用于预防甘油三酯的酶促水解的基于柠檬酸三乙酯的组合物的制作方法

专利名称：：用于预防甘油三酯的酶促水解的基于柠檬酸三乙酯的组合物的制作方法用于预防甘油三酯的酶促水解的基于柠檬酸三乙酯的组合物发明领域本发明涉及在营养品、化妆品或药品中用于保护甘油三酯免于酶促水解的新组合物。现有技术甘油三酯或三酰基甘油包含三个分别与甘油的三个羟基基团酯化的脂肪酸。甘油三酯是疏水的非极性分子。在简单生物体和复杂生物体内，植物或动物来源的甘油三酯构成了重要的能量储备。甘油三酯存在于许多食物中，例如(仅用于说明而没有限制性目的)在植物油如橄榄油、向日葵油、花生油等，以及动物性脂肪如黄油中。甘油三酯对皮肤具有特别的功能作用，特别是在病理状况如痤疮、脂溢性皮炎和其它由于某些能够水解该分子、释^L脂肪酸和甘油的酶(属于酯酶类，特别是脂肪酶类)的作用而使甘油三酯的完整性发生改变的病症中有作用。根据现有技术，当与甘油三酯组合时，还没有对于水解甘油三酯的酶而言能够用作优选底物的化学方法，所迷的酶属于酯酶类，更具体而言是脂肪酶类(无论其来源是细菌、植物或动物)。现在，发明者所进行的下述特别研究和实验，本文认为已经显示出活性成分柠檬酸三乙酯在抑制甘油三酯的酶促水解中发挥了特别的活性。在猪的脂肪酶存在下，使用显色试验通过分析所释放的脂肪酸来评估甘油三酯水解的抑制。该试验包括两个不同的阶段，一个是酶促反应试验，其在猪的脂肪酶存在下能够水解甘油三酯释放出橄榄油，接着是显色试验，测定所形成的游离脂肪酸。猪的脂肪酶在底物(橄榄油)存在下和合适的孵育条件下催化下述反应甘油三酯+水~~甘油二酯+脂肪酸根据脂肪酸的量，间接评估酶促活性及甘油三酯的水解。为了排除所分析的底物的抑制活性，将三个不同浓度的待测底物(5%、1%和0.5%，于水中)在两个不同的反应时间内(15和30分钟)进行测试。为使底物完全溶解，将5%浓度的溶液于室温放置72小时。在使用前将猪的脂肪酶在4X:下溶于去离子水中，浓度为2000U/ml。使用橄榄油作为甘油三酯的来源。反应使用的緩冲液为TrisHC1200mM，pH=7.7，反应温度为37'C。在不同浓度下，按有无底物的情况进行试验。将下述试剂在37'C混匀去离子水(150jiL)，緩冲液(100jiL)，橄榄油(300jiL)。对于样品(TEC5。/。、1%及0.5%)而言，用150fiL的待测溶液代替水。随后，将酶溶液(200nL)加入，反应于37。C分别进行30和15分钟。在15和30分钟的反应时间终点，加入300jiL的95%乙醇终止反应。使用50jiL含有所形成的游离脂肪酸的所述溶液作为生色剂量，使用提供了进行下述反应所必需的试剂的特定试剂盒进行测定。在乙酰辅酶A合成酶(AcylCS)和腺苷-5'-三磷酸酯(ATP)存在下，游离脂肪酸被转化成乙酰辅酶A、腺苷-5'-单磷酸(AMP)和焦磷酸酯。在乙酰辅酶A氧化酶(ACOD)存在下，乙酰辅酶A和氧(02)反应形成2，3-烯酰辅酶A。所产生的H202在过氧化物酶(POD)存在下将2，4，6-三溴-3-羟基-苯甲酸(TBHB)及4-氨基安替比林(4-AA)转化成红色染料。样品在加入ACOD之前和之后于546nm波长下读数，该反应在室温下进行。脂肪酸+CoA+ATP~乙酰CoA+AMP+焦磷酸酯乙酰CoA+02~烯酰-coA+H202H202+4画AA+TBHB~染料+2H20+HBr按照所述方法，从吸光度值可见，柠檬酸三乙酯能够保护甘油三酯免于脂肪酶的酶促水解多达85°/。的比例。与对照相比，脂肪酸的还原(％)15'30,吸光度的平均值15'30'对照0.71250.095TEC0.5%0.5840.084TEC1%0.5卯50.083TEC5%0.3930.01818.0417.1244.8411.1012.7081.50发明目的本发明是在该研究结果的基础上构思而成的，因此，其基本目标是提供至少在食物中、在生物体内和从广义上来说在任何情况下对于保护甘油三酯结构有效的新的有效成分，所述的任何情况是指保护甘油三酯的分子结构免于酶水解是有用的和/或必需的情况，柠檬酸三乙酯水解导致柠檬酸释放，其特征在于具有显著的抗氧化能力，能够保护分子结构如脂肪酸免于氧化和随后的分子降解。因此，本发明的目的是提供保护食物、配制药物和化妆品的有效成分，以阻断和/或抑制甘油三酯的酶促水解，所述药物采用局部的或全身性的途径(口服、肌内、静脉内等)进行给药。已经发现本发明特别是对于一些皮肤病症如皮脂溢、痤疮、脂溢性皮炎，和从广义上说任何特征为甘油三酯水解和随后的脂肪酸释放可以导致临床状况的恶化或者直接或间接影响疾病的发病机理的病症有效。本发明的另一个目的是提供使用不同物质例如抗氧化剂、抗生素、维生素、维生素A酸类、有机酸和从更广义上来说可归为增效剂的其它物质的可能性，所述增效剂的作用是与柠檬酸三乙酯组合，用于有效避免食物降解和/或控制某些病症和/或微小的皮肤缺陷。根据本发明，通过使用一种用于营养品、化妆品或药品的组合物来达到这些目的，所述组合物包含纯的或与增效剂组合的柠檬酸三乙酯作为活性成分。即使没有全部列举，但在下文中也说明性地描述了对痤疮而言维持甘油三酯完整性的重要性。痤疮是大多数男性青少年的典型病症，其特征为特别是但不仅限于在起始阶段的皮脂分泌增加(由男性性激素作用导致)。皮脂主要由甘油三酯构成，在痤疮丙酸杆菌(一种腐生细菌，其随着疾病进展所释放的脂肪酶数量增加)释放的脂肪酶作用下发生水解并伴随脂肪酸的释放，随后，被召集的嗜中性粒细胞将过多的痤瘙丙酸杆菌破坏，释放自由基和活性氧(SWR)，脂肪酸在其作用下降解为酮类、醛类等小分子。其特征在于不同的炎症活性和随后的痤掩损伤表象。因此，维持甘油三酯的完整性可能与控制(即便是间接地控制)炎症发生的进程，并由此控制通常的皮肤损伤如丘疹、脓疱、嚢肿、小瘤等紧密相关。发明详述在本发明中和上述用途中，可以使用纯的柠檬酸三乙酯与合适的支架物或载体，或者更优选与其它化学实体如增效剂、添加剂及赋形剂配制成用于营养、化妆和药物方面的制剂，柠檬酸三乙酯的含量为基于最终制剂重量的0.1重量％到99.9重量％，优选0.2%-50%，更优选1.0%-25%。-与合适的增效剂组合在本发明中，发现即便单独使用柠檬酸三乙酯，也对甘油三酯具有完全特异的保护作用，与不同成分的非组合形式应用相比，它与合适的增效剂组合可以导致所得到的效果增强。因此，以柠檬酸三乙酯为代表的活性成分可以与选自下述化学基团的物质组合使用，所述化学基团包括例如羧酸、羟酸、维生素、氨基酸、生物黄酮类、少量元素、抗生素、磺胺药物、消毒剂，油酸、亚油酸和亚麻酸的二乙基醚，以及与其他组分如红霉素、克林霉素、甲硝唑、庆大霉素、夫西地酸、益康唑、酮康唑、莫匹罗星、过氧化氢、过氧化苯甲酰、十六烷基P比咬蜀t、银盐及相关的有机或无机盐类组合使用。例如，使用下述增效剂反式视黄酸、视黄醇、视黄醛、维生素E、抗坏血酸、壬二酸、十八烷二醇酸、生物素、对氨基苯曱酸、若缇娜(rutina)、P-胡萝卜素、硫胺素、核黄素、吡哆醇、吡哆醛、烟酸、尼克酸、烟酰胺、泛酸、泛醇、葡糖胺、乙酰葡糖胺、叶酸、卵磷脂，磷脂类如磷脂酰胆碱、脑磷脂、磷脂酸、溶血卵磷脂，氢醌、油酸、亚油酸、亚麻酸、油酸乙酯、亚麻酸乙酯、亚油酸乙酯、曲酸、抗坏血酸基葡萄糖苷、红霉素、克林霉素、曱硝唑、庆大霉素、夫西地酸、益康唑、酮康唑、莫匹罗星、新霉素、链霉素、过氧化氢、过氧化苯曱酰、十六烷基吡咬错、洁尔灭、氯己定及相关的盐和酯类、银以及相关的盐，有机或无机的、羟酸或p-羟酸、一元羧酸和二元羧酸，如羟乙酸、乳酸(以右旋、左旋及外消旋混合物形式)、幾丁酸(以右旋、左旋及外消旋混合物形式)、扁桃酸(以右旋、左旋及外消旋混合物形式)、酒石酸(以右旋、左旋及外消旋混合物形式)、苹果酸(以右旋、左旋及外消旋混合物形式)、水杨酸、3-羟基苯曱酸、4-羟基苯甲酸、半胱氨酸、乙酰半胱氨酸、甘氨酸、硒硫，所述的增效剂单独使用或者两种或两种以上联合使用，包括它们各自的盐、酯、酰胺和相关的D-L-DL的形式。这类物质的一种或多种可以与柠檬酸三乙酯组合使用，以重量百分比表示的用量为0.01重量％到50重量％，优选0.5%到15%。下述制剂的实施例是对于含有柠檬酸三乙酯作为有效成分的本发明组合物功效的进一步证据。柠檬酸三乙酯可与上述的适宜增效剂组合，可以用于使用支架物或适宜载体的外用制剂，如油包水的乳剂、单相溶液剂、双相假溶液剂、单相凝胶剂、双相凝胶剂、无水软膏剂、喷洒粉剂等中。抑制食用油发生酸败的基于柠檬酸三乙酯的制剂的实施例。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>制备方法如表所述。制剂2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>制备方法如表所述。治疗痤疮、脂溢性皮炎以及其中甘油三酯的水解可以导致临床状况恶的制剂的实施例。制剂4:用于治疗痤疮的洗剂<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>制备方法将02溶解于03中，将04加入到所得溶液中，然后与01混合。*抗生素选自例如红霉素、克林霉素、莫匹罗星、甲硝唑、庆大霉素的成分。制剂5:用于治疗脂溢性皮炎的洗剂编号说明重量百分数％01柠檬酸三乙酯502*抗生素0.5-503乙醇95%6004蒸馏水，加至所需的量100制备方法将02溶解于03中，将04加入到所得溶液中，然后与01混合。*抗生素选自例如夫西地酸、益康唑、酮康唑酸的成分。制剂6编号说明重量百分数％01柠檬酸三乙酯0.302用于食品的向日葵油，加至所需的量100制备方法如表所述。制剂7编号说明重量百分数％01柠檬酸三乙酯0.302用于食品的花生油，加至所需的量100制备方法如表所述。制剂8<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>制备方法将02溶解于03中；将01与所得溶液混合；然后加入04。制剂9<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>制备方法将02溶解于03中；将01与所得溶液混合；然后加入04。制剂10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>制备方法将02溶在01中。制剂12<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>制备方法将01和02溶于03，将03在所得溶液中分散，直至完全溶解并形成凝胶。权利要求1.一种用于保护甘油三酯免于酶促水解的局部应用的组合物，其特征在于包含纯的柠檬酸三乙酯或与增效剂组合的柠檬酸三乙酯作为活性成分。2.如权利要求1所述的组合物，其包含含量为0.1重量％到99.9重量％、优选0.2重量％到50重量％的柠檬酸三乙酯。3.如权利要求2所述的组合物，其包含含量为1.0重量％到25.0重量％的柠檬酸三乙酯。4.如权利要求1-3中任意一项所述的组合物，其包含以柠檬酸三乙酯为代表的活性成分与至少一种选自下述的其它物质反式视黄酸、视黄醇、视黄醛、维生素E、抗坏血酸、壬二酸、十八烷二醇酸、生物素、对氨基苯曱酸、若缇娜、p-胡萝卜素、硫胺素、核黄素、吡哆醇、吡哆醛、尼克酸、烟酸、烟酰胺、泛酸、泛醇、葡糖胺、乙酰葡糖胺、叶酸、卵磷脂，砩脂类如磷脂酰胆碱、脑磷脂、磷脂酸、溶血卵磷脂，氢醌、油酸、亚油酸、亚麻酸、油酸乙酯、亚麻酸乙酯、亚油酸乙酯、曲酸、抗坏血酸基葡萄糖苷、红霉素、克林霉素、曱硝唑、庆大霉素、夫西地酸、益康唑、酮康唑、莫匹罗星、新霉素、链霉素、过氧化氢、过氧化苯甲酰、十六烷基吡啶錄、洁尔灭、氯己定及相关的盐和酯类、银以及相关的盐，有机或无机的、羟酸或p-羟酸、一元羧酸和二元羧酸，如羟乙酸、乳酸(以右旋、左旋及外消旋混合物形式)、羟丁酸(以右旋、左旋及外消旋混合物形式)、扁桃酸(以右旋、左旋及外消旋混合物形式)、酒石酸(以右旋、左旋及外消旋混合物形式)、苹果酸(以右旋、左旋及外消旋混合物形式)、水杨酸、3-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、半胱氨酸、乙酰半胱氨酸、甘氨酸、硒石克，所述物质单独使用或者两种或两种以上联合使用，包括它们各自的盐、酯和酰胺以及相关的D-L-DL的形式。5.如权利要求4所述的组合物，其中包含所述其它物质的量为0.01重量％到50重量％，优选0.5到15重量％。6.如以上任意一项权利要求所述的包含柠檬酸三乙酯的组合物作为保护营养品中甘油三酯免于酶促水解的物质的用途。7.如权利要求1-5中任意一项所述的包含柠檬酸三乙酯的组合物作为治疗病症的药物的用途，所述病症直接或间接地与甘油三酯的水解相关。8.如权利要求1-5中任意一项所述的包含柠檬酸三乙酯的组合物作为治疗痤疮和脂溢性皮炎的药物的用途。9.如权利要求1-5中任意一项所述的包含柠檬酸三乙酯的组合物作为至少用于治疗微小的皮肤美容缺陷的化妆品的用途，所述皮肤美容缺陷直接或间接地与甘油三酯的水解相关。全文摘要本发明涉及用于保护甘油三酯免于酶促水解的局部应用的组合物，其包含纯的或与某些增效剂组合的柠檬酸三乙酯作为活性成分。所述柠檬酸三乙酯含量为0.1重量％到99.9重量％，优选0.2重量％到50重量％，或更优选1.0到25.0重量％。权利要求还涉及柠檬酸三乙酯用于治疗痤疮和脂溢性皮炎、保护营养品中的甘油三酯和在化妆品领域中用于皮肤美容作用的用途。文档编号A61K8/37GK101321478SQ200680045772公开日2008年12月10日申请日期2006年11月29日优先权日2005年12月6日发明者詹弗兰科·德保利安布罗西申请人:詹弗兰科·德保利安布罗西