专利名称：：二聚西松烷四萜化合物皱褶肉芝内酯甲、乙素及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，更具体地说涉及一类二聚西松烷四鞀化合物及其制备方法和用途。
背景技术：
：珊瑚是低等腔肠门动物，该类海洋生物全球有6100多种，其中中国有496种。软珊瑚是指腔肠门珊瑚纲八放珊瑚亚纲软珊瑚亚目动物。软珊瑚亚目又分6个科，即拟软珊瑚科，软珊瑚科、星针软珊瑚科、棘软珊瑚科、锦花软珊瑚科和异花软珊瑚科。软珊瑚中富含结构新颖次生代谢产物，其化合物的结构类型主要包括二萜、倍半萜、多羟基甾醇和前列腺素等。皱褶肉芝软珊瑚属于软珊瑚科，是最早受到关注也是研究最多的软珊瑚之一，研究范围涉及20多个品种，其化学成分报道最多的是西松烷型和洛贝型二萜。在开发利用我国的海洋生物资源，从中寻找具有生物活性及药用前景的海洋天然产物的过程中，我们发现，中国海南皱褶肉芝软珊瑚(&"o;/^o"/a^m)的丙酮粗提物在体外抗肿瘤筛选实验中对HL-60人早幼粒白血病细胞株显示良好的抑制活性。进一步的生物活性跟踪研究，导致了二聚西松烷四萜化合物皱褶肉芝内酯甲、乙素的发现。文献检索表明，皱褶肉芝内酯甲、乙素是结构新颖的二聚西松烷四萜化合物。
发明内容本发明的目的在于提供一种从中国海南皱褶肉芝软珊瑚中提取分离得到的两个二聚西松烷四萜化合物皱褶肉芝内酯甲、乙素。本发明的另一目的是提供上述二聚西松烷四砲化合物鮍褶肉芝内酯甲、乙素的制备方法。本发明的还一目的是提供上述二聚西松烷四萜化合物鮍褶肉芝内酯甲、乙素在制备治疗癌症和/或肿瘤的药物中应用。本发明的二聚西松烷四萜化合物铍褶肉芝内酯甲、乙素分别具有如下的化学结构式皱褶肉芝内酯甲素皱褶肉芝内酯乙素(Sarcophylaolidea)(Sarcophytlaolideb)本发明提供了从中国海南皱褶肉芝软珊瑚中提取分离化合物铍褶肉芝内酯甲、乙素的方法，歩骤如下a)提取将中国海南皱褶肉芝软珊瑚用分析级丙酮溶剂提取，所得提取液浓縮后得粗浸膏；将该粗浸膏加入NaCl水溶液中，混悬均匀后用乙醚萃取，所得萃取液浓縮后得到乙醚浸膏；b)分离步骤l)中得到的乙醚浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚/丙酮体积比100:0—卯:10—80:20—70:30—60:40—50:50—30:70—0:100进行梯度洗脱进行梯度洗脱；其中，石油醚/丙酮体积比70:30洗脱部分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/甲醇洗脱纯化，得到皱褶肉芝内酯乙素；石油醚/丙酮体积比60:40洗脱部分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/甲醇洗脱纯化，得到铍褶肉芝内酯甲素。在步骤l)提取中，所述的NaCl水溶液优选为0.71.5NNaCl水溶液；并且所述丙酮溶剂提取是采用超声波提取；所述步骤2)中石油醚/丙酮体积比70:30洗脱部分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/甲醇洗脱，所得洗脱液经薄层层析检测，展开剂为体积比2:1的石油醚/丙酮，将Rf值在0.280.33处的洗脱液合并、减压浓縮，得到皱褶肉芝内酯乙素；所述步骤2)中石油醚/丙酮60:40洗脱部分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/甲醇洗脱，所得洗脱液经薄层层析检测，展开剂为体积比2:1的石油醚/丙酮，将Rf值在0.250.30处的洗脱液合并、减压浓縮，得到皱褶肉芝内酯甲素。药理实验二聚西松垸四萜化合物皱褶肉芝内酯甲、乙素的抗肿瘤活性测试对照组OD值一治疗组OD值肿瘤抑制率=-X100%对照组OD值测试原理MTT法活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶，可将黄色的MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)还原为不溶性的蓝紫色甲臢(Formazan)，死细胞此酶消失，MTT不被还原。用三联液溶解甲臢后可用酶标仪在570nm处检测光密度值。光密度值与活细胞数成正比。实验方法MTT法按不同肿瘤生成速率，将一定数量处于对数生长期的HL-60人早幼粒白血病细胞株接种于96孔培养板内，培养24小时后加入受试药液10jil/孔(即皱褶肉芝内酯甲素、乙素在DMSO溶剂中的溶液)，对每个细胞株，每个浓度均为三个复孔，对照的新鲜培养基IOpi/孔。肿瘤细胞在37。C、5%(302条件下培养48小时后，加无血清培养基新鲜配制的5mg/mlMTT液20pl/孔；继续培养4小时后，加入三联液(10。/。SDS-5Q/。异丁醇-0.01mol/LHCl)50(il/孔，于C02培养箱中过夜。然后在570nm用酶标仪测定OD值。实验结果:<table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table>体外抗肿瘤生物活性筛选实验表明，皱褶肉芝内酯甲、乙素对HL-60人早幼粒白血病细胞株显示明显的细胞毒性。本发明对二聚西松烷四萜化合物皱褶肉芝内酯甲、乙素进行了抗肿瘤活性测试，该类化合物对多种肿瘤细胞株具有强烈的抑制作用，表明这些化合物具有明显的抗肿瘤作用，可作为一类研制新的抗肿瘤药物的先导化合物，也可作为治疗各种临床常见多发癌症的药物。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。^NMR用VarianInova600型仪测定；MS(ESIMS及HRESIMS)用Q-TOFMicroLC-MS-MS型质谱仪测定；所使用的硅胶，为青岛海洋化工厂—'生产；各种溶剂均由国药集团试剂有限公司生产，均为分析纯。如无特殊说明，以下实施例中涉及到的液/液之间比值均为体积比。实施例二聚西松垸四萜化合物皱褶肉芝内酯甲、乙素的制备(1)提取中国海南皱褶肉芝软珊瑚干重68g，用丙酮400ml反复超声提取3次，提取液合并后减压浓縮，所得粗浸膏混悬于200mlINNaCl溶液中，以乙醚200ml反复萃取该混悬液3次，所得萃取液合并后减压浓縮得到乙醚浸膏3.2g。(2)分离乙醚浸膏3.2g经200-300目硅胶柱层析，以石油醚/丙酮100:0—90:10—80:20—70:30—60:40—50:50—30:70—0:100梯度洗脱，每个梯度用量1000ml;其中，石油醚/丙酮70:30洗脱液浓縮物得146.3mg，该部分经SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/甲醇洗脱，所得洗脱液经薄层层析检测，展开剂为石油醚/丙酮2:l，将Rf值在0.280.33处的洗脱液合并、减压浓縮即得到皱褶肉芝内酯乙素8.3mg;石油醚/丙酮60:40洗脱液浓縮物得520.0mg，该部分经SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/甲醇洗脱，所得洗脱液经薄层层析检测，展开剂石油醚/丙酮2:1，将Rf值在0.25~0.30处的洗脱液合并、减压浓縮即得到皱褶肉芝内酯甲素9.7mg。皱褶肉芝内酯甲素的理化性状如下无色油状物；NMR(CDC13，500MHz)5:6.1410.3Hz),5.90(s)，5.10(t,J=6.7Hz),4.86(dd,/=10.4,3.6Hz),3.67(brd,J=6.8Hz)，3.57(d,J=10.0Hz),3.09((!，/=10.3Hz),2.68(d，J=12.6Hz),2.58(d,J=12.6Hz),2.12(s),2.08(s),1.70(s),1.76(s),1.12(s)，1.13(s),1.69(s),1.09(d,7.0),1.08(d,7.1);13CNMR(CDC13,125MHz)5:198.2(s),178.1(s),170.5(s)，160.7(s),140.3(s),135.6(s),132.5(s),127.8(s),126.3(d),126.7(d)，121.3(d)，85.6(d)，81.7(d)，73.8(s),73.3(d)，69.9(s),68.1(d),51.9(s),48.9(t),48.7(d),44.2(d),43.9(d),41.1(t)，40.2(t),38.4(t),36.9(t),34.3(t)，31.5(t)，26.1(t),25.9(d)25.1(q)，25.4(q),24.7(t)，23.1(q),22,6(t),21.3(q),20.2(q),20.0(t),19.6(q),19.4(q)，18.0(q),17.9(q);LC-MS:695[M+H]+。皱褶肉芝内酯乙素的理化性状如下无色油状物；'HNMR(CDCb，500MHz)5:5.96((!，/=10.3Hz),6.00(s),5.16(t,/=7.6Hz),4.86(dd,/=10.4,3.6Hz),3.72(dd,/=11.2,4.7Hz),3.63(brd,/=10.8Hz)，3.55(d,/=10.0Hz),2.85(d，J=10.3Hz)，2.65(d,13.4Hz)，1.76(m)，2.06(s)，1.89(s),1.72(s),1.70(s),1.67(s),1.13(s),1.11(s),1.17(d,7.2),1.09(d,7.1);13CNMR(CDC13,125MHz)S:198.7(s),178.9(s),170.5(s),161.9(s),139.6(s),134.5(s),131.8(s),128.9(s)，127.8(d)，124.9(d),121.1(d),85.6(d),82.1(d),73.8(s),72.1(d),69.8(s),68.8(d),52.4(t)，50.9(s),45.6(d),46.1(d),43.7(d),41.5(t),38.3(t),37.1(t)，33.9(t),31.5(t),31.1(t),26.0(t).25.3(t),25.7(d),25.4(q),24.9(q),24.7(q),23.1(q)，22.6(t)，21.2(q)，20.4(q),20.0(t)，19.5(q),18.3(q),17.1(q);LC-MS:695[M+H]十。权利要求1、一类结构式如下的二聚西松烷四萜化合物皱褶肉芝内酯甲素、乙素皱褶肉芝内酯甲素皱褶肉芝内酯乙素(SarcophylaolideA)(SarcophylaolideB)2、如权利要求1所述的二聚西松垸四萜化合物皱褶肉芝内酯甲素、乙素的制备方法，其特征是，该方法包括以下步骤a)提取将中国海南皱褶肉芝软珊瑚用分析级丙酮提取，所得提取液浓縮后得粗浸膏；将该粗浸膏加入NaCl水溶液中，混悬均匀后用乙醚萃取，所得萃取液浓縮后得到乙醚浸膏；b)分离步骤l)中得到的乙醚浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚/丙酮体积比100:0—90:10—80:20—70:30—60:40—50:50—30:70—0:100进行梯度洗脱；其中，石油醚/丙酮体积比70:30洗脱部分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/甲醇洗脱纯化，得到皱褶肉芝内酯乙素；石油醚/丙酮体积比60:40洗脱部分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/甲醇洗脱纯化，得到皱褶肉芝内酯甲素。3、根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述步骤l)中，所述的NaCl水溶液的浓度为0.71.5N。4、根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述步骤l)中，所述的分析级丙酮溶剂提取是采用超声波提取。5、根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述步骤2)中石油醚/丙酮体积比70:30洗脱部分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/甲醇洗脱，所得洗脱液经薄层层析检测，展开剂为体积比2:1的石油醚/丙酮，将Rf值在0.280.33处的洗脱液合并、减压浓縮，得到皱褶肉芝内酯乙素；所述步骤2)中石油醚/丙酮60:40洗脱部分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/甲醇洗脱，所得洗脱液经薄层层析检测，展开剂为体积比2:1的石油醚/丙酮，将Rf值在0.250.30处的洗脱液合并、减压浓縮，得到皱褶肉芝内酯甲素。6、如权利要求1所述的二聚西松烷四萜化合物皱褶肉芝内酯甲素、皱褶肉芝内酯乙素在制备治疗肿瘤的药物中的应用。全文摘要本发明涉及一类从海洋皱褶肉芝软珊瑚(Sarcophytonlatum)中提取、分离获得的结构式如右的二聚西松烷四萜化合物皱褶肉芝内酯甲、乙素及其制备方法和用途。经多次体外抗肿瘤活性实验表明，该类化合物具有明显的抑制肿瘤细胞活性，可望在制备治疗癌症/肿瘤的药物中应用。本发明还可为研制新的治疗各种常见多发癌症药物提供先导化合物，对开发利用中国的海洋生物资源具有重要意义。文档编号A61P35/00GK101328184SQ20071004246公开日2008年12月24日申请日期2007年6月22日优先权日2007年6月22日发明者健丁,周兆丽,缪泽鸿,睿贾,郭跃伟申请人:中国科学院上海药物研究所