专利名称：钨酸锂在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及钨酸锂作为有效成分在治疗神经退行性疾病，治疗糖尿病引起的神经病变，治疗脑缺血(包括脑功能障碍)及其相关疾病的药物中的应用。
背景技术：
阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)，又称老年性痴呆，是一种以进行性记忆减退、认知障碍以及人格改变为临床特征，以大脑皮质和海马区域出现细胞外老年斑(senile plaque，SP)、细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)和胆碱能神经元丢失为病理特征的神经退行性疾病。
SP略成球形，其主要成分为β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)。新产生的Aβ是可溶的，不仅没有神经毒性，还具有一定的神经营养作用。但Aβ老化、聚集，则产生神经毒性，是引起AD主要病理改变的分子基础。Aβ沉积在胞外，周围被溃变的轴突与树突、激活的小胶质细胞和星形胶质细胞包围形成SP。
除了SP，另一个诊断AD的病理指标是NFT。NFT为双螺旋丝结构，由过度磷酸化的tau蛋白组成。后者是一种多功能的微管相关蛋白，能稳定微管，促进微管的装配。由此可见，治疗AD的关键在于阻止Aβ的聚集、拮抗其神经毒性及降低tau蛋白的过度磷酸化，减少NFT的形成。
随着年龄的增长，AD患病率呈明显上升趋势。一般认为，超过65岁，每5岁AD患者所占比例增加一倍。目前世界人口逐年老化，该病发病率进一步升高，使其在老年人群中所占比例进一步扩大。AD已成为65岁以上人群痴呆最常见的病因，在发达国家已被认为是一个主要的公众健康问题，成为人类继心血管病、癌症、中风之后的第四号杀手。
目前用于治疗AD的药物主要有胆碱酯酶抑制剂(ChEI)、钙离子拮抗剂、抗氧化剂、抗炎药物、他汀类降血脂药物、脑代谢激活剂及某些中药天然药物。现有的治疗AD药物大多是针对该病的某些症状进行治疗，缺乏对已知病因的干预。
钨酸钠目前正进行治疗I期糖尿病的临床试验，它通过使葡萄糖载体(GLUT)、胰腺β细胞恢复正常，增加胰岛素活性和胰腺β细胞数量发挥治疗糖尿病的作用。近来研究表明它还是GSK-3的抑制剂，在神经细胞中，它可以在Ser-9位点磷酸化GSK-3β，使GSK-3灭活，从而抑制tau蛋白的过度磷酸化。
长期的锂盐治疗也能抑制GSK-3β，同时能增加重要的保护性蛋白Bcl-2的水平，以抑制细胞凋亡。
GSK-3是一种Ser/Thr蛋白激酶，是最早发现的蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)的直接底物之一，活化的PKB与GSK-3结合，诱导GSK-3向细胞膜转移，磷酸化其N端的Ser活性位点(GSK-α作用位点为Ser21，而GSK-β为Ser9)使之失活。GSK有许多不同的底物，如tau蛋白、c-Jun转录子、β-catenin、cyclinD1、胰岛素受体底物(IRS-1)、eLF2B等，tau和β-catenin在AD等中枢退行性疾病的发病中起重要作用。同时GSK还是Wnt信号通路的重要组成部分。
GSK-3还在PI3-K/PKB对细胞生长调节、尤其在抗凋亡过程中发挥重要功能。Marianna等在Rat-1成纤维细胞以及未分化嗜铬细胞瘤PC12细胞中表达、催化失活的GSK-3，结果显示失活GSK-3可阻止由PI3-K或PKB受抑制所致的细胞凋亡。近来还发现，PKB通过抑制GSK-3可增加cyclin D的积累促进细胞进入细胞周期，促进细胞增殖，而GSK-3抑制剂——氯化锂(LiCl)可以刺激突起(轴突和树突)生长。
Aβ是APP在β、γ分泌酶的共同参与下水解产生的多肽。生理状态下，Aβ浓度低，是一种可溶性物质。病理情况下大量产生，并由可溶性形式转变为不溶性的β-折叠结构，逐渐聚集形成老年斑的核心。Aβ可能通过诱导神经细胞凋亡、过氧化损伤、炎症反应等产生神经毒性作用，如Aβ可以直接产生羟自由基，自由基可以直接或间接造成谷氨酸转运体的功能降低，突触间隙谷氨酸堆积触发兴奋毒作用。Phiel等研究证实GSK-3α通过针对γ分泌酶的特异性底物或接近其复合物的底物调节γ分泌酶的活性，他们在细胞水平观察到，用LiCl减少GSK-3α的表达，可使Aβ40及Aβ42的产量分别降低45％及43％。在AD大鼠脑中，应用LiCl后，不溶性Aβ40及Aβ42也各减少62％及51％。Sheng等发现糖尿病鼠海马神经元Aβ40及Aβ42含量增加，但机制不详；在痴呆鼠模型，饮食诱导的胰岛素抵抗可以增加Aβ40及Aβ42的产生，并伴有γ分泌酶活性的增加。进一步研究显示，此类鼠脑中胰岛素受体信号转导途径障碍，并可能通过降低PKB活性而影响GSK-3α的活性，从而导致Aβ产物的增加。曲忠森等报道糖尿病引起的Aβ40生成异常增加可能是通过GSK-3途径，LiCl可明显降低Aβ的生成。
Arai等在一侧大脑中动脉阻塞(MCAO)的动物模型上发现，在同侧脑梗死灶周围的皮层及远离病灶的双侧海马，脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和TrkB mRNA表达均增加。Kokaia等发现MCAO 2h后，在缺血的周边区BDNF mRNA表达明显增加，海马的CA1区的表达也增加，再灌注2h表达水平最高。Schabitz等在MCAO阻塞前24h开始给大鼠脑室内注射BDNF，结果表明其脑缺血后梗死灶较对照组明显缩小。
Kiprianova等在整个大脑半球缺血的模型上向脑室内连续注射BDNF后发现，BDNF能防止海马CA1区神经元死亡。由此可见，脑缺血缺氧可诱导内源性BDNF和TrkB mRNA的表达增加，在缺血缺氧状态下，BDNF能促进神经细胞的存活和损伤修复。
中枢胆碱能神经系统是学习、记忆神经环路的重要组成部分，BDNF可支持海马和前脑胆碱能神经元存活和分化，上调胆碱乙酰转移酶表达，并可通过影响海马胆碱能神经传递发挥促进学习、记忆的作用。此外，BDNF能增强海马突触后NMDA受体磷酸化，使本已下调的NMDA受体功能逆转，从而诱导长时程增强(long-term potentiation，LTP)，而后者被认为是学习记忆的细胞模式。由此可见，BDNF对学习、记忆功能障碍性疾病的治疗具有应用前景。
Hashimoto等研究表明，LiCl能提高皮质神经元内BDNF的含量，激活TrkB受体。
经文献检索发现，钨酸锂目前只限于化学工业上的应用，尚无治疗相关疾病的报道或专利申请。
发明内容
本发明的目的在于提供钨酸锂在制药中的应用，特别是应用在神经退行性疾病、糖尿病引起的神经病变、脑缺血(包括脑功能障碍)及其相关疾病的治疗药物的制备中。
钨酸钠(sodium tungstate)的分子式为Na2WO4，其阳离子钠并无活性；而氯化锂(lithium chloride)的分子式为LiCl，其阴离子的活性也非常有限；钨酸锂(lithiumtungstate)的分子式为Li2WO4，阴、阳离子都有活性，二者发挥协同作用，更好地抑制GSK-3的活性。通过抑制GSK-3α的活性，降低Aβ的生成，以减少SP；通过抑制GSK-3β的活性，抑制tau蛋白的过度磷酸化，以减少NFT。由此预见，钨酸锂将成为一个非常有前途的治疗神经退行性疾病、治疗糖尿病引起的神经病变、治疗脑缺血(包括脑功能障碍)及其相关疾病的药物。
通过药效学试验证明，本发明提供的钨酸锂能明显改善神经退行性疾病、糖尿病引起的神经病变、脑缺血(包括脑功能障碍)等所引起的症状，且无明显毒副作用。通过抑制GSK-3α的活性，降低Aβ的生成，以减少SP；通过抑制GSK-3β的活性，抑制tau蛋白的过度磷酸化，以减少NFT。
本发明与以往技术相比，具有如下优点由于钨酸锂阴、阳离子均有活性，二者发挥协同作用，可以更好地抑制GSK-3的活性，降低Aβ的生成，以减少SP；抑制tau蛋白的过度磷酸化，以减少NFT。
具体实施例方式
实施例1钨酸锂促进新生小鼠大脑皮层神经元突起生长的作用如表1-2所示，低浓度钨酸锂组与溶媒对照组相比，突起总数、突起长度、有突起的神经元数目均无显著性差异；中浓度钨酸锂组和高浓度钨酸锂组与溶媒对照组相比，突起总数、突起长度、有突起的神经元数目均有显著性增加，而以高浓度钨酸锂组的作用显著。且效果优于氯化锂组、钨酸钠组和氯化锂+钨酸钠组。
表1钨酸锂对培养48h大脑皮层神经元的影响(x±s，n＝10)
与溶媒对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01表2钨酸锂对不同培养期大脑皮层神经元存活数的影响(x±s，n＝10)
与溶媒对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01实施例2钨酸锂降低M146L细胞分泌的Aβ42含量M146L细胞株为转染了人类AD患者APP及突变型PS-1基因的CHO细胞。应用ELISA法定量检测Aβ42的产量。如表3所示低剂量的钨酸锂对Aβ42的生成没有影响，中、高剂量的钨酸锂可以明显降低Aβ42的产量，特别是高剂量组抑制率超过70％，呈现良好的量效关系。且效果优于氯化锂组、钨酸钠组和氯化锂+钨酸钠组。
表3钨酸锂对M146L细胞分泌的Aβ42的影响(x±s，n＝8)
与溶媒对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01实施例3钨酸锂降低侧脑室注射链脲霉素模型鼠的Aβ1-40、Aβ1-42含量链脲霉素(streptozotocin，STZ)是一种亚硝基脲衍生物，在外周可以选择性破坏胰岛细胞，引起葡萄糖代谢紊乱，导致糖尿病；在中枢可以阻断胰岛素受体自身磷酸化和内在的酪氨酸激酶活性，导致胰岛素信号传导障碍。
选取成年SD大鼠20只，随即分为5组正常对照组、溶剂对照组、钨酸锂低、中、高剂量组。溶剂对照组和钨酸锂低、中、高剂量组采用脑立体定位仪于双侧侧脑室各注射STZ10μl(3mg/kg)，第3天重复注射。正常对照组按上述方法以等量生理盐水替代STZ。造模1周后，钨酸锂低、中、高剂量组采用脑立体定位仪于双侧侧脑室各注射钨酸锂2μl，4μl，8μl(浓度为1mmol/L)。
免疫组化结果表明溶剂对照组与钨酸锂低剂量组海马及皮层均可见大量棕褐色Aβ1-40、Aβ1-42阳性细胞，胞质及轴突、树突均清晰着色。正常对照组与钨酸锂高剂量组阳性细胞数很少。而钨酸锂中剂量组介于二者之间。
实施例4钨酸锂降低了注射链脲霉素造成2型糖尿病鼠的tau蛋白磷酸化程度选取成年SD雄性大鼠20只，其中16只高脂高糖高蛋白饮食，4只正常饮食为对照组。8周后，随机从高脂高糖高蛋白饮食组中取8只，按照20～25mg/kg剂量腹腔一次性注射链脲霉素，造成2型糖尿病模型(T2DM组)。余8只高脂高糖高蛋白饮食大鼠为肥胖模型(OB组)按照上述方法腹腔注射柠檬酸缓冲液。1周后，T2DM组和OB组各随机取4只，采用脑立体定位仪于海马背侧分别注射钨酸锂2μl(浓度为4mmol/L)。蛋白质印迹检测结果表明，糖尿病模型组及肥胖模型组中tau蛋白在位点Ser199、Thr212、Thr217及Ser396上的磷酸化程度显著高于对照组；而钨酸锂组则与对照组无明显差异。
实施例5钨酸锂促进新生小鼠大脑皮层神经元脑源性神经营养因子表达应用ELISA法定量检测BDNF的产量。如表4所示低剂量的钨酸锂对BDNF的生成没有影响，中、高剂量的钨酸锂可以明显提高BDNF的产量，呈现良好的量效关系。
表4钨酸锂对皮层神经元分泌的BDNF的影响(x±s，n＝8)
与溶媒对照组比较*P＜0.05，**P＜0.0权利要求
1.钨酸锂在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。
2.钨酸锂在制备治疗糖尿病引起的神经病变的药物中的应用。
3.钨酸锂在制备治疗脑缺血及脑功能障碍药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了钨酸锂在制药中的应用，特别是在治疗神经退行性疾病、糖尿病引起的神经病变、脑缺血包括脑功能障碍药物的制备中应用。由于钨酸锂阴、阳离子都有活性，二者发挥协同作用，可以更好地抑制GSK－3的活性。通过抑制GSK－3α的活性，降低Aβ的生成，以减少SP；通过抑制GSK－3β的活性，抑制tau蛋白的过度磷酸化，以减少NFT。通过提高皮质神经元内BDNF的含量，在缺血缺氧状态下，促进神经细胞的存活和损伤修复，改善学习记忆功能障碍。
文档编号A61P25/00GK101036669SQ20071002772
公开日2007年9月19日 申请日期2007年4月26日 优先权日2007年4月26日
发明者罗焕敏, 翁文 申请人:暨南大学