Pnas-4基因在制备抗肿瘤及抗肿瘤辅助药物中的用途的制作方法

专利名称：Pnas-4基因在制备抗肿瘤及抗肿瘤辅助药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于肿瘤基因治疗领域，具体涉及PNAS-4基因在制备抗肿瘤药物及抗肿 瘤辅助药物方面的用途。
背景技术：
肿瘤细胞是增殖失控、表达原始性状的一个细胞群，而且肿瘤的发生与肿瘤细 胞的"增殖—凋亡"失衡有关。细胞凋亡(apoptosis)与肿瘤的发生、发展，以及与肿瘤 治疗中的细胞死亡有密切关系。细胞凋亡是细胞监测系统重要的组成部分。当细胞 基因组受到损伤时，细胞首先启动修复机制， 一旦损伤完全修复，细胞则重新进入 正常生长状态；倘若修复失败，细胞凋亡机制将被启动，损伤的细胞进入凋亡而被 清除，从而避免基因组损伤遗传给子代细胞，消除了肿瘤发生的潜在可能。细胞凋 亡已经是成为当今生命科学领域研究的热点课题。对细胞凋亡失衡进行干预有望为 肿瘤带来新的治疗方法，诱导细胞凋亡也已成为肿瘤治疗的新目标。因此，以选择 性地诱导肿瘤细胞凋亡为目标的理论和技术已经成为治疗恶性肿瘤的主要策略。其 中最诱人的策略便是以诱导细胞凋亡为目标的基因治疗，也就是通过分子生物学的 途径在肿瘤细胞内导入诱导凋亡的活化基因或灭活凋亡的抑制基因，通过诱导细胞 凋亡来清除肿瘤细胞的。尽管全世界的科学家在肿瘤基因治疗领域做出了许多卓越的贡献，使得肿瘤的 基因治疗一度获得了蓬勃快速的发展，但是至今为止，仍然存在许多需要解决的问 题。而其中急需解决的问题是目前用于肿瘤基因治疗的基因太少，能抑制肿瘤生 长的基因为数不多，急需提供更多可供利用的基因。基因治疗的重点在于目的基因 或其靶点的选择，挖掘并鉴定在临床上有治疗价值的基因一直以来便是肿瘤基因治 疗的热点和前沿课题。随着人类基因组测序计划的完成，人类基因组计划已进入功 能基因组时代，其目的在于克隆新基因并阐明这些基因的功能及其基因间的相互作 用关系。为包括肿瘤在内纵多疾病的治疗鉴定更多的治疗靶点或治疗基因提供了极 其便利的条件。另一方面，目前临床上采用的放射治疗，大多数化疗药物和生物治疗剂主要都 是通过诱导细胞凋亡来清除肿瘤细胞的。传统的化疗和放疗疗效有限，肿瘤细胞凋 亡抵抗是主要原因之一，近年来细胞凋亡抵抗分子机制研究取得了进展，为肿瘤治 疗提供了理论和实践基础，克服肿瘤凋亡抵制的新疗法已进入临床试验。由于肿瘤 细胞的异质性，不同肿瘤细胞获得不同的凋亡抵抗机制，且在同一肿瘤细胞可能存 在多种凋亡抵抗机制，所以各种治疗药物和方法的结合有可能但并不必然会产生更 好的疗效。同时，传统的化疗和放疗还会对病人的免疫系统造成负面影响，会损害 机体健康，降低生活质量，因此，寻找抗肿瘤辅助用药尤其是放化疗辅助用药也是 当前肿瘤治疗领域的一个研究热点。人的PNAS-4 (hPNAS-4)基因是在人类基因组大规模测序中鉴定的新基因之一 (Strausberg， RL， Feingold， EA， Grouse, LH，et al. Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002. 99 (26): 16899-16卯3 )，登录在美国NIH的数据库中，其同源基因 的寻找和功能研究也还未全面开展。 发明内容本发明所要解决的第一个技术问题是提供PNAS-4基因在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物方面的新用途。其中，上述的PNAS-4基因为人、小鼠或爪蟾PNAS-4基因中的至少一种。 其中，上述的PNAS-4基因的序列为SEQ ID NO.l、 SEQ ID NO.3或SEQ IDNO,5。本发明所要解决的第二个技术问题是提供PNAS-4蛋白在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物中的用途。其中，上述的PNAS-4蛋白为人、小鼠或爪蟾PNAS-4蛋白中至少一种。其中，上述的PNAS-4蛋白的序列分别为SEQ ID N0.2、SEQ ID NO.4或SEQ IDN0.6。本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种重组载体。该重组载体含有 PNAS-4基因。其中，上述的载体为真核表达载体。进一步的，上述的真核表达载体为质粒、腺病毒。优选的，上述的腺病毒为复制缺陷型腺病毒。本发明所要解决的第四个技术问题是提供含有上述所述重组载体的宿主细胞。 进一步的，所述的宿主细胞为真核细胞。本发明所要解决的第五个技术问题是提供上述重组载体在制备抗肿瘤药物组合 物或抗肿瘤辅助药物组合物中的用途。本发明所要解决的第六个技术问题是提供一种抗肿瘤药物组合物或抗肿瘤辅助 药物组合物。该抗肿瘤药物组合物或抗肿瘤辅助药物组合物是由PNAS-4基因或 PNAS-4基因编码的蛋白作为主要活性成分添加药学上可以接受的辅料制备而成的。
本发明所要解决的第七个技术问题是提供一种抗肿瘤药物组合物或抗肿瘤辅助 药物组合物。该抗肿瘤药物组合物或抗肿瘤辅助药物组合物是由上述的重组载体作 为主要活性成分添加药学上可以接受的辅料制备而成。其中，上述抗肿瘤药物组合物或抗肿瘤辅助药物组合物的活性成分被脂质体所 包被。其中，上述抗肿瘤药物组合物或抗肿瘤辅助药物组合物的剂型为注射剂。 上述的注射剂可制备为pH值为7.5-8.5的注射液。进一步的，上述抗肿瘤药物组合物中还含有肿瘤化疗药物作为活性成分。 优选的，上述的肿瘤化疗药物为顺铂或和厚朴酚。本发明所要解决的第八个技术问题是提供一种制备上述重组载体的方法。 该方法包括以下步骤a、 将PNAS-4基因构建入载体得到含PNAS-4的重组载体；b、 将a步骤所得含PNAS-4的重组载体转入宿主细胞，扩增制备重组载体。 其中，所使用的载体可为真核表达质粒。优选为pcDNA3. 1，其具体制备方法可为a、 将PNAS-4基因构建入pcDNA3. 1得到pcDNA3. l-PNAS-4;b、 将a步骤所得pcDNA3. l-PNAS-4转入宿主细胞，扩增制备重组质粒。 其中，所使用的载体可为腺病毒载体。优选为pAd/PL-DEST，其具体制备方法可为a、 将PNAS-4基因构建入pAd/PL-DEST得到pAd-DEST-PNAS-4;b、 将a步骤所得pAd-DEST-PNAS-4转染293细胞，扩增制备重组腺病毒。 本发明所要解决的第九个技术问题是提供一种制备上述抗肿瘤药物组合物或抗肿瘤辅助药物组合物的方法，其特征在于包括以下步骤a、 在无菌条件下取注射用水，再按以下配比加入原料重组PNAS-4载体、5 %的葡萄糖溶液；b、 在无菌条件下将步骤a产物混合均匀，加缓冲液调节pH值至7.5-8.5;c、 将步骤b产物无菌过滤后分装成注射剂，或制为冻干制剂，低温保存。 根据本发明的上述各方面内容可知为研究PNAS-4的功能及探索其在肿瘤基因治疗上的应用，本发明克隆得到了爪蟾、小鼠和人的PNAS-4编码基因序列；在细胞 水平和爪蟾胚胎上发现了 PNAS-4能诱导肿瘤细胞凋亡;制备了脂质体包裹小鼠或人 的PNAS-4质粒等具有药用价值的真核表达载体；然后，通过脂质体包裹小鼠或人的 PNAS-4质粒来治疗肺癌、结肠癌及卵巢癌等荷瘤小鼠，均取得了很好的效果，发现 PNAS-4能够成为一个新的肿瘤基因治疗基因，肿瘤的基因治疗提供一个新的靶点。
另夕卜，本发明还通过小鼠CT26结肠癌与IL/2肺癌模型体内发现mPNAS-4基因与化 疗药物顺铂以及和厚朴酚具有协同抗肿瘤作用，能够作为抗肿瘤辅助用药或者与化 疗药物一起制备成组合剂型发挥作用；同时，还考察了PNAS-4是否具有毒副作用， 发现其只具有轻微的副作用，能够很好地改善患者的生活质量。特别需要说明的是，以上生产和操作本发明公开的重组基因、重组载体和抗肿 瘤注射剂的具体的常规技术方法和设备是本领域技术人员已知的，并可按照已描述 的技术完成。本发明的有益效果在于:本发明试验证明PNAS-4过表达能够抑制小鼠肿瘤细胞 的增殖，表明PNAS-4有抗肿瘤的潜力。本发明含PNAS-4的重组载体能在能在体外 可以有效地抑制内皮细胞的生长及迁移；体内的抑瘤实验也表明，在荷瘤小鼠瘤内或 尾静脉注射本发明提供的脂质体包裹pcDNA3.1-mPNAS-4或pcDNA3.1-hPNAS-4注 射剂能够表达PNAS-4蛋白，以显著抑制多种肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存期。 本发明以脂质体包裹含PNAS-4的重组载体和化疗药物顺铂或和厚朴酚共同作为活 性成分的抗肿瘤药物组合物比各自单独使用明显具有更优的效果，能降低两者的使 用量。本发明产品功效明显，毒副作用小，制备方法简单，能克服化疗药物毒副作 用大、疗效难持久等缺陷，能增大给药时间的间隔、大大减少给药量、减轻患者经 济负担并提高患者的生活质量；且本发明重组载体制备的抗肿瘤注射剂还可以弥补 本发明单独使用PNAS-4蛋白输注技术方案具有的药物昂贵、体内稳定性差、输注次 数多等缺陷，具有很好的市场前景。


图l为pcDNA3.1(+)载体图谱图。 图2为质粒pVAXl的图谱。 图3为腺病毒载体图谱。图4为荧光显微镜下的PI染色的细胞核外观.(A)阴性对照组，(B)单独脂质体组，(C) pcDNA3. 1 组，(D) pcDNA3. l-mPNAS-4组。可以看出细胞破裂、细胞体积变小、核碎片和凋亡小体等细胞 调亡的特征。图5表示pcDNA3. 1-mPNAS-4对C57BL/6小鼠LL2肺癌小鼠模型和BALB/c小鼠C26结肠癌模型肿瘤 的抑制和消除结果，各组分别注射总量为100ul。其中脂质体复合的pcDNA3. 1-mPNAS-4质粒组以 X表示；pcDNA3.1质粒组以A表示)；脂质体以隱表示。以第10天开始接种100W NS的小鼠为对 照(图中以^表示)。图5-A表示C57BL/6小鼠LL2肺癌小鼠模型各个受试组间肿瘤的体积，图5-C 表示BALB/c小鼠C26结肠癌模型各个受试组间肿瘤的体积，结果表明在pcDNA3. 1iPNAS-4处理组 与其它处理组间有明显的差异。图5-B表示C57BL/6小鼠LL2肺癌小鼠模型各个受试组的抑瘤率、 图5-D表示BALB/c小鼠C26结肠癌模型各个受试组的抑瘤率，结果表明在pcDNA3. l-mPNAS-4处理
组与其它处理组间有明显的差异。图6表示肿瘤的组织化学染色分析结果。为了评价是否因为肿瘤细胞的凋亡引起了图5所示的结 果，运用原位tunel检测试剂盒通过TUNEL检测对肿瘤细胞进行了组织学检测。这些石蜡切片分别包埋的是E为PBS处理的小鼠肿瘤对照组；F为脂质体处理的对照组；G为脂质体和空载体处理的对照组；H为脂质体和pcDNA3. 1iPNAS-4处理的治疗组(X200);在荧光显微镜下可见绿色的凋 亡小体，与PBS、脂质体、脂质体载体在内的对照组相比，脂质体复合pcDNA3. 1-mPNAS-4的处理 组的残余肿瘤细胞中可以观察到更明显的凋亡细胞。图7表示流式细胞分析转染48小时后细胞凋亡情况，其中A为无血清培养液、B为脂质体、C 为pcDNA3. l+脂质体、D为hPNAS- 4-pcDNA3. l+脂质体，D中箭所指处的信号峰表示凋亡细胞的 信号，信号越强或峰面积越大表示凋亡的细胞越多。图8表示转染后48小时Hoechst33258染色示细胞凋亡情况(荧光显微镜，20X),其中 A.为无血清培养液组；B为脂质体组；C为pcDNA3. l+脂质体组；D为hPNAS- 4-pcDNA3. 1+脂质体组。图9表示裸鼠卵巢癌肿瘤外观体积对比。图10表示裸鼠卵巢癌肿瘤体积-时间曲线。其中1为PBS组；2为Liposome组；3为pAd-DEST-Null+liposome组；4为pAd-DEST-hPNAS-4+liposome组。图ll细胞凋亡PI染色实验。图12表示小鼠肿瘤抑制作用的结果。图13表示小鼠存活率。图14表示体外mPNAS-4与和顺铂(cisplatin)共同抑制肿瘤细胞的试验结果图14-A为处理 CT26细胞的结果；图14-B为处理IL/2细胞的结果。 图15表示小鼠肿瘤抑制作用和小鼠存活率对比。图16肿瘤组织TUNEL检测结果(A)对照组；(B) pcDNA3.1组；(C)顺铂组；(D) mPMS-4组；(E) mPNAS-4加顺铂组。图17表示体外mPNAS-4与和厚朴酚(honokiol)共同抑制肿瘤细胞的试验结果图17-A为处理 CT26细胞的结果；图17-B为处理IL/2细胞的结果。 图18表示小鼠肿瘤抑制作用和存活率对比。图19表示肿瘤组织TUNEL检测结果其中(A)为对照组；(B) pcDNA3. l组；(C)和厚朴酚组； (D) mPNAS-4组；(E) mPNAS-4加和厚朴酚组。以下结合附图通过具体实施方式
的描述对本发明作进一步说明，但这并非对本 发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种变型或改进， 只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
具体实施例方式
实施例一 PNAS-4基因的获取1、人PNAS-4 (hPNAS-4)基因cDNA的克隆根据NCBI中递交的人PNAS-4全长基因序列(NM-016076)，设计引物扩增 PNAS-4基因编码序列。为了进一步克隆入pGEX-6p-l载体，在编码序列上、下游引 物中分别引入BamH I 、 Xho I酶切位点。上游引物(SEQ ID NO. 7):5' _ GCGGATCCAAGATGGCAGATTTTTTGAAAGG-3':下游引物(SEQ ID NO. 8): 5'隱CGCGATATCTTAAGTGTCCTC GTGCATGTCTG画3'(下划线示酶切位点)。 PCR扩增引物由上海博亚公司合成。为增强PNAS-4基因的表达水平，在构建 pcDNA3.1-hPNAS-4重组质粒时，采用下列引物上游引物(SEQ ID N0.9 ) : 5' - GC|GCCACC|GGATCCAAGATGGCA GATTTTTTGAAAGG-3'(方框表示Kozak序列，下划线表示酶切位点)； 下游引物同前。从HEK293细胞株中提取总RNA行RT-PCR以扩增hPNAS-4编码区cDNA。 RT-PCR反应扩增出约600bp片段，与理论预测值一致。将上述PCR产物和pcDNA3.1(+)分别用限制性核酸内切酶BamH I 、 Hind III 双酶切后，经连接、转化、筛选、酶切鉴定、DNA测序鉴定，得到真核表达重组质 粒pcDNA3.1-hPNAS-4。酶切鉴定正确的重组质粒送至上海博亚公司测序，结果显示重组质粒hPNAS-4 中插入的hPNAS-4基因碱基序列与GenBank的序列完全一致。 人PNAS-4的序列(见表l，表2):表1人PNAS-4 cDNA的碱基序列(SEQ ID NO. 1):atgggg gctaaccagt tagtggtgct caacgtgtacgacatgtattgg^tg犯cga^atatacctcatccattggaattggagtttttcattcaggaattgaagtctatttgcttatggtggccatccttaccccttttctggaatatttgaaatttccccaggaaatgcttctgaactaggagaaacattta犯ttt犯3ga^gctgttgttttaggg叫cacggacttcctagaagatgatatsgagaaga3ctggga^aaga3taca^ggcaatgcttatcattt犯tgca^taaa^ELctgcaatcatttttcttcagctttatcagagattctttgtgggaaagagattcctcgctggatcaatcgacttgcctacttcagctcctgtataccctttctacagagttgcctcccgaaggagtggctcacgcccgcagccctgcagtctagtgtcagccaagaactccaggatg犯ctggaggagctgccgcatccgcttccgtggcaagcactgC￡LgC3ggCtccagacccgggcgccacact
表2人PNAS-4蛋白序列(SEQ ID NO. 2): Met Gly Ala Asn Gin Leu Val Val Leu Asn Val Tyr AspMet Asn Glu Tyr lie Glu Val Tyr Phe Ser Gly lie Glu Thr Phe Lys Leu Glu Asp Asp Lys Gly Asn Ala Ser Ala Leu Ser Asn Arg Leu Ala Leu Pro Lys Glu Gin Glu Leu Gin Ala Ser Val Ala Lys Leu2、小鼠PNAS-4Thr Ser Ser Gly Arg Glu Phe Glu lie Phe Lys Glu lie Glu Lys Tyr His Leu Glu lie Leu Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Asp Glu Leu Ser Thr Alalie Gly lie Phe Ala Tyr Ser Pro Gly Ala Val Val lie Val Glu Met His Lys Cys Gly Lys Ser Cys lie Pro Ala Ala Glu Glu Ala Ala Gly SerGly Val Phe Gly Gly His Asn Ala Ser Leu Gly Ser Glu Leu Gly Asn Cys Asn Glu lie Pro Pro Phe Leu Leu Gin Ser Glu Asp Ala Arg Pro GlyMet Tyr Trp His Ser Gly Pro Tyr Pro Glu Leu Gly Thr Asp Phe Lys Glu Tyr His Phe Ser Arg Trp lie Gin Ser Cys Ser Val Ser Ala Ala Ser Arg His Thr(mPNAS-4)基因的克隆 (1)根据人的PNAS-4的蛋白序列，通过Blastp搜索小鼠的cDNA文库，获得 一条小鼠的PNAS-4同源基因序列(GenBank No. NM—024282)，在此命名为 mPNAS-4，用NCBI的ORF Finder软件分析，该基因有完整的ORF，起始密码子 符合kozak规则C4XXATGG)， 3，端有一加尾信号AATAAA (黑色下划线表示)。 因此这条序列符合全长cDNA特征。ORF起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。 从第500bp到第1084bp共585bp，含194个氨基酸残基(序列见表3、表4)。 表3 . mPNAS-4的核苷酸序列(SEQ ID NO. 3) (黑框内的序列@为起始密码子，@为终止密码子).ggg get aac cag tta gtg gtg etc肌c gtc tac gac atg tac tgg atg aat g肌tac acc tea tct att gga att gga gtt ttt cat tct gga att g肌gta tat ggc aga gag ttt get tat ggt ggc cat cca tat cct ttt tct gga ata ttt gaa att tec cca gga aat get tct gag eta gga gaa aca "t aaa ttt aaa gaa get gtt gtt eta gga汪gt acg g级c ttt eta gaa gat gat ata gag aaa att gta gaa gaa ctg ggg aaa gag tat aag ggc aac gec tac cat ctg atg cac aaa aac tgc aat cac ttt tct tea get tta tea gag att etc tgt ggg aaa gag att cct cgc tgg ate肌c egg ctg gec tac ttc age tec tgt ata ccc ttt eta cag agt tgc ctg cca aag gag tgg etc act cct get gca ctt cag tct agtgtc age caa g肌etc cag gat gaa eta g肌gaa gca gag gat gca gec gca tec agt gec atg gca agt get gca get ggt gec aga act ggg cgt cac act aaa eta t肌
表4 . mPMS-4编码的蛋白质序列(SEQ ID NO. 4)MetGlyAlaAsnGinLeuValValLeuAsnValTyrAspMetTyrTrpMetAsnGluTyrThrSerSerlieGlylieGlyValPheHisSerGlylieGluValTyrGlyArgGluPheAlaTyrGlyGlyHisProTyrProPheSerGlyliePheGlulieSerProGlyAsnAlaSerGluLeuGlyGluThrPheLysPheLysGluAlaValValLeuGlySerThrAspPheLeuGluAspAsplieGluLyslieValGluGluLeuGlyLysGluTyrLysGlyAsnAlaTyrHisLeuMetHisLysAsnCysAsnHisPheSerSerAlaLeuSerGlulieLeuCysGlyLysGlulieProArgTrplieAsnArgLeuAlaTyrPheSerSerCyslieProPheLeuGinSerCysLeuProLysGluTrpLeuThrProAlaAlaLeuGinSerSerValSerGinGluLeuGinAspGluLeuGluGluAlaGluAspAlaAlaAlaSerSerAlaMetAlaSerAlaAlaAlaGlyAlaArgThrGlyArgHisThrLys Leu(2) RT-PCR扩增为了进一步验证mPNAS-4基因的开放读码框的存在，通过设计包括了起始密 码子和终止密码子的特异PCR引物进行RT-PCR。其中的上游引物为(SEQ ID NO. 10): 5，-GCGGATCCGCCACCATGGCCAACCAGCCCATCATC-3，；下游引物为(SEQID NO. 11) : 5'陽CCGCTCGAGCTATAGTTTTGTGTGGCGCCCAGG國3,。 以小鼠肝脏 的总RNA为模板，采用一步法RT-PCR扩增，获得小鼠PNAS-4基因开放阅读框 (ORF)，得到的产物为608bp (见图1)，测序后得到的序列与预期的序列完全一 致。(3) pcDNA3.1-mPNAS-4表达质粒的构建及鉴定 将上述所得的扩增产物用BamH I /Xho I双酶切后以T4 DNA连接酶16"C水浴16-20h连接到BamH I /Xho I线性化的pcDNA3.1(+)真核表达载体(Figure 2)上， 转化大肠杆菌XLl-bhie，在氨苄青霉素抗性平板上随机挑选数个白色菌落提取质 粒DNA，通过凝胶电泳初步筛选出可能的重组子，进一步做限制性内切酶BamH I /Xho I酶切鉴定，酶切结果得到了一条约608bp的片段和一条约5400bp左右片 段，与预期结果相一致，命名pcDNA(+)-mPNAS-4，进一步送上海博亚生物公司进 行测序，鉴定结果与预期一致。 3、爪蟾PNAS-4 (xPNAS-4 )基因的获得依据人的PNAS-4基因在NCBI递交的蛋白序列(GenBank No:NM—016076)，采用Blastp检索爪蟾的cDNA文库，从而获得爪蟾的PNAS-4基因cDNA序列；通过以上获得的PNAS-4的cDNA序列设计特异引物，上游引物(SEQ ID NO. 12) : 5，-GGATCCATGGCCAACCAGCCCATCATC-3， 下游引物(SEQIDN013) : 5，-CTCGAGCTATAGTTTTGTGTGGCGCCCAGG-3' 以爪蟾睾丸的总RNA为模板，采用一步法RT-PCR扩增获得爪蟾PNAS-4基因开放阅读框(ORF)，得到的产物为591bp，进而克隆到pGEM-Teasy载体上，最后通过测序验证，与预期一致(见表5，表6)。表5爪蟾的xPNAS-4 cDNA:序列(SEQ ID NO. 5)atggcc犯ccagcccatcatcctcaatgtgtatgatatgtactggattaatcatcccttgg犯taggagttttccactctgg组tc鄉tatatggaagagagtttgcttatggaggtcacccctatccattctctggtgtgtttgaaatctctcctggagattccaccgaactgggaga^ctttt犯3ttta^g犯gcgatagccctgggg3gC3CagatttcacatcgaaeLaaataatcgagg犯aaacgcatatcatctgatgccaaccacttctcctcagctttatcgg3g3tcctgtgcgggctcgttgggttaaccgactagcctacttxagtacctgtgtaccgtttttgcaaagctgcctacccaaggaatggctgacaccggctgctttgcagtct已gcataagtcagg肌Cl:CC3ELgELCg犯Ctgg3gg犯gctg犯gELtgCCgCtgcatcagcctccacctctacaactgcaatgcccagacctgggcgccacacaa^ct3t3g表6爪蟾的xPNAS-4所编码的蛋白序列(SEQ ID NO. 6)MetAlaAsnGinProlielieLeuAsnValTyrAspMetTyrTrplieAsnGluTyrThrSerSerLeuGlylieGlyValPheHisSerGlylieGinValTyrGlyArgGluPheAlaTyrGlyGlyHisProTyrProPheSerGlyValPheGlulieSerProGlyAspSerThrGluLeuGlyAspThrPheLysPheLysGluAlalieAlaLeuGlySerThrAspPheThrGluAsnAsplieGluLyslielieGluGluLeuGlyLysGluTyrLysGlyAsnAlaTyrHisLeuMetHisLysAsnCysAsnHisPheSerSerAlaLeuSerGlulieLeuCysGlyLysGlulieProArgTrpValAsnArgLeuAlaTyrPheSerThrCysValProPheLeuGinSerCysLeuProLysGluTrpLeuThrProAlaAlaLeuGinSerSerlieSerGinGluLeuGinAspGluLeuGluGluAlaGluAspAlaAlaAlaSerAlaSerThrSerThrThrAlaMetProArgProGlyArgHisThrLysLeu
实施例二可用于基因治疗的PNAS-4重组载体的构建1、 重组质粒PNAS-4-pVAXl的构建按本领域常规技术将实施例一中克隆在pcDNA3.1-hPNAS-4上的PNAS-4用 BamH I 、 Xho I酶双酶切切下，插入市场购买的pVAXl质粒子的BamH I 、 Xho I位点上即得，琼脂糖电泳和测序验证均正确。2、 重组质粒PNAS-4-pVAXl的脂质体复合物的制备脂质体(lipofectamine2000)购于Invitrogen公司。根据脂质体lipofectamine 2000的使用说明制备重组质粒PNAS-4-pVAXl的脂质 体复合物，进行了脂质体用量的筛选，最后确定脂质体:质粒=1 : 3 (重量比)。3、 PNAS-4重组腺病毒的构建pAd-DEST-hPNAS-4和pAd-DEST-mPNAS-4的构建、生产与纯化。使用本领域常规技术，用Gateway Vectors出售的的pAd/PL-DEST为基础， 使用本领域常规技术，成功构建了 pAd-DEST-mPNAS-4和pAd-DEST-hPNAS-4腺病毒表达载体，并将腺病毒表达载体转染到293A细胞中进行扩增生产，然后按常规 方法提取并纯化重组腺病毒，以进行进一步的体外、体内实验。A、 将hPNAS-4、 mPNAS-4构建到中间表达载体pENTR11中根据NCBI中公开的PNAS-4全长基因序列(GenBank No. NM-016076)和小鼠的 PNAS-4同源基因序列(GenBankNo.NMJ)24282)设计引物(参见实施例一)，为了将 所扩增的基因克隆入pENTRll载体中，在编码序列的上、下游引物中分别引入EcoR I和XhoI酶切位点，为了使重组腺病毒表达载体上不引入V5标签，所以在引物中引 入了一个终止密码子，然后利用这两对引物分别扩增hPNAS-4和mPNAS-4基因的编 码序列，并将所扩增的片段(约600bp)连接到pENTRll载体中，经过转化、筛选、 酶切鉴定、DNA测序鉴定，得到中间表达载体质粒pENTRll-hPNAS-4和 pENTRll-mPNAS隱4。B、 pAd-DEST-hPNAS-4和pAd-DEST-mPNAS-4腺病毒载体的构建根据pENTRll载体上包含有attL重组酶位点和pAd/CMV/V5-DEST载体有attR 重组酶位点这一特性，将超螺旋的pENTRll-hPNAS-4 、 pENTRll-mPNAS-4和 pAd/CMV/V5-DEST载体，按照产品使用说明，分别在重组酶LR Clonase II enzyme mix (Invitrogen)的作用下，发生LR重组反应，可以将中间表达载体质粒 pENTRll-hPNAS-4和pENTRll-mPNAS-4上的hPNAS-4 、 mPNAS-4基因分别连接
至!jpAd/CMV/V5-DEST载体中，由于引进了一个终止密码子，所以所构建的重组腺病 毒表达载体中V5标签没有功能，分别被命名为pAd-DEST-hPNAS-4和 pAd-DEST-mPNAS-4，将2~3 U 1的LR重组反应液转化大肠杆菌一TOP10中，利用 ampicillin (氨卡青霉素)和chloramphenicol (氯霉素)筛选插入了外源基因的重组 腺病毒克隆(详细过程参照Iiwitrogeii的产品使用说明书)，提取重组腺病毒表达质粒 并测序证明我们所构建的重组腺病毒表达载体完全正确。C、 扩增重组腺病毒提取所构建的重组腺病毒一pAd-DEST-hPNAS-4和pAd-DEST-mPNAS-4表达质 粒，利用PacI进行酶切成线性，以暴露病毒的左、右臂上的ITRs区，有利于重组腺 病毒在293A细胞中的复制与包装，然后利用Lipofectamine 2000 ，按其说明书操作， 将线性化的重组腺病毒质粒转染到293A细胞中，病毒在293A细胞中大量复制、包装， 获得能产生重组腺病毒的293种子细胞。D、 收集、纯化重组腺病毒收集步骤C中的293A种子细胞并得到粗制的重组腺病毒裂解液上清，将所得到 的粗制的重组病毒裂上清去感染293A，经过逐步放大感染可以得到大量的重组腺病 毒裂解液上清。然后采用常规两步CsCl密度梯度超离心法纯化Ad-E，第一步采用 不连续CsCl梯度去除大部分的细胞碎片以及缺陷的病毒颗粒(即不具备感染活性的 病毒颗粒)，第二步采用连续CsCl密度梯度彻底将具备感染活性的病毒颗粒与缺陷的 病毒颗粒区分开，最后再通过透析脱盐，去除CsCl，得到pAd-DEST-hPNAS-4， pAd-DEST-mPNAS-4和pAd-DEST-Null。E、 重组腺病毒滴度测定根据组织培养半数感染剂量(TCID50)法测定重组腺病毒的滴度(详细方法参照 参考文献LaBarre DD， Lowy RJ. Improvements in methods for calculating virus titer estimates from TCID50 and plaque assays. J Mra/ MeAo血2001 ， 96(2): 107-26.)。简言之，即用按10倍稀释制备的病毒稀释液分别感染HEK293细胞，放 于C02孵箱内37 'C培养10d，然后在荧光倒置显微镜下观察细胞病变效应(CPE)情 况，并利用该方法的公式计算重组腺病毒和空病毒的滴度，结果表明本实施例制备 的pAd-DEST-hPNAS-4、 pAd-DEST-mPNAS-4、 pAd-DEST-Null的滴度分别为 4.5xl010 PFU/ml、 3.35x1010 PFU/ml、 4.0xl010PFU/ml，达到要求。 试验例一 本发明产品m-PNAS-4-PcDNA3. 1质粒脂质体复合物的抗肿瘤试验体外细胞增殖活性实验(MTT)发现，mPNAS-4基因的过表达能够抑制小鼠肺癌 LL2和结肠癌C26细胞的增殖，PI染色和DNA片段化分析表明，mPNAS-4基因的 过表达能够促进LL2和C26细胞的凋亡(见图.5)。为了检测mPNAS-4基因在体内是否也具有抗肿瘤效应，建立了 BALB/c小鼠结 肠癌(C26)和C57BL/6小鼠Lewis肺癌(LL2)两种动物肿瘤模型，进行 pcDNA3.1-mPNAS-4与脂质体复合物的抗肿瘤作用的试验。在C26和LL2肿瘤模型 中，从接种肿瘤第17天(即治疗开始后7天)开始，治疗组小鼠(M组)肿瘤的生 长明显较其它各组为慢，均产生了明显的抗肿瘤效应，结果具有统计学意义(P<0. 01);治疗组小鼠的平均生存期也明显长于对照组，结果具有统计学意义(P<0.05) (Fig.6);在接种肿瘤后第30天时，治疗组与对照组的肿瘤体积差异显著，C26肿瘤模型中抑瘤率为64.3%， LL2肿瘤模型中抑瘤率为45.7% (见图.6)。同时，在治疗4次后，取各组的肿瘤组织的进行HE染色分析:在治疗组小鼠肿瘤 组中可见大量坏死或凋亡的肿瘤细胞，细胞核致密固縮、胞浆红染，并有淋巴细胞 浸润的现象。而其他各组无明显的坏死或凋亡出现(见图.7A—图.7D)。利用原位 TUNEL检测试剂盒分析各组肿瘤组织中的肿瘤细胞凋亡水平如图(见图.7E— 图.7H)荧光照片所示，在Lewis肺癌小鼠的残存肿瘤中，凋亡细胞明显增多。体内的抑瘤实验表明，瘤内或尾静脉注射脂质体包裹的pcDNA3.1-mPNAS-4真 核表达质粒能够表达mPNAS-4蛋白，以显著抑制肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存 期。试验例二本发明产品脂质体包裹hPNAS-4-pcDNA3. 1质粒的抗肿瘤试验 体外实验及结果各实验分别设为4组，依次为A、阴性对照(生理盐水)组；B、脂质体组；C、pcDNA3.1空载+脂质体组；D、 hPNAS-4-pcDNA3.1 +脂质体组。细胞接种于6孔或者96孔板内，贴壁生长约70%长满后进行转染，其中A组用 无血清培养液处理；B、 C、 D组分别用脂质体、pcDNA3.1空载+脂质体、 hPNAS-4-pcDNA3.1+脂质体进行转染。转染步骤如下取8个1.5加1无菌￡ 管，分为a、 b两组，每组4个管，分别 标记为1、 2、 3、 4。根据转染需要分别加入对应量无血清培养基，a组2、 3、 4管 中加入脂质体(lipofectamine 2000); b组3管中加入pcDNA3.1， 4管中加入 hPNAS-4-pcDNA3.1。室温放置5min后对应混匀a、 b两组各自4管，标记为c组1、 2、 3、 4号管。室温放置30min,移液枪混匀后按照前述分组分别转染各组细胞。其 中pcDNA3.1空载、hPNAS-4-pcDNA3.1的转染浓度为4照/ml，脂质体质粒为3:1。 转染后细胞于37。C、 5%C02、孵箱继续培养，6—8小时后补加含血清培养液。 后37'C、 5%C02、孵箱继续培养。 体外实验结果流式细胞分析hPNAS-4-pcDNA3.1组经脂质体转染卵巢癌细胞 SKOV3 48小时后，细胞凋亡率为82.6%，细胞阻滞于G0/G1期，增殖细胞在S期的分布相对减少。而其余各组凋亡率分别为A、阴性对照组17.7%; B、脂质体组: 33.1%; C、 pcDNA3.1空载+脂质体组40.0%;经脂质体转染后hPNAS-4-pcDNA3.1 组可见清晰的梯状条带；Hoechst33528染色显示经脂质体转染后， hPNAS-4-pcDNA3.1组的细胞核及细胞质内见浓染致密的颗粒状荧光块，提示细胞凋 亡(结果见图8)。 体内试验及结果体内试验为在卵巢癌裸鼠模型上经尾静脉注射设置阴性对照组、脂质体组、 pcDNA3.1空载+脂质体组、经脂质体转染后hPNAS-4-pcDNA3.1组，根据体外实验 结果，用量按每只每次尾静脉注射100jig质粒当量。治疗采取每3天一次，治疗ll 次，以考察hPNAS体内抗肿瘤作用及其毒副作用。pcDNA3.1空载+脂质体悬液和 hPNAS-4-pcDNA3.1 +脂质体悬液按照质粒脂质体=1: 3配置。体内治疗试验结果本发明脂质体包裹hPNAS-4-pcDNA3.1质粒制剂尾静脉注 射后的荷瘤组裸鼠能在肿瘤组织中表达hPNAS-4蛋白，使肿瘤体积较对照组明显縮 小(图9); HE染色表明治疗组肿瘤中心明显坏死，细胞数量减少，细胞呈圆形，胞 核深染，胞质浓縮，染色质成团块状，提示肿瘤细胞凋亡(结果见图10)。重要器官 无明显损害；Timel检测到其凋亡增加；免疫组化示CD31表达降低，MVD低于对照组。各组裸鼠卵巢癌肿瘤体积-时间曲线见图io。实施例三重组腺病毒pAd-DEST-hPNAS-4和pAd-DEST-mPNAS-4实验结果 体外实验选用pAd-DEST-hPNAS-4进行体外实验。DNA ladder (DNA梯状条带)检测实验结果DNA ladder结果表明，利用liposome包裹的pAd-DEST-hPNAS-4处理LL/2细 胞，处理24小时后发现该组细胞出现明显的DNA ladder现象，而liposome包裹的 pAd-DEST-Null等对照组未能观察到DNA ladder现象，该结果表明liposome包裹的 pAd-DEST-hPNAS-4能够明显诱导LL/2细胞凋亡。细胞凋亡PI染色实验细胞凋亡PI染色实验结果见(图11)表明，利用liposome包裹的 pAd-DEST-hPNAS-4处理LL/2细胞24小时后发现该组细胞有明显的凋亡发生，而 liposome包裹的pAd-DEST-Null处理LL/2细胞只产生了少量的凋亡细胞，其它两组 对照组没有看到细胞凋亡现象，该实验表明liposome包裹的pAd-DEST-hPNAS-4能 够表达hPNAS-4蛋白，明显诱导LL/2细胞凋亡。
体内实验-重组腺病毒pAd-DEST-hPNAS-4治疗Lewis肺癌实验 动物肿瘤模型建立方法收集对数生长期的小鼠Lewis肺癌LL/2细胞，1500 rpm离心3 min，细胞沉淀 用无血清、无抗生素的培养液洗涤1次，计数细胞数量后调整细胞浓度为lxl07/ml， 无菌条件下送到动物室。采用6 8周龄、18 g左右的C57BL/6小鼠雌性小鼠，将0.1 ml ( lx106)的 LL/2细胞接种到小鼠右侧腋部皮下。实验分组及处理接种肿瘤细胞后第7天，当扪及肿瘤直径约4~5 mm时，将荷瘤小鼠随机分为 4组，每组10只，开始分组处理，具体为1) 重组腺病毒pAd-DEST-hPNAS-4治疗组按每只小鼠5xl08 PFU的 pAd-DEST-hPNAS-4重组腺病毒配200照的liposome的用量进行包裹，然后将此 包裹复合物注射到各小鼠瘤内，每3天注射一次，连续注射6次；2) 空病毒pAd-DEST-Null对照组按每只小鼠5xl08 PFU的pAd-DEST-Null 重组腺病毒和200pg的liposome的用量进行包裹，然后将此包裹复合物注射到小 鼠瘤内，每3天注射一次，连续注射6次；3) Liposome对照组每只小鼠瘤内注射Liposome 200叫/次，每3天注射一 次，连续注射6次；4) PBS对照组每只小鼠瘤内注射PBS 100nl/次，每3天注射一次，连续注 射6次。试验结果表明实验组一liposome包裹的pAd-DEST-hPNAS-4能在小鼠体内 持续表达hPNAS-4蛋白，治疗小鼠肺癌后发现荷瘤小鼠肿瘤体积比三个对照组明 显縮小(见图12)，小鼠生存期明显延长(见图13)，显示出了良好的抗肿瘤作用。 试验例四本发明产品与顺铂(cisplatin)联用抗肿瘤试验 体外实验联合mPNAS-4与顺铂对小鼠CT26结肠癌与IL/2肺癌细胞进行处理，主要通过 肿瘤细胞的生长增殖抑制实验(MTT)、DNAladder及凋亡形态分析，测试mPNAS-4 基因与顺铂是否具有协同抗肿瘤作用； 1 MTT assay在96孔板中，对IL/2与CT26细胞先转染pcDNA3.1或pcDNA3.1-mPNAS基 因48h后对细胞做MTT分析。其中pcDNA3.1空载、hPNAS-4-pcDNA3.1质粒的转 染量为0.2pg/孔，脂质体与质粒的比例为2.5: 1。对于mPNAS-4与cisplatin联合组 则是先转染0.2pg pcDNA3.1-mPNAS质粒24h后加5 ug/ml cisplatin作用24h。
实验结果表明(见图14)，与对照组相比，单独的cisplatiii与mPNAS-4均具有 抑制肿瘤细胞增殖的作用；mPNAS-4与cisplatin联合后具有更强的抑制肿瘤细胞增 殖的作用。2 DNA ladder (DNA梯状条带)检测实验结果方法为常规方法。结果如下与对照组及pcDNA3.1空载体处理组比较，mPNAS-4 与cisplatin单独处理均出现明显的DNA梯状条带，mPNAS-4与cisplatin联合处理 则出现更明显的DNA梯状条带，表明mPNAS-4与cisplatin联合处理较单独处理时 细胞凋亡得更多。 体内实验在体内，用常规方法建立BALB/c小鼠结肠癌(CT26)和C57BL/6小鼠肺癌 (LL/2) 二种肿瘤模型，观察mPNAS-4基因通过尾静脉注射荷瘤小鼠后对肿瘤生长 的影响然后通过CD31、 TUNEL及HE等免疫组化技术检测。 实验分组及处理接种肿瘤细胞后第7天，当扪及肿瘤直径约4~5 mm时，将荷瘤小鼠随机分为5 组，每组10只，开始分组处理，具体为1) 对照(生理盐水)组生理盐水组每只小鼠尾静脉注射生理盐水10(Uil/次，每周两次，注射4周；2) pcDNA3.1脂质体组质粒经过Liposome包裹后(质粒与脂质体质量比为 1:3)，按每只小鼠每次尾静脉注射100照质粒的当量注射，每周两次，注射4周；3) 顺铂组单独用Cisplatin:通过腹腔注射按照5mg顺铂/kg体重的用量腹 腔注射顺铂，每周一次，注射4周。4) mPNAS-4组mPNAS-4 Plasmid经过Liposome包裹后(质粒与脂质体的 质量比为1:3)，质粒与脂质体复合物通过尾静脉注射，100ug mPNAS-4 Plasmid /mouse,每周二次，注射4周。5) mPNAS-4+顺铀组mPNAS-4 Plasmid经过Liposome包裹后(质粒与脂 质体的质量比为1:3)，尾静脉注射，100ug mPNAS-4 Plasmid/mouse,每周二次，注 射4周；在每周注射第二次质粒后的第二天，按照5mg顺铂/kg体重的用量腹腔注射 顺铂，每周一次，注射4周。实验结果(1).肿瘤生长与小鼠生存曲线试验结果如图15所示，在BALB/c小鼠结肠癌(CT26)和C57BL/6小鼠肺癌 (LL/2) 二种肿瘤模型里都得出如下结果与对照组及pcDNA3.1空载体治疗组比 较，mPNAS-4与cisplatin单独治疗组肿瘤生长明显受到抑制，小鼠生存期明显延长。 而mPNAS-4与cisplatin联合治疗组肿瘤生长进一步受到抑制甚至存在肿瘤消退 现象，小鼠生存期进一步延长。(2) CD31染色对肿瘤组织切片的CD31进行染色后，记数CD31阳性染色带(血管密度)来定 量新生血管的生成量。结果表明，与对照组及pcDNA3.1空载体治疗组比较， mPNAS-4与cisplatin单独治疗组的肿瘤新生血管数量明显减少，而mPNAS-4与 cisplatin联合治疗组肿瘤新生血管数量进一步减少。(3) TUNEL分析使用Tunel试剂盒，按说明书要求进行处理，处理完毕后在倒置荧光显微镜下检 测并照相，倒置荧光显微镜的激发波长为450-500 nm，显像波长为515-565nm。其 中细胞核显像为暗绿色为Timel阳性(在黑白图片上为浅色)。如图16所示，与对照 组及pcDNA3.1空载体治疗组比较，mPNAS-4与cisplatin单独治疗组均可对肿瘤 组织内的肿瘤细胞诱导凋亡，而mPNAS-4与cisplatin联合治疗组的肿瘤组织内的肿 瘤细胞则大量凋亡。结果表明联合治疗组能协同诱导肿瘤组织内的肿瘤细胞凋亡。本试验结果表明本发明产品和顺铂(cisplatin)联用，具有协同抗结肠癌、肺癌 的作用。表明本发明产品既可以作为抗肿瘤药物，也可以作为抗肿瘤辅助药物与和 顺铂(dsplathi)联和使用。当然，也可以设计成包括顺铂(cisplatin)的剂型销售使用。 试验例五本发明产品与和厚朴酚(hoiiokiol)联用抗肿瘤试验和厚朴酚(honokiol)作为一种天然小分子化合物，具有诱导癌细胞凋亡与抗新 生血管生成作用，而PNAS-4已经证实在体外、体内均可以诱导肿瘤细胞凋亡。本试 验例使用mPNAS-4基因治疗与低剂量的和厚朴酚联合，评价其抗肿瘤作用。 体外试验及结果体外，联合mPNAS-4与和厚朴酚对小鼠CT26结肠癌与IL/2肺癌细胞进行处理， 通过肿瘤细胞的生长增殖抑制实验(MTT)、 DNA ladder及凋亡形态分析，看 mPNAS-4基因与和厚朴酚是否具有协同抗肿瘤作用；1 MTT assay在96孔板中，对IL/2与CT26细胞先转染pcDNA3.1或pcDNA3.1-mPNAS基 因48h后对细胞做MTT分析。其中pcDNA3.1空载、hPNAS-4-pcDNA3.1的转染量 为0.2吗/孔，脂质体与质粒的比例为2.5: 1。对于mPNAS-4与honokiol联合组则是 先转染0.2吗/孔pcDNA3.1-mPNAS质粒24h后，力B 10 ug/mL honokiol作用24h。 实验结果表明(见图17)，与对照组相比，单独的honokiol (10ug/mL)与mPNAS-4 均具有抑制肿瘤IL/2与CT26细胞增殖的作用；mPNAS-4与honokiol联合后具有 更强的抑制肿瘤细胞增殖的作用。
2 DNA ladder (DNA梯状条带)试验试验结果表明，与对照组及pcDNA3.1空载体处理组比较，mPNAS-4与honokiol 单独处理均出现明显的DNA梯状条带，mPNAS-4与honokiol联合处理则出现更明 显的DNA梯状条带，表明mPNAS-4与honokiol联合处理较单独处理时更能促进细 胞的凋亡。 体内试验建模及分组处理体内，建立BALB/c小鼠结肠癌(CT26)和C57BL/6小鼠肺癌(LL/2) 二种动 物肿瘤模型，观察mPNAS-4基因通过尾静脉注射荷瘤小鼠后对肿瘤生长的影响然后 通过藻酸盐实验、CD31染色、TUNEL及HE等免疫组化技术进行结果检测。建模及分组参照试验例四1) 对照(生理盐水)组；肿瘤接种10天后，每只小鼠尾静脉注射生理盐水 10(Hil/次，每周二次，注射4周；2) pcDNA3.1空载体组肿瘤接种10天后，pcDNA3.1空质粒组每只小鼠每 次尾静脉注射100figpcDNA3.1质粒，每周二次，注射4周；3) Honokio1组肿瘤接种10天后，单独用Honokiol开始治疗，腹腔注射(i.p.)， 0.5 mg/ mouse/次，每天一次，连续治疗4周。4) pcDNA3.1-mPNAS-4组肿瘤接种10天后，mPNAS-4 Plasmid经过Liposome 包裹后(质粒与脂质体的质量比为1:3)， pcDNA3.1-mPNAS-4质粒尾静脉注射， 100ug pcDNA3.1- m PNAS-4 Plasmid /mouse/次，每周二次，注射4周；5) pcDNA3.1-mPNAS-4加Honokiol组肿瘤接种10天后，mPNAS-4 Plasmid 经过Liposome包裹后(质粒与脂质体的质量比为1:3)，尾静脉注射100ug mPNAS-4 Plasmid/mouse,每周二次，注射4周；腹腔注射0.3 mg/mouse剂量的honokiol,每 天一次，连续治疗4周。试验结果1、 肿瘤生长与小鼠生存曲线如图18所示，在BALB/c小鼠结肠癌(CT26)和C57BL/6小鼠肺癌(LL/2) 二种肿瘤模型里都得出如下结果与对照组及pcDNA3.1空载体治疗组比较， mPNAS-4与honokiol单独治疗组肿瘤生长明显受到抑制，小鼠生存期明显延长。 而mPNAS-4与honokiol联合治疗组肿瘤生长进一步受到抑制甚至存在肿瘤消退现 象，小鼠生存期进一步延长。2、 藻酸盐实验结果各组小鼠植入藻酸盐，并在治疗15天后取出藻酸盐颗粒观察。应用藻酸盐包被 实验可观察小鼠体内肿瘤细胞周围新生血管的情况。结果表明，单用mPNAS-4和单 用honokiol治疗组中酸盐包被的CT26细胞周围及内部新生血管明显少于PBS与 pcDNA3.1治疗组，而mPNAS-4与honokiol联合治疗组血管进一步受到抑制。3、 CD31 stain通过瘤组织切片的CD31进行染色后，记数CD31阳性染色带(血管密度)来定 量新生血管的生成量。与对照组及pcDNA3.1空载体治疗组比较，mPNAS-4与 honokiol单独治疗组的肿瘤新生血管数量明显减少，而mPNAS-4与honokiol联合治 疗组肿瘤新生血管数量进一步明显减少。4、 用TUNELassay (缺口末端标记技术)检测细胞调亡情况) 使用Timel试剂盒，按说明书要求进行处理，处理完毕后在倒置荧光显微镜下检测并照相，倒置荧光显微镜的激发波长为450~500 mn，显像波长为515 565mn。 其中细胞核显像为暗绿色为Tunel阳性(在黑白图片上为浅色)。试验结果见如图19， 与对照组及pcDNA3.1空载体治疗组比较，mPNAS-4与honokiol单独治疗组均可 对肿瘤组织内的肿瘤细胞诱导凋亡,而mPNAS-4与honokiol联合治疗组的肿瘤组织 内的肿瘤细胞则大量凋亡。结果表明联合治疗组能协同诱导肿瘤组织内的肿瘤细胞 凋亡。本试验结果表明本发明产品与和厚朴酚(honokiol)联用，具有协同抗结肠癌、 肺癌的作用，且能显著降低和厚朴酚的用量。表明本发明产品既可以作为抗肿瘤药 物，也可以作为抗肿瘤辅助药物与和厚朴酚(honokiol)联用。当然，也可以设计 成包括和厚朴酚的剂型使用。 试验例六本发明产品的安全性初步评价本发明产品的功效试验过程中还使用了HE染色以检测肿瘤周围及小鼠其他重要 组织是否受损。(1) hPNAS治疗小鼠卵巢癌试验组在实施例 的试验过程中，为了观察肿瘤组织形态，同时了解各重要脏器毒副 反应，对肿瘤组织和重要器官进行了 HE染色。其中hPNAS-4-pcDNA3.1 +脂质体 治疗组的肿瘤组织石蜡切片HE染色显示，肿瘤组织出现中央区域细胞数量减少，细 胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，提示肿瘤细胞凋亡。其余三组 肿瘤生长正常，细胞数较治疗组多，未见结构异常，未见坏死区域，无大量细胞凋 亡征象。取hPNAS-4-pcDNA3.1 +脂质体治疗组心、肝、脾、肺、肾组织，进行常规HE 染色，检测其治疗后副作用。从治疗组各重要器官石蜡切片HE染色可见，心、脾、 肺、肾组织结构完整，未见明显损害或组织坏死。肝脏组织少部分细胞体积变大，
胞桨疏松呈网状或透明，为气球样变。此即为施用药物后常见的肝脏组织可逆性损 伤的表现。但肝脏组织内未见明显坏死或纤维化变性。该结果提示 h-PNAS-4-PcDNA3.1 +脂质体制剂具有一定的肝脏副作用，但该损伤为可逆性损伤， 无重大威胁，是一种较为安全的抗肿瘤药物，能很好地保证病人的生活质量。 (2)关于mPNAS治疗小鼠肺癌和结肠癌的毒副作用观察治疗过程中观察荷瘤小鼠的一般情况，包括皮毛、体重、活动和进食情况等，各 组间比较没有发现明显的区别。在治疗后处死小鼠，取各组小鼠的脑、肺、心、肝、 脾、肾、胰腺、小肠、骨髓等脏器，进行肉眼观察，并制成病理切片，HE染色后在 光学显微镜下观察，没发现明显的异常。以上的较优的具体实施方式
是对本发明作进一步的举例说明，但并非对本发明范 围的限制，虽然本发明实施例中提供的是使用表达载体的具体实施方式
，但是根据 本发明公开的内容再结合本领域常识可得知，直接使用PNAS-4基因所表达的蛋白也 能达到近似的效果。本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种变型或 改进。比如由本领域常识可知，若有不同的要求，本发明的抗肿瘤药物组合物和抗 肿瘤辅助药物组合物的用量和使用方式可以在一个较大范围内变动。本领域技术人 员可以根据一些巳知的因素，诸如疾病的种类，病情严重程度，病人体重，剂型， 所选用药途径等很容易地加以确定。只要不脱离本发明的基本思想，这些变动均在 本发明的精神及所附上的权利要求书定义的范围之内。 PNAS-4基因在制备抗肿瘤及抗肿瘤辅助药物中的用途—ST25 SEQUENCE LISTING<110〉四川大学<120〉 PNAS-4基因在制备抗肿瘤及抗肿瘤辅助药物中的用途 <130〉 A070149 <160〉 13<170> Patentln version 3.4<210> 1〈211> 585〈212〉 腿<213〉 Homo sapiens〈221〉 CDS〈222〉(1).. (585)〈400〉 atg ggg Met Gly 1get AlaAsncag Gin 5Leugtg Valgtg Valetc LeuAsn 10gtg Valtac Tyrgac Aspatg Mettat tgg Tyr Trp 1J548atg aac gaa tat acc tea tec att gga att gga gtt ttt cat tea gga Met Asn Glu Tyr Thr Ser Ser lie Gly lie Gly Val Phe His Ser My 20 25 30%att gaa gtc tat ggc aga gaa ttt get tat ggt ggc cat cct tac ccc lie Glu Val Tyr Gly Arg Glu Phe Ala Tyr Gly Gly His Pro Tyr Pro 35 40 45144Ut tct gga ata ttt gaa att tec cca gga aat get tct gaa eta gga Phe Ser Gly lie Phe Glu lie Ser Pro Gly Asn Ala Ser Glu Leu Gly 50 55 60192gaa aca ttt aaa ttt犯a gaa get gtt gtt tta ggg age acg gac ttc Glu Thr Phe Us Phe Lys Glu Ala Val Val Leu Gly Ser Thr Asp Phe 65 7b 75 80240eta gaa gat gat ata gas aaa at"t gta gaa gaa ctg gga aaa g犯"tac Leu Glu Asp Asp lie Glu Lys lie Val Glu Glu Leu Gly Lys Glu Tyr 85 90 95288a犯ggc aat get tat cat tta atg cat aaa aac tgc aat cat ttt tct Lys Gly Asn Ala Tyr His Leu Met His Lys Asn Cys Asn His Phe Ser 100 105 110336tea get tta tea gag att ctt tgt ggg aaa gag att cct cgc tgg ate Ser Ala Leu Ser Glu lie Leu Cys Gly Lys Glu lie Pro Arg Trp lie 115 120 125384aat cga ctt gcc tac ttc age tec "tgt ata ccc ttt eta cag agt "tgc Asn Arg Leu Ala Tyr Phe Ser Ser Cys lie Pro Phe Leu Gin Ser Cys 130 135 140432etc ccg aag gag tgg etc acg ccc gca gcc ctg cag tct agt gtc age Leu Pro Lys Glu Trp leu Thr Pro Ala Ala Leu Gin Ser Ser Val Ser 145 150 155 160480c犯gaa etc cag gat gaa ctg gag gaa gca gag gat get gcc gca tec Gin Glu Leu Gin Asp Glu Leu Glu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Ser 165 170 175528get txc gtg gca age act gca gca ggc tec aga ccc ggg cgc cac act Ala Ser Val Ala Ser Thr Ala Ala Gly Ser Arg Pro Gly Arg His Thr 180 185 190576aaa eta "taa Lys Leu585 PNAS-4基因在制备抗肿瘤及抗肿瘤辅助药物中的用途—ST25〈210〉 2<211> 194〈212〉 PRT<213〉 Homo sapiens<400〉 2Met Gly Ala AsnGin 5LeuValValLeuAsn 10ValTyrAspMetTyr 15TrpMet Asn Glu Tyr 20ThrSerSerlieGly 25lieGlyValPheHis 30SerGlylie Glu Val Tyr 35GlyGluPhe 40AlaTyrGlyGlyHis 45ProTyrProPhe Ser Gly lie 50PheGlulie 55SerProGlyAsnAla 60SerGluLeuGlyGlu Thr Phe Lys 65PheLys 7bGluAlaValValLeu 75GlySerThrAspPhe 80Leu Glu Asp Asplie 85GlulieValGlu 90GluLeuGlylysGlu 95TyrLys Gly Asn Ala 100TyrHisLeuMetHis 105LysAsnCysAsnHis UOPheSerSer Ala Leu Ser 115GlulieLeuCysGlyLysGluliePro 125ArgTrplieAsn Arg Leu Ala 130TyrPheSer 135SerCyslieProPhe 140LeuGinSerCysLeu Pro Lys Glu 145TrpLeu 150ThrProAlaAlaLeu 155GinSerSerValSer 160Gin Glu Leu GinAsp 165GluLeuGluGluAla 170GluAspAlaAlaAla 175SerAla Ser Val Ala 180SerThrAlaAlaGly 185SerArgProGlyArg 190HisThrLys Leu〈210〉 3 <211〉 585 〈212〉 DNA <213〉 Mus musculus〈220〉 <221〉 CDS <222> (1).. (585)<400> 3 atg ggg get aac Met Glv Ala Asn 1cag Gin 5Leugtg Valgtg Valetc LeuAsn 10gtc Valtac Tyrgac Aspatg Mettac Tyr 1548atg aat gaa tac Met Asn Glu Tyra_cc Thrtea Sertct Seratt liegga Glyatt lieggs Glygtt Valttt Phecat Histct Sergg3 Gly96 PNAS-4基因在制备抗肿瘤及抗肿瘤辅助药物中的用途—ST25 20 25 30att gaa gta tat ggc aga gag ttt get tat ggt ggc cat cca tat cct 144 lie Glu Val Tyr Gly Arg Glu Phe Ala Tyr Gly Gly His Pro Tyr Pro 35 40 45ttt tct gga ata ttt gaa att tec cca gga aat get tct gag eta gga 192 Phe Ser Gly lie Phe Glu lie Ser Pro Gly Asn Ala Ser Glu Leu Gly 50 55 60gaa aca ttt etaa t"t"t aaa gaa get gtt gtt eta gga agt acg gac ttt 240 Glu Thr Phe Lys Phe Lys Glu Ala Val Val Leu Gly Ser Thr Asp Phe 65 70 75 80eta gaa gat gat ata gag aaa att gta gaa gaa ctg ggg aaa gag tat 288 Leu Glu Asp Asp lie Glu Lys lie Val Glu Glu Leu Gly Lys Glu Tyr 85 90 95aag ggc aac gcc tac cat ctg atg cac aaa aac tgc aat cac ttt tct 336 Lys G工y Asn人la Tyr His Leu Met His Lys Asn Cys Asn His Phe Ser 100 105 110tea get 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33<210>12<211>27<212>■〈213〉Artificial〈220〉〈223〉Artificial<400>12ggatxcatgg ccaaccagcc catcatc 27〈210〉13<211>30〈212〉DNA<213>Artificial〈220〉〈223〉Artificial〈400〉13 PNAS-4基因在制备抗肿瘤及抗肿瘤辅助药物中的用途一ST25 ctcgagctat agttttgtgt ggcgcccagg 30
权利要求
1、PNAS-4基因在制备抗肿瘤药物物与抗肿瘤辅助药物中的用途。
2、 根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的PNAS-4基因的序列为 SEQ ID NO.l 、 SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。
3、 PNAS-4蛋白在制备抗肿瘤药物与抗肿瘤辅助药物中的用途。
4、 根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的PNAS-4蛋白的序列为 SEQ ID NO,2、 SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。
5、 一种重组载体，其特征在于含有序列为SEQ ID NO.l、 SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5的PNAS-4基因。
6、 根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于所述载体为真核表达载体。
7、 一种含有权利要求5或6所述重组载体的宿主细胞。
8、 权利要求5或6所述的重组载体在制备抗肿瘤药物组合物或抗肿瘤辅助药 物组合物中的用途。
9、 一种抗肿瘤药物组合物或抗肿瘤辅助药物组合物，是由PNAS-4基因或 PNAS-4基因编码的蛋白作为主要活性成分添加药学上可以接受的辅料制备而成 的。
10、 一种抗肿瘤药物组合物或抗肿瘤辅助药物组合物，是由权利要求5或6所 述的重组载体作为主要活性成分添加药学上可以接受的辅料制备而成。
11、 根据权利要求9或10所述的抗肿瘤药物组合物或抗肿瘤辅助药物组合物， 其特征在于所述药物组合物的活性成分被脂质体所包被。
12、 根据权利要求9~11任一项所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于还含有 肿瘤化疗药物作为活性成分。
13、 一种制备权利要求5所述重组载体的方法，其特征在于包括以下步骤a、 将PNAS-4基因构建入载体得到含PNAS-4的重组载体；b、 将a步骤所得含PNAS-4的重组载体转入宿主细胞，扩增制备重组载体。
14、 一种制备权利要求10所述的抗肿瘤药物组合物或抗肿瘤辅助药物组合物 的方法，其特征在于包括以下步骤a、 在无菌条件下取注射用水，再按以下配比加入原料重组PNAS-4腺病毒 lxl09~9xlOuIU/ml、 5%的葡萄糖溶液；b、 在无菌条件下将步骤a产物混合均匀，加缓冲液调节？11值至7.5~8.5;c、 将步骤b产物无菌过滤后分装成注射剂，或制成冻干制剂。
全文摘要
本发明属于肿瘤基因治疗领域，具体涉及PNAS-4基因在制备抗肿瘤药物方面的用途。本发明含PNAS-4的重组载体能在体外有效地抑制内皮细胞的生长及迁移；体内的抑瘤实验也表明能够显著抑制多种肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存期。本发明以脂质体包裹含PNAS-4的重组载体和化疗药物顺铂或和厚朴酚共同作为活性成分的抗肿瘤药物比各自单独使用明显具有更优的效果，能降低两者的使用量。本发明产品功效明显，毒副作用小，制备方法简单易实现；且本发明抗肿瘤注射剂还可以弥补蛋白输注药物的缺陷，能增大给药时间的间隔、大大减少给药量、减轻患者经济负担并提高患者的生活质量，具有很好的市场前景。
文档编号A61K38/17GK101130081SQ200710049780
公开日2008年2月27日 申请日期2007年8月14日 优先权日2007年8月14日
发明者杨寒朔, 梁淑芳, 霞 赵, 邓洪新, 陈俐娟, 魏于全 申请人:四川大学