专利名称：铜绿假单胞菌蹭行运动相关基因pa1550及应用的制作方法
铜绿假单胞菌蹭行运动相关基因PA15 5 0及应用S^领域本发明属于微生物生物技术领域，特别涉及一种铜绿假单胞菌蹭行运动相关基因 M7息背景fe^铜绿假单胞菌(i^"cfowonayam/gz力aya)是一种重要的^ff^病菌，常在临床上引 繊固性感染。铜绿假单胞菌对多种赃素都具有耐药性，在固相表面形成生物鹏魏戯多 重耐药的重要原因之一。蹭行运动在生物feM形成早期皿重要作用。在附着到固相表面之前， 铜绿假单胞菌借助鞭毛的游艇动(swimmingmotility)沿着固相表面游动，然后借助鞭毛或IV型菌 毛吸附到固相表面，并开始分裂、增殖。当细菌在非生物表面形成了单层膜之后，它们并没有在 固相表面静止，而是继纟辦动。这时，细菌不再娜鞭毛介导盼游》媳动(swimming motility),而 是 于IV型菌毛的伸展和收縮，推动或牵引自身在固相表面进行位置移动,这种运动，称为蹭 t M动(twitching motility)。细菌3131^种运动发育成微 :进而形) 熟的生^^^，极^i也影 响了抗生素的作用效率。目前国际上已经发现多，绿假单胞菌生辦鹏形成相錢因，我们发 现的蹭纟话动相关基因^75^會滩进一歩丰富这1域，有助于揭示生物Sm药性的机理。发明内容1本发明目的是掛糊绿假单胞菌蹭fi^动相錢因iM/550，并用该基因为新药耙点研制抗菌、iMi物丰鹏药物，应用于对铜绿假单胞菌的临床治疗。本发明提供的铜绿假单胞菌蹭fi^动相关基因具有如序列表序列1所示核苷,列。战的铜绿假单胞菌蹭fi^动相錢因iM7550可以用于以该基因为新药靶点设计并制备能抑 制菌体蹭行的药物，以阻断生物 的形成，增 ^Jt生素的药效。本发明基因iM"50的获得方法^ffl人工Mu转座技术，造成铜绿假单胞菌基因突变， 突变子文库。筛淑斷fM动能力丧失或减弱的突变子，{顿化nl酶切基因组DNA,酶切片段与pUC18 载体连接，ffi3i电转化将连接;^导入^杆菌M5 a ，用卡那霉素和氨卡青霉素 LB固体培 养基筛选阳性克隆，测定插入片段的核苷,列，发现Mu插入的基因，确定皿因与铜绿假单胞 菌蹭摘动有相关性。本发明的有^tm:实验发现，本发明提供的基因失活后，菌体的蹭行运动能力明显减弱，说明此基因与铜绿假 单胞菌的蹭fi^动密切相关。M31本发明，可以针对/M"M基因设计药物，限制其正常表达，使得细菌无法ililS斷话 动形成生物鹏，降低其耐药性，超齢疗铜绿假单胞菌弓胞的感染的目的。
图1是突变子Y46的PCR检测图，其中，M是DNA M量标准DL2000; 1是突变子Y46 PCR 产物；2皿生株PA68 PCR ^t/。图2是IV型菌超曾动能力的检测图。图3是重乡服粒的检测图，其中，M是DNA肝量标准DL15000; 1是转化子中提取的质 私2是1用/^I酶切结果；3是线性pUC18片段。具体实l^实施例l: ^AXMu转座^^进行铜绿假单胞m^J^^t^的Ml将过夜液体培养的铜绿假单胞菌临床分离株PA68 (卡那霉 感)按1 100接种于50 mL LB 培养基(10 g^L胰蛋白腺5 酵娜10^LNaCl)中，37X^00 rpm振荡培养，{顿752诚 爐计测定细菌i歸鹏540nm处的吸爐,在OD540达到0.75时终止i歸。4'C 6000rpm离心 8miiVfeft菌体，分另偶H^f只、1/2 ^R、 1/6^R预冷的300mM蓆^;浮菌体，4°C 7000ipm 离心8min^弃上清，收集菌体，加Aii量的预冷的300mM蔗糖，使细M^浓度超'j 1X10"个细 m/mL,将制备好的细胞5^K IOOmIV管。将0.5 u L(210ng)人工Mu转座复，pKMF41 A Eco加入 到感受态细胞中，混匀后转入到预冷的0.2cm电转化杯中，在2,6KV腿下进行电转化。电击后 将转化体系转入職37'C温浴的900^L SOC培养教20g/L蛋白胨，5 g/L酵娜，0. 5 g^L NaCl， 20mMlSW塘，lmMMgCl2)中。37°C， 200rpm，培养1 h 。将细菌培养物按照500mL菌^/20mL 培养基的比例在含5(^g/mLKm的LB固体培养基JJ4疔凃布，37'C培养16h。挑取转化子，以人 工Mu转座子上的特异序列Pkl : 5'-ATGGGAAGCCCGATGC-3'禾Q Pk2 : 5'-AGCCGTTTCTGTAATGAAGG-3'作为引物，用PCR方法扩增Mu转座子片段、电泳检测(图 1)。实施例2:突变子的蹭瓶动能力检测在无菌塑料培养皿内铺上薄薄的一层蹭动检测培养基[10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母粉，5 g/L NaCl，l% (W/V) Grutulate-agar]，室温晾干。用灭菌过的牙^f兆取在LB琼月默咅养基JJl夜活化 的PA68的Mu转座突变子，矛liiS曾动培养基，将细菌接种到培养基下面的塑料平皿上37r培养 24小时。细菌就会 IV型菌毛的收縮利申展在培养基TM的塑料表面以接种点为圆心，向周 围蔓延生长，产生圆形的菌晕。将培养雜轻揭去，用考马司結染色液(10%乙酸，0.06%考 马司亮兰)^fe塑料平皿20併中，倒掉染液，用自来水冲洗^F皿lmin，观察细菌因蹭动产生的 菌圈，筛选得到蹭动能力减弱的突变子，编号Y46 (图2)。实施例3:蹭fi^动相，因的克隆(1)克隆载体pUC18的大量提取将过夜i歸的200mL含有pUC18的大肠杆難,入250rnL离心管中4。C,12000ipm离心lmin^收集菌体。lOOmLSTE (lOOmMNaCl， 10mMTris.ClpH8.0,1 mMEDTA)洗涤，4。C， 12000g离心lmin，收集菌体。用预冷的25mL溶液I (50 mM g^糖，10mMEDTA， 25mMTris.Cl，pH8.0)悬浮洗涤菌沐力口入50mL的溶液II (0.2 MNaOH， 1%SDS)，轻鶴荡混匀后冰浴5min;加入37.5 mL溶衝II (3 MKAc， 5 M乙酸，pH4.8)，温和震荡混匀，冰浴10 min后4'C ，12000ipm离心20min，四层纱布过滤收針清液。加入80mL的异丙醇，室i^B 10min后20。C,12000ipm离心15 min并收敏淀。用70%乙酸先涤沉淀2 娘真空千燥。将真空千燥后的沉淀溶于5 mLTE(10 mM Tris.Cl pH8.0,lmM EDTA)，分装到2个11 mL离心管中，每管加120nLRNase( 10 mg/mL)，37。C水浴中保温1 h;用，积的酚/氯fttt提两次，收^h清液。每管中加入1/10体积的pH5.0 3MNaAc，在加入2倍^f只的预冷的无水乙醇，混匀后一20。CJ5[S 30min。 4°C， 12000 rpm离心10 min;弃上清，将质粒沉淀用5mL的70"/。乙l^先两次；在真空泵中抽干，溶于适量的TE中。取1^L质粒在0.8%的琼脂撤1|^1电泳，以DL15000做DNA肝量标准，对质茅规行域的定量。(2) pUC18载体柳蹄胜内切酶ApM消化及碱性磷酸酶处理pUC18的命nl酶切体系(50^L)如下pUC18 3^L (2吗)10 XL buffer 5|jL争I 2.5jiL (30U)ddH20 39.5 ^iL37。C鹏2曙3小时。65。C灭活/^1 15 min，补加150MLddH2O，再用等^lR的苯酚/氯仿抽提一次，加1/10 |^只的3 M NaAc (pH5. 0) ， 2 fg^f只的^zK乙醇，一20。C中^C置30 min. 4°C， 12000 ipm离心IO min， DNA沉淀用70^乙微涤两次，真空千燥，将沉淀溶于KVLTE中。去磷酸化反应体系(50|JJ如下pUC18 (拳I) lO(oL10 XCIAP Buffer 5pLCIAP 2pL (50U)ddH20 33 mL37。C反应40min。 65。C灭活CIAP lOmin,补加150^胆20,再用^^的苯酚/氯細提一次，加1/10 #^只的3 M NaAc (pH5.0) ， 2倍^f只的^7K乙醇，一20。C中腿30 min. 4°C, 12000 rpm离心IO min, DNA沉淀用70^乙^^先涤两次，真空千燥，将沉淀溶于50^LTE中。(3) 基因组的提取艮辦鲜歸的LB固体平社挑取Y46的单離，接种到lOmLLB液体i歸基中，37'C过夜 培养,将菌條移至lOmL的离心管中。4°C, 12000ipm，离心2min，收集菌舰淀。用0. 8 mL 裂解缓冲液(20mMTris.HClpH8.0, 10mMEDTA， 10mMNaCl， 20%蓆糖)重繊浮菌体，加入 3(VL RNase (10mg/mL) ， 37。C保温1小时。向离心管中缓漫加入0. 8mL的2% SDS，并轻轻振 荡至溶液澄清，再加入8^iL蛋白酶K (20mg/mL) ， 37。C7K浴中过夜，其间不时摇动离心管,使蛋 白酶K能充分7]C解蛋白。等体积Tris饱和苯酚/氯仿混合舰提蛋白，4°C， 12000卬m，离心20 min，收ai:相。重复抽提歩骤，赶蛋白层消失为止。力口入2倍術只的^7K乙醇，用玻鴻織出 DNA沉淀。将沉淀用7(W乙^f先2次，真空千燥。将DNA溶ftf^ lmL TES溶液(50mM Tris.HCl pH 8.0， 5mMEDTA^0mMNaCl)中，再向其中加入10^LRNase (10mg/mL)， 37。C7JC浴1 h后， 用等^f只苯酚/氯仿抽提蛋白，12000卬m， 10rain，祉清，力口 2倍体积的5￡*乙醇，一20。C欣置半 小时，12000卬m, 10min，沉淀用70%乙|^先两次。真空千燥后溶于20&的TE中，0.挑的琼脂糖 1:电泳定新解酶切过夜。(4) 酶切后的突变子基因组DNA与去磷酸化pUC18的连接反应反应体系(20)JL)如下genome腿(/Cpnl ) 10|xL pUC18 (/fpnl) l单10 XT4Ligase Buffer 2|iLT4Ligase 1.5[xL 鹏0 5pL16。C反应16h，向反应液中补力口 80pLddHA等^f只苯酚/氯仿抽提一次，加1/10 3M NaAc和2丫，积的^7K乙,淀后，用70%乙,两次，抽干后将DNA溶于5ioLddH20中。(5) 连接产物的电转化将过夜液体培养的大肠杆菌DH5a按1:100接种量接种到200mL LB液体培养基中，37°C 200 rpm振荡i歸至OD540i.5左右，转入200mL无麟心管中，4'C, 6000rpm离心6mii^收集菌体。 依7細预冷的^f只、1/2体积的ddH20和l/5体积的甘油(1W。) Sf^浮、洗涤菌体，4°C， 6000 ipm离心10min。最后将菌鹏于2mL 10%甘油溶液中混匀，條成100^17管，一70。C储存。 取5&连接^&J^t/与IOOmL感受态细胞混匀加入到预冷的0. 2cm电转化杯中，2. 4KV电压下电 击。电击混，与900mL SOC培养基混合，在37°C中复苏45min后，涂布到LB固体蹄基(含 100ng/mLAmp， 30ng/mLKm)上，37。C培养16—18 h。挑取转化子，MSI 法小量提M粒， 并4每质粒用iT;ml酶切、电泳检测(图3)。(6) 克隆子质粒的DNA测序，列分析 以AXMu转座子两端的反向重餅列做引物，测定转座子插入位点两侧的核苷,列。插入位点的每一侧做一个测序反应。测序采用Sanger ^^辭冬止法，j顿ABI—377XL全自动测 序仪，测序引物为Seql: 5， 一ATCAGCGGCCGCGATCC-3' Seq2: 5， -TTATTCGGTCGAAMGGATCC-3， 测序反应委ILt海博亚生物技术有限公司完成。测序结mM过Intemet网上BLAST软件在GenBank 数据库中进行同源性检索(网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。基因功肖g在铜绿假单胞菌的基因 组数据库中进行分析(网址为http://www.pseudomonas.com/)。结果表明Mu转座子插入到基因 PA1550中，这是一个目前功能完全未知的基因，与铜绿假单胞菌的蹭t话动能力相关。序列表<110>南开大学<120>铜绿假单胞菌蹭《话动相幾因E4"M ffi用<160> 1 <210>1 <211>540 <212>DNA<213>铜纟录假单胞菌(户鄉ifo附onas am/g^aya, PA ) <400>1atgcagtccg agacccaccc tcaaccctgg tacaaacact tdgggcctg 50 gttcatcgtg gccctcctgg cgaccteggt 鹏ctc鹏 ctgagcctgg 100 tcaccatcgc ggtgcgcaac c鄉acaccc tggtcaccga caactactac 150 gaggccggca agggcatcaa ccgctccctg gaacgcgaga acctggccgt 200 acgcctgcag gtgcacgcca ggtcaaggtgacgacctg accggcgaag 250 ccgaagtgcg cctgaccggc aacagccgtc cggagcagct caccctcaac 300 ctgatctcgccgacccagcc ggagaaggac cgccgcgtgg agctgctgcg 350 cagcaactcc gaccgcgagc gctacgtcgg ccagctgacc gacgccgtcg 400 ggggccgtcg cttcgtcgaa ctgctoggccaggaaggcag cggccagtgg 450 cgtcttttcgaggaagaggt ggtatcgccgaccgtggtca tggagctggg 500 tgacgaaccg ctccagggag cagaagcgaa gcgcccatga 540
权利要求
1、一种铜绿假单胞菌蹭行运动相关基因PA1550，其核苷酸序列如序列表序列1所示。
2、 权利要求l所述的铜绿假单胞菌蹭fi^动相关基因iM"W的应用，用于以该基因为新药 靶点设计并制，制菌体蹭fi^动的药物，以阻断生物被膜的形成，增 m生素的药效。
全文摘要
本发明公开了铜绿假单胞菌蹭行运动(twitching motility)相关基因PA1550。此基因具有如序列表序列1所示核苷酸序列，大小为540bp，目前国际上对此基因的功能尚无报道。实验发现，该基因失活后，细菌的蹭行运动能力明显减弱。蹭行运动是铜绿假单胞菌形成生物被膜的基础运动之一，而生物被膜的形成能使铜绿假单胞菌对抗生素的耐受力增加，用铜绿假单胞菌蹭行运动相关基因PA1550为新药靶点可以研制抗菌、抗生物被膜药物，该药物可应用于对铜绿假单胞菌的临床治疗。
文档编号A61P31/04GK101280314SQ20071006018
公开日2008年10月8日 申请日期2007年12月26日 优先权日2007年12月26日
发明者乔明强, 姚宏明, 璐 张, 张秀明, 徐海津, 白艳玲 申请人:南开大学