本文中"f吏用的，短语"免疫-可治疗的疾病"指一种可以通过在受治疗者体内引发或调节免疫应答来预防、抑制或緩解的病症或疾病。"淋巴细胞，，指的是存在于例如血液中的有核细胞的亚类，其介导特异性免疫应答。"单克隆抗体"或"mAb"指由融合的杂交细胞(即，杂交瘤细胞)克隆或其遗传同源性(同质)种群产生的抗体。克隆杂交细胞以建立产生特异性单克隆抗体的细胞系，所述特异性单克隆抗体是化学上或免疫学上同源的，即仅识別一类抗原。如在本文中使用的，"可操作性(叩erably)连接"意思是结合入遗传构建体中，使得表达控制序列可有效控制感兴趣编码序列的表达。"肽键"指两个或多个氨基酸之间的共价化学键。其是一个氨基酸的oc氨基与另一个氨基酸的oc羧基之间的取代的酰胺键。"药物赋形剂"包括一种材料例如佐剂、载体、pH调节和緩冲剂、张力(张度)调节剂、湿润剂、防腐剂等。"药用"是指生理上可与人或其他动物相容的无毒组合物。如在本文中使用的，术语"多核苷酸"是指任何长度的核香酸(核糖核酸或脱氧核4唐核酸)的聚合形式(多聚形，polymericform)。该术语Y又指分子的一级结构。因此，该术语包括-双链和单链DNA和RNA。其还包括已知类型的修饰，例如本领域中已知的标记物、曱基化，"帽(cap)"，用类似物取代天然存在的核香酸中的一个或多个，核苷酸间^修饰例如i者如那些带有不带电4建(如，膦酸曱酯、磷酸三酯、磷酰胺化物(磷酰胺酶，phosphoamidate)、氨基曱酸酯等)和带电4建(命J^!口，石危4戈石粦酉臾酉旨(phosphorothioate)、二石克^石寿酸酯)的修饰、那些含悬挂物(下垂物，pendant)部分的修饰例如蛋白(包括例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、那些具有插入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的修饰、那些含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、那些含有烷化物(alkylator)的修饰、那些具有改性键合的(modifiedlinkage)(例如，cc-端基核酸)，以及未修饰形式的多核苷酸。"多肽"和"蛋白，，可互换使用，并意思是指任何肽连接的(peptide-linked)氨基酸链，无i仑长度或翻译后的》务饰如4可。如在本文中所〗吏用的，"预防"意思是指完全防止疾病的症状、延乡爰疾病症状发作、或减弱随后发展的疾病症4犬的严重性。"防止，，疾病意思是指该疾病的症状基本上不存在。"蛋白酶切割位点"是指一个位点，在该位点蛋白水解酶催化多肽链中氨基酸之间肽键的水解(断裂)。在本发明中，短语"严格的杂交条件"或"严格的条件"是指这样的条件，在该条件下本发明的化合物将杂交于其耙序列，但Z又杂交于最小数量的其他序列。术语"受治疗者"指任何温血动物，优选人。"标签"指用来分离或纯化含该标签的分子的标记物或标记物序列。示例性的标签包括6xHis(即6个组氨酸的序列)标签。"T细胞，，指一类淋巴细胞，其可以发起针对抗原的抗原特异性应答并且在体液和细月包免疫应答中起作用。"耙结合结构域(TBD)"指免疫球蛋白重链恒定区的全部或一部分(例如，CH1(全部或部分)-CH2-CH3)。短语"治疗有效量"指试剂(例如，嵌合抗原或编码嵌合抗原的多核苷酸)的量足以引起有效的针对抗原的B细胞、细胞毒性T'淋巴细力包(CTL)和/或寿煮助T'淋巴细力包(Th)应答并阻断或治愈或至少部分地阻止或减'j"曼疾病或病症的症状和/或并发症。通过分泌细胞因子，一个T细胞亚群起T辅助细胞的作用，所述细胞因子有助于活化B细J包以分泌抗体或有助于另一种T细胞亚群4吏成为效应子细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。如在本文中^f吏用的，术语"治疗"覆盖任何可通过嵌合抗原治疗的动物(特另"是人)体中的病症的治疗，并且包4舌(i)防止该病症在受治疗者体内发生，该受治疗者可能易感染所述病症，4旦尚未诊断患有该病症；(ii)抑制该病症，例如阻止或减慢其发展；或(iii);咸i爰i亥病症，例^W吏i亥病症或其症习犬消退。如在本文中〗吏用的，"治疗性"的药剂是指这样的试剂，该药剂能导致疾病的症状完全消失，或降4氐该疾病症状的严重性。"异源(异种型，xenotypic)"意思是指来自于除了宿主之外的种属。例如，由小鼠基因组克隆的重组表达的抗体对人是异源的^f旦对小鼠并不是异源的，不管该重组表达的4元体在细菌、昆虫、人还是小鼠细胞内产生。因此，在本发明的嵌合抗原的背景中，异源TBD(例如，异源抗体分子或异源抗体片段)指衍生自不同于嵌合抗原结合的种属。c.嵌合抗原本发明的组合物包括嵌合抗原，该嵌合抗原包括免疫应答结构域(IRD)和耙结合结构域(TBD)组成。在本发明的优选具体实施方式中，IRD部分能够i秀导体液和/或T细胞应答，而輩巴结合部分能够结合APC如树突细胞。本发明的嵌合抗原还可以包括下列中的一个或多个免疫球蛋白的铰链区(或其节段)、免疫球蛋白的CH1区(或其节段)、肽连接子、蛋白酶切割位点、以及适用于提纯步骤的标签。本发明的嵌合抗原能够结合于APC并活化APC。通常<旦非必需的，该IRD是TBD的N末端。在本发明的某些具体实施方式中，嵌合抗原的IRD包4舌一种或多种(例3口，2、3、4、5、6、7、8、9或10)蛋白(4元原)，戶斤述蛋白(抗原)选自包括诸如本文中所述的一种或多种HCV蛋白或一种或多种重组HCV蛋白。在这样的蛋白之间可以可选地是连接子，诸如本文中所披露的任何连接子。在本发明的嵌合抗原中，可以使用这些抗原的免疫原片段而非全长抗原。如果嵌合抗原中存在一种以上抗原，则可仅使用全长抗原、仅使用免疫原片段，或使用全长抗原与全长蛋白的混合物。本发明的嵌合抗原可以为单体(即，它们包含包括IRD和TBD的单个单^立)或者它们可以为多体(即，它们可以包含多个单^f立，每个单位包括IRD和TBD)。多体可以为例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体(septamer)、或八聚体。在这样的多聚体中，单个单位可以相同或不同，或者某些相同而其他不同。图1示出了二聚嵌合抗原。在本发明的另一具体实施方式中，嵌合抗原的ID包4舌融合于一种或多种HCV蛋白或者一种或多种重组HCV蛋白的6xHis肽。在本发明的某些具体实施方式中，嵌合抗原的TBD可以为抗体片,殳。该TBD可以为与待给予相关嵌合抗原的宿主(受治疗者)相同的种属。另一方面，在本发明的优选具体实施方式中，嵌合抗原的TBD是与宿主异源的抗体片4史。例如，如果宿主是人，则示例性的异源抗体片段是非人动物抗体片段，如小鼠抗体片段。在本发明的某些具体实施方式中，该异源抗体片段包括鼠Fc片段。在本发明的最优选的具体实施方式中，TBD包括异源Fc片段(或其节段)、铰链区(或其节段)、CH1区(或其节段)、以及适合于将靶结合结构域连4秦于该IRD的肽4定。本发明还包括连4妄分子(linkingmolecule)的用途，该连接分子将IRD连接于TBD。示例性的连接子分子(连接分子，linkermolecule)包4舌亮氨@交4立《连、和生物素/4元生物素蛋白。其4也可4吏用的连接子(例如在融合蛋白中)是肽序列。这样的肽连接子的长度通常为约2至约40个氨基酸(例如，约4-10个氨基酸)。示例性的肽连接子包括氨基酸序列SRPQGGGS(SEQIDNO:l)。其他连接子在本领域中是众所周知，并且通常富含甘氨酸和/或丙氨酸，以允许其区域之间连接的灵活性。通常，在本发明的嵌合抗原中，IRD和TBD不通过TBD(例如，抗体分子或抗体分子片段)的抗原结合部分与IRD上适当的抗原表位之间的物理性抗原-抗体相互作用而连接。在一个具体实施方式中，本发明的嵌合抗原是具有两个部分的融合蛋白，即，含抗原序列(例如病毒抗原)的IRD、以及含异源Fc片段的TBD。异源鼠Fc片段结合于APC,特别是树突细胞上的特异性受体。因此，嵌合抗原的结合区特异性地靶向抗原呈递细胞。然后，APC的内^卩工具(internalmachinery)力o工i亥嵌合^t原，并呈递MHCI类和II类分子上的特异性肽以接触并活化T细胞并且纟田月包^口癌纟田月包。在另一个具体实施方式中，该嵌合抗原可以为具有两个部分的融合蛋白，即修饰的病毒抗原或多种抗原、抗原蛋白片段或肽、或者其特异位点具有糖基化的任何一种、以及也可以被糖基化的异源鼠Fc片#殳。在又一具体实施方式中，本发明提供了另一种修饰的嵌合抗原，其中所述抗原(IRD)是生物素化的，而所述TBD(例如，Fc片^殳)与抗生物素蛋白(如抗生物素蛋白《连菌素)轭合，例如在融合蛋白中。这样的抗生物素蛋白轭合的TBD促进了一大类IRD-TBD扼合物的生成。当然，应该理解，IRD可与抗生物素蛋白辄合(例如，以融合蛋白的形式)，而TBD(例如，Fc片,殳)可为生物素4b的。在又一具体实施方式中，本发明^是供了IRD(抗原)与TBD(例如，抗体Fc片革殳)之间通过化学扼合的结合。本发明的一个具体实施方式包括HCV的重组抗原(其通过分子生物学技术融合于抗体片段)的用途、在杆状病毒表达系统中生成融合蛋白以及其用作(useas)抵抗慢性HCV感染的治疗性疫苗。本发明4是供了一种有岁丈的方法，用于在体内^)夸HCV4元原递送至APC以1"更产生广泛的免疫应答，涉及CTL和Th2(抗体)应答的Thl应答。预选的病毒抗原(例如，不能被宿主免疫系统识别的抗原)的免疫原性可由于异源抗体片段的存在以及昆虫细胞表达系统中特异性糖基化的存在而^是高。由于存在抗体组分，抗原-抗体片賴二的融合蛋白将结合于在免疫系统的多种细胞(例如APC)上存在的特异性受体，其中所述多种细胞包括树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞、以及粒细胞。给予人或动物的融合蛋白将由APC,特别是DC内化，将被水解为小肽，并与MHCI类和/或MHCII类分子形成复合物而呈递于细胞表面，T细胞具有适当特异性的抗原特异性T细胞受体(TCR)。以这种方式，该嵌合抗原(融合蛋白)可以引起广泛的免疫应答并清除病毒感染。如在本文中所^吏用的，术^吾"耙结合结构域(TBD)"指免疫球蛋白重链恒定区的全长或部分，其是能够结合于APC上Fc受体的抗体片段。根据本发明，TBD是一种能够结合于APC，特别是树突细胞上的Fc受体的蛋白，并且随后可通过受体介导的吸收(才聂取)而转运到APC内。根据本发明，Fc片段的存在增加了嵌合抗原通过APC,特别是DC上的Fc受体的吸收。通过特异性吸收，可加工该病毒抗原并作为异质而呈递；因此，可有效地引起针对该病毒抗原的免疫应答，其本身可^皮宿主耐受或引起宿主体内极其微:弱的免疫应答。此外，根据本发明，优选地，嵌合抗原能够结合于巨噬细胞甘露糖受体/C-型凝集素受体。巨噬细胞甘露糖受体(MMR)，也称为CD206，在诸如DC的APC上表达。该分子是内吞受体的C型凝集素家族的一个成员。甘露糖化的嵌合抗原可以被CD206结合并内化。通常，认为外源性抗原主要通过MHCn类途径加工和呈递。然而，在通过CD206靶向的情况下，有证据表明，涉及MHCI类和MHCII类途径[Apostolopoulosetal.(2000)Eur.J.Immunol.30:1714;Apostolopoulosetal.(2001)CumMol.Med.1:469;Ramakrishnaetal.(2004)J.Immunol.172:2845-2852]。因此，用特异性靶向CD206的嵌合抗原负载的单核细胞源树突细胞将i秀导potentI类依赖性CD8+CTL应答和II类依赖性增殖T辅助细胞应答[Ramakrishnaetal.(2004)J.Immunol.172(5):2845-52]。示例性的TBD来自小鼠抗HBVsAgmAb(杂交瘤2C12)(如在pFastBacHTa表达载体中克隆的)，并且在昆虫细月包表达系统(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)中表达。/人小鼠抗HBVsAgmAb的N末端到C末端，该TBD由部分CH1(含有氨基酸序列VDKKI;SEQIDNO:2)和铰链-CH2-CH3组成。用于实施本发明的IgGl分子的恒定区可以包含连接肽、部分CHl-铰链以及CH2和CH3区。单体TBD的4交链区可以与另一个TBD分子形成双碌J建。该蛋白可以表达为N末端融合蛋白，该N末端融合蛋白具有6xHis标签、7个氨基酸rTEV(重组性烟草蚀纟丈病毒)蛋白酶切割位点、以及抗HBVsAg(杂交瘤2C12)而生成的异源(鼠)mAb革巴结合结构h戈(TBD)的N末端融合。该示例性的TBD是来自2C12的IgGlmAb恒定链的片段，其中氨基酸序列包括8个氨基酸的肽连接子、CH1区的5个氨基酸、4交链序列、Ch2和Ch3区序列，以及可选地，由来源于表达载体的核苷酸编码的另夕卜10个氨基酸的C末端肽。本文中限定的示例性TBD片段形成亲代分子，用于与来自HCV病毒的4元原一起生成融合蛋白。D.新型多核苷酸本发明的另一方面涉及编码本文所披露的所有嵌合抗原的多核香酸。该多核苷酸包括编码免疫应答结构域的第一多核苷酸部分以及编码耙结合结构域的第二多核苷酸部分。该第一和第二多核苷酸部分可以4立于相同或不同的核苷酸《连上。除了上文所描述的本发明嵌合抗原区域外，本发明的多核普酸通常包含前导序列，该前导序列编码促进使嵌合抗原从其生成细胞(如，酵母或昆虫细胞)中分泌出来的前导肽。相关前导序列通常在从细胞中分泌前而从该嵌合抗原中切割。前导序列可以是本文所披露的那些序列中的任何一种并且可以是本领域中已知的其他序列，例如具有的氨基酸序列为MPLYKLLNVLWLVAVSNAI(SEQIDNO:37)的AcNPV甲壳酶信号序列，该氨基酸序列由核苷酸序列TTTCTAACGCGATT(SEQIDNO:38)以及a-交配因子前导序列(leader)编码，其中该核苷S臾序列可用于昆虫细胞中的表达；而该oc-交配因子前导序列可用于在酵母细胞(例如，巴类斤德毕赤(朽c/2Z》/flW0"、)酵母纟田月包)中的表达。本发明4是供了对应于或互补于编码嵌合抗原、mRNA的基因、和/或编石马序列的多核苷酸，4尤选以隔离型(isolatedform),包括编码嵌合抗原变异蛋白的多核苷酸；DNA、RNA、DNA/RNA杂合体，以及相关分子、多核苷酸或寡核苷酸(其互补于编码嵌合抗原或mRNA序列或其部分的基因或与其具有至少90%的同源4生)；以及杂交于编石马嵌合4元原、mRNA的基因、或杂交于编石马嵌合4元原的多核普酸的多核苷酸或寡核苷酸。此夕卜，本发明还包括本文中所披露的可特异性编码嵌合抗原的基因的类似物。类似物包括例如突变体，该突变体保留可引起免疫应答的能力，且优选与任何一种编码嵌合抗原的多核苷酸具有至少80%、更优选90%、并且最优选95%的同源性，如由在SEQIDNO:39和41-51中列出的序列所特别描述的。典型地，这样的类似物^又通过1-10个密码子变化而区分。实例包括具有来自病毒抗原或抗体片段的天然氨基酸序列的较小氨基酸变异的多肽；特别地，具有保守性氨基酸置换的多肽。保守性置换是那些发生在其侧链中相关的氨基酸家族内的置换。可遗传性编码的(genetically-encoded)氨基酸通常分为四个家族(1)酸性=天冬氨酸、谷氨酸；(2)石咸性=赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；以及(4)不带电荷的极性=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸、以及酪氨酸有时共同地分类为芳香族氨基酸。例如，预计用异亮氨酸或缬氨酸置换亮氨酸、用谷氨酸置换天冬氨酸、用丝氨酸置换苏氨酸的隔离置换(isolatedreplacement),或用结构上相关的氨基酸置换氨基酸的相似保守性置换将不会对生物活性产生大的影响，是合情合理的。与本文中所扭:露的任一多肽具有基本上相同的氨基g臾序列，但具有基本上并不影响该嵌合抗原引起免疫应答能力的较小氨基酸置换(取代)的多肽分子也在嵌合抗原的定义范围内。4汙生物包括具有其他嵌合抗原分子的聚集轭合物以及具有非相关化学基团(moieties)的共^f介轭合物。通过本领域中已知的方式，将官能团连接于嵌合抗原氨基酸链中或在N或C末端残基中存在的基团来制备共价衍生物。表1中给出了氨基酸的缩写。表l:氨基酸缩写丙氨酸AlaA精氨酸ArgR天冬酰胺AsnN天冬氨酸AspD半胱氨酸CysC谷氨酸GluE谷氨酰胺GinQ甘氨酸GlyG组氨酸HisH异亮氨酸lieI亮氨酸LeuL赖氨酸LysK蛋氨酸MetM苯丙氛酸PheF月甫氨酸ProP丝氨酸SerS苏氨酸ThrT色氛酸TrpW酪氨酸TyrY缬氨酸ValV可在蛋白内进4亍保守性氨基酸置换而不改变该蛋白的构象或功能。本发明的蛋白，或可用于本发明的蛋白，可以包4舌不超过1546个(例^r，不超过14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或l)保守置换。这样的变化包括用异亮氨酸(1)、纈氨酸(V)和亮氨酸(L)中任何一种置换(代替)这些疏水性氨基酸中其他任何一种；用天冬氨酸(D)置换谷氨酸(E)，并且反之亦然；用谷氨酰胺(Q)置换天冬酰胺(N)，并且反之亦然；以及用丝氨酸(S)置换苏氨酸(T)，并且反之亦然。根据特定氨基酸的环境及其在蛋白三维结构中的作用，其他置换也可以认为是保守的。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)经常可互换，正如可以是丙氨酸(A)和缬氨酸(V)。相对疏水的蛋氨酸(M)通常可以与亮氨酸和异亮氨酸互换，并且有时与缬氨酸互换。在某些位置赖氨酸(K)和^青氨酸(R)经常可互换，其中在所述位置中氨基酸残基的显著特征是其带电并且这两个氨基酸残基的pK's差别不显著，在特殊环境中，还有一些变4b可i人为是"呆守的，，[参见例如，Biochemistry4thEd.,LubertStryered.(W.H.FreemanandCo.),pages18-23;Henikoffetal.(1992)ProcNatlAcadSciUSA89:10915-10919;Leietal.(1995)J.Biol.Chera.270:11882-11885]。其他类似多核香酸包括那些在任一TBD和/或任一IRD中具有一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、或20)插入(添加)或缺失的多核苦酸，其中TBD和/或IRD用来增加相关嵌合抗原的可;容性。所述插入或缺失可以为该嵌合抗原中由多核香酸编码的一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、或更多)氨基酸(以及多核香酸本身内相应凄t量的核苷酸)。本发明还包括与编码嵌合抗原的多核苷酸选择性杂交的多核香酸。优选地，本发明的多核苦酸将在严才各的条件下与SEQIDNO:39和41-51中所列出的序列中的一个或多个杂交。杂交反应的严格性可由本领域中的普通技术人员很容易地确定，并且通常是根据探针长度、洗涤温度以及盐浓度的经验计算。通常，较长的探针需要较高的适当退火温度，而较短的探针则需要较低的温度。当互补链存在于低于其解链温度的环境中时，杂交通常取决于变性核酸序列对重新退火的能力。探针与可杂交序列之间的期望同源性程度越高，则所使用的相对温度越高。因此，其遵循如下规则，即，较高的相对温度将倾向于使杂交条件更严格，而较低温度则使得杂交条件不那么严才各。关于杂交反应严格性的另外的细节和解释，参见例如Ausubeletal"CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,(1995,4乍为April2004才卜充的，i曾开'j66)在2.9.1-2.10.8和4.9.1-4.9.13页。如本文中所定义的，"严格性条件"或"高严格性条件，，可以通过但不限于以下来鉴别(1)在50。C利用低离子强度和高洗涤温度，例如0.015M氯化钠/0.0015M一科蒙酸钠/0.1%十二烷基石克酸钠；(2)在杂交过程中，在42。C下，采用变性剂如曱酰胺，例如50%(v/v)曱酰胺(含0.1%牛血清白蛋白)/0.1。/。菲柯尔(Fico11)/0.10/0聚乙烯吡咯烷酮/50mM、pH6.5的石岸酸钠緩沖液(含750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠)；或者(3)在42。C下，采用50%曱酰胺、5XSSC(0.75M氯化钠、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1%焦磷酸钠、5XDenhardt溶液、超声鱼4青DNA(50pg/mL)、0.1%SDS、以及10%石克酸葡聚糖，其中洗涤为在42。C的0.2XSSC(氯化钠/柠檬酸钠)和55。C的50%曱酰胺，接着在55。C下高严格性洗液由含EDTA的0.1XSSC组成。"中度严格性条件"是那些由在(但不卩艮于)Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.,NewYork:ColdSpringHarborPress,1989中4苗述的条件，并且包括-使用那些不如上述条件严格的洗涤液和杂交条件(例如，温度、离子强度和。/。SDS)。中度严格条件的一个实例是在37。C下、在包含20%甲酰胺、5XSSC(150mM氯化钠、15mM一宁檬三钠)、50mM石岸酸钠(pH7.6)、5XDenhardt溶液、10%石危酸葡聚4唐以及20mg/mL变性(denaturedsheared)鱼一青DNA的溶液中孵育过夜，随后在约37-5(TC下、在IXSSC中洗涤滤膜(过滤器，filters)。本领域的技术人员将认识到如何调节温度、离子强度等，如对适应诸如探针长度等因素所必需的。本发明的多核苷酸的具体实施方式包括编码嵌合抗原的多核苷酸，其中所述嵌合抗原具有选自如在SEQIDNo:40和52-62中所列出的任一序列中的序歹'J,嵌合抗原的核苷酸序列选自如在SEQIDNo:39和41-51中所列出的序列中的任何一个，^f旦用U核苦酸置换(取^)T核苷酸。例如，嵌合抗原核苷酸的具体实施方式包括l旦不限于(a)多核香酸，该多核普酸包含选自如在SEQIDNo:39和41-51中所列出的4壬一序列中的序列，其中T还可以为U;(b)多核苦酸，其序列至少80%与选自如在SEQIDNo:39和41-51中所列出的4壬一序列中的序列同源；(c)多核苷酸，其编码嵌合抗原，该嵌合抗原的序列由包含在本文所披露的任一质粒中的DNA编码；(d)多核苷酸，其编码嵌合抗原，该嵌合抗原的序列是选自如在SEQIDNo:40和52-62中所列出的4壬一序列中的序列；(e)多核苷酸，其编码嵌合抗原相关的蛋白，该蛋白至少90%等同于其序列为选自如在SEQIDNo:40和52-62中所列出的序列中的任何一个的全长氨基酸序列；(f)多核苷酸，其完全互补于(a)-(e)中任一个的多核苷酸；(g)多核苷酸，其在严格的条件下选择性杂交于(a)-(f)中的多核苷酸；以及(h)多核苦酸，其包含选自如在SEQIDNo:39和41-51中所列出的任一序列的序列，但缺乏除IRD(例如，本文中所列出的HCV蛋白)和TBD之外的全部或部分序列，并且可选地包含例如一个或多个可^,替换的连4妄子和/或可^,替」换的分泌(前导)肽。此外，可将额外序列(例如，编码TBD的C末端的氨基酸的载体衍生序列)从本发明的多核苷酸中缺失掉。这样的额外序列可以为那些编石马1-15(例:^2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、或14)个氨基酸的序列。本发明还提供了包含嵌合抗原多核苷酸、其类似物或同源物的重组DNA或转录的RNA分子，包括f旦不限于噬菌体、质粒、噬菌粒、粘粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)、以及各种本领域中众所周知的病毒和非病毒载体，以及用这样的重组DNA或RNA分子转化或转染的细胞。用于生成这样的分子的方法是众所周知的[参见，例如上文Sambrooketal.，1989]。本发明进一步4是供了一种在适合的原核或真核宿主细胞内包括重组DNA分子的宿主-载体系统，该重组DNA分子包含嵌合抗原多核香S交、其类似物或同源物。适合的真核宿主细月包的实例包括-酵母细月包、才直物细月包、或动物细月包如哺乳动物细月包或昆虫细月包(例如，杆状病毒可感染的细胞如Sf9、Sf21、expressSF+、果蝇S2或HighFive细胞)。适合的哺乳动物细胞的实例包括各种前列腺癌纟田胞系如DU145和TsuPrl、其他可转染或可转导的前列腺癌细胞系、原代细胞(PrEC)以及多种常规用于表达重组蛋白的哺乳动物细月包(例^口，COS、CHO、293、293T细月包)。更具体i也i兑，利用本领域中常规采用且广为人知的任何数量的宿主-载体系统，包含嵌合抗原或其片段、类似物或同系物的编码序列的多核苷酸可以用来生成其嵌合抗原。各种各样的适合于表达其嵌合抗原的宿主-载体系统是可获得的，参见侈寸^口上文Sambrooketal.,1989;上文Ausubel,CurrentProtocolsinMolecularBiology,1995。^尤选的用于昆虫细月包表达的载体包括^旦不限于转移载体质粒pFastBacHTa(Invitrogen)。利用这样的转移载体质粒，可在昆虫细胞内生成重组杆状病毒，并可以4吏用其来感染几种包括例如Sf9、Sf21、expressSF+、果蝇S2以及HighFiveTM的昆虫细胞系，以表达嵌合抗原。一个实例是Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen)。可*#换地，优选的酵母表达系统包4舌西良酒酵母、粟酒裂歹直酵母(schizosaccharomycespombe)、巴其斤《老、毕赤酵母(pichiapastoris)、以及^V月毕赤酵母(pichiaaugust)。本发明的宿主-载体系统可以用于生产嵌合抗原。嵌合抗原或者其类似物或同系物还可以通过用含有适当的启动子(例如，昆虫细胞启动子)并编码嵌合抗原的质粒构建体稳定转染细月包(例3口，昆虫细月包)而生成。例如，编^马嵌合^元原或者其类似物或同系物的重组质4立pMIB-V5(Invitrogen)可用于稳、定4争染Sf9昆虫细月包。在Sf9细月包中表达嵌合抗原或相关蛋白，并利用标准的纯化方法分离该嵌合抗原。还可以采用各种本领域中众所周知的其他表达系统。编码在框架内连4妄于所述嵌合抗原编码序列的前导肽的表达构建体可以用于生成分泌形式的嵌合抗原。如本文中讨论的，遗传密码的冗余度允许嵌合抗原基因序列中的变异。特别地，本领域已知，特异性宿主种属经常具有特异性密主。例如，优选的类似物密码子序列通常具有用專交高频率的密码子取代的稀有密码子(即，其在期望宿主的已知序列中的使用频率低于约20%)。特异种属的密码子偏好例如通过利用互联网例如环球网URLwww.kazusa.or.jp/codon上可获4寻的密石马子^f吏用表来计算。已知另外的序列修饰可增强细胞宿主内的蛋白表达。这些修饰包括去除编码假性多腺苷酸化信号、外显子/内含子剪接位点信号、转座子样重复序列，和/或其他这样的已确定对基因表达有害的序列。将序列的GC含量调整为给定细胞宿主的平均水平，如通过参照在宿主细胞中表达的已知基因所计算的。在可能的情况下，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。其他有用的修饰包括在开;故阅读框架起始位置插入翻i奪起始共有序列，如在Kozak[(1989)Mol.CellBiol.9:5073-5080]中所描述的。本领域技术人员应当理解，真核生物核糖体〗义在5，附近AUG密码子启动翻i奪的一^:失见则^f又在才及少凄t条件下会失效[参见，例如Kozak(1995)Proc.Natl.Acad.SciUSA92:2662-2666;Kozak(1987)Nucl.AcidsRes.15:8125-8148]。大肠杆菌(大肠埃希斥干菌，Escherichiacoli)克隆(每一种均用下面列出的质^i中的一种寿争化)于2006年10月11曰在布达j風斯条约下保藏于加拿大国际保藏机构(IDAC)，1015ArlingtonStreetWinnipeg,Manitoba,R3E3R2Canada(电话号码(204)789-6030;传真号(204)789-2018)。通过指定的IDAC登录号很容易地鉴别每一克隆。质粒IDAC登录号pFastBacHTa-gp64HCVNS3mutS-TBD'pFastBacHTa-gp64HCV鹏mut-TBDpFastBacHTa-gp64NS3-NS5A-TBDpFastBacHTa-gp64HCV測5A-TBDpFastBacHTaHCVNS3mut-TBDpFastBacH丁aHCVNS3-NS4B陽NS5A-TBDU1,-06川006-05111006-041U006-02111006-03从提交本申请之前，通过IDAC保藏的样品取自与由ViRexxMedicalCorporation4呆存的相同的4呆藏物。所述{呆藏物将在IDAC保藏处无限制的保存30年或最后一次索耳又(要求)后5年或该专利的有效年限，哪个更长则将选用哪个，并且如果在该期限内所述保藏物变得无法存活，则其将被取代。E.本发明的药物组合物本发明的一个方面涉及包含药用JU武形剂和嵌合抗原的药物组合物，该嵌合抗原包括免疫应答结构域和耙结合结构域，其中所述靶结合结构域包括抗体片卓史。在治疗性应用中，可将药物组合物以一定量给予患者，其中所述量足以引起有效的针对抗原的B细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和/或辅助T淋巴细胞(Th)应答并预防感染或者治愈或至少部分i也阻止或减i爰感染的症;]夫和/或并发症。对该用途有效的用量将才艮据例如所给予的特定组合物、给药方式、4寺治疗疾病的分期(阶4史)和严重性、受治疗者的体重和总体Y建康状态、以及开药医生的判断。对于初始治疗性免疫(用嵌合抗原)的剂量通常存在于单位剂量范围中，其中较低值为约l、5、50、500或l，000ng,而较高值为约10,000、20，000、30,000或50,000jig。对于人类的剂量值通常在约500ng至约50,000kg受治疗者体重。可根据受治疗者的反应和病症(情况)给予按照几天至几个月的加强方案的约1.0ng至约50,000(ig之间的嵌合抗原的加强剂量。给药应持续直到至少临床症状或实验室检测表明该病症已被防止、阻止、减緩或消除并持续一段时间。根据本领域中已知的方法学来调整剂量、给药途径，以及纟合药方案。人嵌合抗原的单位剂型通常包括在药物组合物中，该药物组合物包括可接受的载体(在一个具体实施方式中为含水载体)的人类单位剂量并且以本领i或普通冲支术人员已知的体积/用量纟会予以1更用于一夸这类多月太纟会予人类(参见仿H口，Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy.20thEdition,A.Gennaro，Editor,LippincottWilliams&Wilkins,Baltimore,Md.，2000)。^口本4贞i或普通才支术人员所理解的，多种因素可影响特定病例的理想剂量。这4^的因素包4舌例如嵌合抗原的半衰期、嵌合抗原的亲合力、组合物的免疫原性、期望的稳态浓度水平、给药途径、治疗频率、和与本发明的治疗方法联合使用的其他药剂的影响、以及特定受治疗者的健康状态。通常，给予受治疗者可引起针对嵌合抗原的免疫应答的足够的嵌合抗原。TBD4吏该嵌合抗原靶向于APC如DC上的特异性受体。该嵌合抗原经抗原呈递途径被内化、力。工以引起体液以及细胞免疫应答两者。在某些具体实施方式中，将本发明的组合物应用于严重疾病状态，即威胁生命或潜在威胁生命的情形。在这样的情况中，由于本发明优选的组合物的嵌合抗原的相对无毒性质，给予比这些所述的剂量超过很多的嵌合抗原是可能的并且被治疗医师认为是理想的。本发明的嵌合抗原在药物制剂中的浓度可很大的变化，即重量从低于约0.1%，通常为或至少约2%至高达20%至50%或更高，并且将按照所选择的特定给药模式主要通过液体体积、粘度等进行选择。该药物纟且合物可以通过本^贞Jt或中已知的4壬4可途径来递送，例^口胃肠外、鞘内、血管内、静脉内、肌内、经皮、皮内、皮下、鼻内、局部、口服、直肠、阴道、肺或腹膜内。优选地，该组合物通过胃肠外途径递送，例如皮下或皮内给药。该药物组合物可以通过将期望的嵌合抗原与适当的适合于预期给药途径的载体混合来制备。在制备本发明的药物组合物时，通常将该嵌合抗原与赋形剂混合、用赋形剂稀释或包装在载体内，该载体可以是胶嚢、嚢剂、纸或其他外壳(容器，container)形式。当药用U武形剂用作稀释剂时，其可以为固态、半固态或液态材^",该才才4+用作用于治疗剂的f武形物、载体或介质。因ot匕，该ia合物可以是片剂、丸剂、粉剂(散剂)、锭剂、嚢剂、扁胶嚢(扁嚢剂)、酏剂、悬浮液、乳剂、溶液、糖浆、气溶胶(固态或在液体介质中)、软膏(例如，含按重量计达10%的嵌合抗原)、软和硬明胶胶嚢、栓剂、无菌可注射溶液、以及无菌包装粉末。适合的赋形剂的某些实例包括但不限于葡萄糖、蔗糖、丙三醇、山梨醇、甘露醇、淀#分、阿^立伯月交、^粦酸钙、藻(朊)酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆、以及曱基纤维素。所述制剂还可以包括润滑剂如滑石、石更脂酸4美和矿物油；湿润剂；乳化和悬浮剂；防腐剂如羟基苯甲酸曱酯和羟基苯甲酸丙酯；甜味剂；以及调味剂(增香剂)。可以通过采用本领域已知的程序来配制本发明的组合物以-使在给予受治疗者后提供嵌合抗原的快速、持续或緩释。参见，例如上文Remington第903-92页和1015-1050页。为了制备固态组合物如片剂，可将嵌合抗原与药用赋形剂混合，以形成包含本发明嵌合抗原的同源混合物的固态预制剂组合物。当将这些预制组合物称为同源的时，是指使该嵌合抗原在整个组合物中均匀分散，以使该组合物可以容易地再分为同等有效的单位剂型如片剂、丸剂和月交嚢。可对本发明的片剂或丸剂进行包衣(涂敷)或以其他方式混合以提供一种能提供延长作用的优势的剂型。例如，该片剂或丸剂可以包括内部剂量和外部剂量组分，后者为前者上的包膜形式。该两个组分可以由肠层分开，该肠层用来抵抗胃内分解并允许内部组分完整通过十二指肠或延緩释》文。各种物质可以用于这样的肠层或涂层，这样的物质包括大量聚合物酸(高分子酸，polymerciacid)以及聚合物酸与这才羊的物质诸如虫月交、鲸蜡醇和醋酸纤维素的混合物。其中可结合本发明的新型组合物并用于口服或通过注射的液态形式包括含水溶液、适合地调口未的糖浆、含水或油悬浮液以及调口未乳浊液(具有食用油如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油、或花生油)、以及酏剂及类似药用载体。在制备用于胃肠外给药的组合物时，必须严格注意进行紧张性i周整以P!H氐刺;敫。可重纟且寸生纟且合物(reconstitutablecomposition)是以干燥形式包装的无菌固体。优选可重组性组合物，因为当其以干燥固体而非即时给予的溶液储存时会更稳定。干燥固体通常包装于具有丁基橡胶塞的无菌容器中，以确保该固体以最佳湿度范围保存。可重组性干燥固体通过干式充填法、喷雾千燥法、或冻干法形成。这些方法的描述可在例如上文Remington,第681-685页和802-803页中找到。用于胃肠外注射的组合物通常是稀释的，且其中以较高比例存在的组分是载体。该载体通常不具有治疗活性且是无毒的，但能以适于吸收的形式将嵌合抗原呈递给身体组织。当嵌合抗原以含水溶液呈递时，吸收通常将最迅速且完全地发生。然而，用水溶性液体对载体进行修饰或者用水不溶性液体对载体进行置换(取代)可以影响吸收速率。优选地，用于该组合物的最有价值的载体是等张盐水。在制备适合于注射的组合物时，可以使用含水载体、水溶性载体、以及非水性载体。在本发明的可注射性《且合物中还可以包4舌其4也物质以改善或保障组合物的质量。因此，加入的物质可以影响溶解性，适于受治疗者舒适度、增强化学稳定性或保护该制备物免于微生物生长。因此，该组合物可以包括适当的增溶剂、作为抗氧化剂的物质、以及用作防腐剂以防止微生物生长的物质。这些物质将以适合于其功能4旦并不不利地影响该组合物的作用的量存在。适当的抗4鼓生物药剂的实例包括硫柳汞、氯化苄乙氧铵、氯化苯曱烃铵、酚、对羟基苯曱酸曱酯、对羟基苯甲酸丙酯。适当的抗氧化剂可以在上文Remington,第1015-1017页中才戈到。在某些具体实施方式中，脂质体、毫微型胶嚢、微粒、脂质颗粒、小嚢泡等用于本发明的嵌合抗原的给药。特别地，本发明的组合物可被配制成用于包封在脂质颗粒、脂质体、小嚢泡、毫微球或毫微型颗粒等的递送。可替换地，本发明的组合物可共价或非共价结合于这样的载体赋形剂的表面。通过脂质体给予的组合物还可以用来1)^f吏嵌合抗原耙向于特定组织如淋巴组织；2)选择性靶向于APC;3)携带另外的刺激性或调节性分子；或4)增加嵌合抗原组合物的半衰期。脂质体包括乳液、泡沫、微团、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、薄片状层(lamellarlayer)等。在这些制备物中，将待递送的嵌合抗原单独合并为脂质体的一部分，或者与结合于淋巴细胞中常见受体的分子如结合于CD45抗原的单克隆抗体或与其他治疗性或免疫原性组合物一起合并。因此，用本发明期望的嵌合抗原填充或装饰的的脂质体可以直接定向于淋巴细胞的位置，随后脂质体在该位置递送所述嵌合抗原。根据本发明使用的脂质体由标准的成泡脂质形成，所述脂质通常包括中性和带负电荷的磷脂和固醇如胆固醇。通常，通过考虑例如脂质体大小、用于期望给药途径的脂质体如在血流中的酸不稳定性和稳定性而指导脂质的选择。多种方法可用于制备脂质体[^口在侈寸^口Szokaetal.(1980)Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467-508;以及美国专利第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号和第5,019,369号中所描述的]。包含嵌合抗原的脂质体悬浮液可经静脉、附近或局部等途径以一定剂量给予，所述剂量才艮据特别是给药方式、4寺递送的嵌合抗原、以及4寺治疗疾病的阶羊殳而变4匕。用于吸入法或吹入法的组合物包括药用、含水或有机溶剂中的溶液和悬浮液，或其混合物以及粉末。该液态或固态组合物可以包含如本文所描述的适合的药用赋形剂。该组合物可以通过口服或鼻呼吸途径纟会予，以用于局部或全身步文应。药用;容剂中的组合物可以通过〗吏用惰性气体来雾化。喷化溶液可以直4妄乂人喷化装置吸入或者该雾化装置可以连接到面罩支管上或间歇正压呼吸才几上。溶液、悬浮液或并分末组合物可以优选口服或经鼻从以适合方式递送制剂的装置来给予。本发明的方法中所采用的另一种制剂采用经皮递送装置("贴片，，)。这样的经皮贴片可以用来以可控量4是供连续或间断输注本发明的嵌合抗原。用于递送药物试剂的经皮贴片的构建和用途在本领域是众所周知的。参见，例如美国专利第5,023,252号，将其结合于此作为参考。这样的贴片可构建用于连续、力永沖或按要求递送药并勿i式剂。此外，除了嵌合4元原和药用I武形剂外，包4舌至少一种4元病毒性治疗剂或化疗剂可能是有利的。这些药剂包括但不限于干扰素-Ct2a/b以及纟元病毒剂如利巴韦4木。在某些具体实施方式中，可能期望在本发明的药物组合物中包括至少一种初始化B淋巴细胞或T淋巴细胞的组分。脂质已鉴定为能在体内初始化CTL的药剂。例如，可将棕榈酸残基连接于赖氨酸残基的s-和a-氨基，然后例如通过一种或多种连4妻残基如Gly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser等连4妄于免疫原肽。随后可以^]夸该脂质月太以微团或颗粒直接给予、合并入脂质体或在佐剂如不完全福氏(Freund)佐剂中乳化。在优选的具体实施方式中，一种特别有效的免疫原性组合物包括连接于赖氨酸的s-和ot-氨基的棕榈酸，其通过4建例如Ser-Ser连4妄于所述免疫原肽的氨基末端。作为初始化CTL应答的脂质的另一个实例，当共价连4妻于适合的肽时，Eco//脂蛋白如三棕榈酰-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)可以用来初始化病毒特异性CTL[参见，例如Deresetal.(1989)A^w"342:561]。例如，本发明的嵌合抗原可偶联于P3CSS,虽然本发明的组合物并不必须使用佐剂，但可以使用佐剂。根据宿主种属，可使用不同佐剂来增强免疫应答，并且包括但不限于福氏佐剂(完全和不完全)、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、去垢剂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油乳胶、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚、免疫刺激性多核苷酸序列，以及可能有用的人类佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。另外的佐剂在本领域中也是众所周知的。F.利用嵌合抗原的方法
技术领域：
：本发明的另一方面提供了增强通过APC的抗原呈递，所述方法包括将包含免疫应答结构域和靶结合结构域的嵌合抗原给予该APC，其中，所述靶结合结构域包括抗体片段(例如，异源抗体片段)。在优选的具体实施方式中，该APC是树突细胞。本发明的一个方面涉及活化APC的方法，包括使该APC与包含免疫应答结构域和靶结合结构域的嵌合抗原^妄触，其中，所述耙结合结构域包括抗体片段(例如，异源抗体片段)。在优选的具体实施方式中，所述APC在体内与该嵌合抗原4妄触。在另一个伊C选的具体实施方式中，所述^妄触在人体内进4亍。本发明的又一方面4是供了引起免疫应答的方法，所述方法包括:将包含免疫应答结构域和靶结合结构域的嵌合抗原给予动物，其中，所述輩巴结合结构i或包括抗体片段(例如，异源抗体片^:)。该免疫应答可以为体液和/或细胞免疫应答。在优选的具体实施方式中，所述细胞免疫应答是Thl、Th2、和/或CTL应答。本发明的另一方面提供了治疗免疫-可治疗性病症的方法，包括将包含免疫应答结构域和靶结合结构域的嵌合抗原给予需要该抗原的动物，其中，所述把结合结构域包括异源抗体片,殳。优选地，该免疫-可治疗的病症是慢性丙型肝炎病毒感染。对于HCV的治疗，优选地所述免疫应答结构域包括一种蛋白，所述蛋白选自由HCV核心(1-191)蛋白、HCV核心(1-177)蛋白、HCVEl蛋白、HCVE2蛋白、HCVE1隱E2蛋白、HCVNS2蛋白、HCVNS3蛋白、HCVNS4A蛋白、HCVNS4B蛋白、HCVNS5A蛋白、HCVNS5B蛋白、HCVp7蛋白、以及其组合组成的组。本发明的另一方面提供了接种动物抵抗病毒感染的方法，包括将包含免疫应答结构域和靶结合结构域的嵌合抗原给予动物，其中，所述靶结合结构域包括抗体片段。本发明的方法可预防性地或治疗'J"生地4妾种i亥动4勿以4氐4元病毒感染。的方法。本发明还包括使用本发明的组合物来活化T细胞的方法。本发明还包括将抗原递送至免疫系统细胞如APC的方法。本发明或方法，所述方法包括给予本发明的一种或多种嵌合抗原。克隆并表达后，对嵌合抗原在产生免疫应答中的效力进行评价。评价涉及将嵌合抗原离体或在体内呈递给DC。该DC评价结合并内化该嵌合抗原。将用嵌合抗原负载的幼稚DC呈递给T淋巴细胞并评价干扰素-Y(作为T细胞应答的标记物)的产生。具体地，在离体情形下，单核细胞从外周血中分离并分化为DC。DC将抗原结合、内化、加工并呈递至幼稚自体T淋巴细胞。识别由DC呈递的力口工过的4元原的T细月包4皮活4匕为步文应细月包例如壽甫助T细月包或细月包毒性T淋巴细胞。随后，通过树突细胞的T细胞活化通过已知步骤测定标记物如干4尤素-y水平来评^介[例如Berlyn，etal.(2001)Clin.Immunol.101(3):276-283]。相乂于于背景，产生千4尤素-y的T细胞百分比增加至少50%,则预测体内效力。在优选的具体实施方式中，所述百分比增加为至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%或100%。在体内情形的情况下，将嵌合抗原经胃肠外直接导入宿主体内，其中可获得的4对突和其他抗原呈递细胞具有与所有抗原相互作用并从而处3里该-坑原的能力。G.耳关合治疗本发明的另一方面提供了用于治疗病毒感染的组合物，其包含嵌合抗原和抗病毒剂。本发明还纟是供了治疗病毒感染的方法，包括同时或依次乡会予嵌合抗原和抗病毒剂。在治疗患有慢性丙型肝炎的受治疗者的过程中，可表明将嵌合抗原与抗病毒剂如核苷类似物耳关合应用，在诱导持续应答方面高度有效。这两种药剂联合应用的作用机制在治疗丙型肝炎受治疗者中可以产生协同效应。例如，HCV抗病毒剂如利巴韦林与本文中所描答，从而清除慢性感染受治疗者体内的HCV感染。H.制备嵌合抗原的方法
技术领域：
：本发明的一个方面提供了用于生产嵌合抗原的方法，包括(a)才是供孩吏生物或细胞系(或细力包)，优选地真核，更优选地非哺乳动物樣i生物或细胞系(或细月包)，其包含编码嵌合抗原的多核苷酸；以及(b)在表达所述嵌合抗原的条件下，培养所述微生物或细胞系(或细胞)。优选地，所述樣史生物或细胞系(或细胞)是酵母、植物细胞系(或细胞)或昆虫细胞系(或细胞)。更优选地，所述细胞系(或细胞)是选自由Sf9、Sf21、expressSF+、果錄S2、以及HighFive细胞系(或细胞)组成的组的昆虫细胞系(或纟田胞)。本发明利用已建立的重组DNA冲支术，以生产给定抗原与TBD的融合蛋白，所述TBD对于实施本发明是必需的。融合蛋白构建体在结合特异性限制性酶切位点的DNA水平产生，所述酶切J立点在将期望的DNA片段结合到表达载体的过程中采用，并用来在异源表达系统中表达期望的融合蛋白。如在本文中使用的，术语"载体"表示能够携带编码期望蛋白的DNA的质粒。本发明中所使用的质粒载体包括^旦不限于pFastBacHTa以及在DHlOBac五.co/《Invitrogen)中产生的相应重组"4干粒"(细菌人工染色体)。可以动员(mobilize)期望蛋白的ORF,并产生用于在本发明中采用的除8&010-830@杆状病毒表达系统(Invitrogen)之外的其他系统(细菌或哺乳动物)中表达该蛋白的其他重组质粒。术语"表达"用来表示将DNA序列转录成mRNA，并将该mRNA转录体翻译成融合蛋白。这可通过将感兴趣基因转座入杆粒中，转染到Sf9昆虫细胞中且产生重组杆状病毒而实现。这些重组杆状病毒可用来感染Sf9或HighFive昆虫细胞，其产生感兴趣的蛋白。所产生的重组蛋白可以具有N末端6xHis标签，其可用于通过采用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen，Hilden,Germany)纯4b蛋白的过禾呈中。户斤述蛋白还可以具有N末端rTEV蛋白酶或其他已克隆入的切割位点。将Ni纯化的蛋白用例3口rTEV蛋白酶(Invitrogen)进4亍消4匕，该蛋白也具有N末端6xHis标签。蛋白酶消化后，将混合物加载到Ni-NTA琼脂糖柱上，并可以将纯蛋白洗出，同时6xHis标记的片^a将结合于该柱上。这种纯化方法是标准步骤，并且本领i或的普通纟支术人员能够理解该方法而无需进一步解释。DNA序列的克隆和表达可以通过两种途径实现，该DNA序列编码病毒抗原和鼠单克隆抗体的Fc片,爻以生成嵌合抗原。第一种途径涉及将所述两种蛋白克隆为融合蛋白，而第二种途径涉及将特异性"生物连接子"如生物素或抗生蛋白链菌素整合入两种分子之一中、将其单独纯化并生成嵌合抗原。在示例性的具体实施方式中，杂交瘤2C12(其产生抗乙肝病毒表面抗原的单克隆抗体)用作鼠免疫5求蛋白G的总RNA的来源。分离总RNA并用来克隆鼠Fc片段。具体地，利用Trizo产试剂(Invitrogen/GibcoBRL,产品目录号10551-018，10298-016;酚和异石危氰酸胍的单相溶液，如在美国专利第5,346,994中所描述的)从表达鼠IgG的杂交瘤中分离所述总RNA。通过亲和层析在寡dT柱(Invitrogen/GibcoBRL，产品目录号15939-010)上4寻mRNA乂人总RNA中纯化出来。利用逆转录酶在聚合酶链反应中生成互补DNA(cDNA)。-i殳计寡核苷酸引物以添加独特的限制性酶识别^f立点，以利于克隆。该cDNA利用6&(^0-:6&0@杆状病毒表达系统(Invitrogen/GibcoBRL,产品目录号15939-010)克隆。优先使用杆状病毒系统，这是因为不仅其生成大量异源性蛋白，而且在受感染昆虫细胞内发生了蛋白的翻i奪后修饰如石寿酸化和糖基化。在该表达系统中，可以将所述DNA克隆入称为pFastBacTM(Invitrogen/GibcoBRL,产品目录号15939-010)的载体中。在Bac-to-Bac⑧系统中，重组物的生成基于通过细菌转座子Tn7的位点特异性转座。将感兴趣基因克隆入pFastBac⑧中，其在克隆位点侧翼具有樣吏型Tn7元件。将该质粒转化入大肠杆菌菌4朱DHlOBac(Invitrogen/GibcoBRL，产品目录号10361-012)中，其具有杆状病毒穿梭质粒(杆粒)，该质粒在LacZ基因内含有Tn7附着位点。转座破坏LacZ基因，使得仅重组体产生白色克隆并易于选择。在Eco//中使用转座的优势在于单个克隆仅包含重组体，以致无需空斑纯化和筛选。将重组杆粒转染入昆虫细胞中以产生表达重組蛋白的杆状病毒。所述Bac-to-Bac⑧神干状病毒表达系统可/人Invitrogen商业上购得，并且所采用的方案(程序)如在司协议(如www.Invitrogen.com)中所描述的。^!夸感兴趣的基因克隆入例^口pFastBacHTa供体质粒中，而重组蛋白的生产基于Bac-to-BacTM杆状病毒表达系统(Invitrogen)。在接着的步骤中，为了将所克隆的基因转移入杆状病毒穿梭载体(杆粒)中，将包含感兴趣基因的pFastBacHTa供体质粒用于位点特异性转座中。这是在五.co//菌株DH10BacTM中完成的。将具有感兴趣基因的重组pFastBacHTa质粒转化入DHlOBac细胞中用于转座，以生成重组4干粒。通过标准方案(Sambrook,上文)来分离重组杆4立；所述DNA样品用于转染。为了生产杆状病毒，将该杆粒转染入Sf9昆虫细月包中。转染后，将该细胞在适当条件下孵育，收集并储存包含杆状病毒的培养基。一旦已经确认了杆状病毒的生成和蛋白的表达，则扩增病毒原种(virusstock)，以生产携带感兴趣基因的浓缩杆状病毒原种。将杆状病毒扩增至少两次是本领域中的标准操作，并且在本文所描述的所有方案中均遵循该标准操作。在第二轮扩增后，可才艮据由制造商描述的试剂盒(Invitrogen)方案，利用空斑测定(嗟菌斑测定)来定量所生成的杆状病毒的浓度。还建立了感染昆虫细月包的最适合的病毒浓度以及用于生成期望蛋白的最佳时间点。编码感兴趣蛋白的DNA可利用寡核苷酸引物通过PCR而生成，所述引物含有来自质粒的独特限制性酶切^/立点，而该质粒含有一个拷贝的全病毒基因组并与FcDNA—起克隆为融合蛋白。该嵌合蛋白通过Ni-NTA、凝集素、蛋白A或蛋白G亲和层析或本领域中普通技术人员已知的其他标准纯化方法而纯化。用于连接IRD和TBD的第二种途径涉及将特异性"生物连接子"如生物素或抗生物素蛋白(例如抗生蛋白链菌素)整合入两种分子之一中、将其单独纯化并生成所述嵌合抗原。将感兴趣的病毒抗原克隆入质粒中，该质粒通过噬菌体T7启动子控制蛋白表达。随后将该重组质粒转化入Kco/,'菌冲朱如BL21(DE3)CodonPlusRIL细月包(Stratagene,产品目录号230245)中，该细月包中T7RNA聚合酶的产生通过lac抑制子调节。T7RNA聚合酶对T7启动子高度特异，并且比宿主的RNA聚合酶显著快得多(快约8倍)。当T7RNA聚合酶的生成由异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(IPTG)诱导时，T7RNA聚合酶的特异性和持续合成能力(processivity)引起在T7启动子控制下的高水平基因转录。为了将两种蛋白偶联在一起，利用生物素与抗生物素蛋白(例如抗生蛋白链菌素)之间的紧密结合。在五.co"中，BirA酶将特异性识别序列内的生物素共价4建催化为确定的赖氨酸残基。如上所述，将鼠Fc片革殳在4干状病毒系统内表达为具有抗生物素蛋白的融合蛋白。通过生物素-抗生蛋白链菌素结合，可以混合这两种蛋白以形成二聚蛋白复合物。除非另有指明，本发明的实施采用分子生物学、孩i生物学、重组DNA和免疫学的常规4支术，其为本领域才支术人员所掌握。这才羊的:J支术在文献中有充分解释。参见，例如上文Sambrook;及上文Ausubcl。I.制品和试剂盒本发明的另一方面提供了一款产品，其包括容纳包含嵌合抗原的组合物的容器，所述组合物适合于注射或适合于重建用于注射；与印刷的标签i兌明书结合，4是供如<可在胃肠外，例如皮下、肌内、皮内、经鼻或血管内全会予该组合物的"i仑述。该《且合物可以包含在^壬何适合的容器中，该容器不会与所述组合物发生显著的相互作用，并且可以标记有适当的标记表明其适于胃肠外4吏用。所述标记i兌明书可与容器结合在一起，且该i兌明书与上文所述的治疗方法一致。容纳本发明组合物的容器可以是具有适合于注射的液态组合物的容器。该容器可以被改造适于注射器针头进入。该款产品可以包括用于注射的适当的针头和注射器，使得受治疗者、医生、护士或其他执业者均可给予所述嵌合抗原。可替换地，组合物可以为包含可溶性形式的嵌合抗原的干燥或浓缩组合物，可与含水或不含水载体结合或用其稀释，以溶解或悬浮该组合物。可一##:地，所述容器可以含有以液体的悬浮液，或可以为与载体结合的不溶性形式的盐，其中所述不溶性形式将被悬浮。适当的容器在上文Remington第788-789、805、850-851和1005-1014页中力口以i寸i仑。本发明的试剂盒通常将包括上文所述的容器以及一种或多种其他容器，所述一种或多种其他容器容纳有乂人商业和4吏用者立场所需的物质，所述材料包括緩沖液、稀释剂、滤器、针头、注射器、以及带有使用i兌明书的药品说明书。该容器上可存在标签，以指示所述组合物用于特殊疗法或非治疗性应用，并且还可以指示用于体内或离体应用的说明，如上文所述的那些。说明和/或其他信息还可以包括在试剂盒内的说明书上。V.实施例下面的非限制性实施例提供对本发明的进一步说明。实施例1.桐4+禾口方法材料用于在这些实施例中描述的Chimigen3分子中的TBD(并且，为了方便，在这些实施例中称为"TBD")来自杂交瘤2C12,其产出鼠HBsAg特异性mAb，并且其来自Tyrrell实-验室，通过Aberta大学，Edmonton,Alberta,Canada杀匕准。包含编石马HCV抗原的DNA的质粒pCV-H77C从Alberta大学的Tyrrell实-险室获得。pFastBacHTa克隆载体、昆虫细胞系Sf9、Cellfectin⑧试剂、磷酸緩沖盐(PBS)、铂P&DNA聚合酶、TRizol试剂、SuperscriptFirst-StrandSynthesis逆转录酶、X-gal、异丙基-(3-D-石克代半乳吡喃外唐香(thiogalactopyranoside)(IPTG)和胎牛血清(FBS)乂人Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)购买。昆虫细胞生长和表达培养基ESF921A人表达系统(ExpressionSystems)(Woodland,CA，USA)购买。限制性内切酶EcoRI、SpeI、HindIII、RsrII、AvaII和Notl乂人新英才各兰Biolabs(Ipswich,MA,USA)购买。病毒原种利用ExpressionSystems杆状病毒滴定分冲斤来进4亍;农度测定。将IgG2A-PE(BDBiosciences,SanDiego,USA)l:lO稀释并用作同种型对照。杆状病毒滴度利用FACS采集和分析而确定。BectonDickinsonBiosciencesFACSCalibur3(四色、只又;敫光)采集纟田月包，并采用CELLQuestPro3寿欠^f牛(BDBiosciences)分才斤凄t据。由ExpressionSystems提供微软Excel电子表格，以输入数据并才艮据标准曲线确定病毒滴度。纯4t利用Ni-NTASuperflow3(Qiagen,Hilden,Germany)和ToyopearlSuper650C(TosohBiosciences,GroveCity,OH,USA)来实施。用于制备十二烷基好u酸钠聚丙晞酰胺凝月交电泳(SDSPAGE)的30。/o丙烯酰胺;容液乂人Bio-Rad(Hercules,CA，USA)购买。页蓝3染料、5x加样緩冲液、页蓝3预染的蛋白梯和20X还原剂乂人Fermentas(Burlington,ON,Canada)购买。Hybond3ECL硝'基纤维素和ECLWestern检测试剂盒(GEHealthcare)用于蛋白质印迹。吐温20、溴化十六烷基三曱基4妄(CTAB)、抗小鼠IgG(Fc特异)辣才艮过氧化物酶轭合的抗体、抗小鼠(Fab特异)辣才艮过氧化物酶轭合的第二抗体、羊抗兔辣根过氧化物酶轭合的第二抗体以及抗生素卡那霉素、氨千西林和庆大霉素从Sigma(St丄ouis，MO，USA)购买。兔抗NS5A、羊抗NS3和羊抗NS4多克隆^t体以及鼠抗NS5A单克隆抗体乂人Abeam(Cambridge,MA,USA)获4寻。6xHis-束才艮过氧化物酶轭合的单克隆抗体从Clontech(PaloAlto,CA,USA)购买。Slide-a画lyzer3盒式录4象带(cassette)和MicroBCA3分^N式剂盒乂人Pierce(Rockford,IL,USA)购买。Pro-QEmerald300并唐蛋白;疑月交和BlotStaini式剂盒乂人MolecularProbes(Carlsbad,CA,USA)购买。来自健康供者的白细胞分离法样品从SeraCareLifeSciences(Oceanside,CA,USA)购买。用于T细月包阴性分离的DynalDynabeads3乂人Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)购买。含L-谷氨酰胺、石克酸链霉素(50)Lig/mL)和碌u酸庆大霉素(10jig/mL)的AIMV⑧i咅养基/人Invitrogen获4寻。匹酉己的供者血清乂人Ficoll-Hypaque血液制备物离心后的血清馏分获得。将血清(浓度为50%/AIMV⑧培养基)热灭活、等分并储存于-20。C。Dulbecco磷酸緩冲盐(PBS)从Invitrogen获得。具有下列特异性的轭合单克隆抗体(mAbs)从BDBiosciences(SanDiego,CA)获得CD64-异碌u氰酸焚光素(FITC)、CD32-R-藻红蛋白(PE)、CD16-PE、CD206國PE-Cy5、CD80-PE、CD86-FITC、CD83-PE、CD40-FITC、CDllc-PE、CD14-FITC、CD19-F1TC、CD3-FITC、CD3-PE、CD3-别藻蓝蛋白(APC)、CD8-PE腸Cy5、CD4-APC、CD69-FITC、CD69-APC、HLA画ABC-FITC、HLA-DR-PE、IFN-y-PE、TNF-a-PE、grB-FITC、pfn-FITC和小鼠IgGl隱生物素。生物素化抗6xHis从Qiagen(Mississauga，Ontario,Canada)获得。羊抗兔IgG画生物素抗体来自JacksonImmunoResearchLaboratories(WestGrove,PA)。鼠同种型mAbs和SA-PE-Cy5乂人BDBiosciences获得。混合的同分异构体5-(和6-)二醋酸羧基焚光素、琥询酰亚胺酯(succinimidylester)(5(6)-CFDA，SE;CFDA)从Invitrogen获得。通过使用特异性PE轭合的四聚体(BeckmanCoulter,Mississauga,Ontario,Canada)或五聚体(Prolmmune,Springfield,VA)测定T细胞对抗原的特异性。所使用的五聚体包括HCVNS5A肽VLSDFKTWL(SEQIDNO:3)/HLA画A2和HCVNS3肽CINGVCWTV(SEQIDNO:4)/HLA_A2。所4吏用的四聚体包4舌EBV肽GLCTLVAML(SEQIDNO:5)/HLA-A2、HCVNS3肽KLVALGINAV(SEQIDNO:6)/HLA-A2和阴性对照四聚体(多等位基因的)。下列细月包因子乂人R&DSystems(Minneapolis,MN):白介素-ip(IL-ip)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子I(TNF-ot)、干扰素-K(IFN-y)和干扰素-i(IFN-ot)购买。才艮据制造商的说明重建细胞因子、等分并储存于-70。C。聚IC从Sigma荻得。WaveBioreactorSystem23/10EH和Cellbag10L/O乂人WaveBiotech(Somerset,NJ"USA)购买。方法表达质4立构建。FastBacHTa-TBD,亲代质粒构建体编码CHl-铰链-CH2-CH3区氨基酸的小鼠IgGlDNA序列由从杂交瘤2C12分离的mRNA生成，所述杂交瘤2C12产生抗HBV表面抗原(sAg)的mAb。总m脂A利用TRizol试剂分离，而TBD的cDNA通过利用SuperscriptFirst-StrandSynthesis的RT-PCR而生成。PCR引物包含连4妄子序列，该连4妄子序列编码5'末端的连4妻肽-SRPQGGGS-(SEQIDNO:l)、5'末端独特的NotI位点和3，末端独特的HindIII限制性位点。得到的cDNA包含(5'-Notl)-连接子序列-部分CH1(VDKKI;SEQIDNO:2)-CH2-CH3(3，HindIII)。用各个酶消化后，利用相同的限制性酶切位点将片段与pFastBac-HTa表达载体质粒相连接。用于PCR扩增的5'引物是(正义)5，-TGTATTGTGCCAGG-3，(SEQIDNO:7)，并且3，引物是(反义)5'IDNO:8)，其分别含有NotI和HindIII位点。将扩增的DNA用Notl和HindIII消化，所述片段通过琼脂糖凝胶纯化并与用相同限制性酶消化的pFastBac-HTa表达载体质粒相连接，以生产表达载体质粒pFastBacHTa-TBD。该产物用于表达所述融合蛋白6xHis标签-rTEV蛋白酶切割位点-TBD。通过标准测序法来验证DNA序列及开》丈阅读冲匡架(ORF)的准确性。pFastBacHTa-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQIDNO:9)及由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:10)在图2中示出。pFastBacHTa-gp64的构建为了分泌、，4夸来自苜藉^艮纟丈夜虫我(ca/z/orw'ca)才玄型多角体病毒(AcNPV)gp64蛋白的信号序列克隆入pFastBac-HTa中。合成两种寡核苷酸并将其复性(对合，anneal)在一起。所述寡核香酸序列是5，-GCATGGTCCATGGTAAGCGCTATTGTTTTATGCAGGTACGGTCCGATGC-3'(SEQIDNO:11)和5'-GGACCATGC-3，(SEQIDNO:12)。所述寡核苷酸包含5，Avail位点和3，RsrlI位点。在用Avail和RsrII消化以后，将该片卓殳克隆入Rsrll消4匕的pFastBac-HTa中，该消4匕的pFas氾ac-HTa将所述gp64信号序列置于6xHis标签的紧邻上游，以生成pFastBacHTa-gp64。pFastBacHTaHCVNS5AChimigen疫苗融合蛋白表达载体质jf立的构建利用PCR法从质粒pCV-H77C模板得到编码HCVNS5A片段的DNA。用于PCR的5，引物是含有限制性酶EcoRI位点的(正义)5,一CCGGAATTCTCCGGTTCCTGGCTAAGG-3'(SEQIDNO:13)。用于3，末端的PCR引物是含有限制性酶SpeI位点的(反义)5，_GGACTAGTCCGCACACGACATCTTCCGT-3，(SEQIDNO:M)。扩增的DNA用各个酶消4b并连4妾于pFastBacHTa-TBD,以生成表达质粒pFastBacHTaHCVNS5AChimigenTM疫苗(或pFastBacHTa画NS5A画TBD)。核苷酸序列(SEQIDNO:39)和由pFastBacHTa-NS5A-TBD中ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:40)在图3中示出。对于仅NS5A，将该NS5A片段连接入EcoRI/SpeI消化的pFastBac-HTa，以生成pFastBacHTa-NS5A。用于分泌的pFastBacHTa-g。64NS5AChimigenTM疫苗表达质4立的构建为了将NS5AChimigen疫苗克隆入pFastBacHTa-gp64中，用RsrII和HindIII消化质粒pFastBacHTaHCVNS5AChimigen疫苗(如上所述)，并且所述NS5AChimigenTM疫苗片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化。将NS5AChimigen疫苗片段连接于RsrII和Hindffl消化的pFastBacHTa-gp64质粒，以得到pFastBacHTa-gp64HCVNS5AChimigenTM疫苗(pFastBacHTa-gp64-NS5A-TBD)表达质粒(IDAC登录号111006-04)。pFastBacHTa-gp64-NS5A-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQidNO:41)和由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:52)在图4中示出。用于分泌的pPSC12-NS5A-TBDChimigenTM疫苗表达质粒的构为了促进NS5AChimigenTM疫苗分子的分泌，将其克隆入质粒pPSC12(ProteinSciencesCorporation)中。该质并立具有来自斥干4犬病毒苜蓿银紋夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的曱壳酶基因信号肽。将感兴趣基因克隆入转移载体需要四种PCR引物。感兴趣基因利用两种独特引物扩增(引物〗gtitctaacgcgtcgtactaccatcaccatcac(seqidNO:i5)和2CCGGGGTACCTTACAGCCCAGGAGAGTGGGAGAG(SEQIDNO:16))。扩增多面体上游区i或需要两种不同的引物，所述区域包括上游多面体启动子和信号肽序列(引物3ctggtagttcttcggagtgtg(seqidno:17)和4ggtagtacgacgcgttagaaacggcgaccaac(seqidno:，8))最终，将两种外部引物(引物3和2，上述序列)用于关键的重叠延伸PCR中。NS5A-TBD利用引物1和引物2通过PCR从pFastBacHTa-NS5A-TBD扩增而来，其中引物1包含将与引物4的5，末端退火的序列，而引物2则添加了3，Kpnl位点，用于克隆入载体中。pPSC12的上游多面体区域通过引物3和引物4扩增，所述引物允许其在重叠延伸PCR过程中退火于引物1的3，末端。该上游区域还包含独特的NgoMIV位点，该位点用于克隆入载体中。所述上游多面体启动子、信号肽序列、以及期望基因通过利用引物2和3的重叠延伸PCR而严密地融合。全长融合产物用NgoMIV和KpnI消化，并将得到的片段连接入同样消化的pPSC12,以生成pPSC12-NS5A-TBD。pPSC12隱NS5A-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQIDNO:42)和由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:53)在图5中示出。pFastBacHTaHCVNS3Chimigen疫苗质粒的构建编码NS3的DNA利用下列引物通过PCR从质粒pCV-H77C才莫才反(HCV多蛋白的氨基酸1027至1652(nt3420至5294))生成。NS3C末端最后6个氨基酸未包括在该构建体中，这是因为该序列是NS3丝氨酸蛋白酶活性的靶序列。所使用的5，末端引物是含有EcoRI限制性位点的5'-CCGGAATTCGCGCCCATCACGGCGTA-3，(SEQIDNO:19),而3,末端引物是含有SpeI限制性位点的5，-CCGGACTAGTCCGGCCGACATGCATGTCATGAT-3，(SEQIDNO:20)。用EcoRI和SpeI进行双消化，得到的产物与质粒pFastBacHTa-TBD连接，以生成pFastBacHTaNS3-TBD。pFastBacHTaHCVNS3Chimigen疫苗质粒载体的i秀变Shojietal.[(1999)Virology254:315-323]已经才艮道了当在昆虫细胞中表达时，NS3蛋白的内部切割发生于1488位的精氨酸残基，可能由细胞蛋白酶介导。重叠延伸(OE)PCR用来产生氨基酸精氨酸至丙氨酸的突变，从而避免这样的NS3Chimigen蛋白中NS3部分的切割。乂人亲^CpFastBacHTaNS3-TBD质并立生成两个NS3DNA片,殳。5，NS3片l殳通过含Ecori卩艮制性位点的引物5，-ccggaattcgcgcccatcacggcgta-3，(SEQidNO:19)和突变引物(含精氨酸至丙氨酸的突变)5，-ctgccagtcctgcccgcgcgttgagtcctggag-3，(seqidNO:21)。3，NS3片,殳通过5，引物5，-ggcaggactggcagggggaagccaggcat-3，(seqidno:22)和含SpeI限制性位点的3，引物5，-CCGGACTAGTCCGGCCGACATGCATGTCATGAT-3，(SEQIDNO:20)而生成。OEPCR通过5，和3，NS3片段以及所述两个外部引物而实现。用EcoRI和Spel进4亍双消化，得到的产物可与质粒pFastBacHTa國TBD连4妄，以生成pFastBacHTaNS3mut-TBD(IDAC登录号111006-05)。pFastBacHTaNS3mut-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQIDNO:44)和由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:55)在图7中示出。预测该蛋白的分子量是98.3kDa。对于仅NS3mut，通过EcoRI和SpeI消化而分离NS3mut片段，并克隆入pFastBac-HTa中，以生成pFastBacHTa-NS3mut。pFastBacHTa邻64HCVNS3mutChimigen疫苗载体质粒的构建将pFastBacHTaHCVNS3mut-TBD质粒用RsrII和HindIII限制酶消化，并将该NS3mut-TBD片段克隆入RsrII和HindIII消化的pFastBacHTa-gp64中，以生成pFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD(IDAC登录号111006-02)。pFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD中ORF的核芬酸序列(SEQIDNO:45)和由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:56)在图8中示出。预测该蛋白的分子量是101.5kDa。将类似于用来制备pFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD(但缺乏自发突变并包含另一个)的片,殳的突变NS3mut-TBD片l殳克隆也连4妄入pFastBacHTa-gp64中，以生成第二克隆pFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD。第二克隆pFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD中ORF的核香酸序列(SEQIDNO:43)和由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:54)在图6中示出。pFastBacHTaHCV多抗原Chimigen融合蛋白表达载体质粒的构建为了制备HCV多抗原载体质粒，首先克隆NS4B-NS5A序列。其中利用用于5，末端的引物5，-GCGCACTAGTGTCTCAGCACTTACCGTACATC-3，(SEQIDNO:23)和用于3，末端的5,-CGGCGCGGCCGCCCGCAGCACACGACATCTTCCG-3，(SEQIDNO:24)。利用这些引物的PCR得到的产物具有独特的限制性酶切位点5，末端SpeI位点和3，末端NotI位点。用SpeI和NotI消化该PCR产物，并连4妻入SpeI和NotI消化的pFastBacHTa-gp64中，以生成pFastBacHTa-gp64NS4B-NS5A。4妻着，将TBD部分添至构建体中。用SpeI和HindIII消化质粒pFastBacHTa-TBD和pFastBacHTa画gp64NS4B-NS5A。分离SpeI/HindIU消4匕的TBD并连接至所述消化的pFastBacHTa-gp64NS4B画NS5A,以生成pFastBacHTa-gp64NS4B-NS5A-TBD。NS3活性位点丝氨酸残基的诱变在NS3中，将活性位点丝氨酸(serl165)突变为丙氨S交，以使蛋白酶活性失效。利用四种不同引物(两种巢式引物，两种互补于5，和3，末端的引物)，以pFastBacHTa-gp64NS3mut-TBD作为模板，通过OEPCR生成两种NS3片段。5，NS3片段利用含限制性酶EcoRI4立点的5，末端引物(正义)5，CCGGAATTCGCGCCCATCACGGCGTA-3，(SEQIDNO:19)和突变引物(含ser画ala突变)(反义)5，-CAACAGC(3GACCCCCCGCGGAGCCTTTCAAGTAC}-3,(SEQIDNO:25)来生成。3，NS3片革殳利用5，末端引物(正义)5，GTCCGCTGTTGTGC:CCCGCGGGACACG-3，(SEQIDNO:26)和含限制性酶SpeI位点的3，末端引物(反义)5，"CCGGACTAGTCCC3GCCGACATGCATGTCA-3，(SEQIDNO:27)来生成。全长NS3(ser1165—ala)通过OE-PCR从5，和3，片段和两种外部引物生成。得到的具有在Argl488突变为Ala以及在Serl165突变为Ala的产物称为NS3mutS。将该片革殳克隆入pFastBacHTa-gp64中，以生成FastBacHTa-gp64-NS3mutS-TBD(IDAC登录号111006-001)。pFastBacHTa-gp64HCVNS3-NS4B-NS5A多抗原融合蛋白载体质j^的构建为了制备可用于表达融合蛋白HCVNS3mutS-NS4B-NS5A的构建体，用限制性酶EcoRI和SpeI消化所述NS3mutSOE-PCR产物。将消化的NS3mutS连接入EcoRI和SpeI消化的质粒pFastBacHTa-gp64NS4B隱NS5A-TBD中，以制备pFastBacHTa-gp64NS3画NS4B-NS5A画TBD(IDAC登录号111006-06)，其是pFastBacHTa-gp64HCV多抗原质斗立。pFastBacHTa-gp64NS3-NS4B-NS5A-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQIDNO:46)和由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:57)在图9中示出。pFastBacHTa-gp64HCVNS3-NS5A多抗原融合蛋白载体质粒的构建通过PCR乂人才莫才反pFastBacHTa-gp64HCVNS3-NS4B-NS5A-TBDChimigen疫苗融合蛋白表达载体质粒生成用于HCVNS5A和TBD的DNA。用于PCR的5，引物是含有限制寸生酶SpeI的i口、另'J^f立点的(正义)5，-gagggactag丁gtccggttcctggctaagggac-3，(seqidno:28)。用于3，末端的PCR引物是(反义)5，-ccggtctagattatgatcctctagtacttctcgac-3，(seqidNO:29)。将PCR产物(NS5A-TBD)用凝月交纯化，随后用SpeI和Hindni限制性酶消化。用限制性酶SpeI和HindIII消化质粒pFastBacHTa-gp64NS3-NS4B-NS5A-TBD，释放由编码HCVNS4B-NS5A和所述TBD的序列组成的片,殳。将得到的pFastBacHTa-gp64HCVNS3载体骨架经凝胶纯化并连接至所述NS5A-TBD片4殳，以生成表达质4立pFastBacHTa-gp64HCVNS3-NS5AChimigen疫苗(pFastBacHTa-gp64NS3-NS5A画TBD)(IDAC登录号111006-03)。pFastBacHTa画gp64-NS3画NS5A-TBD中ORF的核香酸序列(SEQIDNO:47)和由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:58)在图10中示出。pFastBacHTaHCV核心(1-177)画TBD融合蛋白质4立和pFastBacHTaHCV核心(1-177)的构建编码HCV多蛋白的氨基酸1-177(nt342-872)的HCV核心DNA序列通过PCR利用5，引物CGGAATTCATGAGCACGAATCCTAAAC(SEQIDNO:30)和3，引物GGACTAGTCCGAAGATAGAGAAAGAGC(SEQIDNO:3i)从pCV-H77C来扩增。所采用的引物添加了独特的5，EcoRI和3，SpeI位点。将PCR产物用EcoRI和SpeI消化并连4姿入pFastBacHTa-TBD和pFastBac-HTa中，以分别生成ChimigenTM疫苗构建体pFastBacHTaHCV核心(1-177)-TBD和pFastBacHTaHCV核心(1-177)。pFastBacHTaHCV核心(1-177)-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQIDNO:48)和由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:59)在图11中示出。为了生成分泌形式的蛋白，将HCV核心(1-177)克隆入pFastBacHTa-gp64和pPSC12中。为了克隆入pFastBacHTa画gp64中，将HCV核心(1-177)-TBD片,殳通过RsrII和HindIII消化而从pFastBacHTaHCV核心(1-177)-TBD中分离出来，并克隆入同样消化的pFastBacHTa-gp64中，以生成pFastBacHTaHCV核心(1-177)-TBD。为了克隆入pPSC12中，采用与如NS5A-TBD所述类似的方案，只是引物2编石马独净争的3，BglII4立点(AGTAAGATCTTTACAGCCCAGiGAGAGTGGGAGAG;SEQIDNO:32)。得到的构建体是pPSC12-HCV核心(1-177)-TBD。pFastBacHTaHCVE1-TBD融合蛋白质粒和pFastBacHTa-El的构建编码HCV多蛋白的氨基酸192-369(914-1452)的DNA序列通过5，引物CCGGAATTCTACCAAGTGCGCAATTCCT(SEQIDNO:33)和3，引物GCGCACTAGTCCCTTCGCCCAGTTCCCCACC(SEQIDNO:34)乂人pCV-H77C而扩增，所述引物添加独特的5，EcoRI位点和独特的3，Spel位点。整个El开放阅读框架终止于氨基酸383，但氨基酸370至383之间的区域是E2的信号序列，因此不被扩增。用EcoRI和SpeI消化PCR产物，并连4妄入同样消化的pFastBacHTa-TBD中，以生成HCVElChimigenTM构建体pFastBacHTa-El-TBD。为了仅表达El,将消化的PCR产物克隆入EcoRI和SpeI消4b的pFastBac-HTa中，以生成pFastBacHTa-El。pFastBacHTa-El-TBD中ORF的核苦酸序列(SEQIDNO:49)和由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:60)在图12中示出。pFastBacHTaE2-TBD融合蛋白质粒和pFastBacHTa-E2的构建从氨基酸384至718(HCV多蛋白的nt1494-2495)的E2序列利用PCR通过5，引物GCGCACTAGTCACCCACGTCACCGGGGGAAATG(SEQIDNO:35)和3，可I物GCGCGCGGCCGCCCGTACTCCCACTTAATGGC(SEQIDNO:36)从pCV-H77C而扩增，所述引物添加独特的5，SpeI4立点和独特的3，Notl位点。氨基酸719至746是p7的信号序列，因此不包括在构建体中。用SpeI和NotI消化PCR产物，并连接于同样消化的pFastBacHTa-TBD,以生成HCVE2ChimigenTM构建体pFastBacHTaE2-TBD。为了仅表达E2蛋白，将消化的E2也克隆入pFastBac-HTa中，以生成pFastBacHTa-E2。pFastBacHTaE2-TBD中ORF的核苦酸序列(SEQIDNO:50)和由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:61)在图13中示出。pFastBacHTa-E1-E2-TBD融合蛋白质#立和pFastBacHTa-E1-E2的构建El和E2的融合蛋白通过将pFastBacHTa-El中的El序列亚克隆入pFastBacHTa-E2中而生成。将该pFastBacHTa-El质粒用EcoRI和SpeI消化，并将片,殳克隆入EcoRI和SpeI消化的pFastBacHTa-E2中，以生成pFastBacHTa-El-E2。为了制备E1画E2ChimigenTM构建体，将pFastBacHTa-El-E2用EcoRI和NotI消化，并克隆入同才羊消化的pFastBacHTa-TBD中，以生成pFastBacHTa-El-E2-TBD。pFas氾acHTa-El-E2-TBD中ORF的核芬酸序列(SEQIDNO:51)和由该ORF编码的氨基酸序列(SEQIDNO:62)在图14中示出。在8&010-830@表达系统中生成重组杆状病毒五.co/,'的转化已连接的质粒用来转化五.co//DH5oc，并通过标准方案来分离质粒。序列和开放阅读框架通过测序一验证，并用于生成重组杆状病毒。转座(转位)重组体的生成基于Bac-to-Bac⑧克隆系统(Invitrogen),该系统利用具有细菌转座子Tn7的位点特异性转座。这可在Eco//菌抹DH10Bac内实现。所述DH10Bac细月包包含杆粒pMON14272和辅助质粒(pMON7124)，其中杆粒pMON14272赋予对卡那霉素的耐药性，而辅助质粒编码转座酶并赋予四环素抗性。将感兴趣基因克隆入pFastBac质粒中，该质粒具有位于克隆位点侧翼的mini-Tn7元件。将质粒转化入具有杆状病毒穿梭质粒(杆粒)的五.co//菌抹DH10Bac，其中所述杆状病毒穿4炎质粒(在LacZoc基因内含有Tn7的附着位点。转座破坏LacZot基因，以致仅重组体产生白色克隆，因此易于选择。在五.co//中4吏用转座的优势在于单个克隆4义包含重组体。该重组杆粒利用标准质粒分离步骤而分离，并用于转染入昆虫细胞中，以生成表达重组蛋白的杆状病毒。Donor(供体)质粒和pFastBacHTa-gp64ChimigenTM疫苗载体用于将克隆的基因位点特异性地转座入杆状病毒穿梭载体(杆粒)中。将含有感兴趣基因的重组pFastBacHTa-gp64质粒转化入DH10Bac细胞中用于转座以生成重组杆粒。将40|aL等份的感受态DH10Bac细胞在冰上解冻，加入基于pFastBacHTa-gp64的质粒，并通过电穿孔进行转化。将转化混合物加入到1mL的SOC培养基(介质)中，并在37。C下孵育4小时。所述转化的细胞(变异细胞)用LB连续地稀释至10"和l(T2，并将100(_iL的每种稀释物涂于LB琼脂平一反上，该琼脂平板中补充了卡那霉素(50ng/mL)、庆大霉素(7ng/mL)、四环素(10昭/mL)、X-gal(200pg/mL)和IPTG(40(ig/mL)，并在37。C下將育至少36小时。庆大霉素抗性由所述pFastBacHTa-gp64质粒U武予，而X-gal和IPTG用来将白色克隆(重组杆粒)与蓝色克隆(非重组)区分开。挑选白色克隆并接种入2mL的LB中，该LB中补充了卡那霉素(50Hg/mL)、庆大霉素(7pg/mL)和四环素(10(ag/mL),并在37。C下振荡孵育过夜。用无菌环来取少量过夜培养物，并将该样品划线在新鲜LB琼脂平氺反上，该琼脂平^^中补充了卡那霉素(50|dg/mL)、庆大霉素(7pg/mL)、四环素(10ng/mL)、X-gal(100pg/mL)和IPTG(40|ag/mL)，并在37。C下孵育至少36小时以确定白色表型。通过标准方案来分离重组杆粒[Sambrooketal.(2001)InMolecularCloning,ALaboratoryManual.ColdSpringHarborPress],将DNA才羊品;容解于40的TE(10mMTris-HClpH8,lmMEDTA)中并用于转染。转染重组杆状病毒的产生为了产生重组杆状病毒，将相关杆粒转染入Sf9昆虫细月包中。一寻Sf9细月包(9x105)4妻种于6孑L细月包i备养皿(35mm孑L)的每一个孑L的2mLESF921内，并允许其在27。C下贴附至少1小时。通过Sf9细胞供应商提供的方案，利用Cellfectin⑧试剂进行转染。转染后，将所述细胞在27。C下孵育72小时。收集含杆状病毒的培养基并在4。C下^f渚存于暗处。通过检查杆状病毒DNA的产生，确定转染效率。对分离的杆状病毒DNA进行PCR,以筛选感兴趣的插入基因。利用6xHis标签-HRP扼合的单克隆抗体或抗小鼠IgG(Fc特异)辣才艮过氧化物酶轭合的抗体作为探针，细胞内异种蛋白的表达可通过SDS-PAGE禾口蛋白质印迹而马全i正。重组杆状病毒原种的扩增一旦已经确认了杆状病毒的生成和期望蛋白的表达，则增大病毒浓度，以生成携带感兴趣基因的浓缩杆状病毒原种。在本文所描述的所有方案中，均遵循将杆状病毒扩增至少两次的标准操作。第二專仑扩增后，利用^N犬病毒滴定分才斤(ExpressionSystems)定量所生成的杆状病毒的浓度。还建立了感染Sf9细胞的最适合病毒浓度以及用于生成期望蛋白的最佳时间。才艮据标准步"^骤，开发用于单层以及悬浮培养的Sf9细力包表达的方案。杆状病毒滴定分才斤所有的病毒原种均利用ExpressionSystems斥干状病毒滴定分牙斤来测定浓度。将病毒原种^人10"至10-4连续进4于稀释。将100等7分的每种,希释才羊品力口入到CostarLowAttachment396孑14反的孑L内，随后，将100[xL的Sf9细胞以2x1(^细力包/mL的浓度加入到每个孔内，并在27。C下将该板在振荡摇床孵箱中以200-250rpm孵育18小时。孵育后，将gp64-PE辄合的抗体1:200稀释，并将同种型对照(IgG2A-PE)1:10稀释。将该—反以1800rpm离心3分钟。通过翻转板来去除培养基，并往孔内加入50jaL的gp64-PE轭合的抗体或50jiiL的同种型对照。随后将该^反在4'C下在暗处孵育20分钟。通过向每个孑L内力口入150fiL冷PBS并^。上文所述离心板而;先涤细胞。接着，向每个孑L内力口入200(aL的冷PBS,随后另一旋转，最后向每个孔内加入200nL的PBS/O.1%BSA以重悬细胞并转移至FACS管中用于分析。所述同种型对照用来在荧光流式细胞仪上i殳定门(gate)。通过将表达阳性细胞群的百分比插入到所^是供的Excel电子表格中并生成一条基于对照病毒的标准曲线而确定病毒浓度。蛋白表达的优化将ChimigenTM蛋白表达在一定的MOI和时间范围内优化。将ESF921中的4^f分50mL的Sf9细胞培养物以2xio6细月包/mL4妻种并以0.5、1.5和10的MOI感染，在感染后的不同时间点收集1mL的培养物。将取^羊的培养物以12,000xg离心1分钟，并分离上清液和细l包。立即制备细胞和上清液用于SDS-PAGE分析。将细力包重悬于500jaL的PBS中，并将150(iL的悬浮液加入到40pL5x加样緩冲液和10[iL20x还原剂中。此夕卜，将150fiL上清液与405x加样緩冲液和1020x还原剂混合。将才羊品煮沸5分钟，并加样到12%SDS-PAGE凝胶上用于蛋白质印迹分析。经评估，对于NS5AChimigenTM蛋白，蛋白生成以36小时和0.5MOI为最适；对于NS3ChimigenTM蛋白，以48小时和2MOI为最适；而对于多抗原ChimigenTM蛋白，则以36小时和1.5MOI为最适。细胞内ChimigenTM疫苗的纯化NS5AChimigen蛋白的大量表达以及细胞裂解物(溶解产物)的制备在ESF921培养基中的5升Sf9细胞培养物(密度约2x106细胞/mL)用杆状病毒以0.5MOI感染。当细胞存活达约95°/。时，在感染开始后约36小时收获细胞。较长的表达时间导致细胞生存力丧失增加以及NS5AChimigenTM蛋白强烈降解。通过离心收集感染细胞并^f诸存在-8(TC下直到^f吏用。通过在;水上在200ml含高)农度。土温20的裂解IC沖液(6MGuHCl,50mMNaH2PO4，0.5MNaCl，1%吐温20,10mMP-3克基乙醇，pH8.0)中旋涡，将来自1L感染细胞培养物的冰冻沉淀迅速重悬。高浓度的吐温20对于NS5AChimigenTM蛋白与Ni-NTA树脂的有效结合是必需的。将重悬的悬浮液在冰上超声处理3次，每次1分钟，其中每次超声脉冲之间的间隔为2分钟。随后将超声处理的裂解物在室温下搅拌2小时。搅拌的裂解物通过离心(约27,000xg，15分钟，l(TC)而澄清，并将上清液用于在Ni-NTAsuperflow上亲和层析。NS3ChimigenTM蛋白的表达以及细胞裂解物的制备使用标准化的感染多重性(MOI)的编码HCVNS3Chimigen蛋白的重组杆状病毒来感染Sf9昆虫细胞用于表达。将Sf9细胞以6xl05细月包/mL的密度4妄种于2LErlenmeyer并瓦中的500mL的ESF921培养基中。将该细胞培养物在27.5。C下以120rpm振荡孵育，直到细胞密度达到2-3x1()6细胞/mL。对于HCVNS3Chimigen蛋白，将细胞以MOI2感染48小时。对细胞裂解物进行蛋白质印迹分析，用于监测感兴趣蛋白的表达。通过在4。C下以3000rpm(1593xg，JA10,BeckmanCoulterAvantiTMJ25)离心10分4中来收获细胞，并将新鲜细胞沉淀用于纯化重组蛋白。可替换地，用条件培养基重悬细胞沉淀，分散于50mL锥形管(每管250mL细胞i咅养物)中，在4°C下在BeckmanGS-6R离心才几中以2,200rpm^走转8分钟。将细胞沉淀快速冰冻于液氮中，并储存于-8(TC。通过78W(设置为(setting)6.5)超声处理1分钟，将冰冻细胞沉淀(相当于2x500mL细胞培养基)重悬于200mL冰冻裂解緩沖液(6MGuHCl，150rnMNaCl，20mMTris-HCl，pH8.00中的冰上。将该混合物转移至250mL玻璃烧杯中，并超声处理4次以上，每次1分钟，78W,且具有5分钟的冷却间歇期。将混合物移至室温，并加入CTAB至乡冬浓度为1%(w/v)。冲企查pH并调至pH8.00，并3寻裂解物孵育2小时。利用JA25.50转头在BeckmanAvantiJ-25离心机内将所述裂解物在10。C下以15,000rpm(27,000xg)离心30分钟，然后对上清液进4于Ni-NTA亲和层析。多抗原ChimigenTM蛋白的大量表达以及细胞裂解物的制备3夺4升ESF921i咅养基寿争移入Cellbag中，并在WaveBioreactorSystem2/10EH上力口热至27.5°C。^!寻1升Sf9细月包i咅养物以6xl06细胞/mL加入该Cellbag中。随后将该袋在27.5。C与注射空气(0.3L/min)—起孵育，并以130rpm振荡。当细月包密度达到2x106细胞/mL时，将重组杆状病毒以MOI1.5接种。注射后36小时，在冰上冷冻该袋，并通过在4。C下以4500xg离心10分钟而收获细月包。将细胞沉淀悬浮于冰冻PBS中然后转移至50mL锥形管(来自300mL;咅养物沉淀/管的沉淀)中。所述细胞沉淀通过在4°C下以2800xg离心15分钟而回收。该沉淀立即在液氮中冷冻，并i者存于-80。C水箱中直至使用。将来自250mL培养物的冰冻Sf9细胞沉淀悬浮于20mlIXPBS、1%吐温20、50mMDTT、5mMEDTA，pH8.0中，并于水上孵育30分钟。用NaOH将该裂解物的pH调至pH12.0,并在室温下搅拌30分钟。用HCl将pH降至8.0,并以39191xg离心30分钟。去除上清液，并将沉淀悬浮于20ml1XPBS、1%吐温20、10mMDTT、lmMEDTA，pH8.0中。如上戶斤述，将pH升至12.0然后降至8.0。收集上清液并对20mMTris、0.05%吐温20、O.lmMEDTA、10mM(3巯基乙醇，pH8.0(用于体积排阻(大小排阻)和疏水作用层析)透析。对于Ni-NTA亲和层析，将来自500mlJ咅养物的冰冻Sf9细月包沉淀悬浮于50mL冰冻裂解緩冲液(6M盐酸胍、50mM碳酸钠、20%乙醇，pH10)中。通过超声仪3000(MisonicInc.)将该细胞裂解物冰上以80W超声5次(1分钟)。将吐温20加入裂解物中(终浓度1%)，并在室温下搅拌该裂解物2小时。通过在4。C下以39191xg离心30分钟而去除裂解物中的不溶性颗粒，并进行Ni-NTA亲和层析。HCV核心ChimigenTM蛋白的表达以及细胞裂解物的制备HCV核心ChimigenTM在两种系统中表达。重组病毒通过在Sf9细胞内共转染pPSC12-HCV核心(1-177)-TBD和线性化杆状病毒基因组而生成、经空斑纯化并扩增。优化后，Sf9培养物以M015感染，并在27.5。C下孵育50小时后收获。重组病毒还可利用Bac-to-Bac⑧系统，通过用pFas但acHTa-gp64HCV核心(1-177)-TBD转染E.coliDH10Bac细胞而生成。分离重组杆并立并用来转染Sf9细胞以产生重组杆状病毒。将Sf9培养物以MOI5在27.5。C感染49小时，随后通过离心而收获。裂解物以与如上所述用于其他Chimigen蛋白基本相同的方式而制备，并进行Ni-NTA亲和层析。Ni-NTA亲和层析将细胞裂解物加样到Ni-NTAsuperflow柱(10ml杉于脂床体积/2.5L细胞培养物沉淀)，该柱已经用10倍床体积的裂解緩沖液加以平4軒。用含有百分比降低的吐温20的洗涤纟爰冲液(6MGuHCl,50mMNaH2PO4，0.5MNaCl，0.1%口土温20,10mMP3危基乙醇，pH8.0)的洗涤緩沖液洗涤该柱，直至A280<0.01，随后用含15mM咪唑的相同洗涤緩冲液进行洗涤。随后用10ml床体积的洗脱緩冲液(6MGuHCl，50mMNaH2P04,250M咪唑，0.1%吐温20,10mMP巯基乙醇，pH8.0)/床体积馏分来洗脱靶蛋白。收集包含洗脱蛋白的馏分并对透析緩冲液3x4L(8M尿素、20mMTris、0.1%口土温20、25mM氨茶石咸、10mMP画巯基乙醇，pH8.5)透4斤。所有含尿素的緩沖液均用去离子尿素制备，以防止蛋白氨曱酰化。尿素通过AmberiiteMB-1(Supelco，PA^USA)(!0g/L/hr)去离子，并向纟爰沖液中力口入氰酸盐清除剂乙二胺(终浓度25mM)。离子交换层析接下来，使通过Ni-NTA亲和层析获得的含已透析的NS5AChimigen3蛋白的样品通过已在透析緩冲液中平4軒过的ToyopearlSuperQ3树脂柱(2.5ml床体积/2.5L细胞培养物沉淀)。所述离子交换柱用离子交换洗涤緩冲液(8M尿素、20mMTris、0.05%吐温20、25mM乙二胺、10mM(3-巯基乙醇，pH8.5)洗涤直至A28。<0.01。随后用IO倍床体积含盐浓度递增(75mM、150mM和500mMNaCl)的洗涤緩冲液将蛋白从柱上洗脱。收集1倍床体积的馏分。该NS5AChimigenTM蛋白主要在150mMNaCl馏分中洗脱下来。轻纟鼓较低MW的污染蛋白则以75mMNaCl洗脱下来。收集洗脱的蛋白馏分，并在4。C下立即对最终透析i爰冲液(150mMNaCl、10mMNaH2PO4、0.05%吐温20，pH8.5)进4亍透析。每次透析2L，并更换5次透析緩冲液。将透析的蛋白通过已预湿的0.2pm滤器过滤,以防止蛋白黏连于此。纯化的NS5AChimigenTM蛋白储存于4。C。为了进一步冲是纯NS3Chimigen3蛋白，^1夺CM-S印harose3FastFlow基质用8M尿素(去离子)、25mMNaH2P04、5mM乙二胺、0.05%(v/v)口土5显20、10mMDTT,pH8.5力口以平#f。矛J用纟戋4生才弟度(0-至0.6M)氯化钠在相同ll冲液中以1mL/min的流速洗脱蛋白。收集含该蛋白的馏分(25-50mMNaCl)。将通过Ni-NTA柱捕获的含多抗原Chimigen3蛋白的样品进一步通过HiTrap3QXLlml柱利用AKTAexplorer3100FPLC系统而纯化。来自Ni-NTA亲和层析洗脱緩冲液中的蛋白通过AmiconUltra-15(MWCO30,000Da)浓缩，随后将该緩冲液换成緩冲液A(8M尿素、50mM碳酸钠、25mM乙二胺、1%吐温20，pH10)。将蛋白加样到HiTrapQ^XL柱上，用50ml的緩冲液A平衡，流速60mL/小时。用《爰冲液A洗涤该柱直至洗脱A280<0.01。蛋白通过线性梯度洗脱(100%緩沖液A至100%緩冲液B)在20倍柱体积中洗脱。HCV多抗原Chimigen蛋白在无逆流镏分(flow-throughfraction)和在40%至50%1￡沖液B之间洗脱的馏分中洗脱。尺寸排阻层析在3MPa压力下，利用AKTAexplorer100FPLC系统(GEhealthcare)将制备级Superdex3200填充于Tricon3柱10/300(1x30cm，PharmaciaBiotech)中。用100ml6M胍、50mM石友酸4内，pH10洗涤该柱。将0.5mL含Chimigen3多抗原蛋白的裂解物加才羊到Superdex200柱上。以30ml/小时的流速洗脱蛋白，并收集0.5mL馏分。通过在280nm处的吸收监测蛋白洗脱。疏水作用层冲斤S夸Phenyl-650CToyopearl(0.5mL,TOSOHCorp.)装载到Poly-prep柱(Bio-Rad)中。该柱用20mLHIC结合纟爰沖液(0.1MTris、2M氯化钠，pH8)进行平^"。将终浓度为2M的氯化钠加入到0.5mL含Chimigen3多抗原蛋白的裂解物中，并用3.5mLHIC结合緩冲液稀释该拔jf又物。通过以18,000rpm(39,191xg,利用JA25.50转子，BeckmanColuterAvantiJ-25离心才几)离心20分4中而除去不;容性颗粒。将上清液以30mL/小时的流速通过重力流加样到柱上。随后，用10mLHIC结合纟爰冲液洗涤该柱，并用5mLHIC洗脱緩沖液(8M尿素、50mM乙二胺、0.5%吐温20，pH10.5)洗脱结合于柱上的蛋白。纯化的ChimigenTM蛋白的生化评估按照制造商l是供的方案，利用MicroBCA3蛋白分析试剂盒以孩史板步骤评估蛋白浓度。对于SDS-PAGE分析，等份的纯化的蛋白通过加入5X蛋白加样緩冲液和20X还原剂而变性并煮沸5分钟。变性蛋白在12%SDS聚丙烯酰胺凝月交上分离，并在由生产商提供的条件下用页蓝3对该凝胶染色。对于蛋白质印迹分析，通过12。/。SDS-PAGE分离蛋白并利用含48mMTris石威、39mM甘氨酸、20%甲醇和0.0375%SDS的緩沖液将其电转染到Hybond3ECL3硝基纤维素膜上。该膜首先在室温下在封闭IC冲液(1%脱月旨乳、在PBS中的0.1%。土温20)中孵育1小时。将用于检测的抗体在封闭緩冲液稀释至期望浓度。在室温下，通过持续混合使该膜与稀释抗体一起孵育1小时。在与每种抗体孵育后，在室温下用封闭緩冲液冲洗该膜3次，每次冲洗10min。通过利用ECL3蛋白质印迹检测试剂盒的化学发光并暴露于KodakBiomaxXARX射线膜而进行蛋白才企测。为了定性才全测蛋白糖基化，使用由MolecularProbes开发的Pro-QEmerald3004唐蛋白凝月交和BlotStaini式剂盒。该试剂盒可以用于4企测在凝胶或印迹上已通过SDS-PAGE分离的蛋白上的糖类。该染料(stain)与大多数全蛋白染色兼容，并且如果需要，可利用质谱进行分析。当染料与高碘酸氧化的糖基相互作用时，产生亮绿色萤光信号，每条带均检测低至0.5ng的糖蛋白。该染料是高石典酸和Schiff法的一种改良，并且制造商宣称可达504咅高的每文感度水平。试剂盒中还包括CandyCaneTM分子量标准。该标准由改变糖基化和非糖基化蛋白(分别用作阳性和阴性对照)而构成。蛋白样品SDS-PAGE后，将凝胶在50%MeOH和5%醋酸中固定过夜。在3%冰醋酸中洗涤凝胶2次(20分钟)，随后在氧化溶液高石典酸中聚糖氧化30分钟。用3%冰醋酸洗涤凝胶3次(20分钟)，随后在新鲜Pro-Q3Emerald300染色液中暗处染色最长120分钟。成像前，还需要在3%冰醋酸中暗处再洗涤两个20分钟。染料的刺激/发射最大值是280/530nm,其中最佳可一见度在约300nm。利用GeneGenius(Syngene)透照器和相应寿欠件可一见^b并扫描凝月交。Chimigen疫苗的免疫学鉴定人PBMC(外周血单核细胞)PBMC通过白细月包分离制备物的Ficoll-Hypaque梯度离心而获4寻，所述制备物来自具有HLA-A2单元型(BiologicalSpecialtyCorporation)的非HCV感染个体。在液氮中，PBMC以3x107细月包/冷冻管4诸存于冻存培养基(50%HumanABserum，40%AIMV，和10%DMSO)中。单核细胞的分离并分化为未成熟DC(树突细胞)在100mm纟且织J咅养4反(BDBiosciences)上，S寻PBMC在37。C下在AIMV⑧培养基(含2.5。/。配型血清)中培养l小时。培养后，去除非贴壁细胞(非粘附细胞)，并用AIMV⑧培养基洗涤该板。随后用含IL-4和GM-CSF(每种1000IU/mL)的2mLAIMV/2.5%配型血清培养贴壁细胞。HCVChimigenTM蛋白与未成熟DC的结合未生熟DC是由在IL-4和GM-CSF存在的情况下i咅养单核细胞24-72小时而获得的。培养后，收获细胞，用含2.5%配型血清的AIMV㊣培养基洗涤一次，随后用含0.1%(w/v)BSA的Dulbecco石粦酸緩冲盐(Invitrogen)(PBSB)洗涤2次。所述细胞用来评估ChimigenTM蛋白的结合和内化。未成熟DC的表型通过标记多种细胞表面标记物而评估，该细月包表面标记物包4舌CD64、CD32、CD16、CD206、HLA-ABC、HLA-DR、CD14、CDllc、CD86、CD80、CD40、CD83、CD19、CD3、和CD4。对于结合分析，所有步-骤均在4。C下进^f于，孵育后进行洗涤。将细胞与不同浓度的Chimigen蛋白或相应的透析緩冲液一起在PBSB中卯孚育60min(96孑L>/-底*反，2x105纟田月包/孑L,体禾口、25孩吏升)。蛋白结合通过将细胞与生物素化抗小鼠IgGl或抗6xHis抗体在PBSB中一起孵育20min，随后SA-PE-Cy520分钟而检测。将细胞重悬于含2%低聚曱醛(PF)的PBSB中。在采用NS5AChimigen蛋白的实一睑中，通过:f关用兔抗NS5A多克隆抗体、羊抗兔IgG-生物素、SA-PE-Cy5来检测结合。将细胞重悬于含2%低聚曱醛(PF)的PBSB中，并通过荧光流式细胞仪(FFC)评估细胞结合。利用结合抑制剂鉴定用于ChimigenTM疫苗的DC受体将未成熟DC与抗CD32mAb(IgG2b同种型)、抗CD206(IgGl同种型)、或同种型对照小鼠IgG2b或IgGlmAbs—起在4。C下孵育60分钟。随后，将所述细胞与Chimigen疫苗一起在PBSB中4X:孵育60分钟。洗涤后，通过FFC分4斤，利用生物素化抗小鼠IgGlmAb或生物素化抗-6xHismAb以及随后的SA-PE-Cy5来4企测与该细月包的结合。荧光流式细胞4义(FFC)分析细胞通过装配有CellQuestPro采集和分析软件(BDBiosciences)的FACSCalibur而获4f。对活细月包群i殳定门，如通过FFC和SSC散射谱确定的，并采集了220,000个事件。特异性阳性细胞的百分比计算如下(阳性细胞一企测样品％-阳性细胞对照％)/(100-对照阳性细胞％)xioo。相对平均荧光强度(MFI)如下确定4全测冲羊品的MFU十照才羊品的MFI。4元原呈递分一斤(APA)APA用来测定T细i包对由APC所呈递的抗原的免疫应答。所述分析将功能性T细胞免疫应答以及抗原负载的成熟DC对诱导抗原特异性T细胞增殖的能力加以量化。步骤包括将PBMC衍生的单核细胞分化为未成熟DC、用抗原(ChimigenTM蛋白或TT)负栽该未成熟DC、将该未成熟DC分化为成熟DC以及随后将成熟的抗原负载的DC与自体幼稚T细胞一起培养。对于活化和增殖分析，培养7天后对T细胞进4于分析。为了分析T细胞功能和特异性，将T细胞用抗原负载的成熟DC再刺激两次，并评估IFN-y、TNF-a、粒酶B(grB)和穿孔素(pfn)的生成。T细胞对抗原的特异性用特异性MHCI类四聚体或五聚体进行评估。抗原负载的成熟DC的生成如上所述生成未成熟DC并与抗原或緩冲液(对照)一起孵育8小时。随后将该细胞与催熟剂polyIC(20|ag/mL)、重组人(rh)IL-l(K10ng/mL)、rhTNF画a(10ng/mL)、rhIL-6(10ng/mL)、rhIFN-aA(1000U/mL)和rhIFN-y(1000U/mL)—起培养16小时。所述DC的成熟程度通过表型分析而评估。将细胞标记多种细胞表面才示i己物，包4舌CD64、CD32、CD16、CD205、CD206、CD209、HLA-ABC、HLA-DR、CD14、CDllc、CD86、CD80、CD83、CD40、CD19、CD3、CD8和CD4。洗涤该成熟的抗原负载DC并将其与T细月包一起i备养。人PBMC(外周血单核细胞)衍生的T细胞的分离按照制造商的步骤，利用DynalBiotechT细胞阴性选择试剂盒(Invitrogen)通过阴性选才奪而/人PBMC中分离T细月包。4吏用匹配血清来代替BSA和FBS。通过多种细胞标记物的表型标记而评估分离细胞的表型。T细胞(CD3+细胞)构成所分离细胞群的98%以上。该T细胞用CFSE标记(见下文)，或直接加入到含有DC的细月包培养物中。T细月包的CFSE才示i己将新鲜分离的T细胞(1-5x107细胞)悬浮于500pl的PBSB中并与500jil新鲜制备的10iug/ml的CFSE工作贮存液混合。在37。C下孵育10min后，用含血清培养基(AIM￥@/10%匹配血清)充分洗涤细胞，以除去未结合的CFSE。T细月包的CFSE标记通过FFC而确定。人PBMC々f生的T细l包的i咅养将T细月包与抗原负载的成熟DC以AIMV/2.5%匹配血清中的1-20x104T细胞至1-5x1()4DC/孔的比例一起孵育。为了进行T细胞活化和增殖APA实—险，培养4天和7天后收获T细胞(见下文)。对于T细胞功能和特异性APA实验，将T细胞培养7天，随后用抗原负载的成熟DC再次刺激并再培养7天。随后将培养14天的T细月包分为两组(细月包内细月包因子(ICC)才反和四聚体4反)，并用抗原负载的DC进行第三次刺激。将1吗/mL布雷菲德菌素A(BDBiosciences)力口入到ICCIFN-y才反的孑L内，并将该细月包i咅养6小时。94IFN-y、TNF-a、grB和pfn的表达如下文所列出的进4亍评估。刺激后5-6天进行四聚体分析，如下文所述。T细胞活化和增殖分析为了活化/增殖APA,与抗原负载的DC—起培养4或7天后，收获T细胞。评估该T细胞的CD69(早期活化标记物)表达和CFSE强度(增殖程度)。用抗CD3-PE、抗CD3-PE-Cy5和抗CD69-APC标记收获的细胞。利用纟爰冲液对照样品可鉴定未经过^壬何倍增的T细胞群。在FL1通道中检测到标记有高度荧光的细胞群，并命名为CFSEhi。经过一次分裂的细胞群具有CFSEhi细胞群的MFI的一半。类似地，经过两次分裂的细胞群具有CFSEhi细胞群的MFI的约25%(小于4倍)。所具有的CFSE荧光低于CFSEhi荧光的细胞命名为CFSE1。。某些细胞群具有接近背景FL1通道荧光，并且可以称为CFSE-(CFSE阴性)。然而，为了此处所列出实验的目的，可认为T细胞是CFSEhi(无细胞分裂)或CFSE1。(至少一次细胞分裂)。T细胞活化通过评估CD69的表达而定量。在某些实验中，通过圏定高FSC和SSC强度CD3+T细胞而定量T母细胞。因此，与细胞群中小(GO)的静息细胞相比，细胞群中母细胞的相对数量表示为具有较大直径(FSChi)和较高细胞复杂度(SSChi)的细胞的比例。细月包内IFN-y、TNF-oc、grB和pfn的4企观'J利用标准ICC(细胞内细胞因子)方案(BDBiosciences),定量IFN-y和TNF-a的生成和丝氨酸蛋白酶#立酶B(grB)[Lobeetal.(1986)Science232:858-861]以及成孔蛋白穿孔素(pfn)[Hameedetal.(1992)Am.J.Pathol.140:1025-1030]的表达。简单的i兌，该过禾呈包4舌用特异性荧光染料扼合的mAbs标记所述细胞，用于^f企测CD3(抗CD3-APC)和CD8(抗CD8-PE-Cy5)，然后进行固定和渗透。随后将细月包才羊品分为两^f分，一份与抗IFN-y-PE抗体和抗-grB-FITC抗体一起孵育，而另一〗分与抗TNF-a-PE和抗穿孔素-FITC—起孵育。利用BDFACSCalibur，平均每份样品可采集到20,000-100,000个细胞。四聚体和五聚体分析将T细月包用抗CD8-PE-Cy5、抗CD4-APC和抗CD69-FITC抗体以及下列PE辄合的iTagTM四聚体(BeckmanCoulter)或五聚体(Prolmmune)中的一种进4亍才示"i己HCV鄉5A(VLSDFKTWL;SMQIDNO:3)HLA-A*0201,EBV(GLCTLVAML邻QIDN0:5)HLA-A*0201,HCVNS3peptide(ON(3VCWTV;SBQE)恥:4)H1AA*0201，HCV!NS3peptide(KLVALG1NAV;SEQIDN0:6)HLA-A*0201,以及一种阴性对照四聚体(多等位基因的)。利用FACSCalibur可采集到约100,000个细万包。通过共聚焦显孩t镜分析ChimigenTM蛋白结合、内化和加工利用共聚焦显微镜研究ChimigenTM蛋白被未成熟DC结合、内化和加工的过程。这些研究中所〗吏用的未成熟DC通过在GM-CSF和IL-4存在的情况下，使贴壁的PBMC起源单核细胞在含2.5%供体匹配血清的AIMV㊣培养基中分化2天而得到。第2天，将未成熟DC转移至腔室玻片，使用前再孵育一天。第3天，则选择为具有适当细月包表面受体和形态的细月包之间的中间物。为了研究ChimigenTM蛋白与DC表面的结合，将细胞用5Tg/mLChimigenTM蛋白或緩沖液(仅作为阴性对照)在4。C下在PBSB中孵育1小时。1小时后，用PBSB洗涤细胞并用生物素化的抗小鼠IgGl抗体标记，随后用抗生蛋白链菌素AlexaFluoKg)5^标记。每一个步骤之间均进行PBSB洗涤。标记并洗涤后，用4%低聚曱醛(在PBSB中制备)将细胞在4。C下固定10min。随后用含4',6-二脒基-2-苯基吲咮、二氢氯^:物(DAPI;Invitrogen)的SlowFadeGoJd抗淬灭剂封片，并将盖玻片用指甲油密封于所述玻片上。通过DC内化ChimigenTM蛋白(5Tg/mL)的研究可通过直接将该细胞在37°C(7%C02)含ChimigenTM蛋白的培养基中孵育，或通过首先在PBSB中在4'C下标记表面受体、洗去未结合蛋白，随后研究该受体结合的蛋白在37°C(7%C02)AIM￥@/2.5%匹配血清的i咅养基中随时间(0min、15min、60min和240min)的吸收。用PBSB洗涤在37。C下孵育的细l包，随后用BDBiosciencesCytofix/Cytoperm溶液固定并渗透10分钟。随后用在BDBiosciencesPerm/WashTM-容液中的生物素抗小鼠IgGl对细月包洗涤并标"i己(1小时)，"t妻着用^t生蛋白链菌素AlexaFhio滞546才示i己。如有需要，可用其他抗体共同标记。最后一次洗涤该细月包后，如上所述安装玻片。为了确定Chimigen蛋白被内吞，实施了脉沖追踪试验，用ChimigenTM蛋白(5Tg/mL)在冰上冲击未成熟DC30分钟。用PBSB洗涤细胞，并在不含ChimigenTM蛋白的AIMV⑧/2.5。/。匹配血清的培养基中追踪，然后在37。C下(7%C02)孵育15分钟。月永冲追踪的细胞用PBSB洗涤、用4%低聚甲醛固定并用MHCn类抗体标记，以^又标记质膜。为了确定如果ChimigenTM蛋白存在于内涵体中，则随后用BDBiosciencesCytofix/CytopermTM溶液将质膜标记的细胞固定并渗透10分钟。如上所述，在用BDPerm八VashTM洗涤后，利用抗小鼠IgGl生物素/抗生蛋白链菌素检测Chimigen蛋白。为了研究微胞々欠作用，5mg/ml的FITC葡聚糖(MW70,000，阴离子，赖氨酸可固定的，Invitrogen)在含或不含Chimigen蛋白(5Tg/mL)的AIMV⑧/2.5。/。匹配血清的培养基中用作液相标记物。为了研究受体介导的胞吞作用，将20Tg/mL的AlexaFluor488转铁蛋白轭合物(Invitrogen)用于含ChimigenTM蛋白(5Tg/mL)的PBSB中。乳胞素(Sigma)既用作半胱氨酸蛋白酶抑制剂又用作蛋白酶体抑制剂(终浓度5Tg/mL)。在体内动物^:莫型中免疫应答的评估这些研究利用两种近亲实^^室动物(小鼠和大鼠)和一种远亲大动物(小猪)种属。特别地，采用BALB/c小鼠(6-8周大，来自CharlesRiver实—验室)、Wistar大鼠(4-6周大，来自CharlesRiver实验室)和杂交小猪(4-6周大，来自PrairieSwineCenter,UniversityofSaskatchewan)。所述研究确定ChimigenTM蛋白的免疫应答和保护效力。安全性评估HCVChimigenTM蛋白经皮下(s.c.)或皮内(i.d.)给予。下列方案和剂量用于注射。动物经s.c.或i.d.接种4次，分别是第0天、第14天、第28天和第42天，每两周一次。对于小鼠s.c.和i.d.注射，采用0.1Tg、lug或10Tg/小鼠。用于大鼠接种的剂量将为0.15Tg、1.5Tg或15Tg/大鼠，而对于小猪则为0.2Tg、2Tg或20Tg/小猪。接种前(第1天)以及每次注射后7天(第7、21、35、49天)收集血液样品，通过ELISA4支术用于分坤斤特异抗体的量以及IgGl/IgG2a比率。最后一次接种后两周处死动物。通过接种后每周至少三次对动物进行体检，而评估HCVChimigenTM蛋白的安全谱。这包括体重和不良事件〗現测。对于全身毒性，采用以固定间隔收集的血液才羊品来监测血清化学物质的变化，包括天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。此外，实验结束时，将尸体剖检时从脾、肝、肾、心、肺、肌肉和脑收集的组织在10%緩冲福尔马林中固定并在石蜡中包埋，用于将来分析可能的病理学变化。周龄匹配的动物用作对照。对Chimigen蛋白的免疫应答预测ChimigenTM蛋白可诱导强烈的细胞和体液免疫应答。实施动物实验以确定小猪体内的宿主对HCVChimigen疫苗的免疫应答。核心、NS5A、NS3和多抗原Chimigen蛋白用于这些研究。在第一l仑中，评估对HCVChimigenTM蛋白的免疫应答。如上所述，该蛋白经s.c.或i.d.,合予。小鼠或大鼠的脾细胞以及小猪的外周血单核细胞(PBMC)用来确定在s.c.和i.d.途径给药后对HCVChimigenTM蛋白的免疫应答的质和量，如下文所述。这些实-睑允许我们确定哪种Chimigen疫苗以及哪种给药途径将能够-秀导最强烈的免疫应答。除了强烈的体液应答之外，靶向性递送所述HCVChimigenTM蛋白还能引起潜在的Thl偏离的免疫应答。来自VIDO对HCV疫苗的研究已经证明用DNA疫苗初始化并随后用蛋白加强可i秀导强烈的和Thl/Th2平衡的免疫应答Yueta1.(2004)J.Gen.Virol.85:533-1543。免疫应答的评估/y>拔^M吝。通过ELISA来确定HCV抗原特异性抗体的存在，以才企测总IgG以及IgGl和IgG2a抗体水平。所述IgG水平表明免疫应答的数量，而IgGl和IgG2a的相对水平则表明免疫应答的性质(Thl或Th2)。这些实验利用已建立的方案而实施。/"^S细應增崖i^定。用HCV抗原在体外刺激小鼠或大鼠的脾细胞、小猪的外周血单核细胞(PBMC)。增殖反应通过将[曱基」H]胸腺嘧啶整合入分裂细胞的DNA而测定。///J细i^西子五U5"尸Or测定。为了进一步确定免疫应答的性质，按照我们已建立的方案用HCV抗原刺激后，在ELISPOT测定中确定脾细胞(小鼠和大鼠)或PBMC(小猪)中分泌干扰素-Y和白介素_4的细月包凄丈量。由HCVChimigenTM蛋白豫导的保护性抗病毒免疫HCV具有非常窄的宿主范围，Y又在人和黑猩猩体内复制。用活HCV激发接种动物是不实际的，因为黑猩猩费用昂贵且供应受限。然而，用编码HCV抗原的重组牛痘病毒接种后激发是一种替代性模型，用于评估由HCV预防性疫苗在动物模型中诱导的保护性能力。ChimigenTM蛋白，单独或作为组合物，用来免疫4妾种动物。为了评估接种后诱导的保护性免疫，完成利用预定策略的计划免疫4妻种后2周，通过编码相同HCV抗原的重组牛痘病毒作为相关Chimigen3蛋白而腹膜内激发动物。激发剂量将为小鼠1x107空斑形成单4立(PFU)、大鼠2x107PFU以及小猪1x109PFU。5天后，处死动物并通过空J赶测定4姿照已建立的方案确定病毒滴度。鉴定最适合的用于HCV治疗性和预防性疫苗的候选物治疗性疫苗基于HCV病毒的非结构蛋白(例如NS5A、NS3),而预防性疫苗则基于结构蛋白(例如El、E2)以及非结构蛋白。所述Chimigen疫苗中的一种或多种的组合物用于离体DC/T细胞抗原呈递分析以及动物;溪型中，并评估免疫学结局。目前正在研究用于治疗性和预防性用途的Chimigen疫苗的免疫4妄种方案以及纟会药途径。通过测定^t体K平、'淋巴细l包增殖以及细胞因子生成而评估免疫应答。由预防性HCVChimigenTM疫苗候选物i秀导的保护性抗病毒免疫还可在激发试3全中辆:评估，如上文所述。实施例2.NS5AChimigen3蛋白的结果NS5AChimigenTM蛋白已4皮4是純并鉴定纯化的NS5AChimigenTM蛋白通过SDS-8%PAGE迁移为一条约105kDA的带，尽管该蛋白的预测分子量是约81kDA。观察到的分子量与预测的分子量之间的差异可能部分由于该蛋白中的高脯氨酸含量(~11%)、糖基化以及其他可能的翻译后修饰而引起。该纯化蛋白用抗小鼠IgGlFc、6xHis和NS5A的抗体进4亍才企测。对该纯化蛋白(从凝胶上切下的条带)进行MS/MSID(质谱)分析，得到明显的NS5A、小鼠IgGl重链以及HCV多蛋白点，表明其的确是NS5AChimigenTM蛋白。将纯化的NS5AChimigenTM蛋白在8%SDS凝月交上分离，并利用Pro-QEmerald300糖蛋白;疑月交以及BlotStain试剂盒染色糖基化，并用UV光照进朽"险测。该揭:作表明所述纯化的NS5AChimigenTM蛋白的糖基化。NS5AChimigenTM蛋白结合于未成熟DC对NS5AChimigenTM蛋白结合于未成熟DC的能力加以检测。在不同浓度的NS5AChimigenTM蛋白存在或缺失的情况下，将该细胞在4。C下孵育1小时。通过生物素化的抗小鼠IgGlmAb和SA-PE-Cy54全测结合的疫苗。结合该疫苗的细力包百分比(阳性细月包%)以及结合蛋白的相对量(MFI)通过流式细胞仪确定(图15)。当NS5AChimigenTM蛋白为4-50昭/mL时，大多数DC结合均为阳性，且结合蛋白的量存在剂量依赖性递增(图15和16)。相比于50昭/mL,20|Lig/mL时蛋白的结合并不是更大，表明与未成熟DC的结合是可饱和的。观察到的高结合MFI提示NS5AChimigen蛋白与未成熟DC的结合非常有效且处于高水平。4。C时的结合是可饱和的，表明该过程是受体介导的。该结合也非常迅速，因为结合的蛋白在4。C孵育5分钟后即可4企测到，其中结合MFI约为孵育1小时后观察到该值的一半(数据未示出)。NS5AChimigenTM蛋白结合于未成熟DC上的特异性受体通过其所包含的Fc片段，推测所述NS5AChimigenTM蛋白通过其TBD区结合于未成熟DC上的CD32(FcyRII)。此外，由于其甘露糖糖基化，推测该NS5AChimigenTM蛋白还结合于C型凝集素受体如CD206(MMR)。为了确定所述疫苗候选物的结合特异性，在阻断性抗CD32和/或抗CD206mAbs存在的情况下，将未成熟DC与NS5AChimigenTM蛋白一起孵育。将未成熟DC与》爰沖液对照、或5|ig/ml同种型对照mAb、抗CD32mAb、抗CD206mAb、或者抗CD32mAb和抗CD206mAb在4。C下一起孵育1小时，随后在4。C下与NS5AChimigenTM蛋白一起孵育1小时。结合的NS5AChimigenTM蛋白用生物素化的抗6xHismAb随后是SA-PE-Cy5进行检测。相比于緩冲液对照，同种型对照mAb(鼠IgGl和IgG2b)并未抑制结合。然而，相比于緩沖液对照，抗CD32和抗CD206分别抑制结合达约60%和40°/。。加入两种mAb进一步抑制NS5AChimigenTM蛋白结合，导致80%抑制。这些凝:才居表明CD32和CD206两者在结合NS5AChimigenTM蛋白过程中的作用。通过共聚焦显微镜，相比于仅用緩沖液，在4。C下与NS5AChimigenTM蛋白一起孵育的细胞表面上表现出强烈的标记，表明ChimigenTM蛋白结合于细胞表面。通过未成熟DC的NS5AChimigenTM蛋白内化在37。C下力。以评估。与ChimigenTM蛋白一起于37。C孵育1小时的未成熟DC表现为点状标记模式，常位于核附近，提示ChimigenTM蛋白被内化且(即使有)几乎非常小的表面标记。DC能够通过几种途径吸收抗原，包括吞噬、巨胞饮、网格蛋白介导的胞吞作用以及非网格蛋白/细胞膜穴样凹陷胞吞作用。已报道巨月包々大是未成熟DC内的一个纟且成')"生过禾呈(TrombettaandMellman2005)。未成熟DC通过巨胞饮在37°C下对内化NS5AChimigen蛋白的能力，利用巨胞饮标记物FITC葡聚糖加以评估[Hewletteta.(1994)J.CellBiology124:689-703〗。^)寻未成熟DC与ChimigenTM蛋白和FITC葡聚糖一起孵育15分钟和60分钟后，观察到嚢泡样结构，其包含蛋白和FITC葡聚糖，表明在37。C所述Chimigen蛋白可通过巨胞饮吸收。还应注意到，FITC葡聚糖可结合于巨噬细胞甘露糖受体(CD206)，因此通过受体介导的胞吞作用，可以出现一些包含ChimigenTM蛋白和FITC葡聚糖的内涵体受体介导的胞吞作用在ChimigenTM蛋白吸收中的作通过脉沖-追踪实-验而研究。未成熟DC用荧光标记的ChimigenTM蛋白于4°C下进4亍冲击、洗涤并在37。C下孵育15分钟。将该细月包固定、渗透并用抗体标记，以检测ChimigenTM蛋白以及转铁蛋白受体。所述转铁蛋白受体通过受体介导的胞吞作用而吸收，随后从早期内涵体循环回质月莫。在4。C下，所述NS5AChimigenTM蛋白结合于该细月包表面，而转铁蛋白受体则主要存在于细胞内部。变至37。C后，观察到形成内涵体，其中一部分内涵体包含Chimigen蛋白和转铁蛋白受体两者。在实验开始时(4。C),大量细胞内已存在的转铁蛋白受体很可能对多个包含转铁蛋白的内涵体(与ChimigenTM蛋白并非共定位)负责。利用共聚焦显微镜，通过与抗转铁蛋白受体的抗体共同标记，还可评估NS5AChimigenTM蛋白通过DC的吸收及其与转铁蛋白的共定位。转铁蛋白结合于转铁蛋白受体，并已知通过受体介导的过程而内化。该分析表明两种分子的共定位，从而表明NS5AChimigenTM蛋白通过受体介导的胞吞作用而被吸收。在尝试增加Chimigen蛋白与转铁蛋白受体信号之间的重叠时，将细胞与辄合于人转4失蛋白的AlexaFluor488—起孵育，以<更间接检测仅最近内吞的转铁蛋白受体而非细胞内全部转铁蛋白受体。在4。C下，将未成熟DC用ChimigenTM蛋白与轭合于转铁蛋白的AlexaFluor488混合物一起进4亍表面标i己。几乎未，见察到AlexaFluor488转铁蛋白阳性内涵体，但当存在时，则其包含NS5AChimigen蛋白，表明Chimigen蛋白确实是通过受体介导的胞吞作用而吸收的。这些结果表明Chimigen3蛋白主要通过受体介导的月包吞作用而4皮内4匕。研究了NS5AChimigenTM蛋白通过未成熟DC的力口工过程。因为疫苗(特别是)被设计成治疗慢性感染，需要通过MHCI类受体CD8+细胞的活化以及抗原交叉呈递。已经提出了两种不同的力口工途径用于抗原交叉呈递〖Liz6eetA(2005)TrendsImmunol.26(3):141-149]。第一种途径涉及通过吞噬吸收的抗原的加工，而第二种途径则涉及由其他胞吞作用途径(如受体介导的胞吞作用)吸收的抗原的加工。在第二种途径中，蛋白吸收入早期内涵体并耙向于晚期内涵体，其中它们通过《且织蛋白酶降解并装载到MHCI类受体上。因此，进行实-验，以确定NS5AChimigenTM蛋白能否在晚期内涵体中;f全测到，并确定其是否与这样的结构中的MHCI类受体共定位。对已经在4。C下用NS5AChimigenTM蛋白沖击并随后在37°C下追踪的细胞进行共标记，以检测Chimigen蛋白和LAMP1(晚期内涵体/溶酶体的标记物)两者。第4小时和24小时，观察到NS5AChimigen蛋白与LAMP1之间的重叠，表明该NS5AChimigen蛋白处于晚期内涵体/溶酶体内。在另一个共标记实一验中，发现所述NS5AChimigenTM蛋白存在于与MHCI类分子相似的结构中，从而表明该ChimigenTM蛋白通过MHCI类分子加工而用于呈递。相信蛋白酶体与抗原破坏有关，用于通过吞噬溶酶体途径的交叉呈递。用细胞可透过的蛋白酶体抑制剂乳胞素(以5(ig/mL的浓度)处理细胞。最近已表明乳胞素在抑制溶酶体蛋白酶CathepsinA方面不3口之前^H人为的净争异[Kozlowskietal.(2001)TumourBioL22(4):211-215]。如果NS5AChimigenTM蛋白的加工如在吞噬溶酶体途径中一样涉及到蛋白酶体，则将能预料到不完全降解的肽在胞质溶月交中部分累积，且这样的累积预期不再晚期内涵体中加工[上文，Liz6eetal.(2005)]。4小时追if宗后，用5pg/mL的乳月包素处理的J5永冲细胞(脉沖和追踪)表现为较大数量含有NS5AChimigenTM蛋白的内涵体。此夕卜，与那些乂寸照细月包的内涵体相比，所述内涵体似乎包含更多的该蛋白。用抗鼠IgGl的单克隆抗体未检测到细胞质NS5AChimigenTM蛋白的增加。这些凄t据再次表明受体介导的胞吞作用而非吞噬溶酶体途径是Chimigen3蛋白内化于DC内的机制。通过DC的NS5AChimigenTM蛋白呈递导致CD8+和CD4+T细胞活化和增殖两者对NS5AChimigenTM蛋白的功能性免疫应答通过离体APA加以评估。该分析可用来在用抗原负载的DC刺激T细胞后测定功能性T细胞免疫应答的多个参数。该分析包括首先通过加入IL-4和GM-CSF由PBMC起源的单核细胞生成未成熟DC。随后将该未成熟DC与疫苗候选物、载体緩冲液(阴性对照)或;皮伤风类毒素(TT)(阳性对照)一起孵育。随后用细胞因子处理所述DC以促进成熟、洗涤并与自体幼稚T细胞一起孵育。为了测定细胞因子的生成、细胞毒性颗粒组分的存在、以及NS5A特异性T细胞的生成，再刺激所述T细胞两次以允许ChimigenTM蛋白特异性T细胞的扩增。活化通过测定早期T细月包活化标记物CD69而评估，而增殖则通过追踪CFSE标记的T细胞荧光而测定。与抗原负载的DC—起培养4天和7天后，评估CD69表达和CFSE荧光两者。初步分析已经表明培养液中DC和T细胞的浓度是确定T细月包免疫应答的重要参数。因此，设计APA，以便评估6种不同的T细胞:DC的比率。采用两组DC浓度，高浓度为5x10"DC/孔，而^[氐浓度为1x1()4DC/孔。培养48小时后，将所述未成熟DC与緩沖液(阴性对照)、NS5AChimigenTM蛋白(5AC,5昭/mL)的两种不同制备物、TT(阳性对照)或PBS—起孵育。随后将该DC培养8小时，并通过加入polyIC、IL-1、IL-6、TNF画oc、IFN-cc和IFN-y而催熟。过夜(16小时)培养后，洗涤来自PBS对照组的DC并才企测多种成熟DC标记物的表达。高浓度和低浓度DC均表达高7jC平HLA-ABC(MHCI类)、HLA-DR(MHCII类)、CD86、CD80、CD83(图17)。通常，所述高浓度DC表达轻微较高水平的DC成熟标记物。通过阴性选择步骤分离自体T细胞，并利用CFSE标记来确定细胞分裂。向96孔板中100pl/孔的DC中，加入100pl/孔的T细胞，每孔浓度为20x104、5x104或2x104。对于高DC浓度孑L(5x104DC/孑1>),每孑L中T细胞/DC的比例组合为20xio4:5xi04(4:!)，5x104:5x104(1:1)，以及2x104:5x104(04:i)。对于低DC浓度孔(1x104DC"L),每孔中T细胞/DC的比例组合为20xK)4:lxlo4(20:l),5xl()4:lxio4(5:l)，以及2xio4:ix104(2:1)。在无4壬<可外源'1~生细月包因子的情况下，将T细月包力口入到DC中。作为对照，培养第3天时，将PHA(1|ig/mL)力口入到T细胞中，其中所述T纟田月包力卩载到PBS处理的DC组上。培养4天后，收获一半细^^培养物(100pi)，用于活化和增殖分析。将100pi新鲜AIM￥@/2.5%匹配的血清加入到剩余的一半细胞培养物中，再培养细胞3天。培养4天后T细月包上CD69的表达示于图18A-C中。图18A示出了乂十于不同T细月包:DC的比率的表达CD69的CD3+细胞的百分比。无论T细胞:DC的比率如何，大多数PHA处理的细胞均表达CD69。与高DC浓度一起培养时，也在T细胞中^r测到了CD69;^f旦与低DC浓度一起培养时，则在T细胞中几乎未纟企测到CD69。相比于缓冲液对照，抗原刺激的T细胞表达较高水平的CD69。第4天时，NS5AChimigen蛋白负载的DCi秀导的表达CD69的CD8+T细月包百分比高于CD4+T细月包(图18B和C)。相比于回忆抗原TT,CD8+T细胞中表达CD69的百分比等于或大于Chimigen3蛋白的百分比。这表明NS5AChimigen蛋白是幼^維CD8+T细月包的强活化剂。培养4天后，经过至少一次分裂的细力包(CFSE'。)的百分比示于图19A-C中。用PHA处理24小时的T细胞3交早开始分裂(图19A)。用TT负载的DC处理的CD8+和CD4+T细胞在培养4天后出现可检测性增殖，但仅在高DC浓度比较明显(图19B和C)。第4天时，在Chimigen蛋白处理组几乎检测不到T细胞增殖。因此，第4天时，幼稚T细胞通过NS5AChimigenTM蛋白负载的DC活化(如通过CD69表达而证明的)，但这些T细胞尚未分裂或其分裂尚不能通过所采用的分析检测到。培养7天后，收获细胞用于活化和增殖的分析。培养7天后，T细月包上CD69的表达示于图20A-C中。图20A示出了对于不同T细胞:DC的比率的表达CD69的CD3+细胞的百分比。用PHA处理的T细胞中CD69表达出现了显著增加。然而，表达CD69的细胞百分比相比第4天时观察到的值已经有所下降，与预期的PHA反应一致CD69快速诱导其后随时间出现表达降低。对于Chimigen3蛋白刺激的T细胞，在与高浓度DC—起培养的T细月包中，以高于5%的水平才企测到CD69,但在与低浓度DC—起培养的T细胞中，则几乎检测不到。因此，4氐DC浓度(1x1(T"DC/孔)不足以用于抗原特异性T细胞活化。相比于緩冲液对照，对于5xl0、细胞和2x104T细胞:5x104DC的比率，较高凄t量的Chimigen3蛋白刺激的T细胞表达CD69。第7天时，回忆TT应答的CD69表达有所降低。第7天时，与d4T细胞相反，NS5AChimigenTM蛋白负载的DC诱导的表达CD69的CD4+T细胞百分比高于CD8+T细胞(图20B和C)。相比于緩沖液或回忆抗原TT,对于高DC浓度(5xioV孔)，CD8+和CD4+T细月包中表达CD69的百分比等于或大于表达Chimigen蛋白百分比。因此，NS5AChimigen首先活化幼稚CD8+T纟田胞，随后活化CD4+T细胞。培养7天后，经过至少一次分裂的细胞(CFSE1。)的百分比示于图21A-C中。结果表明基本上每个用PHA处理的T细胞均已经分裂(图21A)。在培养7天后，用Chimigen3蛋白或TT负栽的DC导致显著的T细月包增殖，^旦这在高DC浓度时最明显。由于抗原负载，仅高DC浓度孔诱导显著的CD8+T细胞增殖(图21B)。然而，用抗原负载的4氐浓度DC足以^秀导CD4+T细胞增殖(图21C)。特别地，在高DC浓度下，Chimigen3蛋白负载的DC诱导T细胞增殖至可与TT负载的DC相比的7K平。T细胞增殖的另一个衡量标准(测量)是T细胞群中T母细胞的相对比例。T母细胞定义为那些具有较高FSC(前光散射，forwardlightscatter)和SSC(侧光散射)的细胞，而且淋巴细胞门中的休止淋巴细胞定义为通过流式细胞仪所评估的。培养物中T母细胞的百分比示于图22中。这些结果与如图21A中示出的经历分裂的细胞百分比非常好地相关联。因此，评估细胞群中T母细胞可作为CFSE分析的替代方案。总体来说，这些结果表明NS5AChimigen蛋白对于诱导初始T细胞应答非常有效，如通过T细胞活化和增殖所测定的。通过DC的NS5AChimigenTM蛋白呈递引起产生IFN-y和TNF-oc的CD8+和CD4+T细月包的生成通过三次刺激离体APA来评估针对NS5AChimigenTM疫苗的功能性免疫应答。将4x1()4dC/孔(高浓度)或2x1()4dC/孔(低浓度)的未成熟dc用对照载体緩冲液、pbs、tt(阳性对照)、或NS5AChimigenTM蛋白负载。随后催熟DC并评估其表型。DC的成熟利用MHCI类、MHCII类、CD86、CD80和CD83的高水平表达而确i人(图23)。将自体T细胞与成熟的抗原负载DC以20x104T细月包/孔4x1()4dC/孔或者4x104T细胞/孔2x1040(:/孔的比例一起孵育。刺激该T细力包三次，并在第三次刺激后6小时通过一全测Thl细月包因子IFN-y和TNF-oc的细胞内水平来评估T细月包功能。此外，还评估了T母细胞的含量。图24示出了高和低DC浓度下的T母细胞百分比。相比于5:1的比率，2:1的T细力包:DC的比率导致较〗氐的背景(纟爰沖液)T细月包增殖反应。由于4吏用2:1的比率，在緩冲'液与抗原负载的T细月包增殖反应之间存在4交显著的差异。以5:1和2:1的T细月包:DC的比率来测定IFN-y应答。ft据以该组每一个孔的应答以及三个孔的平均值和标准差来表示(图25)。T细胞IFN-y应答的比较在5:1和2:1的T细胞:DC的比率之间显示出显著差异。在较高DC浓度的情况下，相比于对照緩沖液，并无Chimigen3诱导的IFN-y应答的证据。然而，在较低DC浓度的情况下，与^f照ll冲'液负载的DC—起i条养的T细月包才及少生成IFN-y，而与Chimigen3蛋白负载的DC—起培养的T细胞则有4交高百分比生成IFN-y。相比于2.5(ag/mL的NS5AChimigenTM蛋白，在已用由5pg/mLNS5AChimigenTM蛋白负载的DC刺激的T细胞中，存在较多产生IFN-y的细胞。还测定了CD8+和CD4+细胞群中表达IFN-y的T细月包百分比(图26牙口27)。由于Chimigen3-DC的刺;敫，低DC浓度组表现出高百分比的表达IFN-y的CD8+T细胞。相比于TT负载的DC，对于用Chimigen3蛋白负载的DC刺激的T细胞，表达IFN-y的CD8+T细胞的百分比较高(图26)。类似地，相比于用对照緩冲液刺激，一旦用NS5AChimigenTM蛋白刺激，还存在高百分比表达IFN-y的CD4+T纟田月包(图27)。相比于用TT负载的DC刺激，对于用Chimigen3蛋白负载的DC刺〗敫的T细J包表达IFN-K的CD4+T细胞的百分比是可比较的(图27)。这些结果表明NS5AChimigenTM蛋白在CD8+和CD4+T细胞群两者中诱导显著的IFN-y应答并暗示该分子在MHCI类和II类通3各两者中均由所述DC力口工。图28示出了用抗原负载的成熟DC刺激6小时而得到的产生TNF-a的T细胞百分比。这些结果类似于IFN-y的结果。尽管由于通过高DC浓度(5:1的比率)的T细胞抗原刺激导致产生TNF-a的细胞百分比增加，但用低DC浓度(2:1的比率)刺激存在更大的差异。相比于2.5|ug/mL蛋白，当用5|ig/mL的Chimigen3蛋白负载的DC刺i^敫时，4交高百分比的T细胞产生TNF-a。相比于TT,对于NS5AChimigenTM蛋白，TNF-a应答较高。利用TT负载的DC的刺激导致表达TNF-a的CD4+T细胞的百分比高于CD8+T细胞(图29)。然而，NS5AChimigenTM蛋白负载的DC在CD8+和CD4+T细胞群两者中诱导类似程度的TNF-a生成(图29)。通过DC的NS5AChimigenTM抗原呈递在第三次刺激后6小时导致表达grB和pfn+的CD8+T细胞和CD4+T细胞的生成还通过离体抗原呈递分析评估了T细胞产生细胞毒性颗粒蛋白grB和pfn的能力。将未成熟DC用对照乡爰冲液、TT(阳性对照)或不同浓度的NS5AChimigenTM蛋白负载，并且一旦成熟即与自体T细胞一起孵育。grB表达可以以不同方式进行4全测，包括酶分析和利用特异性抗体[Ewenetal.(2003)J.Immunol.Meth.276:89-101;Spaeny画Dekkingetal(1998)J.Immunol.160:3610;Hamannetal.(1997)J.Exp.Med.186:1407]。通过细胞内染色，分别利用抗grB和抗pfnmAb来4企测GrB和pfn表达。图30示出了用抗原负载的成熟DC刺激三次后，表达grB和pfn的CD8+T细月包的百分比。相比于无抗原对照，NS5AChimigenTM蛋白负载的DC诱导CD8+T细月包中grB和pfn表达增力口。这些结果表明NS5AChimigen蛋白诱导grB和pfn在CD8+T细胞中表达，且这暗示该蛋白在I类通路中由DC加工，以有效的呈递至T细月包，这引起其A人幼稚CD8+T细胞分化为细力包毒性T淋巴细胞(CTL)。通过成熟DC的NS5AChimigen抗原呈递导致CD8+和CD4+T细胞的产生和持续活化在APA中，用抗原负载的DC刺激T细月包三次。第三次刺潮:后培养6天，收获T细胞并通过FFC研究母细胞的百分比，其作为增殖和活化标记物CD69表达的一个量度。此外，作为一种估计乂人培养物中回收的T细胞绝对数量的方法(means),还才艮据FSC和SSC流式细胞4义分析确定落在'淋巴细胞门(R1门)内的一皮圈定细胞的数量。相比于緩沖液对照，在从TT和ChimigenTM蛋白刺激的细胞中回收T细J包方面存在显著差异(图31)。相比于Chimigen3蛋白刺激的细胞，TT刺激的细胞获得较高的T细胞回收率。然而，所述TT应答是一种回忆应答，因此预计与TT发生特异性反应的初始T细胞群将高于特异于NS5A的初始幼稚T细胞群的该值。特别地，冲艮据对母细胞群的评估，实际上NS5AChimigen3蛋白培养物中的母细胞/增殖细胞的百分比高于所述TT培养物。在》爰沖液对照培养物中几乎不存在母细胞/增殖细月包。如通过CD69表达而评估的，活化的CD8+和CD4+T细胞群的百分比示于图32中。相比于緩冲液对照，用Chimigen3蛋白负载的DC刺激的T细胞中存在较高百分比的表达CD69的CD4+和CD8+T细月包两者。这些结果表明用Chimigen3蛋白刺激引起显著的T细胞活化和增殖，即在第三次刺激后6天(T细胞培养的第20天)依然很明显。因此，该Chimigen3蛋白在CD8+和CD4+T细胞的活化和扩增中是非常有效的。通过成熟DC的NS5AChimigenTM蛋白呈递引起NS5A特异性CD8+T细力包的产生为了评估免疫应答对NS5AChimigen蛋白的抗原特异性，对HLA-A2情形中特异于免疫显性NS5A表位的T细胞百分比进4亍定量。该百分比通过用轭合于PE的NS5A肽/HLA-A2五聚体标i己T细胞而确定。在APA中，幼稚T细胞通过用不同浓度的NS5AChimigenTM蛋白负载的DC刺激三次，并与无^t原(-爰沖液)负载的各个对照DC进行比较。第三次刺激后6天，收获T细胞，并通过四聚体标记和FFC牙企测NS5A特异性T细胞或EBV特异性丁细胞(对照)。阴性四聚体标记(阴性对照)和EBV四聚体标记(阳性对照)的CD8+和CD4+T细胞的百分比示于图33中。在CD8+T细胞群中，三个才企测孔之一是EBV四聚体标记(阳性四聚体)P日性。由于评估的T细胞来自緩沖液对照处理孑L，将预料到EBV四聚体标记的T细胞的数目会相对低。APA后，标记有NS5A五聚体的CD8+T细胞的百分比示于图34中。用NS5AChimigenTM蛋白负载DC导致在两个高DC浓度孔和三个4氐DC浓度3L中，具有该特异'性的CD8+T细胞的显著扩增比较明显。因此，该NS5AChimigen3蛋白能够i秀导生成对这种NS5A免疫显性表位特异的T细力包，并且可能存在对其他NS5A表位具有特异性的T细月包。实施例3.NS3Chimigen3蛋白的结果NS3ChimigenTM蛋白已被提纯并鉴定Sf9细胞中表达的NS3ChimigenTM蛋白通过Ni-NTA亲和层析以及随后的阴离子交换层坤斤而纯化。纯化的样品利用10%SDS-PAGE凝胶进行分析，电泳后，将凝力交转移至硝基纤维素用于蛋白质印迹。该SDS-PAGE凝胶用页蓝染色，并用特异于NS3Chimigen蛋白不同组分的抗体进行蛋白质印迹。纯化的蛋白显示为约110KDa和120KDa的双耳关体。两种组分(species)均通过4元N末端(4元6xHis)、TBD(4元Fc)禾口NS3(多克隆#元NS3)的4元体进行片企测，结果表明该纯化的蛋白是完整的。利用Pro-QREmerald300糖蛋白凝胶以及BlotStain试剂盒，对纯化的NS3ChimigenTM蛋白的糖基化进行定量估计。将纯化的蛋白在8%SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳后，利用制造商的方案对凝胶进行染色并在紫外光照下扫描。由于纯化的蛋白是双联体，推测分子量差异是由于糖基化的不同水平。NS3ChimigenTM蛋白结合于未成熟DC对NS3ChimigenTM蛋白结合于未成熟DC的能力加以检测。在不同浓度NS3ChimigenTM蛋白存在或缺失的情况下，将该细胞在4。C下將育1小时。通过生物素化的抗小鼠IgGlmAb和SA-PE-Cy5#佥测结合的蛋白。结合该Chimigen3蛋白的细另包百分比(阳性细胞%)以及结合蛋白的相对量(MFI)通过FFC来确定。在NS3ChimigenTM蛋白为4-55叱/mL的情况下，大多数DC结合均为阳性，且结合蛋白的量存在剂量依赖性递增(图35和36)。相比于55pg/mL,22ng/mL时蛋白的结合并未表现出更大，表明与未成熟DC的结合是可饱和的。观察到的高结合MFI表明NS3ChimigenTM蛋白与未成熟DC的结合非常有岁文且处于高水平。4。C下的结合是可々包和的，表明该过程是受体介导的。该结合也非常迅速，因为结合的蛋白在4°C下孵育5分钟后即可检测到，其中结合MFI约为將育60min后观察到的值的一半(数据未示出)。NS3ChimigenTM蛋白结合于未成熟DC上的特异性受体由于存在Fc片段，推测NS3Chimigen蛋白通过其TBD区而结合于未成熟DC上的CD32(FcyRII)。此外，由于其甘露糖糖基化，推测NS3ChimigenTM蛋白结合于C型凝集素受体如CD206(MMR)。为了确定所述蛋白的结合特异性，在阻断性抗CD32和/或抗CD206mAb存在的情况下，将未成熟DC与NS3Chimigen蛋白一起孵育。将未成熟DC与緩沖液对照或5pg/mL的同种型对照mAb、抗CD32mAb、抗CD206mAb或者抗CD32mAb和抗CD206mAb两者在4。C下一起孵育1小时，随后与NS3ChimigenTM蛋白在4。C下一起孵育1小时。结合的NS3Chimigen蛋白用生物素化的抗6xHismAb随后是SA-PE-Cy5进行斗全测。相比于緩沖液对照，同种型对照mAb(鼠IgGl和IgG2b)并未抑制结合。然而，相比于1￡沖液对照，抗CD32和抗CD206分别抑制结合约70%和60%(图36)。加入两种阻断性mAb则进一步抑制NS3ChimigenTM蛋白结合，产生90%抑制(图36)。因此，这些凄欠据表明CD32和CD206两者在NS3ChimigenTM蛋白结合于未成熟DC过程中的作用。通过共聚焦显微镜使NS3ChimigenTM蛋白的结合可视化。将未成熟DC与NS3ChimigenTM蛋白在4。C下一起孵育。相比于仅用緩冲液对照，该细胞表面上的强烈标记表明ChimigenTM蛋白结合于细胞表面，可能结合于受体。为了研究内化作用，将未成熟DC与NS3ChimigenTM蛋白在37。C下一起孵育1小时。所述细胞几乎未表现出任何表面标记(质膜4仑廓)，^旦反而表现为点状标记才莫式，常位于核附近，表明Chimigen蛋白4皮内。通过DC的NS3ChimigenTM蛋白呈递导致CD8+和CD4+T细胞两者活化和增殖对NS3ChimigenTM蛋白的功能性免疫应答通过离体抗原呈递分析(APA)力口以评估。该分析可用来在用抗原负载的DC刺激T细胞后测定功能性T细胞免疫应答的多个参数。该分析包括首先通过加入IL-4和GM-CSF从PBMC起源的单核细胞生成未成熟DC。随后将该未成熟DC与疫苗候选物、载体緩冲液(阴性对照)或TT(阳性对照)一起赙育。随后用细月包因子处理DC以促进成熟、洗涤并与自体幼稚T细胞一起孵育。为了测定细胞因子的生成、细胞毒性颗粒组分的存在、以及NS3特异性T细力包的生成，再刺激所述T细胞两次，以允许ChimigenTM蛋白特异性T细胞的扩增。然而，预计单次刺激也能启动从幼稚T细胞群的扩增。活化通过测定早期T细胞活化标记物CD69而评估，而增殖则通过追踪CFSE标记的T细胞荧光而测定。与抗原负载的DC—起培养4天和7天后，评估CD69表达和CFSE荧光两者。免疫应答的重要参数。因此，设计APA使得评估6种不同的T细胞:DC浓度。釆用两组DC浓度，高浓度为5x1()4DC/孔，而低浓度为1x10"DC/孔。培养48小时后，将未成熟DC与緩冲液(阴性对照)、NS3ChimigenTM蛋白(3C,5吗/mL)、TT(阳性对照)、或PBS—起孵育。随后将该DC培养8小时，并通过加入polyIC、IL-1、IL-6、TNF-cc、IFN-a和IFN國y而催熟。过夜(16小时)培养后，洗涤来自PBS对照组的DC并^r测多种成熟DC标记物的表达。高浓度和^f氐浓度DC均表达高水平HLA-ABC(MHCI类)、HLA-DR(MHCII类)、CD86、CD80和CD83。通过阴性选择步骤来分离自体T细胞，并利用CFSE标记用于确定纟田月包分裂。向96孑14反中100(al/孑L的DC中，力口入100jil/孑L的T细胞，每孔浓度为20xl04、5xl()4或2xi04。对于高DC浓度孔(5x104DC/孔)，每孑L中T纟田胞/DC的比例组合为20xlo4:5x104(4:1)，5x104:5x104(1:1)，以及2x104:5x104(04:i)。对于<氐DC浓度孑L(5x1()4DC/孔)，每孔中T细月包/DC的比例组合为20xi04:Ix104(20:l)，5x104:1x104(5:1〉，以及2xi04:x104(2:1)。在无任何外源性细胞因子的情况下，将T细胞加入到DC中。作为对照，培养第3天时，将PHA(1jag/mL)加入到T细胞中，其中该T细月包S皮加载到PBS处理的DC组上。i咅养4天后，收获一半细胞^咅养物(100(il)，用于活化和增歹直分冲斤。将100|il的新鲜AIMV㊣/2.5。/。匹配的血清加入到剩余的一半细月包i咅养物中，并对细月包再i咅养3天。以5x104T细月包/孑L:5x104DC/孔的比率(1:1)培养4天和7天后，T细胞上CD69的表达示于图37中。无i仑T细胞:DC的比率如何，大多数PHA处理的细i)包均表达CD69。与高DC浓度一起培养的T细胞中冲企测到了CD69;但与低DC浓度一起培养的T细胞中几乎未检测到CD69(凄t据未示出)。相比于緩冲液对照，抗原刺激的T细胞表达较高水平的CD69。第4天时，NS3ChimigenTM蛋白负载的DC诱导的表达CD69的CD8+T细胞百分比高于CD4+T细胞。培养4天后，经过至少一次分裂的细胞(CFSE1。)百分比示于图38中。结果表明用PHA处理24小时的T细月包專交早开始分裂。用TT负载的DC处理的CD8+和CD4+T细胞在培养4天后出现可检测性增殖，但这仅在高DC浓度时比较明显(凄t据未示出)。第4天时，在疫苗候选物处理组中几乎检测不到T细胞增殖。因此，第4天时，幼稚T细胞通过NS3Chimigen蛋白负载的DC活化(如通过CD69表达而证明的)，但这些T细胞尚未分裂。培养7天后，收获细胞用于活化和增殖分析。培养7天后，T细胞上CD69的表达示于图37中。对于Chimigen3蛋白刺激的T细胞，在与高DC浓度一起培养的T细胞中，以高于5%的水平检测到CD69,但在与低DC浓度一起培养的T细胞中，则几乎冲全测不到cd69(数据未示出)。因此，低dc浓度(1x1()4dC/孔)不足以用于抗原特异性T细胞的活化。第7天时，回忆TT应答的CD69表达有所降低。第7天时，与d4T细胞相反，NS3ChimigenTM蛋白负载的DC诱导的表达CD69的CD4+T细胞百分比高于CD8+T纟田月包。相比于回忆抗原TT，第7天时CD8+和CD4+T细胞中表达CD69的百分比等于或大于表达Chimigen3蛋白的百分比。因此，Chimigen3蛋白首先活化幼稚CD8+T细胞，随后活化CD4+T细胞。培养7天后，经过至少一次分裂的细胞(CFSE'。)的百分比示于图38中。用Chimigen3蛋白或TT负载的DC引起显著的CD8+和CD4+T细胞增殖，并且这在高DC浓度时最明显(结果未示出)。通过DC的NS3ChimigenTM蛋白呈递导致产生IFN-y和TNF腳a的CD8+和CD4+T细月包的生成通过三次刺激离体APA,评估针对NS3ChimigenTM蛋白的功能性免疫应答。将4x1()4DC/孔(高浓度)或2x1()4dC/孔(低浓度)的未成熟DC用对照载体緩冲液、PBS、TT(阳性对照)、或NS3ChimigenTM蛋白负载。随后催熟DC并评估其表型。如杲其表达高7jc平的MHCI类、MHCII类、CD86、CD80和CD83,则该DC可^H介为成熟。^l夺自体T细月包与成熟的4元原负载的DC以20x104T细胞/孔4x1()4DC/孔或者4x104T细月包/孔2x1()4dC/孔的比例一起孵育。刺激该T细胞三次，并在第三次刺激后6小时通过;险测Thl细胞因子IFN-y和TNF-oc的细胞内水平来评估T细胞功能。此外，还评估了T母细胞的程度。T细胞群中T母细胞的百分比测量可用作T细胞增殖程度的量度。T母细胞定义为那些具有较高FSC和SSC散射的细胞，而且淋巴细胞门中的Y水止淋巴细胞定义为通过流式细胞^f义所评估的。培养14天后，培养物中T母细胞的百分比示于图39中。NS3ChimigenTM蛋白在谈导T细胞增殖(母细胞产生)方面非常有效，其中相比于5:1的比率，2:1的T细胞:DC比率导致较低的背景(緩沖液)T细月包增殖反应。因此，在T细胞:DC比率为2:1时，相比于緩冲液，NS3ChimigenTM蛋白刺激的T细胞增殖存在显著差异。以5:1和2:1的T细月包:DC比率来测定IFN-y应答。数据以该组每一个孔的应答以及三个孔的平均值和标准差表示(图40)。T细胞IFN-y应答的比4交在5:1和2:1的T细月包:DC比率之间显示出显著差异。在较高DC浓度的情况下，相比于对照緩沖液，几乎不存在疫苗候选物诱导的IFN-y应答的证据。然而，在较低DC浓度的情况下，与对照緩冲液负载的DC—起培养的T细胞极少生成IFN-丫，而与疫苗4矣选物负载的DC—起培养的T细月包则有4交高百分比生成IFN-y。相比于5Tg/mL的NS3Chimigen蛋白，在已用由2.5昭/mLNS3Chimigen蛋白负载的DC刺激的T细胞中，产生IFN-y的细胞并未减少。对CD8+和CD4+细胞群中表达IFN-y的T细胞百分比进行了定量，并示于图41中。相比于TT负载的DC，在用2.5吗/mL疫苗候选物负载的DC剌激的T细胞中，表达IFN-y的CD8+T细胞百分比是可比较的。同样，相比于用对照緩冲液刺激，一旦用NS3Chimigen蛋白刺;敫，还出SL高百分比表达IFN-y的CD4+T细月包。相比于用TT负载的DC刺激，用疫苗4美选物负载的DC刺激的T细胞中表达IFN-y的CD4+T细月包的百分比是可比较的。这些结果表明NS3Chimigen蛋白在CD8+和CD4+T细胞群两者中诱导显著的IFN-y应答并暗示该分子在MHCI类和II类通if各中均由DC力口工。图42示出了用抗原负载的成熟DC刺激6小时而得到的产生TNF-ct的T细月包百分比。这些结果类似于IFN-y的结果。相比于TT，NS3ChimigenTM蛋白的TNF-ot应答大约相同或较高。利用TT或NS3Chimigen蛋白负载的DC的刺激导致表达TNF-ct的CD4+T细月包的百分比高于CD8+T细月包。通过DC的NS3ChimigenTM蛋白呈递导致表达grB和pfn的CD8+T细胞的生成还通过离体APA评估T细胞产生细胞毒性颗粒蛋白grB和pfn的能力。将未成熟DC用对照緩沖液、TT(阳性对照)或不同浓度的NS3ChimigenTM蛋白负载，并且一旦成熟即与自体T细胞一起孵育。通过细月包内染色，分别利用3元grB和4元pfnmAb冲企测GrB和pfn表达。图43示出了用抗原负载的成熟DC刺激三次后，表达grB和pfn的CD8+T细胞百分比。相比于緩冲液对照处理的DC,NS3ChimigenTM蛋白负载的DC诱导CD8+T细胞中grB和pfn表达增加。这些结果表明NS3ChimigenTM疫苗诱导grB和pfn在CD8+T细胞中表达。该发现表明该疫苗候选物在MHCI类通路中由DC加工，用于有效的呈递至T细胞，以引起其从幼稚CD8+T细胞分化为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。通过成熟DC的NS3ChimigenTM蛋白呈递导致CD8+和CD4+T细胞的产生和持续活化在APA中，用4元原负载的DC刺;敫T细月包三次。第三次刺;敫后培养6天，收获T细胞并通过流式细胞仪研究母细胞的百分比，其作为增殖和活化标记物CD69表达的量度。此外，作为一种估计从培养物中回收的T细胞绝对数量的方法，还才艮据FSC和SSCFFC分析确定落在淋巴细胞门(Rl门)内的被圈定细胞的数量。如通过CD69表达而评估的，活化的CD8+和CD4+T细胞的百分比示于图44中。相比于緩沖液对照，在用Chimigen3蛋白负载DC刺;敫的T细月包中，表达CD69的CD4+和CD8+T细月包的百分比均有所增加。相比于緩冲液对照，在从TT和ChimigenTM蛋白刺激的细胞中回收T细月包方面存在显著差异(图45)。相比疫苗候选物刺激的细胞，TT刺激的细胞获得较高的T细胞回收率。然而，TT应答是一种回忆应答，因此预计与TT发生特异性反应的初始T细胞群将高于特异于NS3的初始幼稚T细胞群的该值。特别地，根据对培养物中存在的T母细胞的评估，含有NS3Chimigen3蛋白的培养物中的母细胞/增殖细胞的百分比高于所述TT培养物。在緩冲液对照的培养物中，几乎不存在母细胞/增殖细月包。因此，用Chimigen3蛋白刺激引起显著的T细胞活化和增殖，即在第三次刺激后6天(T细胞培养的第20天)依然很明显。因此，NS3Chimigen，蛋白在CD8+和CD4+T细月包两者的活化和扩增中非常有步文。通过成熟DC的NS3ChimigenTM蛋白呈递引起NS3特异性CD8+T细"包的产生为了评估免疫应答对NS3Chimigen蛋白的特异性，对HLA-A2情形中特异于两种免疫显性NS3表位的T纟田月包百分比进行定量。该百分比通过用轭合于PE的NS3肽/HLA-A2五聚体标记T细胞而确定。在APA中，幼稚T细胞通过用不同浓度NS3ChimigenTM蛋白负载的DC刺激三次，并与无抗原(緩沖液)负载的各个对照DC进行比较。第三次刺激后6天，收获T细胞，NS3特异性T细月包或EBV特异性T细月包(对照)通过四聚体标i己来4企测并利用流式细胞仪分析。CD8+T细胞群中，所迷緩冲液对照组的三个孔中有一个是EBV四聚体标记(阳性四聚体)阳性，且不存在对阴性四聚体标记为阳性的孔(数据未示出)。由于被评估的T细胞来自緩沖液对照处理孔，预计EBV四聚体标记的T细胞数量将相对较^f氐。APA后，标记有NS3五聚体的CD8+T细胞的百分比示于图46中。用NS3ChimigenTM蛋白负载DC导致生成对NS3表位具有特异性的T细胞。在6个^f氐DC浓度孔中，其中4个孔内具有该特异性的CD8+T细胞的显著扩增比较明显。因此，该NS3ChimigenTM蛋白能够诱导生成对NS3免疫显性表位特异的T细胞，且可能存在对其他NS3表位具有特异性的T细胞。实施例4.NS3-NS4B-NS5A多抗原Chimigen3蛋白的结果HCVNS3-NS4B-NS5AChimigenTM蛋白的表达SDS-PAGE后，通过蛋白质印迹分析HCV多抗原Chimigen蛋白在Sf9细月包内表达的时间进程。通过考虑HCV多抗原Chimigen蛋白表达和降解两方面因素，确定蛋白表达的最佳条件为注射后MOI1.5达36个小时。从Sf9细胞沉淀的清亮裂解物中纯化HCVNS3-NS4B-NS5AChimigen蛋白Ni-NTA亲和层析作为纯化的第一步，将HCVNS3-NS4B-NS5AChimigenTM蛋白捕获于Ni-NTASuperflow3柱上。结合于Ni-NTASuperflow34i上的蛋白通过SDS-PAGE并利用蛋白质印迹进行分析。该蛋白质印迹表现出该ChimigenTM蛋白的优势条带(显性条带)，然而硝基纤维素膜银染色则示出另外的非免疫反应性蛋白条带。121HiTRapO-XL离子交换层析通过Ni-NTASuperflow4主捕获的蛋白进一步通过HiTrapQ-XLlmL柱层析加以分离。将蛋白在无逆流馏分中洗脱，且所述馏分在0.4至0.5MNaCl之间的盐浓度下进行洗脱。与无逆流馏分中的蛋白相比，结合于柱上的HCVNS3-NS4B-NS5A多抗原ChimigenTM蛋白含有较少污染物。通过银染色，观察到至少6条非免疫反应性蛋白条带。Superdex200层析裂解物中的蛋白通过Superdex200柱分馏。该HCVNS3-NS4B-NS5A多抗原ChimigenTM蛋白在第一个峰内洗脱。对该馏分进行蛋白质印迹和银染色。该蛋白显示为银染色上的一条优势条带；然而，还可见多个污染物条带。蛋白质印迹的结果表明纯化过程中蛋白聚集。Pherwl-650CToyopearl上的疏水作用层析将含有所述HCVNS3-NS4B-NS5A多抗原Chimigen蛋白的细胞裂解物力口才羊于Phenyl-650CToyopearl⑧上并在未吸收和吸收的馏分两者中洗脱。对该馏分进行蛋白质印迹和4艮染色。在两种馏分中，在蛋白质印迹和硝基纤维素膜的4艮染色上，HCV多抗原Chimigen蛋白可视为一条优势条带。实施例5.HCV核心Chimigen3蛋白的结果HCV核心ChimigenTM蛋白已被提纯并鉴定HCV核心Chimigen3蛋白通过在变性条件下的Ni鳌合层析(Ni-NTAsuperflow)以及随后的阴离子交换层析(CM琼脂糖)进行纯化。纯化的蛋白在12。/。SDS-PAGE凝胶上进行分析，主要条带为融合蛋白(约55KDa)，在28kDa观察到的次要条带很可能是降解产物。在12%SDS-PAGE凝胶上分离后，将纯化的蛋白电转至硝基纤维素膜上。蛋白质印迹通过抗6xHis-HRP辄合抗体、抗Fc特异性HRP扼合的抗体以及抗HCV核心抗体并以抗Fab特异性HRP扼合的抗体作为第二抗体而实施。结合的抗体通过化学发光检测。所述抗体与印迹的结合表明纯化的HCV核心TBD具有完整的N末端、核心和TBD部分。此夕卜，所有3种抗体均才全测到4交j氐分子量条带，表明其为来自全长HCV核心ChimigenTM分子的蛋白，且可能是降解的结果。HCV核心ChimigenTM蛋白结合于未成熟DC对HCV核心ChimigenTM疫苗结合于未成熟DC的能力加以检测。在不同浓度HCV核心ChimigenTM蛋白存在或缺失的情况下，将该细胞在4。C下孵育1小时，并通过FFC或通过共聚焦显孩i镜才企测结合。对于FFC分析，通过生物素化的抗小鼠IgGlmAb和SA-PE-Cy5才企测结合的HCV核心ChimigenTM蛋白。结合HCV核心ChimigenTM蛋白的细胞百分比(阳性细胞％)以及结合的蛋白的相对量(MFI)通过FFC确定。在HCV核心ChimigenTM蛋白为5-40昭/mL的情况下，所述细胞几乎100%结合均为阳性，且结合的HCV核心ChimigenTM蛋白的量存在剂量依赖性递增(图47)。观察到的高结合MFI表明HCV核心Chimigen蛋白与未成熟DC的结合非常有效且处于高水平。还4吏用共聚焦显樣"竟研究了HCV核心Chimigen蛋白的结合。所述结合通过FITC轭合的羊抗鼠IgG进4于^r测。蓝色焚光染料DAPI用来成像核。共聚焦图像和相应的光图像表明所述蛋白在4。C下脉沖1小时后结合于未成熟DC膜。HCV核心ChimigenTM蛋白结合于未成熟DC上的特异性受体由于存在Fc片段，推测所述HCV核心Chimigen蛋白通过其TBD区能结合于未成熟DC上的CD32(FcyRH)。此外，由于其甘露糖糖基化，推测HCV核心ChimigenTM蛋白还结合于C型凝集素受体如CD206(MMR)。为了确定HCV核心Chimigen蛋白的结合特异性，在对CD32或CD206特异性的阻断mAb存在的情况下，将未成熟DC与HCV核心ChimigenTM蛋白一起孵育。所述结合还在竟争性配体、用于Fey受体的鼠IgGFc片段以及用于C型凝集素受体的甘露糖化BSA(mBSA)存在的情况下进行4全测。将未成熟DC与PBS(緩冲液对照)、鼠IgGFc片段(500|ig/mL)、CD32mAb(200pg/mL)、甘露糖化BSA(500jug/mL)、或抗CD206(200昭/mL)在4。C下一起孵育1小时，随后与HCV核心Chimigen蛋白(30叱/mL)在4°C下一起孵育1小时。结合的蛋白用生物素化的抗小鼠IgG1mAb或生物素化的抗HCV核心mAb随后是SA-PE-Cy5进行检测。结合的HCV核心Chimigen蛋白的相对量(MFI)通过FFC而确定。来自所述结合和抑制研究的结果表明HCV核心Chimigen蛋白结合于Fey受体如CD32和C型凝集素受体如CD206(图48)。通过DC的HCV核心Chimigen蛋白呈递导致CD8+和CD4+t细胞中的细月包内IFN-y水平升高对HCV核心ChimigenTM蛋白的功能性免疫应答通过离体抗原呈递分析加以评估。将未成熟DC用PBS(緩沖液对照)、破伤风类毒素(阳性对照)、或不同浓度的HCV核心Chimigen蛋白负载。一旦DC成熟，将其与自体T细胞一起孵育。T细胞功能通过牙全测Thl细胞因子IFN-y的细月包内水平而评估。还通过FFC确定该细胞的CD3和CD8表型。图49A和B分别示出了用抗原负载的成熟DC第三次刺;敫后12小时表达IFN-y的CD8+和CD4+T细j包的百分比。石皮伤风类毒素^皮用作有效抗原呈递的阳性对照。相比于无抗原对照，HCV核心Chimigen蛋白负载的DC诱导IFN-y在CD8+T细胞中的表达显著增加。用HCV核心ChimigenTM蛋白负载的DC刺激后，CD4+T细月包群中也存在IFN-y表达的增加。这些结果表明HCV核心Chimigen蛋白诱导IFN-y在CD8+和CD4+T细胞群中的应答，并暗示在MHCI类和MHCII类通路中该分子均由DC力口工。通过成熟DC的HCV核心Chimigen蛋白呈递引起HCV核心净争异'l"生CD8+T细力包的产生为了评估免疫应答对HCV核心的特异性，对HLA-B7情形中特异于免疫显性HCV核心表位的T细胞百分比进行定量。这是通过用辄合于PE的HCV核心肽/HLA-B7四聚体标记T细月包而实现的。此外，将T细月包用CD4和CD8特异性mAb标记。HCV核心幼稚T细胞通过用由不同浓度HCV核心Chimigen蛋白负载的DC刺激三次，并与无抗原、石皮伤风类毒素或TBD负载的各个对照DC进行比较。第三次刺激后5天，收获T细胞，并通过二维FFC检测HCV核心特异性T细胞。图50中，所述二维FFC点图表明与用HCV核心ChimigenTM蛋白负载的DC—起孵育的T细胞表现出在核心四聚体阳性T细胞中^又有少量增加。美国临时申i青第60/726,701号所:坡露的内容(包括全部附录)均结合于此作为参考。在上述说明书中提及的所有出版物、专利申请以及专利以引用方式结合于此作为参考。对于本领域的4支术人员来说，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本发明的方法和系统的各种更改和变化都是显而易见的。虽然结合特定的优选具体实施方式描述了本发明，^f旦是应该明了，本发明的保护范围不应当不'除当地局限于这些特定的具体实施方式。实际上，所述用于实施本发明的方式的各种更改，对于本领i或的才支术人员来i兌是显而易见的，而这些都在本发明的权利要求的范围内。权利要求1.一种用于引起免疫应答的嵌合抗原，所述嵌合抗原包括免疫应答结构域和靶结合结构域，其中，所述免疫应答结构域包括丙型肝炎(HCV)抗原，而所述靶结合结构域包括抗体片段。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原，其中，所述抗体片段是异源抗体片段。3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原，其中，所述嵌合抗原引起体液免疫应答、细胞免疫应答、或体液免疫应答和细胞免疫应答两者。4.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原，其中，所述嵌合抗原引起Thl免疫应答、Th2免疫应答、或Thl免疫应答和Th2免疫应答两者。5.才艮据权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原，其中，所述免疫应答是体内免疫应答。6.根据权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原，其中，所述免疫应答结构i或包4台一个以上的蛋白。7.才艮据权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原，其中，所述免疫应答结构域包括一种或多种蛋白的一个或多个免疫原部分，所述蛋白选自由HCV核心(1-191)蛋白、HCV核心(1-177)蛋白、HCVp7蛋白、HCVEl蛋白、HCVE2蛋白、HCVE1画E2蛋白、HCVNS3蛋白、HCVNS4B蛋白、以及HCVNS5A蛋白纟且成的纟且。8.才艮据权利要求1-7中任一项所述的嵌合抗原，其中，所述耙结合结构域能够结合于抗原呈递细胞(APC)。9.才艮据权利要求2-8中任一项所述的嵌合抗原，其中，所述抗体片段是Fc片段。10.根据权利要求1-9中任一项所述的嵌合抗原，进一步包括6xHis标签、蛋白酶切割位点、以及用于连接所述免疫应答结构J或和所述草巴结合结构i或的连接子中的一种或多种。11.才艮据权利要求10所述的嵌合抗原，其中，所述连接子选自由亮氨酸拉链、结合于抗生物素蛋白的生物素、以及共价肽4定组成的组。12.才艮据权利要求1-11中任一项所述的嵌合抗原，其中，所述嵌合抗原#皮#唐基化。13.根据权利要求1-12中任一项所述的嵌合抗原，其中，所述嵌合抗原被甘露糖糖基化。14.根据权利要求1-13中任一项所述的嵌合抗原，其中，所述抗体片段包括免疫J求蛋白重链片段。15.根据权利要求14所迷的嵌合抗原，其中，所述免疫球蛋白重链片段包括铰链区。16.根据权利要求14所述的嵌合抗原，其中，所述免疫球蛋白重链片段包括一个抗体片4爻的全部或部分，所述抗体片段选自由CH1、铰链区、Ch2結枸域、以及Ch3结构域组成的组。17.—种将抗原递送至抗原呈递细胞的方法，所述方法包括将才艮据权利要求1-16中任一项所述的嵌合抗原给予所述抗原呈递细胞。18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞是树突细月包。19.一种活4b抗原呈递细力包的方法，所述方法包括使所述纟元原呈递细胞与根据权利要求1-16中任一项所述的嵌合抗原接触。20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述接触发生在体外。21.根据权利要求19所述的方法，其中，所述接触发生在体内。22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述接触发生在人体内。23.根据权利要求21或22所述的方法，其中，所述方法包括将包括根据权利要求1所述的嵌合抗原的组合物给予受治疗者，并且其中所述抗原呈递细月包存在于受治疗者体内。24.根据权利要求20-23中任一项所述的方法，其中，所述接触引起体液免疫应答、细胞免疫应答、或体液免疫应答和细胞免疫应答两者。25.冲艮据一又利要求24所述的方法，其中，所述细胞免疫应答是Thl应答、Th2应答、以及CTL应答中的一种或多种。26.才艮据片又利要求23-25中4壬一项所述的方法，其中，所述受治疗者患有或可能患有免疫-可治疗的疾病。27.才艮据4又利要求26所述的方法，其中，所述免疫-可治疗的疾病是急性感染。28.根据权利要求26所述的方法，其中，所述免疫-可治疗的疾病是慢性感染。29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述慢性感染是慢性丙型肝炎病毒感染。30.根据权利要求26-29中任一项所述的方法，其中，所述免疫-可治疗的疾病是丙型肝炎病毒感染，并且所述免疫应答结构域包括一种或多种蛋白的一个或多个免疫原部分，所述蛋白选自由HCV核心(1-191)蛋白、HCV核心(1-177)蛋白、HCVEl蛋白、HCVE2蛋白、HCVEl-E2蛋白、HCVP7蛋白、HCVNS3蛋白、HCVNS4B蛋白、以及HCVNS5A蛋白组成的组。31.根据权利要求23-30中任一项所述的方法，其中，所述受治疗者经接种以4氏抗病毒感染。32.根据权利要求23-31中任一项所述的方法，其中，所述受治疗者被预防性接种以抵抗病毒感染。33.才艮据权利要求31或32所述的方法，其中，所述受治疗者^皮治疗性接种以抵抗现存病毒感染。34.—种生成嵌合抗原的方法，包4舌(a)提供微生物或细胞，所述微生物或细胞包括编码嵌合抗原的多核苷酸；以及(b)在所述嵌合抗原被表达的条件下，培养所述微生物或纟田月包。35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述微生物或细胞是真核孩i生物或细月包。36.才艮据冲又利要求34或35所述的方法，其中，所述细月包是酵母细月包、才直物细月包或昆虫细月包。37.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中，所述嵌合抗原-故翻译后々务饰以包招4唐基4匕。38.根据权利要求34-37中任一项所述的方法，其中，所述嵌合抗原被翁3译后修饰以包括甘露糖糖基化。39.—种编码嵌合抗原的多核苷酸，所述多核香酸包括编码免疫应答结构域的第一多核普酸部分和编码耙结合结构域的第二多核苷酸部分，其中，所述靶结合结构域包括抗体片辜殳。40.根据权利要求39所述的多核苷酸，其中，所述抗体片段是异源抗体片l殳。41.才艮据4又利要求39-40中任一项所述的多核苷酸，其中，所述多核苦酸包括选自由在SEQIDNO:39以及41-51中列出的核普酸序列组成的组中的核普酸序列。42.根据权利要求39-41中任一项所述的多核苷酸，其中，所述多核普酸编码嵌合抗原，所述嵌合抗原与选自由在SEQIDNO:40以及52-62中列出的氨基酸序列组成的组中的完整的氨基酸序列至少90°/"目同。43.才艮据4又利要求39-42中任一项所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸在严才各的条件下选l奪性地与具有选自由在SEQIDNO:39以及41-51中列出的核苷酸序列组成的组中的核苷酸序列的多核苷酸杂交。44.一种载体，包括根据权利要求39-43中任一项所述的多核苷酸。45.根据权利要求44所述的载体，其中，所述多核苷酸可操作性地连接于转录调节元件(TRE)。46.—种樣t生物或细胞，包括根据权利要求39-43中任一项所述的多核苷酸。47.—种制品，包括根据权利要求1-16中任一项所述的嵌合抗原以及用于将所述嵌合抗原给予需要其的受治疗者的说明书。48.—种药物组合物，包括根据权利要求1-16中任一项所述的嵌合抗原以及药用贞武形剂。49.一种生成嵌合抗原的方法，包括(a)提供纟敛生物或细胞，所述纟效生物或细力包包括编码耙结合结构域-连接子分子的多核苷酸，其中，所述靶结合结构域-连接子分子包括结合于连接子分子的靶结合结构域。(b)在表达所述靶结合结构域-连接子分子的条件下，培养所述樣t生物或细力包；以及(c)在允许使所述连接子与所述免疫应答结构域结合的条件下，接触，所述结合得到嵌合抗原全文摘要本发明披露了嵌合抗原，其包括丙型肝炎病毒(HCV)抗原以及用于引起抗所述抗原的免疫应答的免疫球蛋白的Fc片段。通过将免疫应答结构域(来自HCV核心、包膜或非结构蛋白片段的HCV抗原)和靶结合结构域(Fc片段)呈递给宿主免疫系统，来增强免疫应答。通过靶结合结构域，抗原呈递细胞内化并加工该嵌合抗原用于抗原呈递，从而引起体液和细胞免疫应答两者。文档编号A61K47/48GK101300355SQ200680037974公开日2008年11月5日申请日期2006年10月13日优先权日2005年10月13日发明者安托万·努杰姆,布鲁斯·莫蒂卡,拉詹·乔治,洛恩·蒂勒尔,达坎·旺,马友伦申请人:威瑞克斯医药公司