专利名称：一种金樱子多糖的提取工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于天然植物的提取工艺这一技术领域，特别属于金樱子多糖的提取工艺这一技术领域。
背景技术：
金樱子作为传统中药材，具有广泛的用途，金樱子中包括蛋白质，多糖，多酚，苹果酸、柠檬酸、鞣质和皂苷多种成分，通过研究发现并经实验证明金樱子多糖具有抗氧化、降血脂、免疫、抑菌作用，因此对金樱子多糖提取工艺的研究也越来越迫切，而目前国内外对金樱子多糖的提取方法报道极少。现已知金樱子多糖的提取工艺包括粗提过程，脱蛋白过程，分级过程。在粗提过程中采用热水浸提，或者采用稀酸、稀碱进行浸提；在脱蛋白过程用Sevage法或者醋酸法除蛋白纯化；在分级过程中通过调节甲醇或乙醇浓度，使金樱子多糖不同组分被分开；或者以大孔树脂作为填料，用磷酸盐溶液进行分级。甲醇或乙醇溶液所分级出的金樱子多糖分子量变化范围大，纯度低于45％，回收率不到80％；用大孔树脂分级出的金樱子多糖，纯度在55％左右，回收率低于75％，并且操作复杂。采用稀酸或稀碱进行粗提，容易引起多糖的糖苷键断裂，造成纯度只有40％，并且杂蛋白过多，使脱蛋白过程变得困难。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种纯度好，回收率高的金樱子多糖的提取工艺。
本发明解决技术问题的技术方案为一种金樱子多糖的提取工艺，包括粗提过程，脱蛋白过程，分级过程，所述的分级过程为以离子交换剂为填料，离子交换树脂与脱蛋白过程所制得的样品的质量比为10-25∶1，以离子强度为0-5mol/l的中性盐溶液进行梯度洗脱，收集，减压浓缩，透析，冷冻干燥。
优选的离子交换剂与脱蛋白过程所制得的样品的质量比为12-15∶1，中性盐溶液的离子强度为0-4mol/l。
所述的离子交换剂为纤维素离子交换剂。
优选的离子交换树脂为二乙胺基乙基纤维素。
所述的中性盐为氯化钠，氯化钾，氯化镁。
所述的粗提过程包括清洗干燥工序，粉碎过筛工序，脱脂、脱单糖工序，水浸提工序，过滤及减压浓缩工序，在所述的水浸提工序中，加入复合酶，其与金樱子原料的重量比为1∶80-200。
所述的复合酶为纤维素酶，蛋白酶；其与金樱子原料的重量比为1∶100-120。
申请人认为金樱子多糖分子与离子交换树脂与结合，经中性盐离子溶液进行离子交换后，带有相同性质电荷的多糖分子容易被集中洗脱，因此所得的每个多糖组分纯度高；梯度洗脱后，几乎所有样品都能被洗脱，回收率好。
本发明与现有技术相比，具有纯度高，回收率高，操作简单的特点，所制备出的平均分子量为18000～20000的金樱子多糖，具有明显的降血脂作用。
图1为RPs在二乙胺基乙基纤维素柱上的洗脱图谱。
图2为RP2的红外吸收曲线。
图3为RP2的紫外可见吸收曲线，溶剂是水。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行详细的说明。
金樱子多糖纯度的计算方法为y＝0.1238x+0.035，式中x多糖的百分含量，y为多糖液的苯酚-硫酸反应在490nm处的光吸收值。
金樱子多糖回收率的计算方法为所得多糖质量/上样量实施例1粗提过程将金樱子原料1kg洗净，于50℃烘干48小时，粉碎，过40目筛，加入2L石油醚，在60-65℃回流2h，冷却至室温，加入重量浓度为80％乙醇1.5L，放置3h，挥干溶媒，将产物加入水10L，在90-95℃回流4h，冷却至室温，过滤，滤液在温度为60℃，压力为-1.9Mpa的条件下浓缩至1L。
脱蛋白过程将1L浓缩液用Sevage法脱蛋白6次，将分离液加入3.5L乙醇进行醇析，再加1L乙醚、1L丙酮洗涤沉淀，将沉淀进行真空冷冻干燥，得混合多糖(RPs)165g。
分级过程以二乙胺基乙基纤维素为填料，二乙胺基乙基纤维素与混合多糖(RPs)的质量比为10∶1，流速1.5ml/min，先以蒸馏水平衡，再以离子强度为0-3mol/l的氯化钠溶液进行梯度洗脱，洗脱液每8ml收集1管，每5管用苯酚-硫酸法跟踪检测，依吸光度对洗脱液体积作图，收集单一峰，减压浓缩后，蒸馏水透析48h，冷冻干燥，即可。
RPs过二乙胺基乙基纤维素柱得单一对称峰RP1、RP2和RP3，三个峰都出现盐洗脱部分。洗脱图谱见图1，各组份质量比是RP1∶RP2∶RP3＝18∶57∶25。RP1的平均分子量范围是8000～9000，RP2的平均分子量范围18000～20000，RP3的平均分子量范围11000～12500。
实施例1中金樱子多糖的纯度为57.6％，回收率82.2％。
实施例2粗提过程将金樱子原料1kg洗净，于50℃烘干48小时，粉碎，过40目筛，加入2L石油醚，在60-65℃回流2h，冷却至室温，加入重量浓度为80％乙醇1.5L，放置3h，挥干溶媒，将产物加入水10L，在90-95℃回流4h，冷却至室温，过滤，滤液在温度为60℃，压力为-1.9Mpa的条件下浓缩至1L。
脱蛋白过程将1L浓缩液用Sevage法脱蛋白7次，将分离液加入3.5L乙醇进行醇析，再加1L乙醚、1L丙酮洗涤沉淀，将沉淀进行真空冷冻干燥，得混合多糖(RPs)159g。
分级过程以二乙胺基乙基纤维素为填料，二乙胺基乙基纤维素与混合多糖(RPs)的质量比为12∶1，流速1.2ml/min，先以蒸馏水平衡，再以离子强度为0-3.5mol/l的氯化镁溶液进行梯度洗脱，洗脱液每8ml收集1管，每5管用苯酚-硫酸法跟踪检测，依吸光度对洗脱液体积作图，收集单一峰，减压浓缩后，蒸馏水透析48h，冷冻干燥，即可。
实施例2中金樱子多糖的纯度为58.9％，回收率83.4％。
实施例3粗提过程将金樱子原料1kg洗净，于50℃烘干48小时，粉碎，过60目筛，加入2L石油醚，在60-65℃回流2h，冷却至室温，加入重量浓度为80％乙醇1.5L，放置3h，挥干溶媒，将产物加入水10L，加入200mg蛋白酶K，在37℃保温2h，升温至90-95℃，回流4h，冷却至室温，过滤，滤液在温度为50℃，压力为-1.9Mpa的条件下浓缩至1L。
脱蛋白过程将1L浓缩液用Sevage法脱蛋白2次，将分离液加入3.5L乙醇进行醇析，再加1L乙醚、1L丙酮洗涤沉淀，将沉淀进行真空冷冻干燥，得混合多糖(RPs)183g。
分级过程以二乙胺基乙基纤维素为填料，二乙胺基乙基纤维素与混合多糖(RPs)的质量比为15∶1，流速1.0ml/min，先以蒸馏水平衡，再以离子强度为0-4mol/l的氯化钾溶液进行梯度洗脱，洗脱液每8ml收集1管，每5管用苯酚-硫酸法跟踪检测，依吸光度对洗脱液体积作图，收集单一峰，减压浓缩后，蒸馏水透析48h，冷冻干燥，即可。
实施例3中金樱子多糖的纯度为61.3％，回收率84.9％。
实施例4粗提过程将金樱子原料1kg洗净，于50℃烘干48小时，粉碎，过60目筛，加入2L石油醚，在60-65℃回流2h，冷却至室温，加入重量浓度为80％乙醇1.5L，放置3h，挥干溶媒，将产物加入水10L，加入80mg纤维素酶，在37℃保温2h，升温至90-95℃，回流4h，冷却至室温，过滤，滤液在温度为50℃，压力为-1.9Mpa的条件下浓缩至1L。
脱蛋白过程将1L浓缩液用Sevage法脱蛋白2次，将分离液加入3.5L乙醇进行醇析，再加1L乙醚、1L丙酮洗涤沉淀，将沉淀进行真空冷冻干燥，得混合多糖(RPs)172g。
分级过程以二乙胺基乙基纤维素为填料，二乙胺基乙基纤维素与混合多糖(RPs)的质量比为25∶1，流速2.0ml/min，先以蒸馏水平衡，再以离子强度为0-5mol/l的氯化钠溶液进行梯度洗脱，洗脱液每8ml收集1管，每5管用苯酚-硫酸法跟踪检测，依吸光度对洗脱液体积作图，收集单一峰，减压浓缩后，蒸馏水透析48h，冷冻干燥，即可。
实施例4中金樱子多糖的纯度为67.7％，回收率85.0％。
实施例3、4显示，在粗提过程中加入复合酶，能减少脱蛋白次数，减少多糖的损失。
实施例5RP1、RP2、RP3活性筛选a小鼠饲喂与给药小鼠经实验室适应性喂养1周后，按体重随机分为10组正常对照组、高血脂模型对照组、RPs低剂量组、RPs高剂量组，每组8只，雌雄各半。分组后正常对照组喂以基础饲料，其余各组喂以高脂饲料，自由饮水。每天下午2点给药组按低、高剂量ig不同浓度药物，对照组和模型对照组ig等体积蒸馏水，连续2周。
b血脂测定测定前均禁食不禁水12h，断头取血，离心分离血清，用全自动生化分析仪测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)，低密度脂蛋白(LDL-C)，由Friedwald WT公式LDL-C＝TC-(1/5TG+HDL-C)计算，动脉硬化指数(AI)由公式AI＝(TC-HDL-C)/HDL-C计算。结果见表1，从中可以看出，RP2具有显著的降血脂活性。
表1
与高血脂模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01实施例6RP2降血脂活性检验健康Wistar大白鼠15只，体重220g左右，正常饲养一周后，随机分成3组(正常对照组、高血脂模型对照组、RP2饲喂组)，除正常对照喂以基础饲料外，其余两组喂以高脂饲料。给药组按500mg·Kg-1·d-1剂量喂以RP2，连续14周后，取其下行主动脉用15％多聚甲醛充分固定，冰冻切片，苏木素和油红0染色，置Motic显微镜下观察、拍照。结果显示正常对照组血管平滑肌排列齐，内膜光滑；RP2饲喂组血管平滑肌排列稍有紊乱，但内膜较光滑；高脂饮食组动脉壁增厚，管腔面积明显缩小，内膜明显增厚，有多层大量泡沫细胞形成，脂质浸润，细胞排列紊乱，为脂纹期改变。由此可见，RP2通过对血脂的降低能抑制大鼠血管的病变。
RP2为浅棕色无定型粉末，不溶于正丁醇、丙酮等有机溶剂，易溶于热水中，其水溶液粘度较大，与苯酚-硫酸反应，其特征吸收峰为490nm。总糖量为72.3％。
RP2红外吸收图谱见图2，图谱表明在2925、1240cm-1处有两组特征峰，它们分别代表了糖类C-H的伸缩振动与变角振动，因而进一步明确了RP2是糖类化合物；在887cm-1处的吸收峰，代表了吡喃糖β-端基差向异构的C-H变角振动，证明了RP2有吡喃糖的β-糖苷键结构；在780cm-1的吸收峰，反映了RP2含有呋喃糖的衍生物。另外1059，1410cm-1处的红外吸收也是多糖类具有的吸收峰。
通过外标法测得其组成单糖的摩尔比是阿拉伯糖∶鼠李糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝0.30∶0.24∶0.12∶1.2∶1.44∶0.90。
图3表明在260nm与280nm波长处未发现有明显吸收峰，说明RP2中已基本不含蛋白质、多肽与核酸。
权利要求
1.一种金樱子多糖的提取工艺，包括粗提过程，脱蛋白过程，分级过程，其特征在于所述的分级过程为以离子交换剂为填料，离子交换树脂与脱蛋白过程所制得的样品的质量比为10-25∶1，以离子强度为0-5mol/l的中性盐溶液进行梯度洗脱，收集，减压浓缩，透析，冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的一种金樱子多糖的提取工艺，其特征在于所述的离子交换剂与脱蛋白过程所制得的样品的质量比为12-15∶1，中性盐溶液的离子强度为0-4mol/l。
3.根据权利要求2所述的一种金樱子多糖的提取工艺，其特征在于所述的离子交换剂为纤维素离子交换剂。
4.根据权利要求3所述的一种金樱子多糖的提取工艺，其特征在于所述的离子交换树脂为二乙胺基乙基纤维素。
5.根据权利要求1所述的一种金樱子多糖的提取工艺，其特征在于所述的中性盐为氯化钠，氯化钾，氯化镁。
6.根据权利要求1所述的一种金樱子多糖的提取工艺，其特征在于所述的粗提过程包括清洗干燥工序，粉碎过筛工序，脱脂、脱单糖工序，水浸提工序，过滤及减压浓缩工序，在所述的水浸提工序中，加入复合酶，其与金樱子原料的重量比为1∶80-200。
7.根据权利要求6所述的一种金樱子多糖的提取工艺，其特征在于所述的复合酶为纤维素酶，蛋白酶；其与金樱子原料的重量比为1∶100-120。
全文摘要
本发明公开了一种金樱子多糖的提取工艺，包括粗提过程，脱蛋白过程，分级过程，所述的分级过程为以离子交换剂为填料，离子交换树脂与脱蛋白过程所制得的样品的质量比为10－25∶1，以离子强度为0－5mol/l的中性盐溶液进行梯度洗脱，收集，减压浓缩，透析，冷冻干燥。本发明与现有技术相比，具有纯度高，回收率高，操作简单的特点，所制备出的平均分子量为18000～20000的金樱子多糖，具有明显的降血脂作用。
文档编号A61K131/00GK101036711SQ20071002059
公开日2007年9月19日 申请日期2007年3月12日 优先权日2007年3月12日
发明者聂刘旺, 张庭廷, 陈传平, 何梅, 吴安平 申请人:安徽师范大学