专利名称：：一种迟缓爱德华氏菌弱毒活疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明为水产养殖动物病害防治技术，涉及水产养殖细菌性疾病的弱毒疫苗，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌(W附rdsiei2a"rc/a)弱毒活疫苗。
背景技术：
：迟缓爱德华氏菌是一种革兰氏阴性致病菌，感染宿主范围广，可以感染多种低等和高等动物。在水产养殖动物中，该菌是鱼类、两栖类、爬行类的重要致病菌。由其引起的爱德华氏菌病是水产养殖鱼类常见的传染病，对养殖动物的健康和水产养殖业危害巨大。在我国，已经从养殖的牛蛙、鳖、鳗鲡、牙鲆、大菱鲆、真鲷等多种动物中分离到致病性的爱德华氏菌。由于在生产过程中使用各种抗生素进行疾病的防治，已经在世界各地分离到越来越多的爱德华氏菌抗药性菌株，其中多数菌株呈多重抗药性，不仅使治疗效果下降，而且多种抗药性菌株和抗药质粒的存在增加了环境的压力，对环境造成严重的威胁。早在1981年，国际上就成立了世界《慎用抗生素联盟》，其成员国已达到90多个国家。目前，不少国家已经明令禁止在动物饲料中使用抗生素添加剂。我国加入WTO后，解决抗生素残留等问题已经刻不容缓。为了减少抗生素对环境的影响，通过免疫途径防治爱德华氏菌病发生无疑是一种最佳的方式。人们对迟钝爱德华氏菌的各种疫苗组成(包括灭活菌体细胞苗、脂多糖LPS、去类脂A的多糖、溶血素)和免疫途径(包括注射、浸泡、口服)进行了大量的工作，但这些灭活疫苗或亚单位疫苗的保护效果都不理想，没有达到疾病防控的要求。迟缓爱德华氏菌的毒力因子有溶血素、软骨素酶、皮下坏死毒素、过氧化氢酶以及III型分泌系统，这些致病因子参与了细菌的黏附、定殖、侵袭和在动物宿主体内的繁殖和扩散过程。由于迟缓爱德华氏菌可侵入宿主的上皮细胞和吞噬细胞，并在细胞内生长和繁殖。因此作为一种有效的疫苗，只有系统地刺激动物体液和细胞的免疫应答反应才可能达到防治爱德华氏菌病的目的。由于灭活疫苗或亚单位疫苗存在保护抗原不完全、免疫应答反应不全面，尤其是它们主要引起动物的体液免疫应答而不能有效地刺激细胞免疫应答，是疾病防控效果不理想的根本原因；其次是灭活疫苗和亚单位疫苗主要通过注射方式进行鱼类免疫，存在劳动力成本高、给药不方便、容易引起动物应激等副作用。因此到目前为止，还没有可用的迟缓爱德华氏菌疫苗进入巿场。弱毒活疫苗对动物具有低毒性，同时能够有效地激发动物的体液和细胞免疫应答，为动物提供全面的免疫保护，是目前疫苗开发领域的主要发展方向之一；同时以弱毒活疫苗作为表达异源抗原的载体而进行多价疫苗的开发是国际的前沿和热点。目前，美国专利有利用利福平(rifampicin)培养基对迟缓爱德华氏菌进行多次传代的方法筛选弱毒株作为弱毒活疫苗(UnitedStatesPatent7067122)，该方法得到的弱毒株遗传背景不清楚，细菌毒力减弱的机理不明确，在使用时容易造成毒力回复，同时难以对疫苗株进行环境监控。利用转座子或基因插入失活技术构建的弱毒疫苗携带有抗生素和其他外源基因片断，施用时容易将抗生素和外源基因片断释放到环境，存在有基因转移或整合到其他病原体或其他生物的潜在危险。因此这些弱毒活疫苗难以通过各国的生物制品安全检察管理机构的审批法规，从而难以实现商品化。无标记基因突变技术可以对目的基因进行缺失突变。通过对多个目的基因的大片段缺失，大大降低了施用时由于毒力回复而带来的环境传播危险。同时弱毒株不带任何外源的抗生素筛选标记和外源基因片段，遗传背景清晰、毒力减弱机理明确，易于区分疫苗株和野生型菌株，便于对疫苗株进行环境监控，提高疫苗的安全性和可控性。同时，以无标记基因突变弱毒突变株作为疫苗载体表达异源抗原制备多价疫苗具有防治多种传染病的潜力，因而是目前国际的研究前沿和热点领域。目前国内外未见利用无标记基因突变技术开发迟缓爱德华氏菌弱毒活疫苗的文献报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种不带外源抗生素抗性标记和外源基因片段的迟缓爱德华氏菌弱毒活疫苗。为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为迟缓爱德华氏菌毒株野生型菌株LSE40的es"基因缺失弱毒突变株，所述迟缓爱德华氏菌突变株为MZLSE40esrB,其于2007年6月13曰保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,保藏编号为CGMCCNo.2087,分类命名迟缓爱德华氏菌Edwardsiellatarda,其突变株MZLSE40esrB中不含外源抗生素筛选标记和外源基因片段。弱毒活疫苗制剂含有浓度为106－106cfu/ml的迟缓爱德华氏菌弱毒株MZLSE40esrB的细菌细胞和PBS磷酸盐缓液。本发明的迟缓爱德华氏菌株LSE40菌株为野生型毒株，从我国黄海海域海水养鱼场爆发爱德华氏菌病.的大菱鲆鱼体内分离，为致病性菌株。其生化鉴定特征符合伯杰氏细菌系统鉴定手册(第九版)。本发明方法中，培养弱毒疫苗株的培养基可选用胰大豆蛋白胨培养基。本发明所具有的有益效果本发明提供的迟缓爱德华氏菌弱毒疫苗株MZLSE4OesrB相对于野生型菌株LSE40具有明显的低毒性。以该弱毒株制备的疫苗不仅可以刺激鱼类产生体液免疫，而且可以潜在地刺激鱼类产生细胞免疫，有效保护试验鱼免受强致病性爱德华氏菌野生型毒株的感染。该弱毒疫苗适用范围广，可用于各种脊推动物防治爱德华氏菌病，包括各种经济海水养殖鱼和淡水养殖鱼、观享鱼、鳖、蛙等。本发明提供的迟缓爱德华氏菌弱毒疫苗不含任何外源基因片段和外源抗生素條选标记，对环境不存在外源基因转移和抗生素基因传播的危险。由于采用基因缺失突变手段进行毒力基因的大片段缺失，因此在理论上认为该弱毒疫苗毒力不可回复，极大地消除对环境传播大量病原体的危险；突变的遗传背景清楚，减毒机理明确，易于区分疫苗株和野生型菌株，便于对疫苗株进行环境监控，提高疫苗的安全性和可控性，得到有效的迟缓爱德华氏菌无标记基因突变弱毒株，应用于水产养殖动物防治爱德华氏菌病。上述特征为迟缓爱德华氏菌无标记弱毒活疫苗的商业化幵发提供了支持和保证。具体实施例方式实施例l弱毒活疫苗制备1)TSB培养基:胰蛋白胨17.Og/L，大豆蛋白3.Og/L,NaC15.Og/L,K2,2.5g/L，葡萄糖2.5g/L,pH7.3。将上述成分溶解于1000ml蒸馏水中，用10"/。的NaOH调节pH,于1H磅、125'C灭菌15分钟，冷却置室温备用。2)TSA培养基胰蛋白胨17.Og/L，大豆蛋白3.Og/L，NaC15.Og/L,K2HP042.5g/L，葡萄糖2.5g/L,琼脂粉1.5g/L,pH7,3。将上述成分溶解于1000ml蒸馏水中，用l(W的NaOH调节pH,于121磅、125'C灭菌15分钟，冷却至6(TC制成平板备用。3)PBS缓冲液Na2HP04.2H202.74g/L,NaH2P04.H200,63g/L，将所述成分溶解于1000ml蒸馏水，于121磅、125。C灭菌15分钟，冷却置室温备用。疫苗制备取-80。C保存的保藏编号为CGMCCNo.2087的MZLSE"esrB弱毒疫苗株种子划线接种于TSA平板，在25-3(TC培养48小时。挑取3-5个菌落，接种于100mL的步骤1)的TSB培养基，在25-3(TC摇床(200转/分钟)培养12-18小时，取5-10%(V/V)的量接种500mL的TSB培养基，25-3(TC摇床(200转/分钟)培养12-18小时。收活细菌菌液，用PBS洗涤三次，离心收集菌体，所述离心条件为4000xg,IO分钟，4。C,而后用PBS稀释成105-109cfu/mL浓度的细菌悬液，保存于4°C,即得迟缓爱德华氏菌弱毒活疫苗，备用。实施例2以大菱鲆(ScopW/a/mws/7ax//m/s)为试验动物的半数致死量LDs。的测定体长为8-10cm的的健康试验鱼暂养于1000L水族箱，配以流动循环水处理和净化系统，养殖水温维持16-18。C。暂养4周后，随机分组至20L试验水族箱，每组设两个平行试验水族箱，每个水族箱10尾鱼，继续暂养2周。试验水族箱每天上下午各换水一次，换水量为1/2,维持水温16-18'C。在人工感染试验时，每组实验鱼分别注射不同稀释浓度102-109"cfu/mL的实施例l得到的弱毒疫苗株和野生型菌株，每尾鱼腹部肌肉注射O.lmL,观察14天，记录每组每天的死亡鱼数，计算累计死亡数和死亡率，计算LD;值(见表l)。表l迟缓爱德华氏菌野生型和弱毒株对大菱鲆的致病力试验注射剂量(0.lmL)_死亡鱼数_LSE40LSE40esrB109§i108101054107991210688001054400104340010311001020000LD5。1051105°1081108上述结果表明，迟缓爱德华氏菌弱毒株相对于野生型菌株具有明显的减毒效应，对大菱鲆的LDs。提高了3个数量级。实施例3以牙鲆(Paranc/"/jysoh'vaceus)为试验动物的半数致死量LDs。的测定体长为8-10cm的健康试验鱼暂养于的1000L水族箱，配以流动循环水处理和净化系统，养殖水温维持18-2(TC。暂养4周后，随机分组至20L试验水族箱，每组设两个平行试验水族箱，每个水族箱10尾鱼，继续暂养2周。试验水族箱每天上下午各换水一次，换水量为1/2,维持水温18-2(TC。在人工感染试验时，每组实验鱼分别注射不同稀释浓度102-109cfu/mL的实施例l得到的弱毒疫苗株和野生型菌株，每尾鱼腹部肌肉注射O.1mL,观察14天，记录每组每天的死亡鱼数，计算累计死亡数和死亡率，计算Ll值(见表2)。表2迟缓爱德华氏菌野生型和弱毒株对牙鲆鱼的致病力试验注射剂(0.lmL)死亡鱼数LSE40LSE40esrB1091010871081010651071091210688001054400104440010311001020000LD50_^_^_^_107.7上述结果表明，迟缓爱德华氏菌弱毒株相对于野生型菌株具有明显的减毒效应，对牙鲆的LD5。下降了约3个数量级。实施例4以大菱鲆为试验动物的注射免疫剂量试验取健康试验鱼随机分为4组，每组30尾鱼，每试验组设两个平行。将制备的弱毒疫苗采用腹部肌肉注射的方式进行免疫，分别注射浓度102cfu/mL,106cfu/mL，107cfu/mL的实施例l得到的弱毒疫苗株，每尾注射O.1mL。对照组鱼注射O.lmL的PBS.免疫4周后将各种试验组大菱鲆用野生型迟缓爱德华氏菌LSE40活菌以3x106cfu/尾的剂量进行攻毒。在7天内统计免疫组和对照组死亡数，取两平行组平均值，计算免疫保护率(见表3)。按下列公式计算免疫保护率免疫保护率(RPS)%=(对照组死亡率-免疫组死亡率)/对照组死亡率x100%表3不同免疫剂量的迟缓爱德华氏菌弱毒疫苗免疫大菱鲆4周后攻毒的免疫保护率<table></column><column>免疫剂量(cfu/尾)</column><column>试验鱼数</column><column>死亡鱼数</column><column>死亡率(％)</column><column>RPS(%)</column></row><row><column></column><column>103</column><column>30</column><column>23</column><column>76.7</column><column>11.8</column></row><row><column></column><column>105</column><column>30</column><column>11</column><column>36.7</column><column>58.8</column></row><row><column></column><column>107</column><column>30</column><column>3</column><column>10</column><column>88.8</column></row><row><column></column><column>对照</column><column>30</column><column>26</column><column>87/</column></row><table>从上可以看出，随着接种剂量增加，弱毒疫苗的免疫保护率也增加。在105cfu/尾-107cfu/尾的接种剂量范围显示良好的防治野生型迟缓爱德华氏菌感染的效果。实施例5以大菱鲆为试验动物的浸泡免疫效力试验取健康试验鱼随机分组，每试验组30尾鱼，每组设两个平行，分别用106cfu/mL、107cfu/mL、108cfu/mL的浓度浸泡30分钟，对照组以无菌TSB浸泡30分钟作为对照。免疫30天后对各试验组鱼进行攻毒，腹腔注射O.lmL，107cfu/尾。在7天内统计免疫组和对照组死亡数，取两平行组平均值，计算免疫保护率(见表4)。表4迟缓爱德华氏菌弱毒疫苗免疫大菱鲆30天后的免疫保护效力<table><row><column></column><column>攻毒剂量(cfu/尾)</column><column>试验鱼数</column><column>死亡鱼数</column><column>死亡率(％)</column><column>RPS(%)</column></row><row><column></column><column>106</column><column>30</column><column>22</column><column>73.3</column><column>18,6</column></row><row><column></column><column>107</column><column>30</column><column>18</column><column>60</column><column>33.3</column></row><row><column></column><column>108</column><column>30</column><column>13</column><column>43.3</column><column>51.8</column></row><row><column></column><column>对照(107)</column><column>30</column><column>27</column><column>90/</column></row><table>从上可以看出，随着浸泡接种剂浓度增加，弱毒疫苗的免疫保护率也增加，以108Cfu/mL的浸泡接种浓度获得的免疫保护效果最好。权利要求1.一种迟缓爱德华氏菌弱毒疫苗，其特征在于迟缓爱德华氏菌毒株LSE40的esrB基因缺失弱毒突变株，所述迟缓爱德华氏菌突变株为MZLSE40esrB，其保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.2087，其突变株MZLSE40esrB中不含外源抗生素筛选标记和外源基因片段。2.—种迟缓爱德华氏菌弱毒活疫苗制剂，其特征在于含有1()6-10'cfu/mL的迟缓爱德华氏菌弱毒株MZLSE40esrB的细菌细胞和磷酸缓全文摘要本发明为水产养殖动物病害防治技术，涉及水产养殖细菌性疾病的弱毒疫苗，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌弱毒活疫苗。迟缓爱德华氏菌毒株LSE40的esrB基因缺失弱毒突变株，所述迟缓爱德华氏菌突变株为MZLSE40esrB，其保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.2087，其突变株MZLSE40esrB中不含外源抗生素筛选标记和外源基因片段。本发明弱毒疫苗相对于野生型迟缓爱德华氏菌具有明显的低毒性和免疫保护率，且不含任何外源的抗生素抗性标记和外源基因片段。经试验证明，本发明减毒活疫苗可有效地保护易感鱼类免受致病性迟缓爱德华氏菌的感染。文档编号A61K47/04GK101342367SQ20071001528公开日2009年1月14日申请日期2007年7月11日优先权日2007年7月11日发明者杰李,杨佳银,波王,鹏肖,茅云翔,莫照兰申请人:中国科学院海洋研究所