专利名称：Hiv调节/辅助蛋白的融合蛋白的制作方法
此案是申请日为2003年5月14日、中国申请号为03811119.5、发明名称为“HIV调节/辅助蛋白的融合蛋白”的发明申请的分案申请。
本发明涉及一种融合蛋白，所述蛋白包含选自Vif，Vpr，Vpu，Vpx，Rev，Tat和Nef中的至少四种HIV蛋白的氨基酸序列或者一种或多种所述蛋白的氨基酸序列的衍生物，其中所述融合蛋白不被加工成单独的具有天然N和C末端的HIV蛋白。本发明还涉及编码所述蛋白的核酸，包含所述核酸的载体，以及制备所述蛋白的方法。所述融合蛋白，核酸和载体可用作至少部分预防HIV感染的疫苗。
背景技术：
人免疫缺陷病毒(HIV)是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的致病因子。像所有的逆转录病毒一样，该病毒的基因组编码Gag，Pol和Env蛋白。此外，该病毒的基因组还编码调节蛋白，即Tat和Rev，以及辅助蛋白，即Vpr，Vpx，Vpu，Vif和Nef。
尽管公共卫生组织努力控制AIDS流行病的播散，新发感染的数目仍在增长。世界卫生组织估计2000年末，全球感染的人数达3.61千万，比根据十年前的数据预计的数目高50％(WHO&UNAIDS，UNAIDS，2000)。从全球来看，2000年新发HIV感染的数目在530万。
由于该流行病的持续传播，临床上仍需要有效的疫苗。现已发展出一些不同的HIV-1疫苗递送策略例如新的载体或者辅剂系统，并在不同的前临床背景和临床试验中进行了评估。进入III期临床实验的第一种候选疫苗是以明矾中的包膜gp120蛋白(Francis等，AIDS Res.Hum.Retroviruses 1998；14(Suppl 3)(5)S325-31))为基础的。尽管该疫苗在较早的II期实验中不是很成功，其III期实验还是已经开始了。
多年来基于包膜抗原对预防性疫苗投入努力之后，最近更多的努力集中在将调节蛋白例如Tat，Nef和Rev用作候选疫苗抗原上。这些调节性抗原在治疗中已经使用了几年(Miller等，Nature Medicine 1997，3，389-94，Calarota等，Lancet 1998，351，1320-5，Ayyavoo等，AIDS，2000，14，1-9)。近来，在小型临床前实验中对预防性疫苗的研究显示，这些抗原的应用很有前途。使用Tat和Rev，或单独的Tat作为候选的预防性疫苗显示可控制SIVmac(Osterhaus等，Vaccine 1999，17，2713-4)。此外，还表明针对该病毒早期调节蛋白的CTL对于在该病毒产生高水平的成熟病毒粒前消除感染的细胞很重要(van Baalen等，J.Gen.Virol 1997，78，1913-8；Addo等，PNAS，2001，98，1781-6)。
尽管HIV的调节/辅助蛋白诱导有效的免疫应答，但如果不是全部也是大多数都有严重的副作用，从而限制了它们作为疫苗的用途Nef，Tat和Vpu已显示在下调CD4+和/或MHC I类分子的表达中起作用(Howcroft等，Science，1993，260，1320-2；Schwartz等，Nature Med.1996，2，338-42；Swann等，Virology，2001，282，267-77；Janvier等，J.Virol.，2001，78，3971-6，Weissmann等，PNAS 1998，95，11601-6)。已知Tat介导体内的急性免疫抑制(Cohen等，PNAS，1999，96，10842-10847)。还描述了Vpr的免疫抑制作用(Ayyavoo等，Nature Med.，1997，31117-1123)。已经描述了Vpr和Vpx在酵母细胞中具有不同的细胞抑制和细胞毒性效果(Zhang等，Virology，1997，230，103-12)。因此，HIV的大多数辅助/调节蛋白似乎具有疫苗配方中不期望的功能特性。
降低HIV蛋白的有害效果的试验在WO 02/06303中描述。具体地，WO 02/06303公开了包含HIV Vif，Vpu和Nef的氨基酸序列的融合蛋白，其中所述组成蛋白和另一种组成蛋白连续，或者被非组成蛋白如氨基酸序列分开，形成了蛋白水解的裂解位点。已知优选使用包含位于组成蛋白之间的蛋白水解位点的融合蛋白。由于所述组成蛋白被蛋白水解的裂解位点分开，产生了已知有害的天然HIV蛋白。为降低由融合蛋白裂解产生的HIV蛋白的任何有害影响，WO 02/06303提示使用减毒蛋白。因此，WO 02/06303教导我们使用包含HIV Vif，Vpr和Nef蛋白的融合蛋白，其中的裂解位点被插入HIV蛋白之间，并且其中的HIV蛋白是减毒蛋白。然而，减毒蛋白的缺点在于减毒蛋白的氨基酸序列和天然蛋白的氨基酸序列不同，使得利用减毒蛋白进行的免疫产生的免疫应答只能微弱地识别天然蛋白或甚至根本不识别天然蛋白。
发明目的本发明的目的是提供一种能够产生对HIV的多种或所有调节/辅助蛋白产生有效的免疫应答的疫苗，具体是有效的细胞毒性T细胞应答，其中所述疫苗中或由疫苗产生的调节/辅助HIV蛋白比天然的单独的调节/辅助蛋白的功能低，从而使得与天然HIV蛋白相比，所述疫苗中的辅助/调节蛋白产生不期望的副作用的危险性降低，并且其中较弱活性的HIV蛋白诱导与天然HIV蛋白类似的免疫应答。
发明内容
通过提供一种融合蛋白实现了本发明的目的，所述融合蛋白包含选自Vif，Vpr，Vpu，Rev，Tat和Nef中的至少四种HIV蛋白的氨基酸序列或者一种或多种所述蛋白的氨基酸序列的衍生物，其中所述融合蛋白不被加工成单独的具有天然N和C末端的HIV蛋白。具体地，本发明的目的已经通过编码所述融合蛋白的核酸和载体实现了。
如果融合蛋白在包括人细胞的动物细胞中产生，该融合蛋白被细胞蛋白酶裂解的方式不会获得具有天然N和C末端的辅助/调节蛋白。
由于作为融合蛋白一部分的HIV蛋白与单独的HIV蛋白相比，其具有改变的二级/三级结构，所述融合蛋白中的HIV蛋白比单独的蛋白的功能弱，甚至完全没有功能。功能较弱甚至没有功能的调节/辅助蛋白不具有天然构象的HIV蛋白的不良副作用。就免疫原性而言，所述融合蛋白的免疫源性与形成融合蛋白的单独的HIV调节/辅助蛋白的免疫源性相比基本没有差别。具体而言，由于呈递给免疫系统的表位相同，就细胞毒性T细胞(CTL)应答而言基本上没有差别。当将融合蛋白给药患者时的考虑也一样。
本发明术语“HIV”指本领域技术人员已知的任何HIV组，亚型(分化株)，株或分离株。具体地，HIV可以是HIV-1或HIV-2。HIV-1被分成9种亚型(分化株A到I)，而HIV-2可以被分成5种亚型(A到E)，均包含在本发明的范围内。本发明最优选的HIV分化株是HIV-1分化株A，B和C。然而，本发明不限于这些最优选的分化株。
HIV调节蛋白Vif，Vpr，Vpu，Rev，Tat，Vpx和Nef的蛋白序列是本领域熟练技术人员已知的。通过实施例，且不限于所述的实施方案，可参考genebank数据库公开的各种序列，具体是Genebank登录号为K03455的HIV-1分离株HXB2R的序列。在该genebank条目(entry)中，详述了各种HIV1基因的序列和所述基因编码的蛋白的序列。
优选形成所述融合蛋白的HIV蛋白来自同一分化株。根据可选的实施方案，形成融合蛋白的HIV蛋白来自两种或更多种分化株。也可能形成所述融合蛋白的一种或多种HIV蛋白是HIV-1蛋白或HIV-2蛋白。
形成所述融合蛋白的HIV蛋白的氨基酸序列优选是由已知HIV分离株编码的序列，即所述融合蛋白中的HIV蛋白的氨基酸序列和天然存在的HIV分离株编码的相应蛋白的氨基酸序列相同。可选地，融合蛋白中的一种或多种HIV蛋白的氨基酸序列可以是共有序列，即已知HIV分离株中不会发现，但与多种或所有已知的HIV分离株显示最佳同源性的序列-尤其就CTL表位而言。计算共有序列的计算机算法是本领域熟练技术人员已知的。
在可选的实施方案中，所述融合蛋白可以包含作为所述融合蛋白的一部分的一种或多种HIV蛋白的氨基酸序列的衍生物。本发明术语“HIV蛋白的氨基酸序列的衍生物”指与天然存在的相应的HIV蛋白相比，具有改变的氨基酸序列的HIV蛋白。改变的氨基酸序列可能是这样的序列，其中HIV蛋白的一种或多种氨基酸序列被替换，插入或删除。更具体地，“HIV蛋白的氨基酸序列的衍生物”是当融合蛋白中的相应氨基酸序列与已知的HIV分离株的各HIV蛋白的氨基酸序列相比，显示至少50％的同源性，更优选至少70％，更优选至少80％，最优选至少90％的同源性的氨基酸序列。即使仅仅在一种HIV分离株的相应蛋白中发现了同源性，氨基酸序列也被认为具有上述的序列同源性，而不考虑其它分离株中可能有显示较低同源性的相应蛋白。通过实施例，如果融合蛋白中的Vpr衍生物显示与一种HIV分离株的Vpr序列具有95％的同源性，但与(所有)其它HIV分离株仅仅有50％-70％的同源性，所述Vpr衍生物的同源性被认为是至少90％。
已指出与单独的蛋白相比，融合蛋白中的HIV蛋白具有降低的活性，或者甚至根本没有活性，这是由于融合蛋白中的蛋白构象和生物活性蛋白的天然构象不同。然而，可能需要进一步降低融合蛋白中的HIV蛋白具有生物活性这一危险性。为此，尤其优选的作为融合蛋白的一部分的单独的HIV蛋白的“衍生物”是其中的多个氨基酸被去除，插入或替代的氨基酸序列衍生物来获得具有降低的活性或者根本不具有活性的HIV蛋白，其中多个氨基酸更优选不超过10个氨基酸，更优选不超过5个氨基酸。本领域熟练技术人员已知测定HIV蛋白是否具有降低的生物活性的方法。
对于病毒在活体内的复制很重要的Vif蛋白的分子机制仍然是未知的，但Vif具有强的自我结合(selfassociation)的倾向性。这种多聚化对Vif在病毒生存周期中的功能是重要的(Yang S.等，J Biol Chem 2001；2764889-4893)。此外，vif还和病毒核蛋白复合物特异性结合，并且可能具有功能上的意义(Khan M.A.等，J Virol.2001；75(16)7252-65)。因此，具有降低的活性的vif蛋白显示降低的多聚化能力和/或降低的与核蛋白复合物的结合。
Vpr蛋白在病毒生存周期中起重要作用。Vpr调节病毒前整合复合物的核转运，并促进非分裂细胞例如巨噬细胞的感染(Agostini等，AIDS Res HumRetroviruses 2002；18(4)283-8)。此外，通过与LTR反应，它还可介导反式激活活性(Vanitharani R.等，Virology 2001；289(2)334-42)。因此，具有降低的活性的vpr显示降低的反式激活作用或者甚至不能反式激活和/或与病毒前整合复合物反应。
Vpx与Vpr高度同源，对于非分裂细胞中有效的病毒复制也很重要。Vpx通过与gag前体多聚蛋白p6结构域的相互作用而被包装在病毒颗粒中。和Vpr一样，Vpx参与将前整合复合物转运到核中(Mahalingam等，J.Virol2001；75(1)362-74)。因此，具有降低的活性的Vpx显示降低的通过gag前体与前整合复合物结合的能力。
Vpu蛋白已知和CD4的细胞质尾相互作用并导致CD4降解(Bour等，Virology 1995；69(3)1510-20)。因此，具有降低的活性的Vpu具有降低的激发CD4降解的能力。
已知充分定性的Tat蛋白的相关生物活性是通过与反式激活反应元件(TAR)的相互作用进行转录的反式激活。已显示Tat能够反式激活缺乏除TAR以外的HIV序列的异源性启动子(Han P.等，Nucleic Acid Res 1991；19(25)7225-9)。因此，具有降低活性的tat蛋白显示降低的通过TAR元件来反式激活启动子。
Nef蛋白对于病毒复制而言非常重要，它通过诱导细胞表面CD4的下调导致疾病的进展(Lou T等，J Biomed Sci 1997；4(4)132)。这种下调是由CD4和Nef之间的直接作用引起的(Preusser A.等，Biochem Biophys ResCommun 2002；292(3)734-40)。因此，具有降低的功能的Nef蛋白显示降低的与CD4的相互作用。
Rev的相关作用是通过与病毒RNA的Rev-反应元件(RRE)的相互作用启动的转录后反式激活(Iwai等，1992；Nuceic Acids Res 1992；20(24)6465-72)。因此，具有降低的活性的Rev显示与RRE的降低的相互作用。
本发明的融合蛋白包含选自Vif，Vpr，Vpu，Vpx，Rev，Tat和Nef中的至少四种HIV蛋白的氨基酸序列。所述融合蛋白优选包含5，6或所有所述的HIV蛋白。融合蛋白中HIV蛋白的顺序不重要。
至少4种不同的HIV蛋白中的一种或多种可以以两个或更多个拷贝包含于融合蛋白中。因此，通过实施例，本发明的融合蛋白可包含Vif，Vpr，Vpu和两个拷贝的Rev。所述HIV蛋白的两个或多个拷贝的氨基酸序列可以完全相同。可选地，这些拷贝的氨基酸序列可以不同，尤其是使用来自不同的HIV株或分化株的蛋白序列(例如，一拷贝的HIV-1 Rev和一拷贝的HIV-2Rev)。
融合蛋白中相邻的HIV蛋白可无需其它氨基酸而被融合，或者以融合蛋白中两个相邻的HIV蛋白被至少一个其它氨基酸分离的方式融合。两种方式的组合也在本发明的范围之内。例如，在包含四种HIV蛋白的氨基酸序列的融合蛋白中，两个相邻的HIV蛋白可以直接互相连接，而第三个和第四个HIV蛋白可以通过其它氨基酸连接。术语“其它氨基酸”在本文的实施方案中指在天然存在的HIV蛋白中的相应位置上没有发现的氨基酸。
因此，本发明的融合蛋白优选具有以下通式+P1---P2---P3---P4---P5*---P6*---P7*+其中P1-P7是不同的HIV蛋白，选自Vif，Vpr，Vpx，Vpu，Tat，Rev和Nef，其中所述融合蛋白包含至少四种不同的所述HIV蛋白，即P1-P4和可选的一种(P5*)，两种(P5*---P6*)或三种(P5*---P6*---P7*)添加的所述HIV蛋白。缩写“---”独立地表示1到n个加入的氨基酸。当“---”代表0个氨基酸时，相邻的HIV蛋白无需其它氨基酸而直接相互融合。当“---”代表1到n个氨基酸时，相邻的HIV蛋白被一到n个氨基酸分离。加入的氨基酸的上限，即整数n，有赖于细胞内可产生或表达的融合蛋白的最大体积。
根据一个实施方案，所有“---”独立代表0到20，更优选代表0到10，更优选1到5个其它氨基酸。
根据可选的实施方案，至少一个“---”代表其它蛋白质的氨基酸序列或其一部分，所述蛋白不是选自Vif，Vpr，Vpx，Vpu，Rev，Tat和Nef的HIV蛋白。因此，根据这一可选的实施方案，所述其它蛋白侧接调节/辅助HIV蛋白。该其它蛋白可以是任何蛋白。更优选该其它蛋白包含可以帮助诱导对HIV的更好的免疫反应的其它表位。因此，所述其它蛋可以是HIV Env，Gag，和/或Pol蛋白或其一部分。文中术语Env，Gag和Pol的“一部分”指来自所述蛋白之一的氨基酸片段，其包含至少一个表位。更优选该术语“一部分”指来自所述蛋白的至少10个，更优选至少20个，更优选至少50个氨基酸。根据相关的实施方案，至少一个“---”代表作为所述融合蛋白一部分的蛋白P1-P7的一种或几种的氨基酸序列。因此，在这种情况下，所述融合蛋白可以包含一个或多个拷贝的一种或多种所述蛋白，其是该融合蛋白的一部分。已指出该蛋白的拷贝可以具有或可以不具有相同的氨基酸序列。
上述通式中，缩写“+”独立代表0到n个其它的末端氨基酸。因此，本发明的融合蛋白在该蛋白的C和/或N末端可以包含或可以不包含其它氨基酸。根据一个实施方案，至少一个“+”代表一种其它蛋白的氨基酸序列或其一部分，所述蛋白不选自Vif，Vpr，Vpx，Vpu，Rev，Tat和Nef。因此，根据本发明的实施方案，所述融合蛋白包含位于C和/或N末端的其它蛋白，所述蛋白不是选自Vif，Vpr，Vpx，Vpu，Rev，Tat或Nef。该其它蛋白可以是任何蛋白。更优选该其它蛋白包含其它表位，可以帮助诱导对HIV的更好的免疫应答。例如，所述其它蛋白可以是HIV Env，Gag和/或Pol蛋白或其一部分。本文术语Env，Gag和/或Pol的“一部分”指来自所述蛋白之一的氨基酸片段，其包含至少一个表位。更优选术语“一部分”指至少10个，更优选至少20个，最优选至少50个来自所述蛋白之一的氨基酸。
根据可选的实施方案，至少一个“+”代表使得该融合蛋白的检测或纯化更容易的氨基酸序列。因此，至少一个“+”可以是例如一种标记例如His标记。
根据本发明，所述融合蛋白不被加工成单独的具有天然N和C末端的HIV蛋白。更具体地，在人细胞中表达时，本发明的融合蛋白不被加工成具有单独的具有天然N和C末端的HIV蛋白。本领域熟练技术人员已知如何检测在人细胞中表达的融合蛋白是否被加工成单独的具有天然N和C末端的HIV蛋白的方法。本文提供的参考文献是Ayyavoo等，AIDS 2000，14，1-9，具体参考所述文献的图2中公开的试验。简言之，本领域熟练技术人员可轻易地在人细胞例如Hela细胞中表达各融合蛋白；所述细胞随后被裂解并使用对单独的HIV蛋白特异的抗体，对所述细胞裂解物进行Western印迹实验或者免疫沉淀实验，所述单独的HIV蛋白在一起形成各种HIV融合蛋白。对于本发明的融合蛋白而言，没有检测到明显量的大小对应于单独的HIV调节/辅助蛋白的大小的HIV蛋白。
为保证本发明的融合蛋白不被加工成具有天然N末端和C末端的单独的HIV蛋白，所述融合蛋白不应包含位于形成融合蛋白的HIV蛋白的氨基酸序列之间的细胞蛋白酶的特定裂解序列，所述序列将导致产生具有天然N和C末端的HIV蛋白。因此，上文通式中的缩写形式“---”不包含细胞蛋白酶的特定裂解序列，其可能导致产生具有天然N和C末端的HIV蛋白。具体地，所述融合蛋白不包含位于形成融合蛋白的不同HIV蛋白的氨基酸序列之间的裂解序列PEKRAVVG(单字母氨基酸密码)。细胞蛋白的其它裂解序列也是本领域熟练技术人员已知的。因此，本领域熟练技术人员可以轻易避免包含可能产生具有天然N和C末端的单独的HIV蛋白的(细胞)蛋白酶裂解序列。半胱氨酸蛋白酶的裂解序列的实例是Ile/Leu-X-Thr-X-Gly。
本发明的蛋白不包含生产同时具有天然N和C末端的HIV蛋白的特定裂解序列。然而，只要这些裂解位点不能介导同时具有天然N末端和天然C末端的HIV蛋白的产生，通常不排除融合蛋白中的蛋白之间的细胞蛋白酶裂解位点的存在。具体地，上文通式中的缩写氨基酸序列“---”可以包含参与MHC I或MHC II上被呈递的短肽的产生的蛋白酶的裂解位点。根据该实施方案，裂解反应的结果是产生优选少于20个氨基酸的短肽片段，其N或C末端可对应于一个HIV辅助/调节蛋白的N或C末端。然而，当这些短肽在抗原呈递的过程中被产生时，它们不具有其来源的HIV蛋白任何的活性。
本发明还涉及编码本发明定义的融合蛋白的核酸。所述核酸可以是DNA或RNA。如果意图通过使用例如质粒或以DNA病毒为基础的载体的DNA载体，将核酸插入人细胞中，优选所述核酸是DNA。
本领域熟练技术人员已知构建编码本发明的融合蛋白的核酸的方法。不必拘泥于下述方法，本领域熟练技术人员可以从包含一种或多种调节/辅助HIV蛋白的编码序列的基因组HIV克隆，亚基因组HIV克隆，或者任何起始原料例如质粒开始。如果该调解/辅助蛋白的编码序列位于连续的阅读框架中，所述编码序列可通过适当的限制性酶裂解包含所述编码序列的核酸而分离。由此获得的DNA片段可被用于进一步的克隆。可选地，辅助/调节蛋白的编码序列可通过使用适当的引物进行聚合酶链反应(PCR)获得。如果该调解/辅助蛋白由一种以上的外显子编码，如Tat和Rev那样，需要独立地克隆不同的外显子并将其融合产生调节/辅助蛋白的连续阅读框架，或者利用反转录技术例如PT-PCR。
编码序列也可以通过基因合成提供，例如通过使用一套互补的和/或重叠寡核苷酸产生基因。
为获得融合蛋白，编码所述融合蛋白的核酸优选包含连续阅读框架。因此，除最后一段编码HIV蛋白或其它蛋白的序列以外，所有序列的终止密码子优选被突变成编码氨基酸的密码子或者被完全删除。优选，如果PCR使用特定的引物，其可无需终止密码子扩增该编码序列，可轻易实现所述过程。换言之，根据该可选方案，下游引物不应与终止密码子互补。因此扩增的DNA片段不包含终止密码子并可被克隆进入克隆载体中。可选地，也可能将含有终止密码子的编码序列克隆到克隆载体中。所述终止密码子可在以后被消除，例如通过使用特异性核酸内切酶或者通过诱变。
克隆步骤的结果可以产生编码本发明的融合蛋白的连续阅读框架。
获得融合蛋白的表达必要的调节元件可以是任何驱动所需表达系统中的表达的调控元件。如果意图在原核细胞例如大肠杆菌中制备融合蛋白，优选使用细菌或噬菌体启动子。如果意图在真核细胞中表达该融合蛋白，优选使用真核或病毒启动子/增强子。如果意图通过使用痘病毒启动子(见下文)表达该融合蛋白，优选使用例如7.5启动子或AT I启动子的痘病毒启动子。
如上述，该融合蛋白可包含融合配偶体，其不是选自Vif，Vpr，Vpx，Vpu，Rev，Tat和Nef的HIV蛋白。因此，该融合蛋白可以包含其它蛋白的氨基酸序列或其一部分。其它蛋白的实例是HIV Gag，Pol和Env蛋白。因此，本发明的核酸也可包含一种或多种其它蛋白或其一部分的编码序列，所述编码序列位于编码至少四种调节/辅助HIV蛋白或其衍生物的开放阅读框架中。
本发明的另一实施方案中，所述核酸可进一步包含独立的表达盒，所述表达盒编码帮助进一步增强对HIV的免疫应答的其它蛋白。在优选的实施方案中，所述核酸还可包含一种表达盒，其含有选自Gag，Pol和Env中的至少一种的其它HIV蛋白的编码序列或其部分。更优选地，所述核酸除了融合蛋白的编码序列以外，还可包含所有HIV蛋白Gag，Pol和Env的编码序列。所述核酸优选是载体的一部分。所述核酸还可以是病毒基因组或病毒载体的其一部分，优选例如MVA的痘病毒载体。因此，可以从痘病毒载体中表达所述融合蛋白以及其它HIV蛋白，例如选自Gag，Pol和Env的至少一种其它HIV蛋白。
本发明还涉及包含本发明的核酸的载体。术语“载体”指本领域熟练技术人员已知的载体。载体可以是例如pBR322的质粒载体或者pUC系列的载体。更优选的载体是病毒载体。本文术语“病毒载体”指包含病毒基因组的感染性和/或减毒病毒。在这种情况下，本发明的核酸是各病毒载体的病毒基因组的一部分和/或构成病毒基因组。所述重组载体可用来感染细胞或细胞系，具体用于感染包括人在内的活动物。本发明典型的病毒载体是腺病毒载体，逆转录病毒载体，或者以腺伴随病毒2(AAV2)为基础的载体。更优选痘病毒载体。所述痘病毒优选金丝雀痘病毒，禽痘病毒或痘苗病毒。更优选的是改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)(Sutter，G等(1994)，Vaccine121032-40)。典型的MVA毒株是MVA575，其保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures)，保藏号是ECACCV00120707。更优选的是MVA-BN或其衍生物，其在2001年11月22日提交给欧洲专利局的PCT申请PCT/EP01/13628中描述，题目是“ModifiedVaccinia Ankara Virus Variant”。MVA-BN保藏在欧洲细胞培养物保藏中心，保藏号是ECACC V00083008。通过使用MVA-BN或其衍生物，解决了其它的技术问题，以提供一种尤其安全的针对HIV的病毒疫苗，这是因为MVA-BN病毒载体是完全减毒的病毒，其来自改良的安卡拉痘苗病毒，并且特征是其丧失了在人细胞中再生性复制的能力。MVA-BN由于缺乏在人类中复制的能力，而比已知的其它痘苗病毒株更安全。在优选的实施方案中，本发明涉及将MVA-BN和MVA-BN的衍生物作为含有本发明的DNA的病毒载体。MVA-BN的特征，能够评估MVA是不是MVA-BN或其衍生物的生物试验的描述，以及能够获得MVA-BN或其衍生物的方法在上述对比文件PCT/EP01/13628中公开，所述对比文件包含在文中作为参考。
因此，根据这些实施方案，本发明优选涉及重组MVA，例如MVA-BN，其病毒基因组中包含编码本发明的融合蛋白的表达盒。
将本发明的核酸插入所述病毒基因组的方法和获得重组病毒的方法是本领域熟练技术人员已知的。
在重组痘苗病毒中，本发明的DNA的表达优选，但非排除性地，在痘病毒启动子的转录控制之下，所述启动子更优选为痘苗病毒启动子。本发明的DNA优选插入到病毒基因组的非必要区(non-essential region)中。在本发明的另一优选实施方案中，异源性核酸序列被插入痘病毒基因组天然存在的缺失位点中(PCT/EP96/02926中公开)。然而，只要能得到重组痘苗病毒，插入位点的性质对本发明而言并不重要。因此，本领域熟练技术人员可轻易构想到其它适宜的插入位点。
优选所述病毒载体，尤其是痘病毒载体的病毒基因组中除了包含本发明的融合蛋白的编码序列以外，还可以包含选自HIV Gag，Pol和Env基因的其它逆转录病毒基因。更优选所述病毒载体，尤其是痘病毒载体，除了包含本发明的融合蛋白的编码序列以外，还可以包含所有编码HIV Gag，Pol和Env的HIV基因。这些其它的基因可以被插入本发明相同的核酸中。根据该实施方案，所有HIV基因可位于该病毒基因组的相同插入位点。在可选的实施方案中，所述其它基因被插入该病毒基因组的不同位点上。
在优选的实施方案中，本发明涉及将本发明的核酸，载体或融合蛋白用作至少部分预防HIV感染和AIDS的疫苗。“疫苗”是一种化合物，即诱导特定免疫应答的核酸，融合蛋白，载体或病毒。
根据另一实施方案，本发明的“疫苗”以本发明的融合蛋白为基础。
在优选的实施方案中，本发明的核酸，具体为DNA用作疫苗。本领域熟练技术人员已知给药本发明的包含真核表达盒的裸DNA，尤其肌肉内给药所述DNA导致表达盒编码的蛋白的表达。所述蛋白暴露给免疫系统，并激发了特定的免疫反应。
在可选的实施方案中，通过将本发明的载体给药来进行疫苗接种，所述载体具体是病毒载体，更优选痘病毒载体，最优选痘苗病毒载体，例如MVA载体。
为制备以痘苗病毒为基础的疫苗，将本发明的病毒转化成生理可接受的形式。这一过程可根据制备用作天花疫苗的痘病毒疫苗的经验进行(如Stickl，H.等 Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392所述)。例如，纯化的病毒以配置在约10mM Tris，140mM NaCl Ph7.4中，滴度为5×108TCID50/ml保藏在-80℃。为制备疫苗丸，例如在存在2％的蛋白胨和1％的人白蛋白的条件下，102-108的病毒颗粒在含有100ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)的安瓿瓶(优选玻璃安瓿瓶)中冻干。可选地，所述疫苗丸可通过逐步冷冻-干燥配制剂中的病毒制备。该配制剂可以含有适宜在活体内给药的其它添加物，例如甘露醇，葡聚糖，糖，甘油，乳糖或聚乙烯吡咯烷酮，或者含有其它添加物例如抗氧化剂或者惰性气体，稳定剂或者重组蛋白(例如人血清白蛋白)。所述玻璃安瓿瓶随后被密封，并可以在4℃和室温之间保存几个月。然而，一般来说，安瓿瓶优选储存在-20℃以下。接种用的冻干物可以溶解在0.1-0.5ml的水溶液中，优选生理盐水或者Tris缓冲液，并且可系统或局部地给药，即肠胃外，肌肉内或者任何其它本领域熟练技术人员已知的给药途径。本领域熟练技术人员可以已知的方式优化给药的方式，剂量和给药次数。痘病毒载体最优选的是皮下或肌肉内给药。
如果疫苗是包含本发明的DNA的MVA-BN载体或其衍生物，本发明的具体实施方案涉及在第一次接种(“激发接种”)和第二次接种(“强化接种“)中，给药治疗有效量的疫苗。
如果疫苗是包含本发明的DNA的MVA-BN载体或其衍生物，本发明的具体实施方案涉及接种的试剂盒，所述试剂盒含有位于第一小瓶/容器中的用于第一次接种(“激发”)的本发明的MVA-BN病毒载体和位于第二小瓶/容器中的用于第二次接种(“强化”)的本发明的MVA-BN病毒载体。
因此，本发明在疫苗实施方案中涉及包含本发明的核酸，载体或者融合蛋白的疫苗，以及所述核酸，载体或蛋白在制备疫苗中的应用。
本发明的另一实施方案涉及通过将本发明的融合蛋白，本发明的核酸或本发明的载体，给药需要上述物质的包括人在内的动物，保护包括人在内的动物不受HIV的感染。
此外，本发明涉及制备本发明的蛋白的方法，包括以下步骤(i)使用本发明的核酸或载体转染宿主细胞，或(ii)使用本发明的病毒载体感染宿主细胞，(iii)在步骤(i)的转染后的宿主细胞或者(ii)的感染后的宿主细胞中表达所述融合蛋白，和(iv)回收所述融合蛋白。
本发明还涉及使用本发明的核酸或载体转染的宿主细胞或者使用本发明的病毒载体感染的宿主细胞。
根据另一实施方案，所述融合蛋白可包含选自Vif，Vpr，Vpu，Rev，Vpx和Tat中的至少三种不同的蛋白。所述融合蛋白优选包含4，5种或所有的所述HIV蛋白。根据该实施方案，典型的融合蛋白包含HIV蛋白Vpr，Vif，Vpu，Rev和Tat的氨基酸序列或者一种或多种所述蛋白的氨基酸序列的衍生物。如上述，融合蛋白中HIV蛋白的顺序不重要。上述所有优选的实施方案也适用于该可选的实施方案。
附图简述
图1寡核苷酸退火的图解该图片显示了四种寡核苷酸的退火。它们是单链的，并可以通过互补的末端退火。缺口可以通过显示校正活性的聚合酶(例如Pfx聚合酶)填补。
图2蛋白斑(blob)的四种基因的退火的图解vif基因显示与vpr片段的重叠序列，vpu编码片段显示与rev基因(灰色)的重叠序列。PCR片段变性后，重叠互补末段发生杂交。产生的缺口使用Pfx聚合酶填补。Vif-vpr片段和vpu-rev片段的重叠序列融合，可再次用于融合。
图3为把异源基因插入MVA基因组，克隆重组载体中本发明融合蛋白的编码序列的策略融合的vif，vpr，vpu和rev多聚蛋白编码区用包含Cla1和Apa1限制性位点的引物扩增。所述pCR产物被克隆到Cla1/Apa1切割的载体pBNX65中，所述载体含有痘病毒AT1启动子。Tat编码区使用含有Acc651限制性位点的引物通过PCR扩增，并连接到Acc651线性化的pBNX65+vif-rev。产生的表达盒(AT1启动子+编码本发明的融合蛋白的序列)用Pac1限制性酶分离并插入重组载体中，使得异源基因插入MVA基因组14L基因间区(pBNX39)。PBNX39含有与MVA基因组插入位点侧接的序列(F1 14L和F214L)同源的序列。为在MVA基因组和pBNX39同源重组以后筛选重组病毒，所述载体还含有大肠杆菌gpt基因(磷酸核糖基转移酶基因)。纯化所述重组病毒以后，通过Flank 1和Flank 1的重复序列(Flrpt)之间的同源重组可消除选择盒。
图4MVA基因组的图解
MVA含有线性基因组，其经Hind III(A-O)限制后显示特征性片段。14L和15L基因之间的非功能区位于I片段中。使用pBNX39将异源基因插入位置56767-56768。
实施例编码HIV Vif-Vpr-Vpu-Rev-Tat融合蛋白的DNA的生成HIV基因组的单基因可通过使用标准PCR法通过PCR从基因组DNA制备，或通过合成技术制备，该过程基于通过重叠序列的寡核苷酸退火并填补产生的单链缺口。
为产生以寡核苷酸为基础的基因的编码区，从而将其插入编码本发明的融合蛋白的核酸中，设计了具有15bp重叠的40个核苷酸聚合的寡核苷酸。所述寡核苷酸的序列基于来自IIIB株的HIV1分离株HXB2R的基因图谱。退火反应或PCR中用于分离所需序列的寡核苷酸的设计使得在产生的编码区中，用于终止翻译的终止密码子被消除。Tat基因是使用含有终止密码子的寡核苷酸合成的，该基因将被插入编码本发明的融合蛋白的核酸的最后的位置，并因此应当含有正确终止多聚蛋白的翻译的终止三联密码。
为进行寡核苷酸退火反应，进行了10个循环的两步Pfx聚合酶(Gibco-BRL)反应(95℃变性，并在68℃退火/延伸)。在该反应中，寡核苷酸的重叠序列退火，而且缺口也被Pfx校正聚合酶填补(图1)。
为合成vif编码区，即编码所述融合蛋白的核苷酸序列中的第一个被编码的基因，使用基因组HIV cDNA进行了PCR。PCR的进行使得vif编码区与随后的vpr基因的前15bp融合，使得vif和vpr随后退火。Vpr编码区包含HIV HXB2R基因组的碱基对5559-5847，通过10种寡核苷酸的退火制备。产生的缺口被填补，随后的PCR用于扩增产物，该产物含有与vif和vpu的侧翼区融合的vpr编码区，其中vif和vpu的侧翼区被插入在vpr的编码区之后。
使用与合成vif相同的cDNA通过PCR扩增Vpu编码区，生成的产物含有用来与vpr和rev融合的侧翼区。
通过14种寡核苷酸的退火合成rev编码区，其包含HIV HXB2R基因组的碱基对5970-6045和8379-8650的区，以及与vpu和tat退火的15个碱基对的重叠序列。
tat编码区通过使用10种寡核苷酸产生，其包含HIV HXB2R基因组的碱基对5831-6045和8379-8466。
vif和vpr编码区以及vpu和rev编码区通过所述两个片段的重叠序列的退火以及两步Pfx聚合酶反应进行融合(图2)。对融合产物再进行PCR以后，所述片段经纯化，并经vpr和vpu的重叠序列互相接连(图2)。所得产物(vif-vpr-vpu-rev的编码序列)的PCR扩增后，tat编码区通过位于含有痘病毒AT1启动子的pBluescriptKS+载体中相邻的克隆位点克隆vif-vpr-vpu-rev片段和tat而被融合(图3，pBNX65)。完整的表达盒随后通过Pac1限制性酶分离并插入pBNX39中(图3)。PBNX39含有与MVA基因组同源的序列，从而可通过同源重组插入该基因组的非编码区(14L)中。
权利要求
1.一种融合蛋白，其包含选自Vif，Vpr，Vpu，Vpx，Rev，Tat和Nef中的至少四种HIV蛋白的氨基酸序列或者一种或多种所述蛋白的氨基酸序列的衍生物，其中所述融合蛋白在形成该融合蛋白的HIV蛋白氨基酸序列之间不包含细胞蛋白酶的特定裂解序列，所述序列将导致产生具有天然N和C末端的HIV蛋白，并且其中所述HIV蛋白的氨基酸序列的衍生物是当融合蛋白中的相应氨基酸序列与已知HIV分离株的各HIV蛋白的氨基酸序列相比，显示至少50％同源性的氨基酸序列。
2.权利要求1的融合蛋白，其中所述同源性是至少80％。
3.权利要求1的融合蛋白，其中与已知的HIV分离株的各HIV蛋白的氨基酸序列相比，在所述氨基酸序列的衍生物中不超过10个氨基酸被取代、插入或缺失，以获得具有降低的活性或者完全没有活性的HIV蛋白。
4.权利要求1-3之一的融合蛋白，其中所述HIV蛋白选自Vif，Vpr，Vpx，Vpu，Rev和Tat。
5.权利要求1-4之一的融合蛋白，其包含HIV蛋白Vif，Vpr，Vpu，Rev和Tat的氨基酸序列，或者包含一种或多种所述蛋白的氨基酸序列的衍生物。
6.权利要求1-5之一的融合蛋白，其中至少两种所述HIV蛋白的氨基酸序列互相融合而无需其它氨基酸。
7.权利要求1-6之一的融合蛋白，其中至少两种所述HIV蛋白的氨基酸序列被至少一种其它的氨基酸分开。
8.权利要求1-7之一的融合蛋白，其中至少一种所述HIV蛋白的氨基酸序列和融合配偶体融合，所述融合配偶体不是选自Vif，Vpr，Vpx，Vpu，Rev，Tat或Nef的HIV蛋白。
9.编码权利要求1-8之一的融合蛋白的核酸。
10.权利要求9的核酸，其中所述核酸是DNA。
11.权利要求10的核酸，其中该融合蛋白从所述DNA中的表达受选自真核细胞，原核细胞和病毒启动子的调控元件控制。
12.权利要求11的核酸，其中所述病毒启动子是痘病毒启动子。
13.权利要求9-12之一的核酸，其中所述核酸还包含选自Gag，Pol和Env中至少一种的其它HIV蛋白的编码序列。
14.权利要求1 3的核酸，其中所述核酸包含HIV Gag，Pol和Env蛋白的编码序列。
15.包含权利要求9-14之一的核酸的载体。
16.权利要求15的载体，其中所述载体是病毒载体。
17.权利要求16的载体，其中所述病毒载体是痘病毒载体，具体是痘苗病毒载体。
18.权利要求17的载体，其中所述痘苗病毒载体是改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)。
19.权利要求18的载体，其中所述MVA选自保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)的保藏号为V00120707的MVA-575，和保藏在ECACC的保藏号为V00083008的MVA-BN。
20.制备权利要求1-8之一的蛋白的方法，包含以下步骤-使用权利要求9-14之一的核酸或权利要求15的载体转染宿主细胞，或-使用权利要求16-19之一的病毒载体感染宿主细胞，-在转染后的宿主细胞或感染后的宿主细胞中表达融合蛋白，和-回收该融合蛋白。
21.一种宿主细胞，其由权利要求9-14之一的核酸或权利要求15的载体转染，或者被权利要求16-19之一的病毒载体转染。
22.权利要求1-8之一的融合蛋白，权利要求9-14之一的核酸或者权利要求15-19之一的载体，其用作药物。
23.权利要求1-8之一的融合蛋白，权利要求9-14之一的核酸或者权利要求15-19之一的载体，其用作疫苗。
24.一种疫苗，其包含权利要求1-8之一的融合蛋白，权利要求9-14之一的核酸或者权利要求15-19之一的载体。
25.权利要求1-8之一的融合蛋白，权利要求9-14之一的核酸或者权利要求15-19之一的载体在制备疫苗中的用途。
26.权利要求1-8之一的融合蛋白，权利要求9-14之一的核酸或者权利要求15-19之一的载体在制备保护包括人类的动物免受HIV感染的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种融合蛋白，所述蛋白包含选自Vif，Vpr，Vpu，Rev，Tat和Nef中的至少四种HIV蛋白的氨基酸序列或者一种或多种所述蛋白的氨基酸序列的衍生物，其中所述融合蛋白不被加工成单独的具有天然N和C末端的HIV蛋白。本发明还涉及编码所述蛋白的核酸，包含所述核酸的载体，以及制备所述蛋白的方法。所述融合蛋白，核酸和载体可用作至少部分预防HIV感染的疫苗。
文档编号A61K39/21GK1982332SQ200710000639
公开日2007年6月20日 申请日期2003年5月14日 优先权日2002年5月16日
发明者保罗·豪利, 桑贾·利勒, 伊娃·费尔德 申请人:巴法里安诺迪克有限公司