专利名称：：一种从疯草中提取苦马豆素的新方法
技术领域：
：本发明属于物质成份
技术领域：
，具体涉及一种从疯草中提取苦马豆素的新方法。
背景技术：
：苦马豆素是疯草中的主要有毒成分，动物长期采食疯草能够引起以中枢神经机能紊乱为特征的中毒性疾病，由于疯草在世界范围内广泛分布，是危害草原畜牧业最严重的毒草，备受关注。同时，苦马豆素是溶酶体内α-甘露糖甙酶的抑制剂，近年来作为一种崭新的抗癌药物得到极大的关注，其特点在于既具有杀伤癌细胞的作用又具有免疫调节作用，从而抑制肿瘤的生长和转移[1]。目前，疯草中毒机理的研究需要大量的苦马豆素，同时，苦马豆素做为抗癌药物广阔的应用前景，而苦马豆素在疯草中含量低，极性大，不易分离、纯化，国内外学者一直致力于苦马豆素的提取和纯化技术的研究，并取得了一些突破性的进展。Colegate[2]等首次报道分离苦马豆素的方法是，用热乙酸乙脂索氏提取24h，水溶部分上强酸性阳离子交换柱，收集稀氨水洗脱部分，浓缩后的残留物上药用琼脂糖凝胶CL-6B，用氯化钠梯度洗脱，产物用氨性氯仿提取，回收溶剂后用氯仿/乙醚结晶和重结晶，得到白色针状结晶。在国内，曹光荣[3]等报道的方法是，将植物样品用酸水浸泡2次，每次12h，酸滤液过阳离子交换柱，浓缩洗脱液中的总生物碱。总生物碱经硅胶柱层析，TLC结合α-甘露糖甙酶活性抑制试验结果监测，合并同类并浓缩，分离出苦马豆素单体。此外黄有德等(1992)[4]从变异黄芪中分离出苦马豆素，赵宝玉等(1993)[5]从茎直黄芪中分离出苦马豆素。并且童德文等(2001)[6]从甘肃棘豆中提取苦马豆素。以上报道的苦马豆素提取方法都采用柱层析法，步骤烦琐，使用试剂多，费时费力，不适合大批量生产。李勤凡等(2005)[7]，刘志滨等(2006)[8]用萃取的方法提取甘肃棘豆中的苦马豆素，步骤比传统的方法简便，但用水从植物中提取，提取液体积大，不宜蒸干水分。在化学合成苦马豆素方面国外已有许多报道，美国化学家Yasuda和Bennet化学合成苦马豆素共用21步[9]，迄今，最简单的合成方法也需用9步才完成，并且合成过程中使用到一些价格昂贵或毒性强的试剂，使大量生产受限[10]。因此，目前市场上虽可以购买到毫克级的苦马豆素，但价格十分昂贵，该项试验通过改进现有提取工艺流程，用萃取法代替柱层析法，探索一种简便易行的提取方法。发明人在研究过程中检索到的主要参考文献1.ColegateSM，DorlingPR，HuxtableCR.Aspectroscopicinvestiga-tionofswainsonineanα-mannosidaseinhibitorisolatedfromswainsinecanecens[J].AustJChem，1979，(32)2257～22642.曹光荣，李绍君，段得贤，等.黄花棘豆有毒成分的分离与鉴定[J].西北农业大学学报，1989，17(3)1～63.黄有德，肖志国，孟聚诚，等.变异黄芪有毒成分的分离与分析[J].中兽医医药杂志，1992，6(4)3～64.赵宝玉.疯草(甘肃棘豆)生物碱系统分析及其毒性的比较病理研究[D][博士学位论文].陕西杨凌西北农林科技大学，2001.125.邹恒琴，徐峰，张忠义，等.一种具有前景的抗癌药苦马豆素的研究进展[J].中草药，1997，28(7)437~4396.童德文，曹光荣.甘肃棘豆中苦马豆素的分离与鉴定[J].西北农林科技大学学报(自然科学版)，2001，29(3)5～88.李勤凡，王建华，刘志斌等.萃取法提取甘肃棘豆中的苦马豆素研究初报[J]，中国农学通报，2005，21(5)143～1459.刘志滨，赵兴华，余永涛等.甘肃棘豆中苦马豆素提取工艺改进初报，西北农林科技大学学报(自然科学版)，2006，34(1)97～1047.DaleR.Gardner，RussellJ，etal.Analysisofocoweeds(Oxytropisspp.)[J].Agric.FoodChem.2001，49，4573～458010.PearsonWH，HembreEJ.Apracticalsynthesisof(-)-swainsonine[J].JOrgChem，1996.617217～7221
发明内容针对现有技术中存在的缺陷与不足，本发明的目的在于提供一种从疯草中提取苦马豆素的新方法。该方法操作简便、生产成本低、提取率提高，适宜大批量生产。实现上述发明目的的技术方案是一种从疯草中提取苦马豆素的新方法，包括下列操作步骤1)将疯草草粉和乙醇按1∶6～10的比例热回流提取3次，每次4h，过滤，回收乙醇，残留物用3～5倍乙醇反复溶解，直到液体变为淡黄色，再回收乙醇，得到浸膏。2)浸膏中加入浓度为2％醋酸溶解酸化至pH为4.5～6之间，再加入浸膏重量50～100倍的氯仿，回收氯仿层；酸水部分再用50倍氯仿萃取2次回收氯仿，酸水经50～60℃的通风干燥，得到粗生物碱。3)粗生物碱加入浓度为1M氨水至完全溶解，按每45～75g粗生物碱加入1mL10％NaOH，5mL甲醇后，用二氯甲烷反复萃取至液体颜色变淡，再加氨水至残余物完全溶解，二氯甲烷萃取，回收萃二氯甲烷，得到苦马豆素粗品。4)苦马豆素粗品用甲醇溶解，移入升华管中，挥干甲醇，升华管置于115～120℃的油锅中，先常压10～20min升华，再减压至0.1MP左右升华，30～50min左右的得到白色的针状结晶结晶物。与现有技术相比，本发明的提取方法具有以下优点1.本方法采用乙醇提取，容易回收，无毒副作用。2.同时在碱水中加入了甲醇后萃取，使萃取效率提高。3.苦马豆素浸膏的提取中常用氯仿萃取，本方法改用极性更大的二氯甲烷萃取，减少了萃取物中脂溶性的杂质，并且二氯甲烷的毒性比氯仿小，减小了环境污染。4.该项试验所采用的技术，不需经过层析柱或离子交换柱，所用试剂品种少，并且都可以回收再利用，试验流程简单，容易操作，提取率高，是一种简便易行的方法，适合于大批量生产。5.目前研究中常用减压升华的方法。而苦马豆素容易升华，当浸膏达到一定干燥程度，升华管底浸入100℃石蜡油中，针状结晶就会出现在底部2cm升华管壁上。该项试验采用先常压再减压升华的方法，可以减少升华中苦马豆素的损失。下面结合附图对本发明的从疯草中提取苦马豆素的新方法的做进一步的说明。图1是从疯草中提取苦马豆素的新方法的工艺流程框图。图2提取的苦马豆素与标准品的出峰时间相同对照图。图3苦马豆素的IR光谱数据图。图4苦马豆素的MS光谱数据图。图5苦马豆素的1H光谱数据图。图6苦马豆素的13C光谱数据据图。具体实施例方式为了容易理解本发明，以下结合附图和实施例对本发明进行详细说明。本发明以分布广泛，储量丰富，并且可以再生的疯草为材料，根据苦马豆素极性大、分子量小、不易提取等特性，采用二氯甲烷萃取提取出苦马豆素粗品，用先常压后减压的升华措施得到苦马豆素纯品。1操作工艺流程参见图11)疯草草粉按草粉∶乙醇＝1∶6～10的比例热回流提取3次，每次4h，过滤，回收乙醇，残留物用草粉6～10倍量乙醇反复溶解，直到液体变为淡黄色，再回收乙醇，得到浸膏。2)浸膏中加入浓度为2％醋酸溶解酸化至pH为4.5～6之间，再加入浸膏重量10～20倍的氯仿，回收氯仿层；酸水部分再用10倍氯仿萃取2次回收氯仿，酸水经50～60℃的通风干燥，得到粗生物碱。3)粗生物碱加入浓度为1M氨水至完全溶解，按每45～75g粗生物碱加入1mL10％NaOH，5mL甲醇后，用二氯甲烷反复萃取至液体颜色变淡，再加氨水至残余物完全溶解，二氯甲烷萃取，回收萃二氯甲烷，得到苦马豆素粗品。4)苦马豆素粗品用甲醇溶解，移入升华管中，挥干甲醇，升华管置于115～120℃的油锅中，先常压10～20min升华，再减压至0.1MP左右升华，30～50min左右的得到白色的针状结晶结晶物。苦马豆素为白色针状晶体，熔点为143～145℃。纯度≥98％，GC，IR，MS，NMR光谱数据与苦马豆素标准光谱数据完全吻合，具体见附图2-。图2提取的苦马豆素与标准品的出峰时间相同，为1.67h。图3苦马豆素的IR光谱数据IRmax(KBr，cm-1)3423(O-H)，2943，2891(C-H)，2828～2724(Bohlmann带)，1072(C-O)吸收峰。图4苦马豆素的MS光谱数据EI-MSm/e173(M+)，155(M-H2O)，138(M-H2O-OH)，116(M-2H2O-OH)，115，96，84，72，43图5苦马豆素的1H光谱数据1HNMR(400M，D2O，ppm)δ4.340(m，J＝2.0and8.0Hz，H-2)，δ4.245(dd，J＝4.0and5.6Hz，H-1)，δ3.792(td，J＝4.4and10.4Hz，H-8)，δ2.896(m，H-5eq)，δ2.868(dd，J＝2.0and8.0Hz，H-3eq)，δ2.543(dd，J＝8.0and11.2Hz，H-3ax)，δ2.031(m，H-7eq)，δ1.945(m，H-8a)，δ1.918(m，J＝3.6and12.8Hz，H-5ax)，δ1.708(br，d，J＝13.6Hz，H-6eq)，δ1.504(qt，J＝4and13.2Hz，H-6ax)，δ1.228(qd，J＝4and12.8Hz，，H-7ax)图6苦马豆素的13C光谱数据13CNMR(400M，D2，ppm)δ75.1(C-2)，δ72.0(C-1)，δ71.4(C-8)，δ68.7(C-8a)，δ62.9(C-3)，δ54.0(C-5)，δ34.8(C-7)，δ25.5(C-6)。实施例1冰川棘豆中苦马豆素的提取1浸膏的提取1Kg冰川棘豆草粉加入6L乙醇提取3次，每次4h，过滤，用旋转蒸发仪回收乙醇，残留物用6L乙醇溶解，用旋转蒸发仪回收乙醇得到浸膏420.5g。2)每40g的浸膏中加入2％醋酸和500mL氯仿，收集氯仿层，回收氯仿；酸水部分再用500mL氯仿萃取2次，酸水液置于20×20cm的玻璃烤盘中，50℃的通风烘箱中烘干水分，共得到得到粗生物碱51.8g。3)粗生物碱用1M氨水溶解，加入1mL10％NaOH，5mL甲醇后，用二氯甲烷萃取，残余物再用氨水溶解，二氯甲烷萃取，回收二氯甲烷，得到苦马豆素粗品0.6g。4)苦马豆素粗品用甲醇溶解，移入升华管中，挥干甲醇，升华管置于115℃的油锅中，先常压后减压升华，1h左右白色的针状结晶出现在升华头，放置冷却到室温，刮去结晶物，共得到26mg结晶物。实施例2甘肃棘豆中苦马豆素的提取1浸膏的提取2Kg甘肃棘豆草粉加入14L乙醇提取3次，每次4h，过滤，用旋转蒸发仪回收乙醇，残留物用14L乙醇溶解，用旋转蒸发仪回收乙醇得到浸膏968.8g。2)每50g的浸膏中加入2％醋酸和1000mL氯仿，收集氯仿层，回收氯仿；酸水部分再用500mL氯仿萃取2次，酸水液置于20×20cm的玻璃烤盘中，60℃的通风烘箱中烘干水分，共得到得到粗生物碱131.5g。3)将131.5g粗生物碱用1M氨水溶解，加入2mL10％NaOH，10mL甲醇后，用二氯甲烷萃取，残余物再用氨水溶解，二氯甲烷萃，回收二氯甲烷，得到苦马豆素粗品1.5g。4)苦马豆素粗品用甲醇溶解，移入升华管中，挥干甲醇，升华管置于118℃的油锅中，先常压后减压升华，1h左右白色的针状结晶出现在升华头，放置冷却到室温，刮去结晶物，共得到66mg结晶物。实施例31浸膏的提取2Kg甘肃棘豆草粉加入20L乙醇提取3次，每次4h，过滤，用旋转蒸发仪回收乙醇，残留物用12L乙醇溶解，用旋转蒸发仪回收乙醇得到浸膏968.8g。2)每50g的浸膏中加入2％醋酸和1000mL氯仿，收集氯仿层，回收氯仿；酸水部分再用500mL氯仿萃取2次，酸水液置于20×20cm的玻璃烤盘中，60℃的通风烘箱中烘干水分，共得到得到粗生物碱131.5g。3)将131.5g粗生物碱用1M氨水溶解，加入2mL10％NaOH，10mL甲醇后，用二氯甲烷萃取，残余物再用氨水溶解，二氯甲烷萃，回收二氯甲烷，得到苦马豆素粗品1.5g。4)苦马豆素粗品用甲醇溶解，移入升华管中，挥干甲醇，升华管置于120℃的油锅中，先常压后减压升华，1h左右白色的针状结晶出现在升华头，放置冷却到室温，刮去结晶物，共得到66mg结晶物。权利要求1.一种从疯草中提取苦马豆素的新方法，其特征在于，包括下列操作步骤1)将疯草草粉和乙醇按1∶6～10的比例热回流提取3次，每次4h，过滤，回收乙醇，残留物用3～5倍乙醇反复溶解，直到液体变为淡黄色，再回收乙醇，得到浸膏；2)浸膏中加入浓度为2％醋酸溶解酸化至pH为4.5～6之间，再加入浸膏重量50～100倍的氯仿，回收氯仿层；酸水部分再用50倍氯仿萃取2次回收氯仿，酸水经50～60℃的通风干燥，得到粗生物碱；3)粗生物碱加入浓度为1M氨水至完全溶解，按每45～75g粗生物碱加入1mL10％NaOH，5mL甲醇后，用二氯甲烷反复萃取至液体颜色变淡，再加氨水至残余物完全溶解，二氯甲烷萃取，回收萃二氯甲烷，得到苦马豆素粗品；4)苦马豆素粗品用甲醇溶解，移入升华管中，挥干甲醇，升华管置于115～120℃的油锅中，先常压10～20min升华，再减压至0.1MP左右升华，30～50min左右的得到白色的针状结晶物。全文摘要本发明公开了从疯草中提取苦马豆素的新方法，将疯草粉与乙醇按1∶6～10的比例热回流提取3次，每次4h，过滤，回收乙醇，残留物用3～5倍乙醇反复溶解回收乙醇，得到浸膏加入浓度为2％醋酸至pH为4.5～6之间，再加入浸膏重量50～100倍的氯仿，回收氯仿层；酸水部分用50倍氯仿萃取2次回收氯仿，酸水经50～60℃干燥，得到粗生物碱加入浓度为1M氨水至完全溶解，按每45～75g粗生物碱加入1mL10％NaOH，5mL甲醇后，用二氯甲烷反复萃取至液体颜色变淡，加氨水至残余物完全溶解，二氯甲烷萃取，回收二氯甲烷，得到苦马豆素粗品用甲醇溶解，挥干甲醇，升华即得白色针状结晶物。该方法容易操作且提取率高。文档编号A61K36/185GK101050214SQ20071001784公开日2007年10月10日申请日期2007年5月14日优先权日2007年5月14日发明者李勤凡,蒿彩菊,王建华,刘志滨申请人:西北农林科技大学