Atr抑制剂的制作方法

专利名称：：Atr抑制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种抑制ATR(毛细血管扩张性共济失调突变和rad3相关的；ataxia-telangiectasiamutatedandrad3-related)活性的ATR抑制剂，具体涉及一种含有三环性化合物作为有效成分的ATR抑制剂。
背景技术：
：已知ATM(毛细血管扩张性共济失调突变ataxia-telangiectasiamutated)和ATR(毛细血管扩张性共济失调突变和rad3冲目关的；ataxia-telangiectasiamutatedandrad3-related)蛋白质激酶(以下只称为ATM和ATR)，在细胞的DNA损伤相关的修复中扮演着重要的角色(非专利文献1)。通过紫外线(UV)和电离放射(IR)照射，细胞受到DNA损伤，引起关卡信号级联(cascade),为了修复DNA损伤引起细胞凋亡，细胞周期停止于G1/S、中间S期及G2/M期。缺失ATM的AT(毛细血管扩张性共济失调症)患者来源的细胞由于呈现缺少Gl/S和G2/M期关卡(checkpoint)的表现型，因此对IR具有感受性，因此，ATM及其下游的途径对维持染色体很重要。而且，由于一度或稳定的ATR的缺失，染色体的稳定性显著受损，或者在初期胚阶段达到致死(非专利文献2)。令人感兴趣的是，现在已知ATR产生的p53蛋白质(以下只称为p53)或NBSl的磷酸化由于ATM的存在而延迟。这提示，ATR在DNA损伤反应这一点上，是一种ATM的协调分子种类。事实上，ATR在防御DM损伤中起着核心的作用。这些事项表明，ATM或ATR活性的控制不但是维持染色体的稳定性所必需的，而且也可以应用于化学疗法和放射线治疗等抗癌治疗中。非专利文献3公开了由咖啡因(3，7-二氢-1，3,7-三甲基-lH-嘌呤-2，6二酮)辅助的化学疗法，以最小限度解决与非增殖性的骨肉瘤相关的肿瘤的切除。人们认为咖啡因与由化学疗法中引起的DM损伤相反应，抑制ATM和ATR的蛋白质激酶活性，但已知咖啡因相对于ATR而言，更能抑制ATM。近年来，通过siRNA转染细胞，重组体的激酶使激酶活性部位缺失的蛋白质过度表达等，从而清楚了ATR和ATM的主要功能(非专利文献4-6)。但是，由于稳定的敲除了ATR的小鼠是致死的，因此与ATM相比，很少有报道ATR的功能的例子。而且，在不知道ATR的特异性抑制剂的现状中，使用咖啡因和PI3激酶的抑制剂-Wortmannin，广泛进行了化学抑制ATM和ATR的蛋白质激酶活性的研究。因此，通过研究出ATR的特异性抑制剂，对于DNA损伤应答反应中生物化学的信息，进而在抗癌治疗的研究有许多优点，因此期盼抑制ATR活性的药物。这其中，ATM和ATR在细胞中对应于DNA损伤的反应期间，对p53的第15位的丝氨酸残基进行磷酸化。p53在由DNA损伤诱导的Gl/S关卡中，起着核心的作用。根据近年来的认识表明暴露于UV光时，p53的第15位的丝氨酸残基直接被ATM或ATR磷酸化，发生Gl期的细胞周期停止。因此，p53的笫15位的丝氨酸残基的磷酸化是评价在由UV诱导的DNA损伤后以ATM或ATR作为起点的Gl/S关卡是否起作用的合适指标。而且，这种磷酸化在对应于UV的损伤反应中反映ATR的活性。G2/M关卡与Gl/S同样，在DNA损伤细胞中受到ATM和ATR的调控。G2/M关卡十分重要，在p53缺失或突变肿瘤等许多癌细胞中很好地保存。尤其是，缺失p53功能的细胞和G2/M关卡的废止对DNA损伤具有感受性。事实上，与G2/M关卡相关时，ATR对于分裂细胞的染色体维持十分重要。这些结果提示包括ATR蛋白激酶活性的抑制在内的与G2/M关卡相关的一组的抑制成为抗癌治疗的候补方法。另一方面，来源于五味子(SchisandraeFructus)的各种五味子素类和戈米辛(gomisin)类是二卡基环辛烷基因衍生物，是作为生物药剂最常使用的化合物类群。作为该化合物类群中一种的有用性，非专利文献8公开了在S固C-7721肝癌细胞中，五味子素B诱导Caspase-3依赖性细胞凋亡。人们希望对这种化合物在包括肿瘤在内的多种细胞中产生的其它信号调节物质或其它效果展开进一步的研究。一直以来人们所相信的是，根据中国数千年的经验，在含有各种五味子素类和戈米辛类的传统生药、五味子中残留了许多可能性。抗癌剂的70°/。以上来源于天然物质，或希望副作用更少的类似物。本申请申请人，在抗癌治疗增感剂的观点来看，想到将各种五味子素类和戈米辛类应用于与DNA损伤相关的反应中的信号传递途径中。专利文献1:特开平7-206751号公报专利文献2:特开平6-192133号公报专利文献3:特开平2-48592号公报专利文献4:特开平5-123184号公报专利文献5:美国专利申请公开号第2005/0282910号说明书非专利文献l:ShilohY著，"ATMandATR:networkingeellularresponsestoDMdamage",CurrOpin.Genet.Dev.，2001年，11巻，71-7页非专利文献2:CortezD等著，"ATRandATRIP:partnersincheckpointsignaling"，Science,2001年，294巻，1713-6页非专利文献3:TsuchiyaH等箸，"Caffeine-assistedchemotherapyandminimizedtumorexcisionfornonmetastaticosteosarcoma."，AnticancerRes.，1998年，18巻，657-66页非专利文献4:ShackelfordRE等著，"TheAtaxiatelangiectasiageneproductisrequiredforoxidativestress—inducedGlandG2checkpointfunctioninhumanfibroblasts."，J.Biol.Chem.，2001年，276巻，21951-9页非专利文献5:WrightJA等著，"ProteinkinasemutantsofhumanATRincreasesensitivitytoUVandionizingradiationandabrogatecellcyclecheckpointcontrol."，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，1998年，95巻，7445-50页非专利文献6:ShigetaT等著，"DefectivecontrolofapoptosisandmitoticspindlecheckpointinheterozygouscarriersofATMmutations."，CancerRes.，1999年，59巻，2602-7页非专利文献7:SarkariaJN等著，"InhibitionofATMandATRkinaseactivitiesbytheradiosensitizingagent,caffeine.，，，CancerRes.，1999年，59巻，4375-82页非专利文献8:WuYF等著，"Down-modulationofheatshockprotein70andup-modulationofCaspase-3duringschisandrinB-inducedapoptosisinhumanhepatomaSMMC-7221cells"，WorldJ.Gastroenterol,2004年，10巻，2944-48页非专利文献9:Tibbetts等著，Gene&Development,2000年，14巻，2989-3002页非专利文献10:Canman等著，Science,1998等281巻,1677-9页非专利文献11:Rouet等著，Proc.Natl.Acad.Scie.USA,1994年，91巻，6064-8页非专利文献12:Chem.Pharm.Bull.,2003年，51巻，11号，1233-1236页非专利文献13:ActaPharmacologicaSinica，1998年，19巻，4号，313-316页
发明内容发明要解决的问题因此，本发明目的在于提供一种ATR抑制剂，其含有作为ATR蛋白质激酶抑制剂有用的各种五味子素类和戈米辛等三环性化合物作为有效成分。用于解决问题的手段本发明的ATR抑制剂的特征在于含有下式(l)所示的化合物作为有效成分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>而且，本发明的ATR抑制剂的特征在于含有下式(2)所示的化合物作为有效成分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>而且，本发明的ATR抑制剂的特征在于含有下式(3)所示的化合物作为有效成分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>而且，本发明的ATR抑制剂的特征在于含有下式(4)所示的化合物作为有效成分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>而且，本发明的ATR抑制剂的特征在于含有下式(5)所示的化合物作为有效成分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(5)HaCD而且，本发明的ATR抑制剂的特征在于含有下式(6)所示的化合物作为有效成分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(6)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>而且，本发明的ATR抑制剂的特征在于含有下式(7)所示的化合物作为有效成分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>而且，本发明的ATR抑制剂的特征在于含有下式(8)所示的化合物作为有效成分(8〉<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>而且，本发明的ATR抑制剂的特征在于含有下式(9)所示的化合物作为有效成分而且，本发明的ATR抑制剂的特征在于含有下式(10)所示的化合物作为有效成分其中，作为本发明的ATR抑制剂，优选含有上式(l)-(5)所示的化合物作为有效成分。本发明的ATR抑制剂中，前述ATR活性优选为蛋白质磷酸化活性。本发明的ATR抑制剂中，前述蛋白质磷酸化活性优选为对细胞周期关联蛋白质进行磷酸化的活性。本发明的ATR抑制剂中，前述细胞周期关联蛋白质优选为p53。本发明的ATR抑制剂中，前述细胞周期关联蛋白质优选为选自于Brcal和Chkl构成的组中。发明的效果如果按照本发明，可以在体内和体外特异性抑制ATR活性。图1:是表示经UV照射的A549细胞中五味子素B对生存率的影响的图。图2:是表示经UV照射的A549细胞中五味子素B对细胞周期的影响的图，(A)是表示对总细胞数的磷酸化组蛋白H3量的图，(B)是表示以磷酸化组蛋白H3量作为指标，将分裂细胞数在所有细胞中所占比率图像化的图。图3:是表示经电离放射线照射的A549细胞中五味子素B对分裂细胞数的影响的图。图4:是表示经UV照射或电离放射线照射的A549细胞中五味子素B对p53磷酸化的影响的图。图5-1:是表示经UV照射的A549细胞中五味子素B对p53磷酸化的浓度依赖性影响的图。图5_2:是表示经UV照射的A549细胞中ATR抑制剂对p53磷酸化的影响的图。图6:是表示A549细胞中五味子素B对细胞周期的影响的图。图7:是表示五味子素B对ATR和ATM所具有的磷酸化活性的影响的图，(A)为对应于ATR的图，(B)是对应于ATM的图。图8:是表示经UV照射的AT2KY细胞中，五味子素B对各种蛋白的磷酸化的影响的图。图9:是表示经抑制ATR或ATM表达的UV照射的A549细胞中，五味子素B对各种蛋白的磷酸化的影响的图。图10:是表示A549细胞中，五味子素B对MAPK的磷酸化的影响的图。具体实施方式本发明的ATR抑制剂可以利用合成产品、天然产品等各种市售的可以利用的化合物，也可以按照专利文献1等中记载的^^知的合成方法制备，而且，也可以是按照专利文献2等公知的方法从五味子(SchisandraChinensis)来源的FructusSchisandrae等天然生药中提取/纯化出的物质。具体是，作为上式(l)所示的五味子素B(SchizandrinB;SchB)，可以是通过以下方式获得如专利文献2中的记载，用n-已烷等烃类溶剂或甲醇等醇类溶剂加热一定时间提取五味子(FructusSchisandrae)后，置于柱层析，对含有所获得的非水溶性物质和水溶性物质的混合物的溶液浓缩干燥，在其中添加氢氧化钾和甲醇的混合液进行皂化，在这样获得的原料中加入甲醇搅拌溶解后，用氢氧化钾水溶液溶解，然后除去上述曱醇，析出目的物质的非水溶性物质。而且，作为上式(2)所示的戈米辛C(GomisinC;GC)，可以通过以下方式获得如上述专利文献3所示的方法，用石油醚等弱极性溶剂提取后，再使用石油醚，n-庚烷等弱极性水不溶性溶剂和甲醇等高极性水溶性溶剂进行分配提取后，根据需要用柱层析、通过高效液相层析等分离目的物质。而且，作为上式(3)所示的戈米辛G(GomisinG;GG),可以是如上述非专利文献12中所示，从阿里山五味子(Schizandraarisanensis)的干燥干中用乙酸乙酯提取，根据需要用柱层析进行纯化的制品。而且，作为上式(4)所示的戈米辛H(GomisinH;HG)，可以如上述专利文献5中记载，从北五味子(Schizandrachinensis)中获得。而且，作为上式(5)所示的戈米辛J(GomisinJ;GJ)，可以通过专利文献l中所示的内容，在获得通过将从五味子中提取的脱氧五味子素酰基化合成的下式(B)所示的化合物后，脱烷基(式中的R!基)，脱酰基化(式中，C0R基)获得。(式中，Ri表示低级烷基，R表示氢原子或低级烷基)。而且，上式(6)所示的五味子素(Schizandrin;Sch)，可以如专利文献3所示，用石油醚等低极性溶剂和甲醇等高极性水溶性溶剂进行分配提取后，根据需要，通过柱层析、高效液相色谦等分离目的物质。而且，作为上式(7)所示的戈米辛A(GomisinA;GA),可以通过以下方式获得除按照上述专利文献3的方法之外，如专利文献4中的记载，还原下式(A)所示化合物的5元环二羟基化后，再进行氧化反应、甲磺酰化反应，从获得的dl-五味子素(III)中分离旋光异构体。13而且，作为上式(8)所示的戈米辛B(GomisinB;GB)，可以通过以下方式获得通过按照上述非专利文献12中记载的内容，用乙酸乙酯从阿里山五味子(Schizandraarisanensis)的干燥干中进行提取，根据需要使用柱层析进行纯化。而且，上式(9)所示的戈米辛N(GomisinN;GN)，可以通过专利文献5中记载的内容，来源于北五味子(Schizandrachinensis)。而且，上式(10)所示的五味子素C(Schizandrinc;SC),可以通过非专利文献13所示内容，使用五味子的石油醚提取物通过柱层析纯化获得。实施例(实施例1)经UV照射的A549细胞中五味子素B对生存率的影响将A549细胞(AmericanTissueTypeCollection公司制)以500个/6Qmm皿接种于含有10°/。胎儿牛血清(FBS)、1QQug/mL链霉素和100个单位/mL青霉素的DMEM培养基(以下称为增殖培养基)中培养一昼夜后，在培养基中以luM和10pM的终浓度添加五味子素B(制备含有终浓度为10g/L的五味子素B的DMSO溶液，再在培养基中稀释成培养基中不到5g/L的DMS0浓度，再使用。以下相同)。添力pl小时后，用Stratalinker(Stratagene^^司制)照射20和50J/ci^的UV(波长采用254nm。以下相同)，再次更换成具有与上述同浓度的五味子素B的培养基(以下，称为含有五味子素B的培养基)，再连续培养14天后，用磷酸緩沖生理盐水(PBS)清洗细胞，用2%亚曱蓝，按照克隆法，计算存活的细胞数。结果示于图1。图1，横轴表示照射的UV的剂量，纵轴以百分比表示相对于未处理组，处理组中存活细胞的比率。图中，O表示没有用五味子素B处理的组，A表示经1liM的五味子素B处理的组，B表示经10jiM的五味子素B处理的组。而且，用平均土标准误差(n-3)表示各组。(实施例2-l)经UV照射的A549细胞中五味子素B产生的对细胞周期的影响在增殖培养基中以3x1(T个/cm2的终浓度在10mm皿中接种A549细胞，培养一昼夜后，以30laM的终浓度在培养基中添加五味子素B。1小时后，除去培养基，照射20和50J/m2的UV，在含有与上述浓度相同的五味子素B的培养基中培养细胞l小时。然后，按照下述的组蛋白H3磷酸化量的测定，测定细胞中的组蛋白H3磷酸化量。结果示于图2。图2(A)为经五味子素B处理时获得的流式细胞仪测试的结果，图2(A)中，圆圏中的部分表示G2/M期的细胞群，其上方记载的数据表示G2/M期的细胞群数相对于总细胞数的比率。而且，图2(B)为以图形表示该比率的图。(实施例2-2)在实施例2-1中，除了照射20J/n^的UV代替20和SOJ/n^的UV,使用上式(i)-(io)中所示的化合物和下式(C)所示的当归酰戈米辛A(AngeloygomisinA;AGA)(终浓度30pM)代替终浓度为30juM的五味子素B之外，进行与实施例2-l相同的步骤，获得了G2/M期的细胞群数相对于总细胞数的比率。结果示于表l。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(实施例3)经电离放射线照射的A549细胞中五味子素B对分裂细胞数的影响在增殖培养基中以3x104个/(^2的终浓度在10mm皿中接种A549细胞，培养一昼夜后，以30nM的终浓度在培养基中添加五味子素B。l小时后，除去培养基，照射3Gy的电离放射线，在含有与上述浓度相同的五味子素B的培养基中培养细胞1小时。对于该细胞，进行下述的组蛋白H3磷酸化量的测定。结果示于图3。各个数值与图2(B)相同。(实施例4)经UV照射或电离放射线照射的A549细胞中五味子素B对p53磷酸化的影响在增殖培养基中以3x104个/(1112的终浓度在10mm皿中接种A549细胞，培养一昼夜后，以30yM的终浓度在培养基中添加五味子素B。l小时后，除去培养基，照射20J/m2的UV，培养3小时(以下将这种细胞群称为uv细胞群)。而且，同样，培养一昼夜，在培养基中以30jiM的终浓度添加五味子素B，培养1小时，除去A549细胞的培养基，照射10Gy的电离放射线(Y射线)，在含有与上述浓度相同的五味子素B的培养基中培养细胞2小时(以下将这种细胞群称为IR细胞群)。而且，UV细胞群和IR细胞群中的任一者，从照射的15分钟前直至下述的细胞回收，都在50um的N-乙酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-正亮氨酸(N-acetyl-L-Leucyl-L-Leucyl-norleucinal，以下称为IXnL;Sigma公司制，MO，美国)存在下培养细胞。然后，按照下述的蛋白制备提取细胞中的蛋白质后，按照下述的免疫印迹分析，对p53蛋白的第15位的丝氨酸残基的磷酸化体(P-p53(Ser15))、p53蛋白(p53)、ATM蛋白的第1981位丝氨酸残基的磷酸化体(P-ATM(Ser1981))和甘油醛-3-磷酸脱氬酶(GAPDH)，进行免疫印迹分析。结果示于图4。(实施例5-1)经UV照射的A549细胞中五味子素B对p53磷酸化的浓度依赖性影响在增殖培养基中以3x1(T个/cn^的终浓度在10mm皿中接种AW9细胞，培养一昼夜后，以10、30和100uM的终浓度在培养基中添加五味子素B。1小时后，除去培养基，照射20〃1112的UV。并且，与实施例4相同，使用LLnL处理细胞。然后，按照下述免疫印迹用与上述同浓度的五味子素B处理1小时的细胞，研究p53和p"的第l5位的丝氨酸残基的磷酸化体(P-p53(Serl5))的表达。结果示于图5-1。(实施例5-2)除了分别添加上述式(1)-(10)所示的化合物和上述式(C)所示的化合物(30jaM的终浓度)来代替实施例5-1中在培养基中以30uM的终浓度添加五味子素B，照射25J/fl^的UV替代20J/i^的UV之外，与实施例5-1相同进行，研究p53的第15位的丝氨酸残基的磷酸化体(P-p53(Serl5))的表达。此时获得的电泳图像示于图5-2，对于相当于P-p53(Serl5)的条带强度(用微管蛋白标准化的条带)，以经UV照射获得的作为100%时的由各化合物获得的强度的相对比率示于表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>(实施例6)A549细胞中五味子素B对细胞周期的影响在增殖培养基中以3xl0'个/cm'的终浓度在10mm皿中接种A5W细胞，培养一昼夜后，以30uM的终浓度在培养基中添加五味子素B。4小时后，按照下述FACS分析，研究细胞周期。FACS分析的结果示于图6。(实施例7-1)五味子素B产生的对ATR和ATM所具有的磷酸化活性的影响在按照下述的磷酸化反应用ATR混合液和ATM混合液的制备荻得的磷酸化反应用ATR混合液和ATM混合液中添加作为底物的1jag的重组PHAS-I蛋白质(AlexisBiochemicals公司制)，与之同时添加五味子素B，添加具有适当浓度的32P-ATP的300jiMATP，使之于S0。C反应20分钟。用该反应液的4倍量的SDS加样緩沖液(200mMTris-HCl(pH6.8)，400mMDTT和8。/。SDS)停止反应，将该混合液置于12%SDS-PAGE,将凝胶干燥后，对于与上述的混合液中的32P-ATP的条带，用自动放射照相法计算Y线剂量。结果示于图7。(A)和(B)分别表示ATR和ATM的相对活性，横轴表示五味子素B的浓度，纵轴以相对于不添加五味子素B的计算的相对值表示。(实施例7-2)本发明的ATR抑制剂对ATR所具有的磷酸化活性的影响除了使用上述式(1)-(5)所示的化合物和上述式(C)所示的化合物代替实施例7-1中的五味子素B之外，与实施例7-l相同进行，根椐获得的直线计算I"值。该值示于表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>(实施例8)经UV照射的AT2KY细胞中，五味子素B对各种蛋白的磷酸化的影响以3xl(T个/cmS将AT2KY细胞(/1^久廿4工^只振兴财团(大阪))接种于含有15%FBS、100jag/mL链霉素和100个单位/mL青霉素的RPMI1640培养基中，培养一昼夜。在培养基中以30jaM的终浓度添加五味子素B。添加1小时后，除去培养基，照射20J/cW的UV。然后，对于用与上述浓度相同的五味子素B处理4小时的细胞，按照下述免疫印迹分析，研究p53的笫15位的丝氨酸残基的磷酸化体(P-p53(Ser15))、Brcal的第1423位的丝氨酸残基的磷酸化体(P-Brcal(S1423))和Chkl的笫345位的丝氨酸残基的磷酸化体(P-Chkl(S345))的表达。结果示于图8。(实施例9)经抑制ATR或ATM表达的UV照射的A549细胞中，五味子素B对各种蛋白的磷酸化的影响在增殖培养基中以3x1(T个/ci^的终浓度在10mm皿中接种A549细胞，培养一昼夜后，用Oligofectamine(Invitrogen公司制)和Opti-MEM(Invitrogen公司制)，用按照下述siRNA的制备获得的各个双链siRNA(siGFP，siATM和siATR)转染细胞。培养一晚后，更换成新鲜的增殖培养基，72小时后，用30jliM的五味子素B处理l小时，除去培养基，照射20J/i^的UV。然后，对于经与上述浓度相同的五味子素B处理3小时的细胞，按照下述免疫印迹，研究p53蛋白的第15位的丝氨酸残基的磷酸化体(P-p53(S15))、Chkl的第345位的丝氨酸残基的磷酸化体(P-Chkl(S345))、ATM蛋白(ATM)、ATM蛋白的第1981位丝氨酸残基的磷酸化体(P-ATM(Serl981))和ATR蛋白(ATR)的表达。结果示于图9。而且，记载于图9中的P-p53(S15)和P-Chkl(S345)栏下的表达比率表示经对照siGFP和UV照射获得的各个蛋白的条带强度为1.0时各条带的相对强度。(实施例10)A549细胞中，五味子素B对MAPK的磷酸化的影响在增殖培养基中以3x1(T个/cm2的终浓度在IO鹏皿中接种A549细胞，培养一昼夜后，在无血清的增殖培养基中再培养16小时。然后，用50nMPD098059(Sigma公司制)或30jaM五味子素B处理细胞，再用100ng/mLPhorbo卜12-肉豆蔻酸13-醋酸(PMA;Sigma公司制)处理5分钟。然后，按照下述的免疫印迹分析，研究细胞的42kDa和44kDa促细胞分裂剂活性化蛋白质激酶(p42MAPK和p44MAPK)和它们的磷酸化体的表达。结果示于图10。(组蛋白H3磷酸化量的测定)用PBS清洗细胞后，用70%经冰冷却的乙醇固定。在其中添加含有0.25%TritonX-100的PBS,置于冰上30分钟后，回收细胞，离心分离(500G，5分钟)，在获得的细胞小球中添加含有1%牛血清白蛋白(BSA)和lpg抗兔血清(特异于组蛋白H3的第13位的丝氨酸残基的磷酸化体)的PBS(100jiL)，室温下^L置4小时。然后，用含有1。/。BSA的PBS将其清洗，添加用含有1。/。BSA的PBS稀释至IOO倍的结合了FITC的山羊抗兔IgG抗体，在黑暗的地方放置30分钟。再按照下述FACS分析进行PI染色后，用流式细胞仪(Beckman-Coulter公司制)测定磷酸化组蛋白H3量。(免疫印迹分析)对50|ig的蛋白(按照下述的蛋白制备来制备的)进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(12.5%)，按照常规方法将电泳后的各个蛋白转移到硝基纤维素膜上，用含有5%脱脂乳和0.l%TrionX-100的Tris緩冲生理盐水(TBS-T)，室温下进行1小时封闭反应。用以下所示的所希望的抗体在4X:将获得的膜温育16小时，然后，用结合了来源于山蓊菜的过氧化酶的二级抗血清(针对上述所希望的抗体的来源动物的)在室温下培养1小时。然后，用ECL反应试剂盒(Amersham公司制)和化学发光膜(Amersham公司制)使靶蛋白可视化，获得蛋白图像。<抗体>p53(Calbiochem^^司制)磷酸化p53抗体(Cellsignalingtechnology公司制)磷酸化ATM抗体(Rockland公司制)磷酸化Chkl抗体(Cellsignalingtechnology公司制)ATR抗体(Bethyl/>司制)微管蛋白抗体(Sigma公司制)GAPDH抗体(SantaCruz/〉司制)磷酸化Brca1抗体(Upstate公司制)抗MAPK抗体和抗磷酸化MAPK抗体(Cel1Signaling公司制)(蛋白制备)用经冰冷却的PBS从培养皿中剥离细胞，用冷PBS清洗两次后，进行离心分离，在获得的细胞小球中用下述UTB緩冲液使之溶解，制备细胞来源的蛋白混合物。用蛋白质测试盒(Bio-Rad公司制，ProteinAssayKit)测定蛋白量。〈UTB緩冲液〉歸尿素150mM2-巯基乙醇50mMTris(pH7.5)(FACS分析)用PBS清洗细胞后，用70%经冰冷却的乙醇固定。在通过离心分离回收的细胞小球中加入PBS清洗后，在进行离心分离。将细胞小球悬浮于含有终浓度为100|LiM的碘化丙锭(PropidiumIodide,Sigma/>司，以下称为PI)和40jag/mL的RNaseA的溶液(PI溶液)，在室温下培养30分钟。然后，用流式细胞仪(Beckman-Coulter公司制)分析细胞周期。(磷酸化反应用ATR混合液和ATM混合液的制备)在磷酸化反应用ATR混合液中，使用非专利文献9等公知的方法制备的经Flag标记的ATR。具体是，非专利文献9中公开的方法为将ATR基因(序列号4)的BamHl-Swal片段(lkb)置换为对应于N末端具有Flag(DYKDDDDK)的ATR的基因，将通过PCR扩增的基因产物导入到pcDNA3.1中的质粒，从中合成经Flag标记的ATR。而且，在磷酸化反应用ATM混合液中，使用非专利文献IO和11等公知的方法和快速改变定点诱变试剂盒(QuickchangeSite-DirectedMutagenesisKit,Stratagene/^司制)制备的经Flag标i己的ATM。按照下述的磷酸钙法以这些经Flag标记的ATR和ATM质粒(序列号4和5)转染293T细胞(ATCC编号CRL-11268)，培养两天。然后，于4XM小时用20lig抗Flag-M2单克隆抗体1(Sigma公司制)，使5mg按照将上述UTB緩冲液更换为下述的IP緩冲液进行的上述制备获得的蛋白混合物免疫沉淀。用结合了蛋白质G琼脂糖(Amersham公司制)的小珠与上述产物一起于4'C温育1小时。用下述TGN緩冲液清洗所获得的免疫复合体两次，再用下述激酶緩冲液清洗1次，获得磷酸化反应用ATR混合液和ATM混合液(序列号6和7)。〈IP緩冲液〉lOmMTris(pH7.5)lmMEDTAlmMEGTA15隨NaCl0.5%NP-401%TritonX-100lmM苯甲基磺酰氟化物(PMSF)2yg/mL胃酶抑素2jig/mL抑肽酶lmMp，p，-二氯二苯三氯乙烷(DDT)〈TGN緩冲液〉50mMTris(pH7.4)50raM磷酸甘油15隨NaCl1%Tween2010%甘油<激酶緩冲液>lOmMHepes(pH7.5)50mM磷酸甘油5隨NaCllOrnMMgCl210mMMnCl2<砩酸钾法>在增殖培养基中以2x1(T个/cm'的终浓度在10mm皿中接种293T细胞，培养一昼夜。然后，将上述Flag-ATM和Flag-ATR与终浓度为25mM的BES(N，N-二(2-羟基乙基)-2-氨基甲磺酸)和25mM的CaCl2混合，将其转染细胞。培养一晚后，更换成新鲜的增殖培养基，培养两天。(siRNA的制备)按照HPGe醒eWidesiRM(QIAGEN公司制)合成针对ATR、ATM和绿色荧光蛋白(GFP)的双链siRNA(分别对应序列表中记载的序列号1、2和3)。将获得的双链siRM分别命名为siATR、siATM和siGFP。(考察)ATM(毛细血管扩张性共济失调突变)和ATR(毛细血管扩张性共济失调和rad3相关的)在针对细胞周期的DNA损伤的反应中涉及的信号传递中扮演着重要的角色。ATM和ATR对Chkl、p53、NBS1、Brcal、SMC1等所有的关卡.蛋白质群和转录因子进行磷酸化。为了避免作为癌症发生成因的下一世代继续持有DNA损伤，上述关卡信号控制整个细胞周期。ATM或ATR的缺失，通过由UV或IR照射或抑制诱导性药剂诱导的DM损伤，使细胞的存活率降低。这表明受到损伤的DNA的修复，维持和管理中需要ATM和ATR。在本发明中，本申请申请人公开了北五味子(SchisandraChinensis)的成分的五味子素B使UV照射后的细胞的存活率以浓度依赖性显示下降。这表明体内的DNA损伤反应中，五味子素B对关卡信号途径具有抑制效果。组蛋白H3，正常的分裂细胞中其第IO位的丝氨酸残基被磷酸化，成为从G2期向M期移行的指标，但由于DNA损伤，G2期/M期关卡一旦行使功能，磷酸化组蛋白H3阳性细胞的比率就减少。如果根据图2,通过20和50J/ii^的UV照射，磷酸化组蛋白H3的比率减少。另一方面，经50J/m2的UV照射并不明显，经20J/m2的UV照射，上式(l)所示的五味子素B使G2/M关卡显著崩溃。事实上，低剂量的UV照射中，对应于DNA损伤的反应中，五味子素B使G2/M关卡完全无效。而且，上式(1)-(10)所示的化合物和上式(C)所示的化合物和上式(C)所示的化合物也使G2/M关卡(checkpoint)完全无效。另一方面，对A549细胞进行IR照射时，不会引起G2/M关卡的剧烈抑制。已知，一般来说，IR照射使ATM活性化，UV照射使ATR活性化，使细胞周期关卡行使功能。根据这些结果显示，五味子素B在经低剂量的UV照射诱导的DNA损伤的过程中的G2/M关卡中，比起对ATM来说而是对ATR活性具有抑制效果。同样事项，也可以适用于上式(1)-(10)所示的化合物等本发明的ATR抑制剂的其它化合物。为了验证本发明的ATR抑制剂对体内的ATR激酶活性的抑制活性，研究了经IR或UV照射诱导的DNA损伤后的p53磷酸化。已知p53在体内，在多个部位受到各种蛋白质激酶磷酸化，对于细胞来说是非常重要的转录因子。考虑癌症治疗中DM损伤反应时的p53的功能时，细胞受到UV照射，yIR照射和甲基化剂的抑制时，p53的第15位的丝氨酸残基中，被ATR和ATM特异性磷酸化。本发明中，对A549细胞进行20J/n^的UV照射后，p53磷酸化由于五味子素B而减少，经IR照射并未减少。IR照射后ATM的第1981位的丝氨酸残基被显著活性化，而经20J/m2的UV照射仅少量被活性化，而五味子素B在任意一种DNA损伤中，对ATM活性都不产生影响。而且，也没有发现五味子素B所产生的细胞周期的局部的积累和偏向。而且，观察到了上式(1)-(10)所示的化合物对p53磷酸化的抑制。根据这些结果，表明经20J/m2的UV照射所产生的p53的第15位的丝氨酸残基的磷酸化的减少只由ATR引起。非专利文献7公开了咖啡因对于A549腺癌细胞中ATM和ATR蛋白激酶的抑制效果。本申请申请人通过与该文献相同的方法，研究了在体外五味子素B对ATM和ATR的蛋白质激酶活性的影响。如果将五-未子素B与激酶緩冲液一起温育，就会抑制ATM和ATR，五味子素B抑制ATR蛋白质激酶比抑制ATM更为显著。事实上，五味子素B产生的对ATR的ICs。是ATM的约240倍。而且，观察到上式(1)-(5)所示化合物显著抑制ATR蛋白质激酶活性。细胞的存活率和激酶活性的结果表示，诱导细胞的DNA损伤的UV照射的反应中，ATR蛋白质激酶活性受到抑制。为了研究五味子素B对DNA损伤所涉及的关卡的影响，使用AT患者来源的成纤维细胞(AT2KY)和siRNA处理细胞。如果对AT7KY进行UV照射，不仅磷酸化p53以及关卡途径中ATM和ATR的作为下游分子的Brcal(Serl423)和Chkl(Ser345)的磷酸化体就增加。而且，只是在对照和ATM所涉及的经siRNA处理的细胞中，五p木子素B使p53和Chkl的磷酸化减少。而且，经siRNA处理的细胞中，并没有观察到关卡的蛋白质所涉及的磷酸化有所减少。根据这些结果，表明五味子素B在体内介导ATR蛋白质激酶活性的抑制，抑制DNA损伤所涉及的关卡的信号传递途径。为了确认五味子素B在体内对ATR抑制的特异性，研究了称为促细胞分裂剂活性化蛋白质激酶(MAPK)的EM的血清刺激和PMA处理对由特异的活性化系统所产生的磷酸化的效果。ERK的磷酸化，通过上述的参照方法，受到强力促进。该ERK磷酸化完全不受五味子素B的影响。因此清楚了，针对DNA损伤的反应中，五味子素B的有效性高度特异于ATR活性。在本发明中，通过对细胞的UV照射诱导的DNA损伤应答反应(关卡)中出现五味子素B的效果。由于敲除了ATR的胚细胞是致死的，因此预测ATR在哺乳类成长的阶段扮演着重要的角色。这表明染色质的不稳定化，对应于生物体内连续生成的自由基的关卡的缺失，和生长过程中的细胞性DNA的复制压力所产生的关卡中需要ATR。另一方面，由于ATR起ATM的后备的作用，因此关卡在AT患者来源的细胞(遗传上ATM不起作用的细胞)中维持关卡。这表明，包括肺瘤发生的增殖性细胞中，ATR蛋白质激酶十分重要。由于可以通过ATR的激酶活性抑制阻止患者中DM损伤关卡，因此根据本发明的见解，五味子素B在放射线疗法和化学疗法等的抗癌治疗中可具有优势。咖啡因，与ATR相比，具有1/5的ICs。的ATM的活性。因此，可以预见在临床中癌症治疗时，如果五味子素B单独或与咖啡因组合进行放射线疗法和化学疗法，它们的感受性会显著增加。非专利文献3报告了在临床中试验性地使用咖啡因作为化疗剂或放射线治疗的辅助。该文献公开了，通过由咖啡因辅助的治疗，与分别处理化疗剂或放射线疗法相比，骨肉瘤的尺寸减少且最小化。这些结果表明，咖啡因抑制ATM和ATR蛋白质激酶活性，在增殖肿瘤的细胞周期的任一阶段，也都会带来对DNA损伤所涉及的关卡的抑制。因此，作为由五味子素B辅助的化学疗法和放射线疗法，五味子素B存在临床试验性应用的可能性。进一步研究所涉及的，对于在咖啡因的200680039106.6说明书第23/23页临床试验的同时使肿瘤消失或使之最小化所涉及的效率化是否可能，需要研究与五味子素B—起使用的效果。尤其是，五味子素B，为希望是在患者中完全没有副作用的天然植物体取物中的成分。即使化疗/放射线疗法的给药量和剂量降低至最低限度，可预计上述这种ATM/ATR抑制剂具有与以往相同或其之上的效果，因此对于化疗/放射线疗法，通过组合五味子素B和咖啡因，可以预计将对患者的副作用抑制到最小限度。以上，通过本发明的优选的实施方式对本发明进行了说明。其中，公开了特定的具体例子说明本发明，但是清楚的是，不脱离权利要求的范围中定义的本发明的广泛的目的和范围，可以对这些具体例子增加各种修正和改变。即，本发明不受具体例子的详细内容和添加的附图限定和解释。权利要求1、一种ATR抑制剂，其特征在于含有下式(1)所示的化合物作为有效成分2、一种ATR抑制剂，其特征在于含有下式(2)所示的化合物作为有效成分(2)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3、一种ATR抑制剂有效成分其特征在于含有下式(3)所示的化合物作为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>(3)4、一种ATR抑制剂有效成分其特征在于含有下式(4)所示的化合物作为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>5、一种ATR抑制剂，其特征在于含有下式(5)所示的化合物作为有效成分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>6、一种ATR抑制剂，其特征在于含有下式(6)所示的化合物作为有效成分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>7、一种ATR抑制剂，其特征在于含有下式(7)所示的化合物作为有效成分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>8、一种ATR抑制剂，其特征在于含有下式(8)所示的化合物作为有效成分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>9、一种ATR抑制剂，其特征在于含有下式(9)所示的化合物作为有效成分:10—种ATR抑制剂，其特征在于含有下式(10)所示的化合物作为有效成分11、根据权利要求1-10任一项中记载的ATR抑制剂，其特征在于前述ATR活性为蛋白质磷酸化活性。12、根据权利要求11中记栽的ATR抑制剂，其特征在于前述蛋白质磷酸化活性为对细胞周期关联蛋白质进行磷酸化的活性。13、根据权利要求12中记载的ATR抑制剂，其特征在于前述细胞周期关联蛋白质为p53。14、根据权利要求12或13中记栽的ATR抑制剂，其特征在于前述细胞周期关联蛋白质选自于Brcal和Chkl构成的组中。全文摘要本发明的目的在于提供一种ATR抑制剂，其含有作为ATR蛋白质激酶抑制剂有用的各种五味子素类和戈米辛类等的三环性化合物作为有效成分。文档编号A61K36/00GK101291668SQ20068003910公开日2008年10月22日申请日期2006年10月18日优先权日2005年10月21日发明者小西彻也,滨森康雄,西田浩志申请人:株式会社新泻Tlo