专利名称：：一种新的可水解鞣质及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及有机化学领域，具体涉及一种含有咖啡酰基的吡喃葡萄糖类可水解鞣质。技术背景鞣质，又称为植物单宁，是一类广泛存在于植物体内的复杂多元酚类化合物，其中可水解鞣质是酚酸与多元醇形成的酯或苷。Zhi-hongJiang禾口YokoHirose等人于2001年在蛇菰(&/a"opAora/a/om'aiMakino)中发现了多种含有咖啡酰基和没食子酰基的吡喃葡萄糖类可水解鞣质，如1-0-(^-咖啡酰基-3-0-没食子酰基-P-D-吡喃葡萄糖，该化合物是一种黄色无定形粉末，[a]D15-48.9°(c=0.8，MeOH)，在鞣酸酶的作用下可水解为没食子酸和l-O-f￡j-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖；3-0-f巧-咖啡酰基-4-0-没食子酰基-D-吡喃葡萄糖，该化合物是一种黄色无定形粉末，[a]D15-144.2°(c=0.7，MeOH)，在鞣酸酶的作用下可水解为没食子酸和3-0-f巧-咖啡酰基-D-吡喃葡萄糖[Caffeoyl，Coumaroyl，Galloyl，andHexahydxydiphenoylGlucosesfrom5a/cmo^p/joro！_/a/7om'ca.Zhi-hongJiang,YokoHiroseet.Chem.Pharm.Bull.49(7)887-892(2001)]。但上述文中没有公开这类化合物的用途，也未见其他报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种新的含有咖啡酰基的吡喃葡萄糖类可水解鞣质。本发明的另一目的在于提供该含有咖啡酰基的吡喃葡萄糖类可水解鞣质在制药中的应用。本发明新的含有咖啡酰基的新的吡喃葡萄糖类可水解鞣质是一种可水解鞣质，其分子结构为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(I)。该化合物从蛇菰(&to"o;^omya;wm'c"Makino，主要分布于我国南部和日本)中分离出来的一种可水解鞣质，为褐色无定型粉末，分子式C29H24019K2，比旋光度[a]D16.47.7。(c=0.2,MeOH)，是一种酰化葡萄糖化合物，在碱性条件下可被水解。本发明化合物可以通过下述方法从蛇菰中提取获得(1)取蛇菰，切碎，在室温下用70%甲醇或乙醇浸泡2411，过滤，滤液减压除醇，得总提取物；(2)总提取物用适量水稀释，然后依次用乙醚、乙酸乙酯萃取，取水溶部分；(3)将水溶部分先经MCI-gelCHP20P柱层析，用水和10%甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液；(4)步骤(3)所得的洗脱物经ChromatorexODS，以水洗脱后以1080%甲醇洗脱，收集4080%甲醇洗脱液，减压回收甲醇，残渣加少许甲醇溶解；再上MCI-gelCHP20P，以水洗脱后以1080%甲醇洗脱，收集4080%甲醇洗脱液，减压回收甲醇，残渣加少许甲醇溶解；然后上SephadexLH-20层析，以水洗脱后以1080%甲醇洗脱，收集4080%甲醇洗脱物，减压回收甲醇，残渣加少许甲醇溶解；最后经MCI-gelCHP20P柱层析，用水洗脱后用1080%甲醇洗脱，收集TLC上对FeCl3溶液显深蓝色斑点的流分，合并含单一斑点的柱层析的洗脱流分，即可。本发明化合物具有抗肿瘤活性，能抑制肿瘤细胞的增殖，可以用于制备治疗肿瘤的药物，该药物由本发明可水解鞣质和医学上可接受的辅料组成，其中本发明可水解鞣质的含量为520%(W/W)。下面将通过体外抗肿瘤实验来证明本发明化合物具有抗肿瘤活性。采用人肝癌细胞株HepG2为模型进行本发明化合物的抗肿瘤活性检测。1、实验方法1)HepG2细胞培养生长至指数生长期时，即以0.25%胰蛋白酶消化，1000Xg离心3min，细胞沉淀以10%FBS的DMEM培养基调整至6Xl(^个/ml，96孔培养板每孔接种190u1，置于37'C、5。/。C02及饱和湿度条件下培养24小时。2)每组设5个复孔，每孔中加入10ixl本发明化合物，上述条件下继续培养48小时。实验重复3次。3)细胞培养48小时后，每孔加入10u1的CCK-8(cellcountingkit8)试剂，37'C，5%(:02及饱和湿度条件下继续培养1.5小时。4)用酶标仪测定在波长为450nm处的吸光度值(0D)，650nm作为参考波长，细胞生长抑制率按公式抑制率=(对照孔0D值-实验孔0D值)/对照孔0D值)X100%计算，并用compusyn软件计算各组分的IC5。。2、实验结果表1本发明化合物对HepG2细胞增殖的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>正常培养HepG2细胞呈单层生长，细胞密度均匀分布，细胞呈梭形生长良好。在培养细胞中加入蛇菰组分48小时后，细胞出现回縮、变圆，漂浮，随着时间延长，漂浮的细胞增加。各剂量的本发明化合物对HepG2细胞生长的抑制率如表1所示，当本发明化合物剂量低于25ug/ml时，对HepG2细胞增殖的抑制程度与剂量的递增成正相关；当本发明化合物剂量高于25ug/ml时，剂量的增加对HepG2细胞增殖的抑制没有显著改变。可见本发明化合物，能抑制肿瘤细胞的增殖，具有抗肿瘤活性。二、本发明化合物对荷S180小鼠肿瘤大小的影响1、将S180瘤源小鼠于传代接种后IO天在无菌条件下从腹腔抽出瘤液，用无菌生理盐水调整瘤细胞数至5Xl(f个/ml。2、取21只小鼠(18-22g/只)，分别接种步骤1所得的瘤液0.2ml于右大腿皮下后被随机分为以下5组(1)本发明化合物低剂量组给予本发明化合物治疗，5.0mg/kg;(2)本发明化合物中剂量组给予本发明化合物治疗，10.0mg/kg;(3)本发明化合物高剂量组组给予本发明化合物治疗，20.0mg/kg;(4)阳性对照组给予表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)治疗，20mg/kg;(5)空白对照组生理盐水灌胃。接种次日同时灌胃给药，给药量0.211，每日给药一次，连续10天，停药次日称重，解剖后剥离皮下瘤体，称瘤重。按下式计算抑瘤率(％)=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重X100%。表2本发明化合物对荷S180小鼠肿瘤大小的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本发明化合物高剂量组20.0mg/kg_0.61±0.09_^￡_结果如表2所示，本发明化合物对荷S180小鼠肿瘤的抑制作用随剂量增加而增大，其抑制肿瘤的效果比EGCG好。具体实施方式制备例1、本发明化合物的获得(1)取蛇菰，切碎，在室温下用70。/。甲醇或乙醇浸泡24h,过滤，滤液减压除醇，得总提取物；(2)总提取物用适量水稀释，然后依次用乙醚、乙酸乙酯萃取，取水溶部分；G)将水溶部分先经MCI-gelCHP20P柱层析，用水和10%甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液；(4)步骤(3)所得的洗脱物经ChromatorexODS，以水洗脱后以1080%甲醇洗脱，收集40-80%甲醇洗脱液，减压回收甲醇，残渣加少许甲醇溶解；再上MCI-gelCHP20P,以水洗脱后以1080%甲醇洗脱，收集40-80%甲醇洗脱液，减压回收甲醇，残渣加少许甲醇溶解；然后上SephadexLH-20层析，以水洗脱后以1080%甲醇洗脱，收集40-80%甲醇洗脱物，减压回收甲醇，残渣加少许甲醇溶解；最后经MCI-gelCHP20P柱层析，用水洗脱后用1080%甲醇洗脱，收集TLC上对FeCl3溶液显深蓝色斑点的流分，合并含单一斑点的柱层析的洗脱流分，得本发明化合物。2、该化合物的鉴定1)方法(1)旋光度由JASCODIP-370digitalpolarimeter测定；(2)和"C-NMR由VarianUnityplus500和VarianGemini300spectrometers测定；耦合常数(J)用Hz表示，化学位移用S(ppm)表示，四甲基硅垸为内标，高分辨ESI质谱由Q-TOFmassspectrometer(BrukerDaltonics,MA,USA)测定，EI和FAB质谱由JEOLJMSDX-303spectrometer测定，甘油为FAB质谱的基质。(3)薄层层析用Kieselgel60F254预铺板(0.2mmthick,Merck)，斑点由紫外灯和2%FeCl3和10%硫酸喷雾显色。2)结果[a]D16-47.7°(c=0.2,MeOH).CalcdforC29H24019K22H20:C，44.06;H，3.57.Found:C，44.08;H，3.52.NegativeFAB-MSw/z:753[M-H]-;PositiveFAB-MSw/z:755[M+H〗+.NegativeHR-ESI-MSw/z:677.1016[M-2K+H〗層(calcd.forC29H25019:677.1000).'H-NMR[500MHz,D20+C5D5N(2:1)]:S7.24(1H，d，>/=2Hz,caf-2),7.14(1H,d,/=8Hz,caf-5)，6.90(1H,dd,7=2,8Hz，caf-6)，7.66(1H,d，《7=16Hz，caf-7),6.26(1H,d，J=16Hz,caf-8),6.19(1H，d，《/=8Hz，glc-l)，4.15(1H，dd，>/=8，9Hz，glc-2),4.25(1H,t，7=9Hz,glc-3),4.20(1H，t,/=9Hz，glc-4),4.34(1H，m,glc-5)，5.18(1H，d，/=12Hz,glc-6a),4.94(1H，dd，/=4，12Hz,glc-6b),7.43(1H,s,6-acyl-3'),5.47(1H，d，《/=2Hz，6-acyl-4),5.24(1H，d,7=2Hz，6-acyl-5)，3.54(1H,d，Hz,6-acyl-2a)，3.48(1H,d，/=16Hz，6-acyl陽2b).13C-NMRdata见表2。表2本化合物的13C-NMR(125MHz)SpectralDataNO."C-NMR(125MHz)SpectralDataeaffeoyl-l127.7caffeoyl-2U6.7caffeoyl-3147.2caffeoyl-4150.6caffeoyl-5117.6caffeoyl-6124.3caffeoyl-7149.2caffeoyl-8114.6caffeoyl-9168.7glucose-196.4glucose-274.4glucose-377.7glucose-471.7glucose-576.6glucose-664.84,6-acyl-l177.24，6-acyl-243.14，6-acyl-391.54，6-acyl"454.04，6陽acyl-585.64，6-acyl-6176.34，6-acyl-7179.64,6-acyl-l'123.24，6-acyl-2,117.84，6-acyl-3，114.64，6-3cyl-4，148.24,6-acyl-5'137.44，6-acyl-6，148.8_4，6隱acyl-7，__iH-NMR确定所述化合物为酰化葡萄糖化合物该化合物的'H-NMR中有咖啡酰基的质子信号[S7.09(1H,d,/=2Hz,caffeoyl(caf)-2),6.79(1H，d,/=8Hz,caf-5),7.00(1H，dd，J=2，8Hz，caf-6)，7.70(1H,d,Hz，caf-7),6.31(1H,d，Hz,caf-8)]和1(3,6-二酰化葡萄糖基团的质子信号[S5.53(1H,d，Hz，glc-l)，4.49(1H，dd，《/=2，12Hz,glc-6a)，4.32(1H，dd,^6,12Hz，glc-6b)]。正离子和负离子的FAB质谱给出的分子离子峰分别是755和753，负离子的高分辨ESI质谱给出677.1016的分子离子峰，对应为[M-2K+H]'，因此可确定该化合物的分子式为C29H24019K2，并通过元素分析进一步确定了。除了有一个咖啡酰基和一个P葡萄糖基团，"C-NMR迸一步显示有一个14个碳的芳香基团的信号，包括有一个五取代的苯环、两个羧酸羰基、一个酯羰基、一个亚甲基、两个次甲基和一个季碳。这个酰化基团的结构通过HMBC的相关信号确定，见式(III):HMBC中糖6位H与羰基碳的明显相关信号可以确定该酰化基团连在葡萄糖的6位；咖啡酰基很明显连在糖的端基上因为HMBC中有糖端基质子与咖啡酰基羰基碳的相关信号。最后，H-2和H-4，H-2和H-5之间的NOE相关信号确定C-3,4,5的相对立体结构，如式(IV)所示。综上，该化合物可确定是分子结构如式(I)所示的化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>应用例蛇菰片剂应用例一制剂处方可水解鞣质20g微晶纤维素48g可溶性淀粉30g滑石粉2g共制1000片，每片含该化合物100mg。制备方法称取该化合物20g，加可溶性淀粉稀释成50g，混匀，再称取微晶纤维素48g，用95%乙醇制软材，过筛制粒，低温5(TC干燥，整粒，加入滑石粉2g，混匀，压片(每0.1g),质检、包装，即得。用法用量每次2-3片，每日3次。适用人群适用各种肿瘤患者。例二制剂处方可水解鞣质10g微晶纤维素48g可溶性淀粉40g滑石粉2g共制1000片，每片含该化合物100mg。制备方法称取该化合物IOg，加可溶性淀粉稀释成50g，混匀，再称取微晶纤维素48g，用95%乙醇制软材，过筛制粒，低温50。C干燥，整粒，加入滑石粉2g，混匀，压片(每0.1g)，质检、包装，即得。用法用量每次2-3片，每日3次。适用人群适用各种肿瘤患者。例三制剂处方可水解鞣质5g微晶纤维素48g可溶性淀粉45g滑石粉2g共制1000片，每片含该化合物U)0mg。制备方法称取该化合物5g，加可溶性淀粉稀释成50g，混匀，再称取微晶纤维素48g，用95%乙醇制软材，过筛制粒，低温5(TC干燥，整粒，加入滑石粉2g，混匀，压片(每0.1g)，质检、包装，即得。用法用量每次2-3片，每日3次。适用人群适用各种肿瘤患者。权利要求1、一种可水解鞣质，其分子结构为OH(I)。2、权利要求1所述的鞣质的制备方法，该方法由以下步骤组成(1)取蛇菰，切碎，在室温下用70。/。甲醇或乙醇浸泡24h,过滤，滤液减压除醇，得总提取物；(2)总提取物用适量水稀释，然后依次用乙醚、乙酸乙酯萃取，取水溶部分；(3)将水溶部分先经MCI-gelCHP20P柱层析，用水和10%甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液；(4)步骤(3)所得的洗脱物经ChroniatorexODS,以水洗脱后以1080%甲醇洗脱，收集4080%甲醇洗脱液，减压回收甲醇，残渣加少许甲醇溶解；再上MCI-gelCHP20P，以水洗脱后以1080%甲醇洗脱，收集4080%甲醇洗脱液，减压回收甲醇，残渣加少许甲醇溶解；然后上SephadexLH-20层析，以水洗脱后以1080%甲醇洗脱，收集4080%甲醇洗脱物，减压回收甲醇，残渣加少许甲醇溶解；最后经MCI-gelCHP20P柱层析，用水洗脱后用1080%甲醇洗脱，收集TLC上对FeCl3溶液显深蓝色斑点的流分，合并含单一斑点的柱层析的洗脱流分，即可。3、权利要求l所述的鞣质在制备抗肿瘤药物中的应用。4、权利要求3所述的应用，其中所述药物由权利要求I所述的可水解鞣质化合物(I)和医学上可接受的辅料组成。5、如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的药物中化合物(I)的质量百分比含量为520%。全文摘要本发明提供了一种新的含有咖啡酰基的吡喃葡萄糖类可水解鞣质，其化学结构如式(I)所示。本发明所述的化合物能抑制肿瘤的增殖，具有较好的抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤的药物。文档编号A61K31/7042GK101121737SQ20071003011公开日2008年2月13日申请日期2007年9月6日优先权日2007年9月6日发明者刘中秋,吴少瑜,吴曙光,姜志宏,岩田弘美,广濑小野,文晓芸,河野高畑勋,田中山中崇申请人:南方医科大学