专利名称：一种用免疫亲和层析色谱柱提取银杏内酯b的方法
技术领域：
本发明涉及一种提取银杏内酯B的方法，特别涉及一种用免疫亲和层析色谱柱提取银杏内酯B的方法。
背景技术：
银杏系银杏科植物，又名白果，是最古老的中生代植物，至今已有20亿年的历史，现仅存一科一属一种，有裸子植物“活化石”之称。中国是银杏的故乡，也是全球最大银杏种植地，银杏年资源量达2.5万吨，占全球总量的70％以上。银杏成分复杂，迄今为止科学家从银杏中分离得到160多种化学成分。主要有效成分为白果内酯、银杏内酯和银杏黄酮，其中白果内酯主要存在于果实中，类似神经生长因子，有神经保护、促进神经生长的作用，常用于防治神经系统疾病和老年性痴呆。银杏黄酮(主要包括银杏双黄酮、异白果双黄酮、异鼠李素、山奈酚、槲皮素、芦丁等38种)存在于叶片与果实外皮之中，具有清除自由基，抗血栓形成，改善微循环，促进脑部血液循环等药理作用。银杏内酯分为A、B、C、J、M五种，主要存在于叶片中，是血小板活性因子(Platelet Activating Factor，PAF)特异性拮抗剂，其特有的C20笼状结构能与PAF受体楔合，产生竞争性抑制作用，具有显著的PAF拮抗作用。特别是银杏内酯B(Ginkgolide B，GB)，由于分子中醚氧与羰基氧间的距离和PAF中醚氧与羰基氧的距离一致，其PAF拮抗活性最强，是迄今发现作用最强的PAF拮抗剂，有很强的抗血栓形成，抗肺支气管过敏、抗移植排斥、抗炎、抗休克等药理作用。药效大大优于总内酯，价格也远远高于银杏内酯。法、英、德等国将银杏内酯B作为抗移植排斥、抗中风、血液透折、抗休克、抗哮喘新药应用于II、III期临床试验。我国也正在研发国家一类中药GB制剂。GB含量极低，干叶中仅约含0.001-0.01％，但其独特、强大的药理作用吸引研究者广泛深入地探讨了GB的提取纯化方法。楼凤昌等(2004)取干燥银杏叶10.0kg粉碎，以95％乙醇回流提取3次，提取液合并，减压浓缩，与硅燥土拌样后，置索式提取器中，依次用石油醚、乙酸乙酯、甲醇回流提取。乙酸乙酯提取物经硅胶柱(硅胶粒度200-300目)反复层析，二氯甲烷∶甲醇(100∶1-100∶100＝v/v)梯度洗脱，洗脱物经重结晶得到总萜内酯，再经制备型HPLC纯化，得50mgGB纯品[3]。Stanislav Jaracz等(2004)将银杏总提取物溶于乙酸乙酯上硅胶层析柱，用乙酸乙酯与正丁烷以不同比例洗脱，洗脱物进行复杂的苄基化、过柱和去苄基化后，得98％银杏内酯B纯品。这一类提取分离方法虽然能获得高纯度GB，但整个流程复杂，提取步骤非常烦琐，使用的试剂也非常多，且通常需要制备型HPLC，有一定的仪器要求。GB是银杏叶的代谢产物，故有不少学者尝试以愈伤组织或悬浮细胞培养的方法获取GB。此类方法提取GB存在三个明显缺点。其一，在细胞培养过程中，由于形态分化受到抑制和染色体变异，目的产物逐步降低，最后消失；其二，银杏内酯含量低，据报道银杏内酯含量约占培养基的0.0023-0.0099％，最高的也只占细胞干样质量的0.07528％；其三，微量的银杏内酯还必须进一步分离GB。提取纯化的困难，促使不少科学家把眼光放到了GB的合成上，但GB的结构复杂独特。它由20个C结合一个叔丁基，6个五元环组成，包括1个螺壬烷和1个四氢呋喃环，以及3个内酯环，其中有11个手性中心，10个含氧碳，4个完全取代碳，合成的难度很大。1967年，Marayama等就确定了GB的结构，但直到1988年，Corney才以包含26步的反应路线完成GB的首次合成，1999年，Michael等将反应步骤减少为19步。但是其程序复杂、合成成本巨大、产量少，仅限于实验室使用。
免疫亲和层析柱是利用抗原、抗体之间高特异结合进行分离纯化。将可溶性抗原或抗体用化学方法偶联到不溶性载体上，使之固相化。当样品溶液通过免疫亲和层析柱时，相应抗原或抗体被特异性地结合到柱上，与样品中的杂质分离，然后选择适当的溶剂将结合的成分洗脱下来，只用一步即得到高纯度物质。
发明内容
本发明的目的是提供一种用免疫亲和层析色谱柱提取银杏内酯B的方法。
本发明是这样来实现的，其方法步聚为1、银杏内酯B的初步提取将银杏叶以三倍量的90％乙醇提取，提取三次后，以旋转蒸发仪浓缩，将乙醇蒸干至提取物为粘稠；2、将步骤1所得粘稠提取物上免疫亲和层析色谱柱，然后用磷酸缓冲液冲洗三次，然后以甲醇冲洗，挥干甲醇冲洗液中的甲醇即得银杏内酯B。
本发明所提供的提取GB的免疫亲和层析色谱柱是由固体载体和与其偶联的GB单克隆抗体组成；所述的GB单克隆抗体是以GB半抗原与载体蛋白偶联为免疫原得到；所述半抗原是1mgGB标准品溶于四氢呋喃(THF)，加入5mLN，N’-羰基二咪唑，室温条件下振荡反应30-60分钟，真空抽干THF，用100μL二甲基亚砜溶解残留物，加入5mg溶于pH7.5磷酸盐缓冲液(PBS)的牛血清白、卵清蛋白室温下继续反应过夜，4℃透析72小时而得。
所述固体载体为纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺、多孔玻璃、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰-琼脂糖凝胶等，优先为Sepharose 4B。
所述GB单克隆抗体源可为鼠源性。
所述载体蛋白可为牛血清白蛋白或卵清蛋白等常用载体。
所述免疫亲和吸附剂可装载入柱中，制成免疫亲和层析柱，此免疫亲和色谱层析柱也属本发明保护范围。
本发明的优点是(1)引用抗原、抗体之间的高特异结合进行分离纯化，通过免疫亲和层析色谱柱一步即得到高纯度物质；(2)生产方法简便，减少污染。
具体实施例方式
实施例一1、初步提取将100g银杏叶，以300mL90％乙醇加热回流法提取三次，合并三次提取液后，浓缩至粘稠状。
2、洗涤将初步提取物上柱，停留半小时后，用0.1mol/L、pH值为7.4的磷酸缓冲液洗涤三次，洗去不能与GB抗体结合的成分。
3、提取GB洗去不能与GB结合的部分后，留下的均是能与GB单克隆抗体结合的GB。以甲醇冲洗三次后，合并洗脱液，并挥干甲醇后，得到的结晶物，就是GB。
免疫亲和层析色谱柱的制备基质的准备取溴化氰活化的Sepharose 4B冻干粉，在装有0.1mol/L盐酸的漏斗中膨胀。
抗体的准备用0.1mol/L的碳酸盐钠溶液将纯化后的GB单克隆抗体稀释，调溶液pH值为8.4偶联反应将膨胀的溶胶用0.1mol/L的碳酸盐钠平衡后，转入上述单克隆抗体溶液中，混合，4℃下缓慢搅拌20-24小时。偶联率可达98％。
活化位点的封闭将上述偶联后的凝胶转入有0.1mol/L、pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液中，混合，4℃下缓慢搅拌2hr，以封闭没有偶联的活化位点。
洗涤凝胶用5倍体积的0.1mol/L、pH值为4.0醋酸盐缓冲液和0.1mol/L、pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液交替冲洗3次。用0.1mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g，叠氮钠1g)平衡后，抽干的凝胶转入0.1mol/L、pH值为7.4的PBS中。
装柱将偶联有GB单克隆抗体的免疫吸附剂转入柱中，制成偶联有GB单克隆抗体的免疫亲和层析色谱柱。
权利要求
1.一种用免疫亲和层析色谱柱提取银杏内酯B的方法，其方法步聚为(1)银杏内酯B的初步提取将银杏叶以三倍量的90％乙醇提取，提取三次后，以旋转蒸发仪浓缩，将乙醇蒸干至提取物为粘稠；(2)将步骤1所得粘稠提取的上免疫亲和层析色谱柱，然后用磷酸缓冲液冲洗三次，然后以甲醇冲洗，即得银杏内酯B。
2.根据权利要求1所述的一种用免疫亲和层析色谱柱提取银杏内酯B的方法，其特征是免疫亲和层析色谱柱是由固体载体和与其偶联的GB单克隆抗体组成。
3.根据权利要求2所述的GB单克隆抗体，其特征是以GB半抗原与载体蛋白偶联为免疫原得到；所述半抗原是1mgGB标准品溶于四氢呋喃(THF)，加入5mLN，N’-羰基二咪唑，室温条件下振荡反应30-60分钟，真空抽干THF，用100μL二甲基亚砜溶解残留物，加入5mg溶于pH7.5磷酸盐缓冲液(PBS)的牛血清白、卵清蛋白室温下继续反应过夜，4℃透析72小时而得。
4.根据权利要求3所述的载体蛋白，其特征是可为牛血清白蛋白、卵清蛋白等常用载体。
5.根据权利要求2所述的固体载体可为纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺、多孔玻璃、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰--琼脂糖凝胶。
全文摘要
一种用免疫亲和层析色谱柱提取银杏内酯B的方法，其方法步聚为1.银杏内酯B的初步提取将银杏叶以三倍量的90％乙醇提取，提取三次后，以旋转蒸发仪浓缩，将乙醇蒸干至提取物为粘稠；2.将步骤1所得粘稠提取的上免疫亲和层析色谱柱，然后用磷酸缓冲液冲洗三次，然后以甲醇冲洗，即得银杏内酯B。
文档编号A61K36/16GK101041661SQ20071005180
公开日2007年9月26日 申请日期2007年4月2日 优先权日2007年4月2日
发明者余宙 申请人:南昌大学