专利名称：：抗白介素-22结合蛋白的抗体及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明一般地涉及细胞因子白介素-22。特别地，本发明涉及结合并中和白介素-22结合蛋白的抗体和抗原结合片段。
背景技术：
：白介素-22(IL-22)或IL-TIF(与白介素IO相关的源自T细胞的可诱导因子)是一种结构上与IL-10相关的细胞因子，最初被鉴定为由鼠T淋巴细胞中IL-9诱导的基因的产物(Dumoutier，L.etal.2000.尸rac.Wa".爿cadUSA97:10144)。在体外，在经IL-9、抗CD3抗体或伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激后的T辅助细胞以及经IL-9刺激的肥大细胞中发现IL-22的表达。在体内，基于抗CD3和脂多糖(LPS)的施用，在脾细胞中证明有IL-22产生。IL-22的生物学作用被认为与炎症过程以及许多代谢性疾病例如肥胖、糖尿病、高脂血症和高胰岛素血症有关。IL-22激活其耙细胞上的特异性受体复合物。IL-22受体复合物由两条链组成。其中一条链IL-22RA，对IL-22的结合是特异性的。另一条链IL-IORP，与EL-10共享。IL-10RP，也称为CRF2-4，是IL-10信号传输所必需的。IL-22RA也被描述为CRF2-9，一种在专利数据库中被称为ZCYTORll的孤儿受体，Xie等人建议将其重命名为IL-22R(2000.J.Biol.Chem.275:31335)。IL-22受体的两条链均属于II型细胞因子受体家族。近来鉴定到一种人类中在遗传学上不同的IL-22的可溶性受体。这一可溶性受体大小为40kDa，长度为210个氨基酸(aa)。它被命名为可溶性IL-22R/CRF2-10，也称为IL-22受体-a2或IL-22结合蛋白(IL-22BP)。除标准的210aa形式以外，也报道了两种替代剪接形式。一种剪接形式是长度为131aa的截短形式。第二种剪接形式是242aa的成熟分子。该长的形式是在胎盘中发现的，可以调节IL-22和IL-20的活性。IL-22结合蛋白的210aa的标准形式显示是IL-22活性的拮抗剂。IL-22BP能够与IL-22结合并中和在表达IL-22受体亚单位的BaF3细胞中证明的EL-22的生物活性(Xuet.Al.PNAS，2001，vol98:9511-9516)、IL-22反应性人类肺癌A549细胞中的STAT激活、HepG2细胞中细胞因子信号传导-3(SOCS-3)表达抑制剂的诱导(Kotenkoetal.JournalofImmunology,2001vol166:7096-7103)。发明概述本发明提供了特异性结合并阻断人IL-22BP生物活性的抗体，特别是分离的人源化抗体，或者分离的人抗体或其生物学活性部分。一方面，本发明的抗体结合IL-22BP并调节人IL-22和IL-22BP之间的相互作用。这种调节阻断IL22与IL-22BP的相互作用，因此增加了能够结合IL-22受体复合物的游离IL-22分子的水平，导致靶组织或细胞对IL22的生物反应增强。在一个实施方式中，本发明的抗体是多克隆抗体并特异性抑制IL-22和IL-22BP之间的相互作用。在另一个实施方式中，本发明的抗体是单克隆抗体并特异性抑制IL-22和IL-22BP之间的相互作用。在最优选的实施方式中，本发明的抗体是一种分离的抗体或其生物学活性部分，其能够结合并中和IL-22结合蛋白及其变体(如SEQIDNo.:2、3和4所示)的生物活性。另一方面，本发明涉及一种治疗代谢性疾病的方法，包括施用一种治疗有效剂量的抗IL-22结合蛋白抗体。本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含一种分离并纯化的抗体。本发明还涉及一种药物组合物，其基本上由一种分离并纯化的抗体组成。图1是全长鼠IL-22BP序列。图2是鼠IL-22BPa序列。图3是鼠IL-22BPJ3序列。图4是全长鼠IL-22BP(mlL-22BP)、鼠IL-22BPa和鼠IL-22BPP的序列比对。图5是经蛋白A纯化的抗IL-22BP抗体。图6显示了应答于体内IL-22BP的降低的血清甘油三酸酯(TG)水平。优选实施方式的详细描述说明书和权利要求书中所使用的术语"人源化抗体"定义为一种人类抗体，其由超过50%的人类肽序列，优选超过70%，以及最优选超过90%的人类肽序列组成，当以治疗有效剂量将其注入人体时引起最小的抗原性。本发明的优选实施方式是一种人类抗体和具有特异性肽结合结构域和人类Fc区域的肽体(peptibody)。但是，本发明可以包含任何能够结合IL-22BP而同时阻断IL-22BP与IL-22的相互作用的蛋白质。这种蛋白质可以是，但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、抗原结合片段或任意具有人类Fc片段的肽等等。具有Fc结构域的随机产生的肽被称为肽体(peptibody)，参见2003年12月9日授予Feige等人的US6,660,843(全文引入作为参考)。他们包括连接至N末端、C末端、氨基酸侧链或多个这种位点的一或多种肽。肽体技术使得能够设计合并了靶向一或多种配体或受体、肿瘤归巢肽、膜转运肽及类似物的肽的治疗药剂。肽体技术被证明在设计许多这种分子(包括线性和二硫化物约束肽、"串联肽多聚体"(即Fc结构域的一条链上有多于一种肽)。参见，例如，US6,660,843、；美国专利申请号2003/0195156，公布于2003年10月15日(对应于WO02/092620，公布于2002年11月21日)；美国专利申请号2003/0176352，公布于2003年9月18日(对应于WO03/031589，公布于2003年4月17日)；美国系列号09/422,838，申请日1999年10月22日(对应于WO00/24770，公布于2000年5月4日)；美国专利申请号2003/0229023，公布于2003年12月11日；WO03/057134，公布于2003年7月17日；美国专利申请号10/666,480，申请日2003年9月18日(对应于WO04/026329，公布于2004年4月1日)；这些文献中的每一篇全文引入作为参考。以下实施例教导如何产生本发明的抗体，并证明这些抗体的效果。所有的参考文献全文引入。实施例实施例1鼠IL-22结合蛋白(IL-22BP)基因克隆鼠IL-22结合蛋白基因(图1，核苷酸序列SEQIDNo.:1)的克隆采用类似于WeissB等人描述的方案(GenesImmun.5:330-336，2004,GenBankAccessionnumber:AJ555484)。简单来说，利用QiagenRNeasy分离试剂盒(QiagenGmbH)从小鼠脾脏中提取总RNA。利用QiagenOneStepRT-PCR试剂盒克隆全长鼠IL-22BPcDNA。PCR扩增使用基因特异性引物5，-atgatgcctaagcattgccttc-3，(SEQIDNo.:5)禾卩5，-tcagaccttcaatttcaacagctc-3'(SEQIDNo.:6)。将PCR产物克隆进PCR4载体(Invitrogen)，并通过序列分析进行确认。使用全长cDNA作模板制备鼠IL-22BPcDNA的两个亚克隆。第一个克隆，鼠IL-22BPa，含第32-133位氨基酸，不含推定的信号序列(图2)。第二个克隆，鼠IL-22BP卩含第140-210位氨基酸(图3)。全长鼠IL-22BP和所述亚克隆的序列比较显示于图4中。鼠IL-22BPa序列用PCR弓I物5，國cggggtaccaaggtccgatttcagteca-3，(SEQIDNo.:7)禾口5，-gcggecgetcaagtcacgaccggaggatc-3，(SEQIDNo.:8)克隆。鼠IL-22BP卩序列用PCR引物5，-cggggtacctctttgegggtgcttctc-3,(SEQIDNo.:9)和5'誦gcggecgetcacattteagecactacgca-3，(SEQIDNo.:10)克隆。将扩增后的DNA片段克隆进pMD18-T(Takara)并制备质粒。含鼠IL-22BPa和鼠IL-22BPp的质粒经NotI和KpnI消化后克隆进表达载体pET32a(Novagen)。通过DNA序列分析确认鼠IL-22BPa和鼠IL-22BP|3的序列，分别如SEQIDNo.:11和13所示。实施例2重组鼠IL22BPa和鼠H22BPp蛋白表达重组鼠IL-22BPa和鼠IL-22BPp的表达采用类似于WeiChi-Chen等人描述的方法(GenesandImmunityvol:4;p204,2003)。简单来说，使用大肠杆菌(￡.co//)菌株BL21(+)菌株(Stratagene)作为表达宿主。将宿主细胞在含有氨苄西林(lOO^ig/mL)的Luria-Bertani(LB)培养基中培养。以lmM异丙基-P-D硫代半乳糖苷诱导蛋白质的表达。用匀浆器将细胞沉淀打碎，通过离心获得鼠IL-22BPa和鼠IL-22BPP包涵体。包涵体以pH8的50mMTriszHCl、100mMNaCl、lmMEDTA、lmMDTT和0.5%(重量/体积)的脱氧胆酸钠洗涤。于4°C，将包涵体在pH8.0的100mMNaH2P04、10mMTris-HCl和8M尿素中溶解过夜。溶液以100,000xg离心30分钟，收集上清液。使用Ni-NTAspin试剂盒(QiagenGmbH，德国)利用Ni-NTA琼脂糖色谱法纯化重组鼠IL-22BP蛋白。用肠激酶(Invitrogen)处理纯化的鼠IL-22BP蛋白以除去硫氧还蛋白融合蛋白。基于SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析，估计鼠IL-22BPa(SEQIDNo.:12)和鼠IL-22BP卩(SEQIDNo.:14)蛋白的纯度大于90%。实施例3:抗鼠IL-22BP抗体的制备将兔用于制备抗鼠IL-22BP的多克隆抗体。重组鼠IL-22BPa和鼠IL-22BPP蛋白以1:1(重量)比例混合在一起用于免疫兔。如Coligan等1994编辑的CurrentProtocolinImmunology中所描述的那样，免疫溶液含有溶于添加了2.0mL弗氏完全佐剂(CFA,Sigma)的2.0mLPBS中的1.5mg鼠IL-22BPa和1.5mg鼠IL-22BP卩蛋白的混合物。每只兔在背部4个部位通过皮下注射接受2.0mL免疫溶液。第一次免疫后，在第3周和第6周再次通过皮下注射相同量的蛋白加弗氏不完全佐剂(IFA，Sigma)。在第6周收集血清样品，通过ELISA测定抗体效价(Coligan等1994编辑的CurrentProtocolinImmunology)。在两只兔中所测定的针对鼠DL-22BPa和鼠IL-22BP|3的抗体效价均大于1:lxl06。表1.兔抗小鼠IL-22BP抗体的特征描述<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例4:蛋白A纯化的抗IL-22BP抗体用蛋白A琼脂糖柱(Coligan等1994编辑的CurrentProtocolinImmimology)纯化来自一只正常兔和一只经免疫的兔的抗体血清免疫球蛋白(IgG)。将纯化的IgG溶于PBS并保存于4°C。图5显示了含纯化自正常未免疫兔的IgG(NR-Ig)和纯化自经鼠IL-22BP免疫的兔的IgG(BPR-Ig)的SDS-PAGE凝胶。蛋白A柱色谱的纯度估计为大于95。/。。实施例5:抗IL-22BP抗体在体内阻断IL>22的生物活性16周龄、体重19-24克的雌性C57BL/6小鼠单次(皮下)注射经蛋白A纯化的兔多克隆抗鼠IL-22结合蛋白抗体(IgG)，剂量为每只动物注射于0.2mLPBS中的0.1mg或1.0mg抗体。对照鼠接受分离自未用抗原免疫的兔的纯化免疫球蛋白(IgG)。对照组接受相同剂量的IgG，即每只动物接受于0.2mLPBS中的0.1mg或1.0mgIgG。在注射后第7天从经处理的小鼠收集血清，并储存于-20。C。用自动血液化学分析仪(SynchronLxi725,BeckmanCoulterInc.USA)测定甘油三酸酯(TG)的血清水平。结果TG的血清水平如表2中所示。用纯化的对照IgG处理的小鼠具有正常水平的血清TG。用来自经重组鼠IL-22BPa加鼠EL-22BPp免疫的兔的纯化IgG处理的小鼠，具有显著降低的血清TG水平(p=0.049和p=0.018)。结果表明利用中和抗体在体内阻断IL-22结合蛋白可显著降低血清的TG水平(图6)。_表2.通过中和抗体在体内阻断IL-22结合蛋白的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>因此本发明的优选实施方式已充分描述。虽然描述涉及特别的实施方式，对本领域技术人员清楚的是，可在改变这些具体细节的情况下实施本发明。因此，本发明不应被限于此处描述的实施方式。例如，本领域技术人员将会意识到本发明可应用于结合并中和其它IL-22结合蛋白及如SEQIDNo.:2、3和4所示的变体的生物活性。权利要求1.一种分离并纯化的(单克隆或多克隆)抗体，其特异性地与人类白介素-22结合蛋白或其衍生物结合。2.权利要求1所述的分离并纯化的抗体，其中所述抗体特异性地抑制IL-22结合蛋白与IL-22的结合。3.权利要求2所述的分离并纯化的抗体，其中所述抗体用于诊断、预防或治疗一种选自如下一组的代谢性疾病肥胖、糖尿病、高脂血症和高胰岛素血症。4.权利要求3所述的分离并纯化的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、抗原结合片段、任何具有Fc片段的肽、或其任何衍生物。5.权利要求4所述的分离并纯化的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。6.权利要求4所述的分离并纯化的抗体，其中所述抗体是通过转基因或基因打靶技术在小鼠中产生的完全人抗体。7.权利要求5所述的分离并纯化的抗体，其中所述抗体由超过50%的人类肽序列组成。8.—种药物组合物，其包含一种分离并纯化的抗体，其中所述抗体特异性地与人类白介素-22结合蛋白或其衍生物结合。9.权利要求8的药物组合物，其中所述抗体特异性地抑制IL-22结合蛋白与IL-22的结合。10.权利要求9的药物组合物，其中所述抗体用于诊断、预防或治疗一种选自如下一组的代谢性疾病肥胖、糖尿病、高脂血症和高胰岛素血症。11.权利要求IO的药物组合物，其中所述抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、抗原结合片段、任何具有Fc片段的肽、或其任何衍生物。12.权利要求11的药物组合物，其中所述抗体是人源化抗体。13.权利要求11的药物组合物，其中所述抗体是通过转基因或基因打靶技术在小鼠中产生的完全人抗体。14.权利要求12的药物组合物，其中所述抗体由超过50%的人类^:序列组成。15.—种制备包含分离并纯化的抗体和药学上可接受的载体的药物组合物的方法，其中所述抗体特异性地与人类白介素-22结合蛋白或其衍生物结合。16.—种人类的治疗方法，包括施用药学上的有效剂量的分离并纯化的抗体，所述所述抗体特异性地与人类白介素-22结合蛋白或其衍生物结合。17.权利要求16的人类的治疗方法，其中所述抗体用于治疗一种选自如下一组的代谢性疾病肥胖、糖尿病、高脂血症和高胰岛素血症。全文摘要本发明涉及与白介素-22结合蛋白特别是人类白介素-22结合蛋白(IL-22BP)结合、并与调节与白介素-22相关的生物反应有关的抗体和抗原结合片段。本发明还涉及利用所述抗体和抗原结合片段治疗与白介素-22相关的疾病的方法。本发明所公开的抗体可用于诊断、预防或治疗代谢性疾病包括肥胖、糖尿病、高脂血症和高胰岛素血症等。文档编号A61K45/00GK101341170SQ200680048286公开日2009年1月7日申请日期2006年12月21日优先权日2005年12月22日发明者陈旭文,黄予良,黄智华申请人:Dhy&Co.有限公司