爱泼斯坦-巴尔病毒相关疾病的治疗的制作方法

专利名称：爱泼斯坦-巴尔病毒相关疾病的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗和/或预防爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr Virus,縮写为EBV，也译作EB病毒、埃-巴二氏病毒或非洲淋巴瘤病 毒)相关疾病的方法、疫苗、免疫组合物和合成多肽，还涉及调节免 疫应答的相关方法。
背景技术：
能提供实质上完全抗EBV相关疾病的免疫保护的安全有效的疫苗 策略的缺乏是一个很重要的问题，它己经阻碍了几种EBV相关疾病如 移植后淋巴细胞增生症(PTLD)、鼻咽癌(NPC)和何杰金淋巴瘤(HL) 治疗的进展。
对于这些疾病中的每一种疾病而言，细胞毒性T淋巴细胞(CTL) 在控制EBV感染中是一种重要的效应机制，经自体类淋巴母细胞系在 体外激活的EBV特异的CTL的过继性转移可用来治疗偶尔在移植受 者中出现的PTLD，上述观察表明近年来在进行性的EBV相关恶性肿 瘤中进行免疫干预的可能性大大增加了。在这个例子中，过继性转移 的CTL大量培养物主要是免疫显性EBV核蛋白，EBNA 3、 4和6特 异性的效应细胞。
然而，潜在的病毒编码靶蛋白在NPC和HL中表达范围更有限， 即EBNA1 、 LMP1和LMP2，将这种策略扩展应用于NPC和HL的选 择受到了阻碍。其中，LMP1和LMP2是仅有的潜在靶蛋白，因为病 毒感染的细胞不能很好的加工EBNA1并且不能很好的通过MHC I类 途径递呈。
由于健康个体中对LMP1表位的前体频率低，使用LMP1扩增用 于用于过继性转移的效应细胞的可能性有限，从而在设计NPC和HL 的新治疗方法中出现更多的困难。而且，由于LMP蛋白能在正常细胞 中独立地启动致癌进程，全长LMP蛋白在临床中的应用就受到了阻碍。
本发明基于乱序抗原疫苗(scrambled antigen vaccine),或称为 "SAVINE"可用来治疗和/或预防EBV相关疾病这一令人惊讶和出 乎意料的发现。

发明内容
本发明的第一方面提供治疗或预防患者EBV相关疾病的疫苗，其 中所述的疫苗包括包含至少一种亲本EBV多肽的多个不同区段的合成 多肽，其中以相对于该区段在至少一种亲本EBV多肽中不同的连接关 系将该区段连接在一起。
至少一种亲本EBV多肽选自包含EBNA1、LMP1和LMP2的群组。
EBV相关疾病可以是癌症。
癌症可以选自包含鼻咽癌(NPC)、何杰金淋巴瘤(HL)和移植后 淋巴细胞增生症(PTLD)的群组。
合成多肽基本上由单个亲本EBV多肽的不同区段组成。
或者，合成多肽基本上由多个不同亲本EBV多肽的不同区段组成。
该合成多肽中的区段可以相对于该区段在至少一种亲本EBV多肽 中相应区段不同的顺序或排列将该合成多肽中的区段顺次连接。
至少一个所述的区段与一个或更多其他所述的区段具有部分序列 同一性或同源性。所述的序列同一性或同源性包含于所述的至少一个 区段的一端或两端。
本发明的第二方面提供合成多肽，其中所述的多肽包括至少一种 亲本EBV多肽的多个不同区段，其中以相对于该区段在至少一种亲本 EBV多肽中不同的连接关系将该区段连接在一起。
本发明的第三方面提供编码第二方面的合成多肽的合成多核苷酸。
所述的多核苷酸包括如SEQIDNO:l中所述的序列。 本发明的第四方面提供包含可操作的连接到调节多核苷酸的第三 方面的多核苷酸的构建体。
本发明的第五方面提供制备第三方面的合成多核苷酸的方法，包 括将编码至少一种亲本EBV多肽不同区段的多个核酸序列在相同的读 码框中连接在一起以形成合成多核苷酸，该合成多核苷酸的序列编码以相对于该区段在至少一种亲本EBV多肽中不同的连接关系连接在一 起的所述的区段。
所述的方法可进一步包括将相关亲本EBV多肽的序列片段化形成 片段并且以相对于该片段在至少一种亲本EBV多肽中不同的连接关系 将该片段连接在一起。
所述的片段可随机连接在一起。
所述的方法可进一歩包括反翻译相关亲本EBV多肽的序列或其区 段，以提供编码所述亲本EBV多肽或所述区段的核酸序列。
可通过反翻译所述的亲本EBV多肽序列的氨基酸，以在所使用的 细胞中提供比其他同义密码子具有更高翻译效率的密码子。
另外或替代地，可通过反翻译所述亲本EBV多肽序列的氨基酸， 以提供在相邻或局部序列元件的环境中具有更低倾向形成对执行任务 不利序列的密码子。
所述的不利序列可以是回文序列或重复序列。
所述的任务可以是克隆、测序、增强多核苷酸的稳定性或增强体 内翻译。
本发明的第六方面提供包含选自第一方面的疫苗、第二方面的合 成多肽、第三方面的合成多核苷酸和第四方面的合成构建体的免疫增 强剂与药用载体的组合物。
所述的组合物可以任选地包含佐剂。
本发明的第七方面提供调节抵抗EBV相关疾病免疫应答的方法， 包括给予需要该治疗的患者有效量的选自第一方面的疫苗、第二方面 的合成多肽、第三方面的合成多核苷酸、第四方面的合成构建体，或 第六方面的组合物的免疫增强剂。
本发明的第八方面提供EBV相关疾病的治疗和/或预防方法，包 括给予需要该治疗的患者有效量的选自第一方面的疫苗、第二方面的 合成多肽、第三方面的合成多核苷酸、第四方面的合成构建体，或第 六方面的组合物的免疫增强剂。
本发明的第九方面提供第一方面的疫苗、第二方面的合成多肽、 第三方面的合成多核苷酸、第四方面的合成构建体和第六方面的组合 物在调节免疫应答中的用途。
本发明的第十方面提供第一方面的疫苗、第二方面的合成多肽、 第三方面的合成多核苷酸、第四方面的合成构建体和第六方面的组合 物在制备治疗EBV相关疾病的药物中的用途。
本发明的第十一方面提供包括第二方面的合成多肽、第三方面的 合成多核苷酸、第四方面的合成构建体或第六方面的组合物的疫苗在
治疗EBV相关疾病中的用途。


现对本发明通过下述的图表进行描述，该描述仅作为例子。
图1、编码随机地连接在一起的LMP1、 LMP2和EBNA1蛋白的 重叠肽组的NPC SAVINE的图示。编码这3种蛋白的DNA序列用序 列特异的长度从20-100bp不等的重叠寡核苷酸进行构建。序列经分步 不对称PCR连接在一起以产生的亚盒。这些亚盒用限制性消化和PCR 连接在一起以形成6.8kb的最终NPC SAVINE构建体。然后将这种构 建体克隆到复制缺陷型腺病毒载体(Ad5F35)内。表达SAVINE构建 体的重组腺病毒(AdSAVINE)通过转染到HEK293细胞内获得。这种 SAVINE构建体也插入到牛痘和禽痘病毒递送(delivery)载体(见 Thomson S. A., Jaramillo A.B.， Shoobridge M.， Dunstan K. J., Everett B., Ranasinghe C, Kent S. J,, GaoK., Medveckzy C. J., French R.A., Ramshaw LA.. Development Of A Synthetic Consensus Sequence Scrambled Antigen HIV-1 Vaccine Designed for Global Use (2005) Vaccine, 23 (38) 4647-57)。
图2. SAVINE构建体内确定表位的加工和递呈。LMP1、 LMP2禾口 EBNAl-肽特异的CTL杀伤感染了 SAVINE的耙标。确定的表位特异 的在EBNAl(HPV， HLA-B35限制性的)、LMP1(YLL和YLQ, HLAA2-限制性的；IAL,HLAB35-限制性的)和LMP2 (CLQ LTA和LLS, HLA A2-限制性的；PYL, HLA-A23-限制性的；正D， HLA-B40-限制性的)抗 原的CTL多克隆系或CTL克隆从四个EBV血清阳性的健康供者中获 得。通过细胞溶解测定法对这些CTL抗带有确定的表位的PHA母细 胞的特异性进行检测。接着，为了找出EBNA1、 LMP1和LMP2抗原 的确定表位是否是内源性加工的，HLA匹配的成纤维细胞首先用表达 SAVINE构建体(MOI， 10:1)的牛痘、禽痘或腺病毒载体进行感染。 感染了牛痘TK-、空腺病毒的靶标成纤维细胞或未感染的成纤维细胞 用作对照。然后在铬释放测定中检测这些靶标的抗EBNA1、 LMP1和 LMP2表位特异的来自EBV血清阳性的健康供者的CTL多克隆系或 CTL克隆的细胞溶解活性。10:1的效应细胞:靶细胞比例用于这些测定 中。感染了表达SAVINE构建体的牛痘、禽痘或腺病毒载体的HLA匹 配的成纤维细胞具有细胞溶解活性，然而感染了对照载体的成纤维细 胞不溶解。这些结果表明SAVINE构建体的确定表位能被很有效地加 工并递呈到靶细胞。
图3、 SAVINE和LCL的激活刺激来自EBV血清阳性的健康供者 的CTL。 (A)和(B)来自健康的人EBV携带者(ScBu和DoSc)的 PBMC用感染了 (效应细胞与刺激物的比例为2:1) AdSAVINE, AdPoIy 或自体LCL (30:1)的自体PBMC进行刺激。所有的培养物每周用Y-照射过的上述感染的自体LCL进行再刺激。3次再剌激后的三天培养 的细胞在铬释放测定中被用作抗肽致敏的自体PHA母细胞的效应细 胞。(C)培养的细胞还用ELISPOT进行检测并且结果用每106 CTL中 斑点形成细胞(SFC)来表示。
图4、在EBV血清阳性的健康供者中EBNAl、 LMPl和LMP2-特异的应答的定位。全长LMP1抗原的氨基酸序列是来自亚洲EBV株， CAO (长17 mer的32肽有8个残基重叠)和高加索原型1 EBV株， B95.8(长17mer的42肽有8个残基重叠)。全长LMP2(长20 mer的 49肽有10个残基重叠)和EBNAl (长15 mer的69肽有10个残基 重叠)抗原的氨基酸序列是来自高加索原型IEBV株，B95.8。来自四 个EBV血清阳性的健康供者的腺病毒SAVINE和LCL激活的CTL进 行重叠肽刺激后IFN-y分泌的检测。观察确定的CD8+和CD4+ T细胞 表位的特异的T细胞反应性。除了对已经确定的表位的反应性外，这 些新肽池序列中的四个(来自LMPl和LMP2各2个)对SAVINE和 LCL-激活的CTL有反应性以及这些新肽池序列中的四个(来自CAO LMPl、 B95.8 LMPl LMP2和EBNAl各1个)对SAVINE激活的CTL 有反应性。
图5、由Ad SAVINE引发和牛痘SAVINE或禽痘SAVINE增强后，
来自体内的特异的CTL的体外(￡x Wvo) ELISPOT分析。两组 HLA-A2/Kb转基因鼠(n=5)用Ad SAVINE (109噬斑形成单位)进行 皮下免疫和两周后，这些小鼠用牛痘-SAVINE (107噬斑形成单位)或 禽痘SAVINE (2><107噬斑形成单位)再进行注射。两周后，收获脾细 胞而且CTL应答用ELISPOT测定法进行评价而且结果用每106脾细胞 中的斑点形成细胞(SFC)平均值+标准差表示。
图6、由腺-SAVINE引发和牛痘或禽痘SAVINE增强的来自HLA 转基因鼠的脾细胞的体外扩增的SAVINE-CTL的治疗性过继性转移引 起人NPC的退化。免疫缺陷型裸鼠用人NPC同种异体移植物进行接 种并当肿瘤大小约为0.2 cm3 (肿瘤接种后14天)时、每组带瘤的裸鼠 (n-6只小鼠/组)用5X106 Ad (引发)-VV (增强)SAVINE特异的 T细胞或5 X 106 Ad-FPV SAVINE特异的T细胞进行过继性地转移。 另一组裸鼠注射5X106 Ad-FPV SAVINE-CTL并在每次过继性转移后 1、 2和3天腹腔注射人1匸15 (5 ug)进行处理。对照组包括注射5 Xl(^LMP多表位-特异的CTL,细胞巨化病毒多表位(CMV)-特异的 CTL, CD8衰竭的Ad-FPV SAVINE-CTL或未处理的。SAVINE特异的 T细胞的治疗效果通过肿瘤退化的规律监测进行评价和肿瘤体积大于 1.0 cm3的小鼠被处死。未处理鼠、接受CMV T细胞或CD8衰竭的 Ad-FPV SAVINE-CTL的小鼠并不导致肿瘤生长的抑制并且在这些小 鼠中肿瘤在第一次T细胞转移后大约12-24天就达到1.0 cm、接受CD8 衰竭的LMP-CTL的小鼠在第一次CTL转移后大约12-78天处死。90 天后，仅接受Ad-FPV SAVINE-CTL或接受Ad-FPV SAVINE-CTL和 IL15的1/6小鼠中持续退化而在接受Ad-VV SAVINE-CTL的2/6小鼠 中持续退化。
定义
此处所用的"包括(包含)"是指"主要包括，但并不一定是仅包 括"。而且，"包括comprising"的变化形式如"包括comprise"禾C1 "包 括comprises"有相应的多种含义。
此处中所用的"治疗treating"和"治疗treatment"是指以任何方式 改善病情或症状、预防病情或疾病的发生、或其他预防、阻断、延缓、 或逆转病情或疾病或其他不良的症状的任何和所有的用途。
此处所用的"有效剂量"包括在它的意义内非毒性的却足以提供 预期的效应的试剂或化合物的量。所需的准确剂量随着患者不同而不 同取决于如治疗个体的人种、年龄和一般情况，治疗疾病的严重程度， 所服用的特定试剂和给药方式等因素。因此，规定一个确切的"有效 剂量"是不可能的。但是，对于任何特定的情况，适当的"有效剂量" 可以由一个本领域中普通技术人员用常规实验来决定。
此处所用"多肽"、"肽"、和"蛋白"可替换地用于指氨基酸残基 的聚合物和片段、变体、类似物、直系同源物或及其同源物。因此， 这些术语既可应用于氨基酸聚合物其中一个或多个氨基酸残基是合成 的而非自然存在的氨基酸，如对应于自然存在的氨基酸的化学类似物， 也可用来指自然存在的氨基酸聚合物。
此处所用的"多核苷酸"或"核苷酸"表示包括mRNA、 RNA、 cRNA、 cDNA或DNA或其结合的寡核苷酸。
此处所用的"可操作的连接(operably linked)"指以使多核苷酸转 录和多肽翻译的方式置于相对于编码多肽的多核苷酸的相应位点的转 录和翻译的调节多核苷酸。
此处所用的"合成多肽"指的是通过处理多肽或将相应多核苷酸 处理成一般非天然存在的形式从而在体外形成的多肽。例如，合成多 肽可以是合成多核苷酸的翻译产物。
此处所用的"合成多核苷酸"是指通过将多核苷酸处理成一般非 天然存在的形式从而在体外形成的多核苷酸。例如，合成多核苷酸可 以是表达载体的形式。 一般来说，这样的表达载体包括可操作地连接 到该多核苷酸上的转录和翻译的调节多核苷酸。
此处所用的术语"EBV相关疾病"是指由EBV引起或和EBV相 关的任何疾病、疾病状态或病症，包括但并不限于癌症，如鼻咽癌、 何杰金淋巴瘤或移植后淋巴细胞增生症。
此处所用的术语"亲本EBV多肽"是指已被分离或来源于爱泼斯 坦-巴尔病毒(EBV)的多肽，或者是同源的并用于制造合成多肽的多 肽。亲本EBV多肽可以是天然存在基因编码的EBV多肽。或者，亲 本EBV多肽也可以是天然不存在但运用重组技术被工程化的EBV多 肽。这种情况下，多核苷酸编码亲本多肽包括与天然基因编码一样的
多肽相关的不同却同义的密码子。替代地，亲本EBV多肽并不对应于
天然的多肽序列。例如，亲本EBV多肽包括多个多肽中常见的一个或
多个共有序列。
此处所用的术语"调节"是指直接或间接地增加或减少针对抗原 的免疫应答。
此处所用的术语"保守氨基酸置换"是指一个氨基酸置换或替换 另一个在多表位链(蛋白的一级序列)内具有相似特性的氨基酸。例
如，带电的氨基酸谷氨酸(Glu)置换为相似带电的氨基酸天冬氨酸 (Asp)就是保守氨基酸置换。
此处所用的术语"蛋白"、"多肽"、"多核苷酸"和"核苷酸"的 范围是指片段及其变体，包括但不限于多核苷酸和核苷酸的反向互补 和反义形式。
术语"片段(fragment)"是指编码成分或本身就是全长蛋白或基 因的成分的多核苷酸或多肽序列。就多肽而言片段具有和全长蛋白相 同的定性生物活性。
此处所用的术语"变体"是指实质上非常相似的序列。 一般来说， 核苷酸序列的变体编码具有共同的定性生物活性的多肽。 一般来说， 多肽序列变体还具有共同的定性生物活性。而且，这些多肽序列变体 可以有至少50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%序列同一性。
而且，变异的多肽包括类似物，此处的术语"类似物"是公开的 多肽的衍生物的一种多肽，多肽衍生物包括一个或多个氨基酸的添加、 去除或置换，以至于多肽保留了和衍生出它的天然多肽实际上相同的 功能。
具体实施例方式
称为"SAVINE" (scrambled antigen vaccine,"乱序抗原疫苗")在 WO 01/90197 (该公开通过引用合并于此)中公开的的新技术平台被本 发明者应用于有关EBV相关疾病如鼻咽癌(NPC)、何杰金淋巴瘤(HL) 和移植后淋巴细胞增生症(PTLD)的新的治疗方法中。
与传统EBV治疗策略关联的独有的困难包括只有3个EBV抗原
表达在EBV来源的NPC细胞上，S卩EBNA1、 LMP1和LMP2。因而 选择性地以EBV肿瘤细胞为靶标的能力非常有限。另外，在3个表达 的抗原中，EBNA1不能很好的递呈在EBV感染的细胞和/或其子细 胞的表面上，并且全长LMP蛋白不能被用于诱导适当的CTL免疫应 答，因为这些蛋白能独立致癌。而且，由于特异性对LMP表位的前体 细胞频率低，在过继性T细胞转移的治疗策略中使用LMP1来扩增效 应细胞的作用有限。实际上，体外激活用于过继性转移的EBV特异的 CTL细胞群经常是特异性针对EBV核蛋白而不是细胞表面抗原 EBNA1, LMP1禾口 LMP2的CTL占优势。
因此关于EBV相关疾病超越传统治疗策略如化疗和放疗的创新难 以进步。实际上，建立在放疗和化疗之上的EBV相关疾病如NPC和 HL的现有治疗仅有部分是成功的而且伴有严重的副作用。重要的是， 关于EBV的与相关的基于疫苗的方法的缺乏意味着缺乏任何防止/预 防措施。
相应地，虽然EBV感染了95。/。以上的世界人口，但是目前的治疗 方案如放疗和化疗对EBV相关疾病鼻咽癌(NPC)大约80%的病人只 有5年生存率，晚期发病率也是一个主要问题。
为了克服这些困难，本发明者制定疫苗策略不仅可以治疗而且可 以防止/预防EBV相关疾病。本发明者在30个氨基酸重叠序列(有 15个氨基酸重叠)中打乱了来源于EBV细胞表面表达的EBV抗原 EBNA1, LMP1和LMP2的DNA序列。这个SAVINE序列被插入到以 带有腺病毒35纤维蛋白的腺病毒5 (Ad5F35)为基础的复制缺陷型腺 病毒载体。
乱序抗原疫苗途径作为EBV相关疾病潜在治疗的一种新颖方法而 被应用。相应地，在此处公开的本发明表明(1 )插入到病毒载体Ad5F35 中的来源于EBV抗原EBNA1 、 LMP1禾Q LMP2的乱序的DNA序列能 够被有效的加工并递呈到抗原特异的T细胞中，(2)能够引发EBV免 疫患者的SAVINE特异的CTL应答，(3)随后用牛痘或禽痘SAVINE 构建体免疫能够放大CTL (引发的)应答，禾a (4)用确定表位CTL 肽体外扩增的引发-放大SAVINE CTL能诱导体内抵抗NPC肿瘤细胞 生长的脾细胞的激活。
因而这种SAVINE构建体的显著优势在于去除了 LMP1致癌能力 的同时允许EBNA1 、LMP1和LMP2中所有可能的MHC I和II类表位 的递呈。而且，在现在的形式中，EBNA1内所有的甘氨酸/丙氨酸重复 序列都被去除了，因此将调节整个蛋白的T细胞加工过程的免疫抑制 信号最小化了。
相应地，本发明提供了用于治疗或预防患者EBV相关疾病的疫苗， 其中所述的疫苗包括包含至少一种亲本EBV多肽的多个不同区段的合 成多肽，其中以相对于该区段在至少一种亲本EBV多肽中不同的连接 关系将该区段连接在一起。
所述的至少一种亲本EBV多肽选自包含EBNA1 、 LMP1和LMP2 的群组。
所述的EBV相关疾病可以是癌症。
癌症可以选自包含鼻咽癌(NPC)、何杰金淋巴瘤(HL)和移植后 淋巴细胞增生症(PTLD)的群组。
本领域的技术人员易于理解合成多肽可以基本上由单个亲本EBV 多肽的不同区段组成，或可替换地，合成多肽可以基本上由多个不同 亲本EBV多肽的不同区段组成。
对熟练的技术人员来说显而易见的是该合成多肽中的区段可以相 对于该区段在至少一种亲本EBV多肽中相应区段不同的顺序或排列将 该合成多肽中的区段顺次连接。
至少一个所述的区段与一个或更多其他所述的区段具有部分序列 同一性或同源性。所述的序列同一性或同源性包含于所述的至少一个 区段的一端或两端。
合成多肽
发明者通过相对于该区段在亲本EBV多肽中不同的连接关系将该 区段融合、偶联或其它方式连接在一起，从而能够打乱亲本EBV多肽 的结构到足以阻碍、取消或改变亲本EBV多肽的至少一种功能，同时 将在亲本EBV多肽中的潜在有用表位的破坏降到最低。这种连接关系 改变的结果导致在所产生的合成多肽中区段的连接顺序与亲本EBV多 肽中的顺序是不相同的。
相应地，本发明提供合成多肽，其中所述的多肽包括至少一种亲 本EBV多肽的多个不同区段，其中以相对于该区段在至少一种亲本
EBV多肽中不同的连接关系将该区段连接在一起。
与本发明相一致的是，融合蛋白也可被工程化以改善多肽或变体
或其片段的特性。例如，肽基团(peptide moieties)可以被添加到多肽 中以增加多肽的稳定性。多肽的肽基团的添加是本领域技术人员所熟 知的常规技术。
本发明中的合成多肽作为免疫增强剂有用，本说明其它地方被称 为乱序抗原疫苗，超减毒疫苗或"SAVINES"。
本领域技术人员可理解所述合成多肽中的区段以相对于该区段在 至少一种亲本EBV多肽中相应区段不同的顺序或排列将该合成多肽中 的区段顺次连接是优选但却非必需的。例如，在包含4个连续的或重 叠的区段A-B-C-D的亲本EBV多肽例子中，这些区段可以以23中其 他可能的顺序进行连接以形成合成多肽。这些顺序可选自A-B-D-C、 A-C-B-D、 A-C-D画B 、 A-D-B-C、 A-D-C画B 、 B-A-C画D、 B画A- D-C 、 B-C-A隱D、 B-C-D-A、 B-D-A-C、 B-D-C-A、 C-A-B-D、 C-A-D-B、 C-B-A-D、 C-B-D-A、 C画D-A-B、 C-D-B-A、 D-A-B陽C、 D-A-C-B、 D曙B-A画C、 D-B-C-A、 D-C-A-B、 或D-C-B-A组成的群组。虽然区段的重排优选是随机的，但是特别优 选的是将重排后产生亲本序列完全或部分再组装的重排(如ADBC、 BACD、 DABC)排除或最小化。然而，应理解当重排区段的数目增加 的时候，上述的完全或部分再组装的可能性就降低了 。
区段的顺序以相对于它们在亲本EBV多肽中存在的顺序而言进行 了适当的交叉交换、再排序或重排以使多肽的结构被打乱到足以阻碍、 取消或改变亲本EBV多肽相关的至少一种功能。优选地，在合成多肽 中亲本EBV多肽的区段随机重排。
所述的亲本EBV多肽适当地是与疾病或病情相关的多肽。例如， 亲本多肽可以是EBV表达的多肽，或EBV感染引起的、产生的或相 关的癌细胞表达的多肽。特别地，亲本EBV多肽选自包含EBNA1、 LMP1禾口LMP2的群组。
任何一种由EBV引起的、产生的或相关的癌症或肿瘤的治疗都涵 盖于本发明中。例如，癌症或肿瘤包括，但不限于，移植后淋巴细胞 增生症(PTLD)、何杰金淋巴瘤和鼻咽癌(NPC)。
在优选的实施方式中，区段是以大小为基础进行选择的。本发明 区段可以是能被用于引起抗亲本EBV多肽编码抗原的免疫应答的任何 适合的大小。很多因素可以影响区段大小的选择。例如，区段大小优 选自包括或对应于T细胞表位和它们的加工所需的大小。本领域技术
人员认为I类限制性T细胞表位在长度上可以是在8和IO个氨基酸之 间，如果将其置于非天然的侧翼残基紧邻的位置，该表位一般要求2
到3个天然的侧翼氨基酸以确保他们能被有效的加工和递呈。n类限
制性T细胞表位在长度上可以是12到25个氨基酸的范围，并且可以 不要求天然的侧翼残基进行有效的蛋白酶解加工，尽管有人认为天然
的侧翼残基可能发挥作用。n类限制性表位的另一个重要特征是它们
一般在中间含有能特异性结合到II类MHC分子的9-10个氨基酸的核 心，该核心任何一侧的侧翼序列通过以序列非依赖性方式与II类MHC 抗原任何一侧的保守结构相联来稳定结合(Brown J. H., Jardetsky T. S., Gorga J. C, Stern L. J., Urban R. G" Strominger J. L., Wiley D. C. : Three-dimensional structure of the human class II histocompatibility antigen HLA-DR1 .Nature 1993,364:33-39.)。因此II类限制性表位的功能区域 典型地是少于15个氨基酸长度。线性的B细胞表位的大小和影响它们 加工的因素，如II类限制性表位，是十分多变的，尽管这些表位在大 小上经常是小于15个氨基酸。由上述可知，优选地，但非必需地，区 段大小是至少4个氨基酸，优选地至少7个氨基酸，更优选至少12个 氨基酸，更优选至少20个氨基酸和更优选至少30个氨基酸。适当地， 区段的大小是少于2000个氨基酸，更优选少于1000个氨基酸，更优 选的少于500个氨基酸，更优选少于200个氨基酸，更优选少于100 个氨基酸，更优选少于80个氨基酸和甚至更优选少于60个氨基酸和 甚至更优选少于40个氨基酸。在这方面，优选的是片段的大小尽可能 的小，从而合成多肽可以采用相对于亲本EBV多肽的结构而言功能上 不同的结构。优选的是片段的大小应大到足以使T细胞表位损失最小。 在特别优选的实施方式中，片段的大小大约是30个氨基酸。
可选的间隔物可用来间隔彼此相邻的区段。相应地，可选的间隔 物可插入到一些或所有区段间。间隔物适当地改变相邻区段的蛋白酶 解加工和/或递呈。在这种类型的优选实施方式中，间隔物促进或增
强相邻区段的蛋白酶解加工和/或递呈。优选地，间隔物包括至少一 个氨基酸。至少一个氨基酸适合的是中性氨基酸。中性氨基酸优选的 是丙氨酸。可替代的，所述的至少一个氨基酸是半胱氨酸。
在优选的实施方式中，区段被选择以使它们与一个或多个其他区 段有部分序列具有同一性或同源性。适合地，在相关区段的一端或两 端包括与一个或多个其他所述的区段所包含的氨基酸序列具有同一性 或同源性的至少4个连续的氨基酸，优选至少7个连续的氨基酸，更 优选至少10个连续的氨基酸，更优选至少15个连续的氨基酸和甚至 更优选至少20个连续的氨基酸。优选地，在相关区段的一端或两端包 括与一个或多个其他所述的区段所包含的氨基酸序列具有同一性或同
源性的少于500个连续的氨基酸，更优选少于200个连续的氨基酸， 更优选少于IOO个连续的氨基酸，更优选少于50个连续的氨基酸，更 优选少于40个连续的氨基酸，和甚至更优选少于30个连续的氨基酸。 可以确保区段边界的潜在表位不会丢失以及确保如果置于抑制加工的 氨基酸旁边或附近，区段边界或附近的表位能被有效的加工的序列重 叠(在本说明书其它地方也称为"重叠片段"或"重叠区段")是优选 的。优选地，区段大小大约是重叠大小的两倍。
在优选的实施方式中，当区段内部有部分序列同源时，同源序列 适当地包含保守的和/或非保守的氨基酸差异。
保守的或非保守的差异对应于在相应亲本EBV多肽中的多态现 象。多种病原生物和癌症表达有多态性多肽。例如，在不同个体中可 以由不同的病毒株或分化单位或癌症表达多态性多肽。
优选的相关区段间的序列重叠能使相对于在亲本EBV多肽中已有 顺序的区段的任何交叉交换或重排产生的表位序列的破坏最小。如果 上述的重叠区段用于形成合成多肽，改变相对于亲本EBV多肽中正常 存在的相应区段的顺序连接在一起的区段的顺序是不必要的。在这方 面，这样的重叠区段当在合成多肽中被连接在一起时能采用以相对于 亲本EBV多肽结构而言的不同结构，其中不同结构并不提供亲本多肽 相关的一个或多个功能。例如，如果四个区段A-B-C-D的每个均跨越 亲本EBV多肽的30个连续氨基酸并与一个或多个邻近区段有10-氨基 酸重叠序列，那么合成多肽将有连接区段A-B、 B-C和C-D的重复的
10-氨基酸序列。这些重复的序列的存在足以形成不同的结构并使相对 于亲本EBV多肽而言的功能丧失或改变。
在优选实施方式中，区段大小大约是30个氨基酸，并且在相关区 段中的一段或两端的重叠序列大约是15个氨基酸。然而，可以理解为
其他适合的区段大小和序列重叠大小也涵盖于本发明，这很容易由本 领域技术人员进行确定。
优选但非必需的是在合成多肽的构建中利用亲本EBV的多肽所有 区段。适当的，亲本EBV多肽序列的至少30。/。，优选至少40%，更优 选至少50%，甚至更优选至少60%，甚至更优选至少70%，甚至更优 选至少80%和甚至更优选至少90%用于构建合成多肽。但是，可以理 解为用于构建合成多肽的亲本EBV多肽来源的序列信息越多，合成多 肽作为免疫原的种群覆盖度就越大。优选地，无亲本EBV多肽来源的 序列信息被排除在外(例如由于免疫表位的明显缺失)。
合成多肽的制备
本领域技术人员应理解在制备抗EBV或抗EBV引起的、产生的 或相关的癌症的合成多肽时，优选地使用EBV或癌症表达的多个不同 多肽来源的序列信息。相应地，在优选实施方式中，根据本发明来自 多个不同亲本EBV多肽的区段被连接在一起以形成合成多肽。在这方 面优选在合成多肽构建体中尽可能多的使用特定来源的或与其相关的 很多亲本EBV多肽。特别地，优选使用EBNA1、 LMP1和LMP2多肽。
适当地，在亲本EBV多肽内的任何高变序列被排除于合成多肽构 建体之外。
本发明的合成多肽可以用本领域技术人员知道的任何适当的操作 进行制备。例如，多肽的合成可通过使用溶液合成或固相合成，如下 所述，例如在Atherton禾口 Shephard (1989， Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. IRL Press, Oxford)第9章和Roberge等人(1995, Science 269: 202)。合成物可以利用，例如，t-叔丁氧羟基(t-Boc)或 9-芴甲氧羰基(Fmoc)化学物(见Coligan等人，CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, John Wiley & Sons, Inc. 1995-1997第9.1章; Stewart禾口 Young, 1984， Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chemical Co.， Rockford， III.;和Atherton和Shephard,如上所述)。或者，多肽可以用包括下列步骤的操作进行制备
(a) 制备包括编码合成多肽的合成多核苷酸的合成构建体，其中 所述的合成多核苷酸被可操作地连接到调节多核苷酸，其中所述的合 成多肽包括亲本多肽的多个不同区段，其中所述的区段以相对于亲本 EBV多肽中的区段连接而言不同的关系被连接在一起；
(b) 将合成构建体导入适当的宿主细胞；
(C)培养宿主细胞以表达来自于所述的合成构建体的合成多肽；
以及
(d)分离合成多肽。
相应地，本发明提供编码上述的合成多肽的合成多核苷酸，和包 括可操作地连接到调节多核苷酸上的合成多核苷酸的合成构建体。
合成构建体优选的是表达载体的形式。例如，表达载体可以是自 主复制的染色体外的载体如质粒，或整合到宿主基因组中的载体。典 型地，调节多核苷酸包括，但并不限于，启动子序列、引导或信号序 列、核糖体结合位点、转录启始和终止序列、翻译启始和终止序列、 和增强子或激活子序列。本领域中所知的组成性或诱导性启动子也涵 盖于本发明。启动子可以是天然存在的启动子，或一个以上启动子的 元件组合而成的混合启动子。调节多核苷酸一般与用于表达的宿主细 胞相适合。对于多种宿主细胞而言适当的表达载体和适当的调节多核 苷酸的许多类型在本领域中是已知的。
在优选实施方式中，表达载体含有可选标记基因以允许转化的宿 主细胞的选择。选择基因在本领域是众所周知的并且随着所用的宿主 细胞而变化。
表达载体还可包括融合伴侣(典型地由表达载体提供)从而本发 明的合成多肽表达为带有所述的融合伴侣的融合多肽。融合伴侣的主 要优势在于它们能够协助所述的融合多肽的鉴定和/或纯化。为了表 达所述的融合多肽，将本发明的多核苷酸连接到表达载体内是必要的， 以便融合伴侣和多核苷酸的翻译读码框相一致。
熟知的融合伴侣的例子包括，但不限于，谷胱甘肽转移酶(GST)、 人IgG的Fc段、麦芽糖结合蛋白(MBP)和六组氨酸(HIS6)，它们 对于用亲合色谱法分离融合多肽特别有用。为了用亲合色谱法纯化融 合多肽，亲合色谱法的有关基质分别是谷胱甘肽-、直链淀粉-、和镍-或钴-交联的树脂。很多这样的基质可以以"试剂盒"形式获得，如用
于(HIS6)融合伴侣的QIAexpress 体系(Qiagen)禾n Pharmacia GST
纯化体系。在优选实施方式中，重组多核苷酸被表达于商品化载体 pFLAG 中。
本领域中另一个众所周知的融合伴侣是绿色荧光蛋白(GFP)。该 融合伴侣起着允许本发明的融合多肽用荧光显微镜或流式细胞仪进行 鉴定的荧光"标签"的作用。GFP标签在评价本发明的融合多肽的亚 细胞定位时有用，或者可以用于分离表达本发明的融合多肽的细胞。 流式细胞仪方法如荧光激活细胞分选术(FACS)在后一种应用中尤其 有用。优选地，融合伴侣也可以有蛋白酶切位点，如凝血因子Xa、凝 血酶和内蛋白(蛋白质内含子)，它们允许相关蛋白酶部分地消化本发 明的融合多肽因而释放本发明的重组多肽。释放的多肽可以用随后的 色谱分离从融合伴侣中分离出来。本发明的融合伴侣也包含在"表位 标签"的范围内，它们通常是可获得特异性抗体的短肽序列。易于得 到特异性单克隆抗体的表位标签的人们熟知的例子包括c-Myc、流感病 毒、血细胞凝集素和FLAG标签。或者，可以提供融合伴侣以促进其 他形式的免疫。例如，融合伴侣可以是与耙抗原上的构象表位或对耙 抗原的翻译后修饰有免疫相互作用的抗原结合分子(如与糖基化的靶 抗原有免疫相互作用的抗原结合分子)。
合成构建体导入宿主细胞的步骤可通过任何适当的方法产生，.包 括转染和转化，方法的选择取决于所用的宿主细胞。这样的方法对于 本领域技术人员来说是熟知的。
本发明的合成多肽可以通过培养转化了合成构建体的宿主细胞生 产。蛋白表达的适当条件随表达载体和宿主细胞的选择而改变。本领 域技术人员通过常规实验很容易进行确定。
用于表达的适合宿主细胞可以是原核生物的或真核生物的。用于 表达本发明多肽的优选宿主细胞是细菌。所用的细菌可以是大肠杆菌。 或者，宿主细胞可以是昆虫细胞，例如，可用于杆状病毒表达系统的 SF9细胞。
合成多肽可由本领域技术人员使用标准实验方案便利地制备，该
方案如Sambrook等人，MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, 1989)，特别在16和17部分； Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, Inc. 1994-1998)，特别在10和16章；和Coligan 等人，CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1997)，特别在1、 5和6章。
合成多肽的氨基酸可以是任何非自然存在或任何自然存在的氨基 酸。在多肽合成吋非自然氨基酸及其衍生物的例子包括但不仅限于， 使用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸，4-氨基-3-羟基-6-甲基-庚酸、t-丁基甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、 鸟氨酸、肌氨酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-右旋体。
本发明也涉及使用普通的分子生物学技术修饰本发明的合成多肽 以改变它们对蛋白水解的降解的抵抗力或优化可溶特性或使它们更适 合于作为免疫原。
合成多核苷酸的制备
根据本发明的实施方式，公开的多核苷酸有在序列表中列出的核 苷酸序列或显示充足的序列同一性以杂交在序列表中列出的核酸序 列。在替代的实施方式中，多核苷酸的核酸序列可以与序列表中列出 的核苷酸序列具有至少30%, 40%， 50%, 60%, 70%， 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%的等同性。
本发明涉及编码上述合成多肽的合成多核苷酸。编码亲本EBV多 肽区段的多核苷酸能用任何适当的技术生产。例如，这样的多核苷酸 可以用容易获得的机器重新合成。DNA的序列合成己在，例如，美国 专利第4,293,652号中阐述。除了重新合成，可以应用重组技术，包括 限制性内切酶切割编码亲本EBV多肽的至少一个区段的多核苷酸，以 及使用连接酶将编码亲本多肽不同区段的多个切割的多核苷酸连接在 一个框架中。适当的重组技术在如Ausubel等人(如上所述)和 Sambrook等人(如上所述)的相关部分中有所描述，它们通过引用合 并于此。优选地，使用如Horton等人(19卯，Biotechniques 8 (5): 528-535; 1995, Mol Biotechnol. 3(2): 93-99;和1997, Methods Mol Biol. 67: 141-149)所描述的重叠延伸拼接(SOEing)方法建构合成多核苷
酸。然而，值得注意的是本发明并不依赖于，并且不涉及用于建构合 成构建体的任何一种特定技术。
合成多核苷酸的各种修饰可以作为增加胞内稳定性和半衰期的方 法引进。可能的修饰包括但不限于将核糖-或脱氧-核苷酸的侧翼序列添 加到分子的5'和/或3'末端或在寡脱氧核糖核苷酸主链内使用磷硫 酰或2' O-甲基而不是磷酸二酯酶连接。
因而本发明涉及产生前面详细说明的合成多核苷酸的方法，包括
将编码亲本EBV多肽不同区段的至少两个核酸序列在相同的读码框中
连接在一起以形成合成多核苷酸，该合成多核苷酸编码本发明的合成
多肽。适当地，编码亲本多肽的至少IO个区段，优选至少20个区段， 更优选至少40个区段和更有选至少100个区段的核酸序列用于制备所 述的合成多核苷酸。
优选地，该方法进一步包括选择亲本EBV多肽的区段、反翻译所 选区段和制备编码所选区段的核苷酸序列。优选的该方法进一步包括 随机地将核酸序列连接在一起以形成合成多核苷酸。核酸序列可以是 寡核苷酸或多核苷酸。
适当地，区段以大小为基础进行选择。此外，或替代地，选择与 一个或多个其他区段有部分序列同一性或同源性(即序列重叠)的区 段。很多因素能影响区段大小和上面提到的序列重叠。关于序列重叠， 大量重复的核酸序列有时能导致在所述序列的核苷酸扩增(如聚合酶 链反应，PCR)、在细菌宿主内的重组质粒增殖时或在含有这样序列的 重组病毒的扩增时核苷酸的区段丢失。相应地，在优选实施方式中， 编码与一个或多个其他区段有序列同一性或同源性区段的核酸序列不 以具有同一性或同源性序列连续的排列方式连接在一起。并且，优选 不同密码子用于编码重复区域内的特定氨基酸。在这种环境下，优选 地反翻译亲本多肽序列的氨基酸，以提供在相邻或局部序列元件中具 有更低倾向形成对执行任务(如克隆或测序)不利序列(如重复序列 或回文序列)的密码子。替代地，可选择含有羧基末端亮氨酸残基的 区段或编码包含便于反翻译序列剪接的限制性酶位点区段的反翻译序 列的区段。
方法任选地进一步包括连接编码至少一个区段编码核酸之间的间
隔物(spacer)残基的间隔物寡核苷酸。这样的间隔物残基有利于确保 区段内的表位被有效的加工和递呈。优选地，间隔物寡核苷酸编码2 到3间隔物残基。间隔物残基适当地是中性氨基酸，优选的是丙氨酸。 可选择地，该方法进一步包括在和其他包含区段的核酸序列相同 的读码框内连接编码与其他编码区段有同源性但不相同的可变区段的 至少一个可变核酸序列。适当地，可变的区段包括相对于一个或多个
其他编码的区段而言保守的和/或非保守的氨基酸差异。这样的差异 可对应于上述的多态现象。在优选的实施方式中，设计简并碱基或插 入到至少一个可变核酸序列中以产生所有所需的同源序列。
优选地，方法进一步包括优化合成多肽的密码子组成以使它能被 宿主细胞有效地翻译。关于这一点，众所周知不同密码子的翻译效率 在有机体之间不同，以及在密码子使用中这样的差异能被用来增强在 特定有机体中蛋白表达的水平。关于这方面，可以参考Seed等人(国 际申请公开号WO 96/09378)他公开在亲本EBV多核苷酸中用同义密 码子替换现有密码子以增强在哺乳动物宿主细胞中病毒多肽的表达。 这也具有稳定编码区段的多核苷酸的作用。优选地，第一或第二最常 用的密码子用于优化密码子。
本发明的合成多核苷酸能被可操作的连接到调节多核苷酸上以形 成如上面所述的合成构建体。本发明的合成构建体的多种用途之一是 可作为核苷酸疫苗来用。调节多核苷酸和合成构建体的选择依赖于预 期的宿主。
用于表达本发明合成多肽的代表性的表达载体包括，但不限于， 建立在带有来自腺病毒35的纤维蛋白的腺病毒5 (Ad5F35)基础之上 的复制缺陷型腺病毒载体。另外，改良的Ankara牛痘病毒如Allen等 人(2000, J. Immunol. 164 (9) :4968-4978)所述，禽痘病毒如Boyle 和Coupar( 1988， Virus Res. 10: 343-356)所述和单纯疱疹扩增子如Fong 等人在美国专利第6,051,428号中所述也可以使用。替代地，爱泼斯坦 -巴尔病毒载体，它们能优选地接受大量的DNA或RNA序列信息，可 以使用。
能用于表达合成多肽的优选启动子序列包括如Kumar和Boyle. (1990， Virology 179:151-158)所公开的P7.5或PE/L启动子、CMV和
RSV启动子。
合成构建体可选择地进一步包括编码免疫刺激分子的核酸序列。 免疫刺激分子可以是合成多肽的融合伴侣。替代地，免疫刺激分子可 以与合成多肽单独翻译。优选地，免疫刺激分子包括一般的免疫刺激
肽序列。例如，免疫剌激肽序列可以包括如Brett等人(1993， Eur. J. Immunol. 23: 1608-1614)所公开的来自细菌耶尔森菌种的透明质酸酶 蛋白(Iiw)的结构域。
在替代实施方式中，免疫刺激分子可包括免疫剌激膜或可溶性分 子，它是适当的T细胞共刺激分子。优选地，T细胞共刺激分子是B7 分子或其生物活性片段，或它们的变体或衍生物。B7分子包括，但不 限于，B7-l和B7-2。优选地，B7分子是B7-1。替代地，T细胞共剌 激分子可以是如ICAM-1和ICAM-2的ICAM分子。
在另一个实施方式中，免疫刺激分子是细胞因子，它包括，但不 限于，白介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子和干扰素。替代地，免疫刺 激分子可包括如Krieg在美国专利第6,008,200号所公开的免疫调节寡 核苷酸。
适当地，合成多肽的大小不超过宿主细胞转录、翻译或蛋白水解 加工和递呈表位到免疫系统的能力。本领域技术人员也认为合成多核 苷酸的大小能影响表达载体在宿主细胞中表达合成多核苷酸的能力。 在这一点上，己知DNA接种的效能随着表达载体大于20-kb而减少。 在这种情况下优选利用大量更小的合成构建体而不是单个大的合成构 建体。
组合物和免疫增强剂
本发明也涉及包括选自上述合成多肽、合成多核苷酸和合成构建 体的免疫增强剂，和药用载体组成的组合物。
免疫增强剂可以被制成中性或盐类形式的组合物。药用的盐类包 括酸性加成盐(由肽的游离氨基形成)和由无机酸如盐酸或磷酸，或 有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、马来酸等形成的盐。由游离羧基形成 的盐也可来源于无机成分如钠、钾、铵、钙、或高铁氢氧化物、和有 机成分如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等。
一般而言，适当的组合物可以根据本领域普通技术人员已知的方法进行制备并包括药用的稀释剂、佐剂和/或辅料。稀释剂、佐剂和 辅料必须是"可接受的"以相容于组合物的其他组分，和对其受者无 毒。
药用的稀释剂的例子是去除矿物质的或蒸馏的水；盐水溶液；植 物油如花生油、红花油、橄榄油、棉子油、玉米油、芝麻油如花生油、 红花油、橄榄油、棉子油、玉米油、芝麻油或椰子油；硅酮油，包括 聚硅氧垸、如二甲硅油、苯聚硅氧烷和甲苯基聚硅氧垸(methylphenyl polysolpoxane);挥发性硅酮；矿物油如液状石蜡、软石蜡或角鲨烷； 纤维素衍生物如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤 维素钠或羟丙基甲基纤维素；低链烯醇类如乙醇或异丙醇；低链烷醇 (lower aralkanols); ^氐聚烷t掌二酉享(lower polyalkylene glycols)或〈氐 烯基乙二醇如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或丙 三醇；脂肪酸酯如棕榈酸异丙酯、异丙基(肉)豆蔻酸酯或油酸乙酯； 聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrridone);琼脂；角叉菜胶；西黄蓍胶或 阿拉伯胶，和矿油凝胶。典型的，载体形成组合物重量的1%到99.9%。 最优选地，稀释剂是盐类。
为了作为可注射溶液或混悬液给药，非毒性注射途径可接受的稀 释液或载体包括，林格(氏)溶液、中链甘油三酯(MCT)、等渗盐、 磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1,2丙二醇。
用于口服使用的适合的载体、稀释剂、辅料和佐剂的一些例子包 括花生油、液状石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、海藻酸钠、阿 拉伯胶、西黄蓍胶、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、明胶和卵磷脂。 另外这些口服组分可含有适合的调味和着色剂。当以胶囊形式服用时 胶囊可用延缓崩解的化合物如一硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯进行 包被。
佐剂代表性的包括软化剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和 缓冲剂。
用于口服给药的固态形式可包括在人类和兽医药理学实践中可接 受的粘合剂、增甜剂、崩解剂、稀释剂、调味料、包衣衣料、防腐剂、 润滑剂和/或时间延迟剂。适当的粘合剂包括阿拉伯胶、明胶、玉米 淀粉、西黄蓍胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。适当的增甜
剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、天冬甜二肽或糖精。适当的崩解剂包括 玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯酮、瓜尔胶、黄单胞菌胶、膨润 土、海藻酸或琼脂。适当的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露醇、葡萄 糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。适当的调味剂包 括薄荷油、冬绿树油、樱桃、柑橘的油红莓调味料。适当的包被剂包 括丙烯酸和/或异丁烯酸和/或它们的酯类的聚合物或共聚物、蜂蜡、 脂肪醇、玉蜀黍蛋白、虫胶或粘胶质。适当的防腐剂包括苯甲酸钠、 维生素E、 Ot-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙 酯或亚硫酸氢钠。适当的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯 化钠或滑石粉。
用于口服给药的液体形式可包括，除了上述的制剂外，液体载体。 适合的液体载体包括水，油如橄榄油、花生油、芝麻油、葵花子油、 红花油、花生油、椰子油、液状石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、 乙醇、丙醇、异丙醇、丙三醇、脂肪醇、甘油三酯或它们的组合物。
用于口服给药的混悬液可进一步包括分散剂和/或悬浮剂。适当 的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚-乙烯基-吡咯垸酮、海藻酸钠或乙酰基乙醇。适当的分散剂包括卵磷脂、 脂肪酸如硬脂酸的聚氧乙烯酯类、聚氧乙烯山梨醇一-或二-油酸盐、-硬脂酸盐或-月桂酸盐、聚氧乙烯去水山梨醇一-或二-油酸盐、硬脂酸 盐或-月桂酸盐等等。
用于口服给药的乳剂可进一步包括一种或多种乳化剂。适当的乳 化剂包括如前面所举例的分散剂或天然的树胶如瓜尔胶、阿拉伯胶或 西黄蓍胶。
用于制备经注射途径可给药的组合物的方法对于被领域技术人员
而言是很明显的，并在如Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed.， Mack Publishing Company, Easton， Pa.中进行了更详尽的描述，因而通过 引用合并于此。
组合物可掺入任何适当的表面活性剂如阴离子的、阳离子的或非 离子的表面活性剂如山梨坦酯或它的聚氧乙烯衍生物。悬浮剂如天然 树脂、纤维素衍生物或无机材料如硅胶、和其他成分如羊毛脂，也被 包括在内。
在制备免疫增强组合物时一种或多种免疫增强剂可被用作活性组 分。这样的制备使用本领域技术人员所知的常规方法。典型地，这样 的组合物可作为可注射剂、或作为液体溶液或混悬液进行制备；在注 射前适合存在于或混悬于液体中的固态形式也可被制备。制备物也可 以被乳化。活性免疫成分经常和药用的并与活性成分相容的辅料进行 混合。
给药途径
根据本发明的方法，化合物和组合物可以用任何适当的途径进行 给药，全身地、区域性地或局部地。在特定环境下使用特定的给药途 径取决于许多因素，包括要被治疗的疾病的性质、疾病的严重度和范 围、要给药的特定化合物的必需剂量和化合物的潜在副作用。
例如，在要求所需化合物的适当浓度被直接释放到需要治疗的身 体部位的情况下，给药应是区域性的而不是全身性的。区域性给药提 供将所需化合物的非常高的局部浓度释放到要求的部位的能力因而适 于获得想得到的治疗或预防效果，同时避免身体的其他器官暴露于化 合物而潜在地减少副作用。
例如，根据本发明的实施方式给药可以用任何标准途径完成，包 括腔内的、膀胱内的、肌内的、动脉内的、静脉内的、皮下的、外用 的或口服的。腔内给药可以是腹膜内的或胸膜内的。在特定实施方式 中，给药可以通过静脉输注或腹膜内的给药。最优选地，给药可以通 过静脉输注。
如果有需要，实际上为了材料相对慢的释放到身体中，含有适于 持续或周期释放的免疫增强剂的设备或化合物能植入身体或局部应 用。
基因治疗构建体给药到哺乳动物，优选人类，可包括通过直接口 服摄入、全身注射的途径递送，或递送到所选组织或细胞，或间接地 送到从哺乳动物或匹配供者中分离得到的细胞。后一个途径的例子是 干细胞治疗，其中分离的具有生长和分化潜能的干细胞用含有Sox 18 核酸的载体进行转染。干细胞培养一段时间后转移到被治疗的哺乳动 物身上。
关于基于核酸的组合物，递送该组合物的所有方式均涵盖于本发
明。该组合物到动物的细胞或组织的递送可以用例如微粒轰击、脂质
体介导的转染(如lipofectin或lipofectamine)、电穿孔术、磷酸钙或 DEAE-葡聚糖-介导的转染进行促进。在替代实施方式中，合成构建体 以本领域所知的"裸露DNA"组分的形式作为治疗或预防组合物。合 适的递送方法的讨论可以在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Eds. Ausubel等人；John Wiley & Sons Inc" 1997 Edition)的第9章中或在国际网站DNAvaccine.com中找到。组合 物可以用皮内(如用panjetTM递送)或肌内的途径给药。
将合成多核苷酸导入耙细胞的步骤由于预期的使用和物种而有所 不同，并涉及一个或多个非病毒和病毒载体、阳离子脂质体、逆转录 病毒、或腺病毒如Mulligan, R.C., (1993 Science 260 926-932)所描述 的，其通过引用合并于此。这样的方法可包括，如
A. 合成多核苷酸的通过注射局部应用(Wolff等人，19卯，Science 247 1465-1468，通过引用合并于此)、外科移植、滴注或其他任何方法。 这个方法也可与注射、外科移植、滴注或其他任何方法应用合成多核 苷酸编码的蛋白的反应细胞的局部应用相结合使用，以增加治疗的效 果。这个方法也可与通过注射、外科移植、滴注或其他任何方法应用 另外一种因子或所述蛋白活性需要的因子的局部应用相结合使用。
B. 通过DNA (Calabretta等人，1993, Cancer Treat. Rev. 19 169-179， 通过引用合并于此)或RNA，单独的或结合脂质体(Zhu等人，1993， Science 261 209-212,通过引用合并于此)、病毒衣壳或纳米颗粒
(Bertling等人，1991, Biotech. Appl. Biochem. 13 3卯-405,通过引用合 并于此)或其他任何递送介质的注射进行广泛的全身性递送。改良的 靶向作用可通过将合成多核苷酸连接到靶分子(所谓的"魔术弹"途 径使用，如抗体)，或通过注射、外科移植或其他任何方法的局部应用 另外一种因子或所述合成多核苷酸编码的蛋白活性需要的因子，或对 所述蛋白反应的细胞来完成。
C. 注射或移植或通过任何方法的递送来自体内在体外(ex vivo) 进行修饰的细胞，该修饰通过转染(如存在磷酸钙Chen等人，1987, Mole. Cell Biochem. 7 2745-2752，或阳离子脂质和多胺Rose等人， 1991,BioTech. 10 520-525,这些文章已通过引用合并于此)、感染、注射、
电穿孔(Shigekawa等人，1988, BioTech. 6 742-751，通过引用合并于此) 或其他任何途径，以增加所述的合成多核苷酸在那些细胞中的表达。 该修饰可以通过质粒、噬菌体、粘粒、病毒(如腺病毒或逆转录病毒 Mulligan, 1993, Science 260 926-932; Miller, 1992， Nature 357 455-460; Salmons等人，1993, Hum. Gen. Ther. 4 129-141,这些文章已通过引用合 并于此)或其他载体，或其他如脂质体(Zhu等人，1993, Science 261 209-212，通过引用合并于此)、病毒衣壳或纳米颗粒(Bertling等人， 1991,Biotech.Appl.Biochem. 13 390-405，通过引用合并于此)的修饰 剂，或其他任何修饰介质进行介导。作为基因或基因产物递送载体使 用的细胞已由Barr等人，1991, Science 254 1507-1512和Dhawan等人， 1991, Science 254 1509-1512进行了描述，这些文章己通过引用合并于 此。处理的细胞能与促进细胞在治疗患者体内存活的营养素、生长因 子、基质或其他试剂相结合进行递送。
组合物也可以脂质体形式给予。脂质体一般来源于磷脂或其他脂 类物质，并通过分散在水性介质中的单层或多层水合的液晶形成。任 何无毒性的、生理学上可接受的、形成脂质体的可代谢脂类均能被使 用。脂质体形式的组合物包括稳定剂、防腐剂、辅料等等。优选的脂 质是磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，两者均可是天然的和合成的。形成 脂质体的方法在本领域中是已知的，相关的具体参考文献有Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV， Academic Press, New York, N. Y- (1976) ,p.33etseq.，它的内容已通过引用合并于此。
剂量
对于任何特定患者而言给药化合物的有效剂量水平取决于很多因 素包括被治疗疾病的类型和疾病的阶段；所用化合物的活性；所用 的组合物；病人的年龄、体重、 一般健康状况、性别和饮食；给药的 时间；给药的途径；化合物的消除率；治疗的持续时间；与治疗相结 合的或同时使用的药物，与医学中众所周知的其他相关因素。
本领域的技术人员，通过常规实验，能决定可用于治疗环境下所 需的有效、无毒性剂量。这些最经常是根据各个病例具体情况的 (case-by-case)基础上决定的。
就重量而言，给病人服用的组合物的治疗有效剂量被期望是在每
千克体重每24小时大约0.01mg到大约150mg的范围内；典型地，每 千克体重每24小时大约O.lmg到大约150mg;每千克体重每24小时 大约O.lmg到大约100mg;每千克体重每24小时大约0.5mg到大约 100mg;或每千克体重每24小时大约l.Omg到大约100mg。更典型地， 有效剂量范围被认为是在每千克体重每24小时大约5mg到大约50mg。
替代地，有效剂量可达到大约5000mg/m2。 一般来说，有效剂量 被预期在大约10到大约5000mg/m2，典型地大约10到大约2500mg/m2， 大约25到大约2000mg/m2，大约50到大约1500mg/m2，大约50到大 约1000mg/m2，或大约75到大约600mg/m2。
而且，个体剂量的最佳数量和间隔将决定于被治疗情况的性质和 程度，给药的方式、途径和位置，和被治疗的特定个体的性质对本领 域普通技术人员是明显的。而且，这样的最适条件可以用常规技术进 行决定。
最佳疗程，例如，每单位时间所给组合物的剂量的数量对本领域 普通技术人员是明显的，可以由本领域技术人员使用常规疗程决定实 验进行确定。
治疗方法
调节抗EBV相关疾病的免疫应答的方法也被包括在本发明中，该 方法包括给予需要该治疗的患者有效量的选自如上所述的疫苗、合成 多肽、合成多核苷酸、合成构建体或组合物的免疫增强剂。
而且，本发明也提供了EBV相关疾病的治疗和/或预防方法，包 括给予需要该治疗的患者有效量的选自如上所述的疫苗、合成多肽、 合成多核苷酸、合成构建体或组合物的免疫增强剂。
在优选实施方式中，本发明的免疫增强剂是适合于癌症的治疗， 或癌症的预防。根据本发明的实践能被适当地治疗的癌症包括鼻咽癌、 何杰金淋巴瘤和移植后淋巴细胞增生症。
在另外的或替代的实施方式中，免疫增强组合物适合于病毒性感 染的治疗或预防。本发明中涉及的病毒感染包括爱泼斯坦-巴尔病毒引 起的感染。
免疫接种效能的评价
免疫接种的效果可以通过任何合适的技术进行评价。例如，通过
使用刺激的脾细胞或外周血单核细胞(PBMC)， CTL溶解测定法可以
应用在肽包被的或重组病毒感染的.sup.51Cr标记的耙细胞上。这样的 测定能够通过用如灵长类动物、小鼠或人类细胞(Allen等人，2000, J. Immunol. 164 (9) :4968-4978以及Woodberry等人，见下述)来完成。 替代地，免疫接种的效能和可以用一种或多种技术包括，但不限于， 新鲜的和剌激的PBMC (如见Allen等人，见上述)HLAI类四聚体染 色、增殖测定法(Allen等人，见上述)、Elispot 测定法和胞内y-INF 染色(Allen等人，见上述)，用于线性B细胞应答的酶联免疫吸附测 定法；表达合成多肽的细胞样品的蛋白质印迹法。 合成多肽的设计和生产
通过软件程序运行的计算机可适当地帮助设计或构建本发明的合 成多肽序列或合成多核苷酸序列，其功能之一是能将亲本EBV多肽的 序列片段化形成片段并且以相对于该片段在亲本EBV多肽中不同的连 接关系将该片段连接在一起。构建本发明所需合成分子的可用亲本 EBV序列需要以计算机可读形式存储。因此，根据本发明，相关亲本 分子(如亲本多肽)的序列数据储存在计算机可读形式的存储介质中， 它能加工数据将亲本分子的序列片段化形成片段并且以相对于该片段 在亲本分子中不同的连接关系将该片段连接在一起。
因此，本公开也与计算机可读形式的数据存储介质相关，包括编 码机器可读形式的数据的数据存储物质，当用机器程序指导使用所述 的数据时，它能将亲本序列片段化形成片段并且以相对于该片段在亲 本序列中不同的连接关系将该片段连接在一起。在这种类型的优选实 施方式中，所提供的计算机可读形式的数据存储介质能将相关片段序 列反翻译以提供编码该片段的核酸序列并在相同读码框内连接各个核 酸序列以提供编码其中相对于其在亲本多肽序列中不同的连接方式连 接的所述片段的多肽序列的多核苷酸序列。
在另一个实施方式中，公开包括用于设计本发明的合成多肽和/ 或合成多核苷酸的序列的电脑，此处的电脑包括此处所述的电脑包括 (a)含有编码机器可读形式的数据的数据存储介质的机器可读形式的 的数据存储介质，此处所述的机器可读形式的数据包括亲本多肽的序 列；(b)用于存储加工所述的机器可读形式的数据的指令的操作记忆;
(C)和所述的操作内存及所述的计算机可读形式的数据存储介质相 配对的中央处理装置，用于将所述的计算机可读形式的数据加工为所 述的合成多肽序列和/或所述的合成多核苷酸；和(d)和所述的中央 处理装置相配对的输出硬件，用于接收所述的合成多肽序列和/或所 述的合成多核苷酸。
然而在另一个实施方式中，公开涉及用于设计本发明的合成多核 苷酸序列的计算机程序产物，包括作为亲本多肽序列输入来接收的代 码，将亲本多肽序列片段化为片段的代码，反翻译相关片段序列以提 供编码片段的核苷酸序列的代码，在相同读码框内将每个所述的核苷 酸序列连接在一起以提供编码多肽序列的多核苷酸序列的代码在多肽 序列内所述的片段以相对于亲本多肽序列内的连接而言不同的连接关 系将所述的片段连接在一起，和存储代码的计算机可读介质。
相应地，公开涉及与用于设计合成多肽序列的计算机程序产物， 包括
(a) 接收作为至少一个亲本EBV多肽序列输入的代码；
(b) 使相关的亲本EBV多肽序列片段化成片段的代码；
(c) 使所述的片段以相对于在所述的亲本EBV多肽序列中的连 接而言不同的连接关系连接在一起的代码；和
(d) 存储代码的电脑可读介质。 此处的公开进一步涉及用于设计合成多核苷酸的电脑程序产物，
包括
(a) 接收作为至少一个亲本EBV多肽序列输入的代码；
(b) 使相关的亲本EBV多肽序列片段化成片段的代码；
(c) 反翻译相关片段的序列以提供编码所述的片段的核苷酸序
列；
(d) 使每个所述的核苷酸序列在相同读码框内连接在一起以提 供编码多肽序列的多核苷酸序列在多肽序列内所述的片段以相对于至 少一个亲本EBV多肽序列内的连接而言不同的连接关系被连接在一 起；和
(e) 存储代码的电脑可读介质。 此公开还涉及用于设计合成多肽序列的电脑，此处所述的电脑包
括
(a) 机器可读数据存储介质包括由机器可读数据编码的数据存 储材料，此处所述的机器可读数据包括至少一个亲本EBV多肽的序列；
(b) 用于存储加工所述的机器可读数据的指令的操作记忆；
(C)和所述的操作记忆及所述的机器可读数据存储介质相配对 的中央处理装置，为了加工所述的机器可读形式的数据以提供所述的 合成多肽序列；和
(d)和所述的中央处理装置相配对的输出硬件，以接收所述的合 成多肽序列。
所述的机器可读形式的数据的加工包括将相关亲本EBV多肽序列 片段化为片段和将所述的片段以相对于所述的亲本EBV多肽序列内的 连接而言不同的关系连接在一起。
公开额外地涉及用于设计合成多核苷酸序列的电脑，此处所述的 电脑包括
(a) 机器可读数据存储介质包括由机器可读数据编码的数据存 储材料，此处所述的机器可读形式的数据包括至少一个亲本EBV多肽 的序列；
(b) 用于存储加工所述的机器可读形式的数据的指令的操作记
忆；
(c) 和所述的操作记忆及所述的机器可读形式的数据存储介质 相配对的中央处理装置，为了加工所述的机器可读形式的数据以提供 所述的合成多核苷酸序列；和
(d) 和所述的中央处理装置相配对的输出硬件，以接收所述的合 成多核苷酸序列。
所述的机器可读形式的数据的加工包括将相关亲本EBV多肽序列 片段化为片段，反翻译相关的片段序列以提供编码所述的片段的核苷 酸序列和将每个所述的核苷酸序列在相同读码框内连接在一起以提供 编码多肽序列的多核苷酸序列在多肽序列内所述的片段以相对于至少 一个亲本EBV多肽序列内的连接而言不同的连接关系被连接在一起。
本发明通过参考下述的具体实施例来进一步更详细的描述，具体 实施例不应该被解释为在任何方式中限制本发明的范围。 实施例
实施例1: 一般方法
1.1 NPCSAVINE构建
编码EBNA1、 LMP1和LMP2蛋白的DNA序列用长度变化为20 到lOObp的序列特异性重叠寡核苷酸进行构建(图1)。序列用分布不 对称PCR连接在一起以产生亚盒。这些亚盒用限制性消化和PCR连接 在一起以形成最终的6.8kb的NPC SAVINE构建体。然后这个构建体 被克隆到复制缺陷的腺病毒载体Ad5F35内。表达SAVINE构建体
(AdSAVINE)的重组腺病毒通过转染到HEK293细胞而获得。 SAVINE构建体也可被插入到牛痘和鸡痘病毒递送载体内(见Thomson S.A., Jammillo A.B., Shoobridge M., Dunstan KJ.， Everett B.， Ranasinghe C, Kent S. J., Gao K.， Medveckzy C. J., French R.A., Ramshaw I.A, Development Of A Synthetic Consensus Sequence Scrambled Antigen HIV-1 Vaccine Designed for Global Use (2005) Vaccine, 23 (38) 4647-57)。
1.2 细胞系的建立和维持
EBV转化的类淋巴母细胞系(LCL)经用B95.8病毒分离的外周B 细胞的外源性病毒转化从血清阳性供者中建立起来。这些细胞系常规 地用添加了 2 mM L-谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素和100 u g/ml链霉素 及10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640 (Gibco Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)(称为生长培养基)进行维持。另外，HEK293细胞系用含10n/。FCS 的DMEM进行维持。
1.3 肽的合成
肽，用Merrifield固相法合成，购买于Chiron Mimotopes (Melbourne, Australia),溶解于二甲基亚砜，和稀释于无血清 RPMI1640培养基中用于标准CTL测定。这些肽的纯度用质谱分析法 进行试验并显示大于90%纯度。
1.4 LMP特异的来源于人健康EBV供者的CTL的扩增
来自EBV血清阳性的HLA A2健康个体的外周血细胞被LMP多 表位成分激活。简言之，2X1(^PBMC在24-孔板中和感染了表达LMP
多表位(MOI: 50:1)的重组腺病毒的自体PBMC以50:1的应答者: 刺激者比例进行共培养。三天后，生长培养基添加rhIL-2 (20U/mL)。 这些培养物每周用感染了表达LMP多表位的重组腺病毒和添加了 rhIL-2的自体LCL进行再刺激。至于LCL刺激，2X 106 PBMC和自体 LCL (被照射的，8000rads)以30:1的应答者:刺激者的比例进行共培 养和LMP特异性T细胞反应性用ELISPOT测定法和体外细胞毒测定 法进行评价。
1.5体外细胞毒测定法和ELISPOT测定法
在3轮体外刺激后的第6天，CTL活性用ELISPOT和51Cr释放测 定法进行检测。对于ELISPOT测定法，扩增的CTL和有关的肽(10—5M) 在预包被了抗小鼠IFN-y mAb (Mabtech AB, Nacka, Sweden)的96-孔 混合纤维素酯膜板(Millipore, Bedford, USA)中平行3孔在37。C孵育 大约18小吋。(抗人IFN-y mAb和生物素化的抗人IFN-y mAb被用于 检测扩增的人CTL)。孵育后，板子用含有0.5%吐温20的PBS进行 充分洗涤并和生物素化的抗小鼠IFN-y mAb二抗进行孵育，随后加入 抗生物素蛋白链菌素碱性磷酸酶。个别的IFN-Y产生细胞在与5-溴-4 氯-3-吲哚磷酸盐和硝基四偶氮蓝反应后被检测为紫色的斑点。斑点用 图像分析软件进行自动计数。每个表位的CTL前体频率以每106培养 的细胞中斑点形成细胞来计算。IFN-Y分泌T细胞的数量通过扣除阴性 对照(CTL用无关肽培养)进行计算。
对于体外细胞毒测定法，HLA-A2限制性的用相关肽脉冲的人PHA 母细胞被用作靶细胞。特异性溶解百分比计算如下
100X (实验释放-自发释放) (最大释放-自发释放)
1.6小鼠
Balb/c裸鼠和HLAA2/Kb小鼠(由Dr L. Sherman, Scripps Research Institute, CA惠赠)从动物资源中心(ARC)购买，WA, Australia. HLA A2/Kb转基因鼠表达嵌合体的人(al禾Pa2HLAA2结构域)和鼠(a 3,跨膜和胞内H-2/Kb结构域)I类分子。6-8周龄的雌性HLA A2/Kb
和裸鼠用于所有的实验。所有的实验在研究所伦理委员会同意的实验 方案下完成。1.7肿瘤模型
免疫缺陷裸鼠在颈的背面皮下移植2mn^人NPC同种异体移植物 (称为C17,由Dr. Pierre Busson, Gustav Roussey, Paris友情提供)。C17 最初来源于NPC病人的转移组织(HLA型肿瘤A2、 B41、 B45)。
1.8HLAA2/Kb转基因鼠用SAVINE的免疫接种
HLAA2/Kb转基因鼠(n=5)用Ad SAVINE (109噬斑形成单位) 进行皮下(s.c.)免疫。两周后，这些小鼠用牛痘SAVINE (107噬斑形 成单位)或禽痘SAVINE (2X10"噬斑形成单位)再进行注射。
1.9来自免疫的HLA-A2/Kb鼠脾脏的SAVINE特异性CTL的体外
扩增
免疫接种3周后，脾的单细胞悬液通过尼龙膜挤压后用ACK裂解 缓冲液裂解红细胞而得到的。细胞以4Xl(^/孔接种于24-孔板中在含 有10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素、2mML-谷氨酰 胺和50uM (3-巯基乙醇(RPMI1640完全培养基)的RPMI培养基中加 入20U/ml人IL-2。脾细胞用对相关肽(10—SM在37。C 1小时)敏感的 自体照射过的(2000 rads)脾细胞以4:1的效应者:刺激者的比例进行 剌激。这些培养物每周用包被了相关肽的同种基因的脾细胞进行再刺 激。
I.IO过继性转移
免疫缺陷型裸鼠接种人鼻咽癌同种异体移植物并当肿瘤大小大约 为0.2 cm3 (肿瘤接种后14天)，每组带瘤的裸鼠(11=6只小鼠/组)用 5X106Ad (引发的)-VV (增强的)SAVINE特异的T细胞或5X 106 Ad-FPV SAVINE特异的T细胞进行过继性转移。另一组裸鼠注射5 X 106 Ad-FPV SAVINE-CTL并在每次过继性转移后1、 2禾B 3天腹腔注 射(i.p.)人IL-15 (5ug)进行治疗。对照组包括注射了 5X106LMP 多表位特异的CTL、细胞巨化病毒多表位(CMV)特异的CTL、 CD8 衰竭的Ad-FPV SAVINE-CTL或未处理的。SAVINE特异的T细胞的治 疗效果通过有规律的监测肿瘤退化进行评价和肿瘤体积大于1.0 cm3的 小鼠被处死。
实施例2:编码SAVINE蛋白的DNA序列
编码SAVINE蛋白的乱序的DNA序列以SEQ ID NO:l公开。由
SEQ ID NO:l编码的蛋白由随机重叠的来自EBNA1、 LMP2禾B LMP1
的氨基序列组成。编码的肽序列是来自这些蛋白的30个氨基酸重叠了 15个氨基酸。这个SAVINE蛋白被插入到Ad5/F35、痘苗病毒和禽痘 病毒载体中。
实施例3: SAVINE蛋白内的确定表位有效的加工和递呈到 EBNA1 、 LMP1和LMP2 T细胞
感染了表达SAVINE蛋白的牛痘、禽痘或腺病毒的HLA-配对的成 纤维细胞显示抗EBNA1、 LMP1和LMP2肽-特异性CTL的细胞溶解 活性然而感染了牛痘TK-，空的腺病毒或未感染的成纤维细胞不被溶 解(图2)。
图2显示在EBNA1 (HPV,HLA-B35限制性的)，LMP1 (YLL禾口 YLQ, HLAA2-限制性的；IAL, HLAB35-限制性的)和LMP2(CLG, LTA 和LLS, HLA A2-限制性的；PYL, HLA-A23-限制性的；IED， HLA-B40-
限制性的)抗原内的确定的表位特异性CTL多克隆系或CTL克隆可以 从四个EBV血清阳性的健康供者中产生。这些CTL的特异性在细胞 溶解测定法中用抗确定表位-负载的PHA母细胞进行检测。随后，为了 找出在EBNA1、 LMP1和LMP2抗原内的确定表位是否是内源型加工 的，HLA-配对的成纤维细胞首先用表达SAVINE构建体(MOI， 10:1) 的牛痘、禽痘或腺病毒载体感染。感染了牛痘TK-，空的腺病毒的靶 成纤维细胞或未感染成纤维细胞作为对照。这些耙标然后在铬释放测 定中检测抗EBNA1、 LMP1和LMP2表位-特异性CTL多克隆系或从 EBV血清阳性的健康供者中获得的CTL克隆的细胞溶解活性。在这些 测定中使用10:1的效应者:靶标的比例。感染了表达SAVINE构建体的 牛痘、禽痘或腺病毒载体的HLA-配对的成纤维细胞具有细胞溶解活 性，然而感染了对照载体的成纤维细胞并不被溶解。
这些结果表明SAVINE构建体内的确定表位非常有效的被加工和 递呈到靶细胞上。
实施例4:来自EBV免疫健康供者的SAVINE特异性的CTL的激
活
来自健康人EBV携带者(ScBu和DoSc)的PBMC用感染了 AdSAVINE, AdPoIy或自体LCL (30:1)的自体PBMC (2:1的效应者
对刺激者比例)进行刺激(图3 (a)和(b)。所有的培养物用Y-照射 过的如上面所述的感染的自体LCL每周进行再刺激。在3次再刺激后 的3天培养的细胞在铬释放测定中作为抗肽-敏感的自体PHA母细胞的 效应者。培养的细胞也可以用ELISPOT进行检测和结果以每106 CTL 中的斑点形成细胞(SFC)来表达(图3 (c))。
用自体LCL的腺病毒SAV1NE刺激来自健康供者的PBMC，用铬 释放测定和ELISPOT测定进行效应子功能测验(图3 (a)、(b)和(c)) 因此表明SAVINE-激活的CTL具有比LCL激活的CTL更高的特异性 溶解。
实施例5:用SAVINE构建体定位新的反应
全长的LMP1抗原的的氨基酸序列从亚洲EBV株，CAO (17 mer 的32肽在长度上重叠8个残基)和高加索原型1EBV株，B95.8 (17 mer的42肽在长度上重叠8个残基)。全长的LMP2 (20 mer的49肽 在长度上重叠10个残基)和EBNA1 (15 mer的69肽在长度上重叠10 个残基)抗原的的氮基酸序列来自高加索的原型1EBV株，B95.8。来 源于四个EBV血清阳性的健康供者的腺病毒-SAVINE和LCL-激活的 CTL在用重叠肽剌激后检测IFN-y的分泌。特异性T细胞对确定的 008+和004+ T细胞表位的反应性能被观察到。除了抗已经确定的肽 的反应性，这些新肽池序列(2个来自LMP1和LMP2)中的四个通过 SAVINE和LCL活化的CTL显示反应性和这些新肽池序列(1个来自 CAO LMP1 ， B95.8 LMP1 LMP2和EBNA1)中的四个通过SAVINE活 化的CTL显示反应性。
SAVINE活化的CTL用来自EBNAl、 LMP1和LMP2 (图4 (a), (b) , (c)和(d))的一组肽进行的筛选表明SAVINE构建体能激活 来自三个蛋白中的每一个已确定的CTL表位。此外，SAVINE激活对 4个新的混合的肽序列的反应性。
实施例6: Ad5/F35 SAVINE构建体能引发小鼠中的可被牛痘 SAVINE或禽痘SAVINE增强的CTL应答
两组HLA-A2/Kb转基因鼠(n=5)用Ad SAVINE (109噬斑形成 单位)进行皮下免疫及两周后，这些小鼠再注射牛痘-SAVINE (107 噬斑形成单位)或禽痘SAVINE (2X10、篮斑形成单位)。两周后，脾
细胞被收获并且CTL应答可以用ELISPOT测定法进行评价以及结果 用每106脾细胞中的斑点形成细胞(SFC)的平均值+标准差来表示(图 5)。
图5因而表明用Ad5/F35 SAVINE免疫的HLA A2 Kb小鼠引发特 异性的CTL应答并且在脾细胞中的这种反应可以通过ELISPOT测定 法在体外进行检测。这个始发的CTL应答能被接着的使用牛痘SAVINE 或禽痘SAVINE的免疫接种所增强。
实施例7:体外扩增的SAVINE CTL的治疗效果导致人鼻咽癌的
退化
免疫缺陷型裸鼠接种人鼻咽癌同种异体移植物并当肿瘤大小大约 为0.2 cm3 (肿瘤接种后14天)，每组带瘤的裸鼠(11=6只小鼠/组)用 5X106Ad (引发的)-VV (增强的)SAVINE特异的T细胞或5 X106Ad-FPV SAVINE特异的T细胞进行过继性转移。另一组裸鼠注 射5 X 106 Ad-FPV SAVINE-CTL并在每次过继性转移后1 、 2和3天腹 腔注射人IL-15 (5ug)进行治疗。对照组包括注射了 5X106 LMP多 表位特异的CTL、细胞巨化病毒多表位(CMV)特异的CTL、 CD8衰 竭的Ad-FPV SAVINE-CTL或未处理的。SAVINE特异的T细胞的治疗 效果通过有规律的监测肿瘤退化进行评价和肿瘤体积大于1.0 cm3的小 鼠被处死。未处理小鼠、接受CMV T细胞或CD8衰竭的Ad-FPV SAVINE-CTL的小鼠不会导致肿瘤生长的抑制并且这些小鼠中的肿瘤 在首次T细胞转移后的大约12-24天达到1.0 cm3。接受CD8衰竭的 LMP-CTL的小鼠在首次CTL转移后的大约12-78天被处死。90天后， 单独接受Ad-FPV SAVINE-CTL的1/6小鼠或接受Ad-FPV SAVINE-CTL及IL15的小鼠持续的退化并且在2/6小鼠中接受Ad-VV SAVINE-CTL的小鼠持续的退化(图6)。
图6因而表明来自小鼠主要如图5中增强的和随后用确定表位 CTL肽体外进行扩增的SAVINE CTL能保护人的鼻咽癌细胞在其体内 生长的裸鼠。
权利要求
1、治疗或预防患者爱泼斯坦-巴尔病毒相关疾病的疫苗，其中所述的疫苗包括包含至少一种亲本爱泼斯坦-巴尔病毒多肽的多个不同区段的合成多肽，其中以相对于该区段在至少一种亲本爱泼斯坦-巴尔病毒多肽中不同的连接关系将该区段连接在一起。
2、 根据权利要求1所述的疫苗，其中所述的至少一种亲本爱泼斯 坦-巴尔病毒多肽选自包含EBNAl、 LMP1禾口LMP2的群组。
3、 根据权利要求1或权利要求2所述的疫苗，其中所述的爱泼斯 坦-巴尔病毒相关疾病为癌症。
4、 根据权利要求3所述的疫苗，其中所述的癌症选自包含鼻咽癌 (NPC)、何杰金淋巴瘤(HL)和移植后淋巴细胞增生症(PTLD)的群组。
5、 根据权利要求1至4中任一项所述的疫苗，其中所述的合成多 肽基本上由单个亲本爱泼斯坦-巴尔病毒多肽的不同区段组成。
6、 根据权利要求1至4中任一项所述的疫苗，其中所述的合成多 肽基本上由多个不同亲本爱泼斯坦-巴尔病毒多肽的不同区段组成。
7、 根据权利要求1至6中任一项所述的疫苗，其中所述合成多肽 中的区段以相对于该区段在至少一种亲本爱泼斯坦-巴尔病毒多肽中相 应区段不同的顺序或排列将该合成多肽中的区段顺次连接。
8、 根据权利要求1至7中任一项所述的疫苗，其中至少一个所述 的区段与一个或更多其他所述的区段具有部分序列同一性或同源性。
9、 根据权利要求8所述的疫苗，其中所述的序列同一性或同源性 包含于所述的至少一个区段的一端或两端。
10、 合成多肽，其中所述的多肽包括至少一种亲本爱泼斯坦-巴尔 病毒多肽的多个不同区段，其中以相对于该区段在至少一种亲本爱泼 斯坦-巴尔病毒多肽中不同的连接关系将该区段连接在一起。
11、 编码如权利要求io所述的合成多肽的合成多核苷酸。
12、 根据权利要求ll所述的合成多核苷酸，其中所述的多核苷酸 包括如SEQIDNO:l中所述的序列。
13、 包括可操作的连接到调节多核苷酸的如权利要求11或12所 述的多核苷酸的合成构建体。
14、 制备如权利要求11或12所述的合成多核苷酸的方法，包括 将编码至少一种亲本爱泼斯坦-巴尔病毒多肽不同区段的多个核酸序列 在相同的读码框中连接在一起以形成合成多核苷酸，该合成多核苷酸 的序列编码以相对于该区段在至少一种亲本爱泼斯坦-巴尔病毒多肽中 不同的连接关系连接在一起的所述的区段。
15、 根据权利要求14所述的方法，进一步包括将相关亲本爱泼斯 坦-巴尔病毒多肽的序列片段化形成片段并且以相对于该片段在亲本爱 泼斯坦-巴尔病毒多肽序列中不同的连接关系将该片段连接在一起。
16、 根据权利要求15所述的方法，其中所述的片段随机连接在一起。
17、 根据权利要求14至16中任一项所述的方法，进一步包括反 翻译相关亲本爱泼斯坦-巴尔病毒多肽的序列或其区段，以提供编码所 述亲本爱泼斯坦-巴尔病毒多肽或所述区段的核酸序列。
18、 根据权利要求17所述的方法，其中反翻译所述的亲本爱泼斯 坦-巴尔病毒多肽序列的氨基酸，以在所使用的细胞中提供比其他同义 密码子具有更高翻译效率的密码子。
19、 根据权利要求18所述的方法，其中反翻译所述亲本爱泼斯坦 -巴尔病毒多肽序列的氨基酸，以提供在相邻或局部序列元件的环境中 具有更低倾向形成对执行任务不利序列的密码子。
20、 根据权利要求19所述的方法，其中所述的不利序列为回文序列或重复序列。
21、 根据权利要求19或20所述的方法，其中所述的任务是克隆、 测序、增强多核苷酸的稳定性或增强体内翻译。
22、 包括选自如权利要求1至9所述的疫苗、如权利要求10所述 的合成多肽、如权利要求11或权利要求12所述的合成多核苷酸或如 权利要求13所述的合成构建体的免疫增强剂与药用载体的组合物。
23、 如权利要求22所述的组合物，进一步包括佐剂。
24、 调节抵抗爱泼斯坦-巴尔病毒相关疾病免疫应答的方法，包括 给予需要该治疗的患者有效量的选自如权利要求1至9所述的疫苗、 如权利要求10所述的合成多肽、如权利要求11或权利要求12所述的 合成多核苷酸、如权利要求13所述的合成构建体或如权利要求22或 23所述的组合物的免疫增强剂。
25、 治疗和/或预防爱泼斯坦-巴尔病毒相关疾病的方法，包括给 予需要该治疗的患者有效量的选自如权利要求1至9所述的疫苗、如 权利要求IO所述的合成多肽、如权利要求11或权利要求12所述的合 成多核苷酸、如权利要求13所述的合成构建体或如权利要求22或23 所述的组合物的免疫增强剂。
26、 如权利要求1至9所述的疫苗、如权利要求10所述的合成多 肽、如权利要求11或权利要求12所述的合成多核苷酸、如权利要求 13所述的合成构建体或如权利要求22或23所述的组合物在调节免疫 应答中的用途。
27、 如权利要求1至9所述的疫苗、如权利要求10所述的合成多 肽、如权利要求11或权利要求12所述的合成多核苷酸、如权利要求 13所述的合成构建体或如权利要求22或23所述的组合物在制备治疗 爱泼斯坦-巴尔病毒相关疾病的药物中的用途。
28、 包括如权利要求IO所述的合成多肽、如权利要求11或权利 要求12所述的合成多核苷酸、如权利要求13所述的合成构建体或如 权利要求22或23所述的组合物的疫苗在治疗爱泼斯坦-巴尔病毒相关 疾病中的用途。
全文摘要
本发明涉及治疗或预防患者EBV相关疾病的疫苗，其中所述的疫苗包括包含至少一种亲本EBV多肽的多个不同区段的合成多肽，其中以相对于该区段在至少一种亲本EBV多肽中不同的连接关系将该区段连接在一起。
文档编号A61K39/245GK101379078SQ200680052334
公开日2009年3月4日 申请日期2006年12月6日 优先权日2005年12月6日
发明者D·J·莫斯, J·K·杜赖斯瓦米, S·A·汤姆森 申请人:赛文医疗私人有限公司